NGHIÊN cứu QUY TRÌNH CHIẾT CÁC hợp CHẤT STEVIOL GLYCOSIDE từ CỎ NGỌT (stevia rebaudiana b )

Quy trình chiết được xây dựng nhưsau: trích ly cỏ ngọt với dung môi nước, loại màu sơ bộ dung dịch thu được bằngphương pháp gia vôi, sau đó tiến hành tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT CÁC HỢP CHẤT

STEVIOL GLYCOSIDE TỪ CỎ NGỌT

(Stevia rebaudiana B.)

SVTH: HỒ THỊ LINH MY MSSV: 61302408

GVHD: TS LÊ XUÂN TIẾN

Bộ môn: Kỹ thuật Hóa Hữu Cơ

 Khảo sát quy trình chiết cỏ ngọt với dung môi nước

 Khảo sát quy trình tinh chế dịch chiết cỏ ngọt bằng phương pháp gia vôi

 Khảo sát quy trình tính chế dung dịch thu được sau quá trình gia vôi bằngphương pháp sắc ký cột nhựa trao đổi ion

3 Ngày giao nhiệm vụ: 03/2016

4 Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 12/2016

5 Giảng viên hướng dẫn: TS Lê Xuân Tiến

Luận văn này được thông qua bởi Bộ môn Hóa hữu cơ - Khoa Kỹ thuật hóa học

Tp HCM, ngày tháng năm 2017

Trưởng bộ môn Hóa Hữu Cơ Giáo viên phản biện Giáo viên hướng dẫn

(Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký)

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cám ơn đến thầy Lê Xuân Tiến đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiếnthức trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Xin cám ơn các thầy cô trong bộ môn Kỹ thuật Hữu cơ đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn

em trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp

Xin cảm ơn các bạn cùng thực hiện luận văn tại Phòng thí nghiệm Kỹ thuật Hữu cơ vàPhòng thí nghiệm Hóa dược đã hỗ trợ tôi hoàn thành tốt luận văn

Xin cảm ơn những lời động viên, hỗ trợ từ gia đình và bạn bè

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm xây dựng, khảo sát quy trình chiết và tinh chếcác hợp chất ngọt steviol glycoside từ cây cỏ ngọt Quy trình chiết được xây dựng nhưsau: trích ly cỏ ngọt với dung môi nước, loại màu sơ bộ dung dịch thu được bằngphương pháp gia vôi, sau đó tiến hành tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột nhựa traođổi ion Đây là “phương pháp sạch” để thu các chất ngọt từ cây cỏ ngọt, không sửdụng các loại dung môi độc hại Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly đượckhảo sát bao gồm: dạng nguyên liệu, tỉ lệ rắn/lỏng, thời gian, nhiệt độ, số lần chiết.Dựa vào hiệu suất chiết và độ hấp thu UV (= 210 nm) để đánh giá chọn ra điều kiệnthích hợp ở từng yếu tố khảo sát Quy trình loại màu bằng phương pháp gia vôi khảosát những yếu tố sau: nồng độ dung dịch, khối lượng Ca(OH)2/khối lượng cao, nhiệt

độ, thời gian gia vôi Tiếp đến, khảo sát những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tinh chếsteviol glycoside bằng phương pháp sắc ký cột nhựa trao đổi ion bao gồm: tốc độ dòngchảy, tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dịch Sử dụng phương pháp so sánh màu và độ hấp thu

UV (= 210 nm) để xác định điều kiện tinh chế thích hợp nhất Kết quả nghiên cứu chỉ

ra rằng, điều kiện trích ly thích hợp là: dạng nguyên liệu lá nguyên, tỉ lệ rắn/lỏng 1/8g/mL, thời gian chiết 30 phút, nhiệt độ 90 oC, chiết 2 lần với hiệu suất chiết là37.96%; điều kiện gia vôi thích hợp nhất: nồng độ dung dịch 90 g/mL, khối lượngCa(OH)2/khối lượng cao 1/1 g/g, nhiệt độ 0 oC, thời gian 10 phút; điều kiện trao đổiion tốt nhất: tốc độ dòng chảy 0.5 mL/phút, tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dịch 1/10mL/mL với hiệu suất quá trình là 12.22% Hiệu suất tổng toàn bộ quá trình chiết vàtinh chế steviol glycoside là 4.64%

This study was carried out to develop and investigate the process of extracting andpurifying steviol glycosides from Stevia The extraction procedure was as follows:extraction of Stevia with water, preliminary decolorizing of the obtained extraction byCa(OH)2, and purification by ion exchange chromatography This is a "green –method" for obtaining sweeteners from Stevia, without the use of organic solvents.The factors influencing the extraction process were investigated including: materialtype, solid /liquid ratio, time and temperature of extraction, extraction times Based onthe extraction efficiency and UV absorption ( = 210 nm), to determine theappropriate conditions for each factor The decolorize process by Ca(OH)2 investigatesthe following factors: solution concentration, Ca(OH)2 mass/extract mass, temperatureand time of reaction Next, investigating the factors that affect the purification ofsteviol glycoside by ion exchange chromatography, including: flow rate, plasticvolume /extract volume ratio Use color difference and UV absorption ( = 210 nm) todetermine the most suitable refining conditions The results show that the appropriateextraction conditions are: raw leaf material, solid /liquid ratio 1/8 g/mL for 30 minutes

at temperature 90 °C, with extract efficiency is 37.96%; the most suitable limingcondition: solution concentration 90 g/mL, Ca(OH)2 mass/extract mass 1/1 g/g attemperature 0 oC for 10 minutes; the best ion exchange condition: flow rate 0.5mL/min, plastic ratio/extract volume 1/10 mL/mL with process efficiency of 12.22%.The total extraction and purification efficiency of steviol glycoside was 4.64%

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM TẮT LUẬN VĂN iv

ABSTRACT .

v MỤC LỤC .

vi DANH MỤC HÌNH ẢNH ix

DANH MỤC BẢNG BIỂU xii

DANH MỤC PHỤ LỤC xiii

LỜI MỞ ĐẦU .

xiv CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 15

1.1 Giới thiệu về cỏ ngọt 15

1.1.1 Nguồn gốc và phân bố 15

1.1.2 Mô tả thực vâ ̣t 16

1.1.3 Bảo quản 17

1.1.4 Thành phần hóa học 18

1.1.5 Tác dụng dược lý 22

1.1.6 Ứng dụng 24

1.2 Các công trình nghiên cứu tách chiết cỏ ngọt 25

1.2.1 Nghiên cứu trong nước 25

1.2.2 Nghiên cứu nước ngoài 29

CHƯƠNG 2 Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm 42

2.1 Mục tiêu nghiên cứu và đối tượng nghiên cứu 42

2.2 Nô ̣i dung nghiên cứu 42

2.3 Hóa chất và thiết bị 42

2.3.1 Hóa chất 42

2.3.2 Thiết bị 42

2.4 Thực nghiệm 43

2.4.1 Nguyên liê ̣u 43

2.4.2 Phương pháp đo độ ẩm 43

2.4.3 Khảo sát điều kiện chiết cỏ ngọt với dung môi nước 43

2.4.4 Khảo sát quy trình tinh chế các hợp chất steviol glycoside 46

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 52

3.1 Kết quả khảo sát quá trình chiết nước 52

3.1.1 Khảo sát dạng nguyên liệu chiết 52

3.1.2 Khảo sát tỉ lệ rắn/lỏng 54

3.1.3 Khảo sát thời gian chiết 56

3.1.4 Khảo sát nhiệt độ 57

3.1.5 Khảo sát số lần chiết 59

3.2 Khảo sát quá trình gia vôi 61

3.2.1 Khảo sát nồng độ dịch chiết 61

3.2.2 Khảo sát tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao 63

3.2.3 Khảo sát nhiệt độ 65

3.2.4 Khảo sát thời gian phản ứng 67

3.3 Khảo sát quá trình sắc ký cột nhựa trao đổi cation và anion 69

3.3.1 Khảo sát tốc độ dòng chảy 69

3.3.2 Khảo sát tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dịch 71

3.4 Sản phẩm thu được sau quy trình chiết và tinh chế các chất ngọt steviol

glycoside 73

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 76

4.1 Kết luận 76

4.2 Kiến nghị 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO 77

PHỤ LỤC 85

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hình ảnh về cỏ ngọt 15

Hình 1.2 Khung steviol cơ sở xây dựng nên các glycoside có trong cỏ ngọt 19

Hình 1.3 Quy trình chiết tách chất ngọt từ cỏ ngọt ở Việt Nam[59] 26

Hình 1.4 Quy trình chiết tách stevioside từ cỏ ngọt 27

Hình 1.5 Quy trình chiết cỏ ngọt theo John Donald Payzant 36

Hình 2.1 Quy trình tinh chế các chất ngọt trong cỏ ngọt 46

Hình 3.1 TLC bột steviol glycoside có hàm lượng > 95% 52

Hình 3.2 Nguyên liệu dạng: A – lá nguyên; B – bán nguyên; C – bột mịn 53

Hình 3.3 Hiệu suất chiết theo dạng nguyên liệu chiết (Phụ lục 1) 53

Hình 3.4 TLC các dịch chiết trong khảo sát dạng nguyên liệu chiết 54

Hình 3.5 Hiệu suất chiết theo tỉ lệ rắn/lỏng (Phụ lục 2) 55

Hình 3.6 TLC các dịch chiết thu được trong khảo sát tỉ lệ rắn/lỏng 55

Hình 3.7 Hiệu suất chiết theo thời gian (Phụ lục 3) 56

Hình 3.8 TLC các dịch chiết thu được trong khảo sát thời gian chiết 57

Hình 3.9 Hiệu suất chiết theo nhiệt độ (Phụ lục 4) 58

Hình 3.10 TLC các dịch chiết thu được trong khảo sát nhiệt độ chiết 58

Hình 3.11 Hiệu suất chiết theo số lần chiết (Phụ lục 5) 59

Hình 3.12 TLC các dịch chiết thu được trong khảo sát thời gian chiết 60

Hình 3.13 TLC hiện màu và đã hiện màu của dịch chiết ban đầu A: là chất tạo màu vàng nâu của dịch chiết (hệ giải ly EtOAc:EtOH:H2O:AF = 12:4:2.5:0.5) 61

Hình 3.14 Độ khác biệt màu sắc E của các dịch thu được so với dung dịch gốc (Phụ lục 6) 62

Hình 3.15 TLC các dung dịch thu được sau giai đoạn gia vôi trong khảo sát nồng độ 62

Hình 3.16 Các dịch thu được sau giai đoạn gia vôi trong khảo sát nồng độ 63 Hình 3.17 Độ khác biệt màu sắc E*ab của dịch thu được trong khảo sát tỉ lệ lượngCa(OH)2/khối lượng cao so với dung dịch gốc (Phụ lục 7) 64 Hình 3.18 TLC các dung dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát tỉ lệ lượng

Ca(OH)2/khối lượng cao 64

Hình 3.19 Các dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khốilượng cao 65

Hình 3.20 Độ khác biệt màu sắc E*ab của dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát

nhiệt độ so với dung dịch gốc (Phụ lục 8) 66 Hình 3.21 TLC các dung dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát nhiệt độ 66 Hình 3.22 Các dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát nhiệt độ 67 Hình 3.23 Độ khác biệt màu sắc E*ab của dịch thu được trong khảo sát thời gian so

với dung dịch gốc (Phụ lục 9) 68 Hình 3.24 TLC các dung dịch thu được sau quá trình gia vôi trong khảo sát thời gian

nhựa/thể tích dịch so với dung dịch gốc (Phụ lục 11) 72 Hình 3.30 TLC các dung dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát tốc độ dòng chảy 72 Hình 3.31 Các dịch thu được trong khảo sát tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dịch 73 Hình 3.32 Dung dịch: A – Dịch chiết nước ban đầu; B – Dịch sau quá trình gia vôi;

C – Dịch sau quá trình trao đổi ion 73

Hình 3.33 TLC của dung dịch: A – Dịch chiết nước ban đầu; B – Dịch sau quá trình

gia vôi; C – Dịch sau quá trình trao đổi ion 74

Hình 3.34 A – Cao chiết thô; B – Cao sau tinh chế 75

DANH MỤC BẢNG BIỂUBảng 1.1 Cấu tạo của một số glycoside chủ yếu trong lá cỏ ngọt Glc, Xyl, and Rha

tương ứng với glucose, xylose, and rhamnose [19] 20

Bảng 1.2 Tính chất vâ ̣t lý của các hợp chất steviol glycoside trong cỏ ngọt[26] 21

Bảng 3.1 Hàm lượng chất ngọt thu được sau quá trình chiết và tinh chế 74

DANH MỤC PHỤ LỤCPhụ lục 1 Bảng số liệu hiệu suất chiết và độ hấp thu UV theo dạng nguyên liệu trong

Phụ lục 6 Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo nồng độ dung dịch

trong quá trình gia vôi 91

Phụ lục 7 Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo tỉ lệ lượng

Ca(OH)2/khối lượng cao trong quá trình gia vôi 93

Phụ lục 8 Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo nhiệt độ trong quá

trình gia vôi 94

Phụ lục 9 Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo thời gian trong quá

trình gia vôi 95

Phụ lục 10 Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo tốc độ dòng chảy

trong quá trình trao đổi ion 96

Phụ lục 11 Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo tỉ lệ thể tích nhựa/ thể

tích dịch trong quá trình trao đổi ion 97

LỜI MỞ ĐẦU

Các nghiên cứu cho thấy mối liên hệ tiềm tàng giữa sử dụng đường ngọt và các vấn đềsức khỏe, bao gồm béo phì và sâu răng Sử dụng quá mức đường có liên quanđến bệnh tiểu đường loại 2, béo phì, gia tăng bệnh tim và làm cho các tế bào ung thưphát triển nhanh hơn Theo nhiều nghiên cứu, các hợp chất ngọt chiết xuất từ cây cỏngọt có đô ̣ ngọt gấp rất nhiều lần so với đường sucrose và rất tốt đối với sức khỏe conngười khi dùng trong mô ̣t giới hạn cho phép Hiê ̣n nay, trên thế giới đă ̣c biê ̣t là Nhâ ̣tbản, Hàn Quốc đã và đang sử dụng các hợp chất ngọt chiết xuất từ cỏ ngọt này để thaythế dần cho đường sucrose và đường nhân tạo trong thực phẩm, dược phẩm Tuynhiên, ở Viê ̣t Nam cỏ ngọt ít được người dân biết đến do chưa có quy trình chiết xuấtcác hợp chất ngọt từ cỏ ngọt nào ứng dụng vào quy mô công nghiê ̣p để sản xuất trongnước, nếu nhâ ̣p khẩu thì giá rất cao nên các hợp chất ngọt này chưa được bán nhiều ởnước ta Nhìn thấy được điều đó và dựa trên các nghiên cứu, thăm dò về cỏ ngọt, đề tàinghiên cứu quy trình chiết các hợp chất steviol glycoside từ cỏ ngọt hướng định hướngứng dụng trong quy mô công nghiê ̣p được đề xuất

Hình 1.1 Hình ảnh về cỏ ngọt

1.1 Giới thiệu về cỏ ngọt

Tên thường gọi: cỏ ngọt hay cỏ đường, cỏ mật, cỏ cúc

Tên khoa học: Stevia rebaudiana Bertoni

Cỏ ngọt là cây bụi lâu năm thuộc họ Cúc Asteraceae, có nguồn gốc từ vùng Amambay

và Iguacu thuộc biên giới Brazil và Paraguay[1, 2] Ngày nay được trồng nhiều ở một số

quốc gia trên thế giới như Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan, Thái Lan, Indonesia, HoaKỳ, Brazil, Argentina, Paraguay, Mexico.

Cây cỏ ngọt bắt đầu được du nhập từ Nam Mỹ vào Việt Nam từ năm 1988[3] Hiệnnay, đã có khá nhiều giống cỏ ngọt được trồng và phát triển trên nhiều vùng trong cảnước, từ các tỉnh phía Bắc như Hà Giang, Cao Bằng, Sơn La, Phú Thọ, Vĩnh Phúc,Hòa Bình, Hà Nội… cho đến các tỉnh phía Nam như Lâm Đồng, Đắc Lắc Tuy nhiên,mới chỉ có rất ít nghiên cứu về thành phần cỏ ngọt, cũng như dinh dưỡng của lá cỏngọt được trồng tại Việt Nam

1.1.2 Mô tả thực vâ ̣t

Thân cỏ ngọt có thể cao tới 1 m dạng thân bụi tròn nhiều lông, mọc thẳng Cỏ ngọtphân nhiều nhánh Thân non màu xanh, già màu tím nâu, có hệ thân mầm phát triểnmạnh Lá mọc đối thành từng cặp hình thập tự, mép lá có răng cưa Lá hầu như khôngcuống, lá trưởng thành dài 3-4 cm, rộng 0.6-1 cm, có 3 gân song song, lá màu xanhlục Cây con gieo từ hạt có 2 lá mầm tròn tới cặp lá thứ tư mới có răng cưa ở mép lá Toàn thân có vị ngọt, nhiều nhất ở lá Lá già ở dưới thấp chứa nhiều chất ngọt hơn lánon ở phía trên cao, lá chết khô ở dưới nhưng cuống rất dai nên không rụng (vẫn còn

vị ngọt)

Hoa tự, nhóm dày đặc trên đế hoa, trong đó có 4-7 hoa đơn lưỡng tính Mỗi hoa đơnhình chùy có cấu trúc gồm một đế hoa với 5 đài màu xanh, 5 cánh tràng màu trắngkhoảng 5 mm, các lá bắc tiêu giảm, nhị 4-5 dính trên tràng có màu vàng sáng, các chỉnhị rời còn bao phấn dính mép với nhau Bầu hạ 1 ô, 1 noãn, vòi nhụy mảnh chẻ đôi,các nhánh hình chỉ cao hơn bao phấn do đó mà khả năng tự thụ phấn thấp hoặc không

có Quả và hạt nhỏ, thuộc loại quả bế, khi chín màu nâu sẫm Hạt có 2 vỏ hạt, có phôi,nhưng nội nhũ trần do vậy tỉ lệ này mầm thấp

Rễ của cây gieo từ hạt ít phát triển hơn so với cành giâm Hệ rễ chùm lan rộng ởđường kính 40 cm và có độ sâu từ 20 – 30 cm, hệ rễ phát triển tốt trong điều kiện đấttơi xốp, đủ ẩm Là cây lâu năm có thân rễ khỏe, mọc nông từ 0–30 cm tùy thuộc vào

độ phì nhiêu, tơi xốp và mực nước ngầm của đất[4]

Hạt cỏ ngọt có sức sống kém, tỷ lệ nảy mầm thấp nên cần chọn đất màu mỡ, dễ thấmnước và thoát nước, kín gió và tưới tiêu thuận lợi, được thu hoạch khi đạt độ cao 1mhoặc hơn[5] Cỏ ngọt là cây lâu năm, có thể được thu hoạch trong 8 năm mỗi năm 6 lầnthu, khối lượng lá thu được khác nhau từ 15 tới 30 g/cây[6] Cỏ ngọt chịu được lạnhkhông thấp hơn 9 oC Tốc độ phát triển nhanh nhất ở nhiệt độ 20-24oC[7].

Ở nước ta cỏ ngọt sinh trưởng quanh năm, nhưng cho thu hoạch cao nhất từ tháng 4đến tháng 11 dương lịch (trừ 3 tháng rét nhất là tháng 12, tháng 1 và tháng 2 ở phíaBắc) Bởi vậy cỏ ngọt nên được trồng vào tháng 4 đến tháng 9, nhưng để có thu hoạchcao ngay từ những năm đầu nên trồng vào tháng 4 và 5 Dương lịch, trong điều kiện đấtđai cho phép có thể trồng từ tháng 2-3, nhưng thời gian đầu cây sinh trưởng kém vàthu hoạch thấp, chậm

Hiện nay trên thế giới và tại Việt Nam, lượng tiêu thụ cỏ ngọt là rất lớn Vì vậy, ta cầnquan tâm đến những yếu tố ảnh hưởng đến việc trồng cỏ ngọt để cho năng suất cao,hàm lượng chất ngọt nhiều Tác giả Nguyễn Văn Tý và nhiều cộng sự[8] đã có nhiềunghiên cứu ảnh hưởng nồng độ dung dịch đồng sulfat đến một số chỉ tiêu sinh lý, sinhhóa và năng suất cỏ ngọt trồng trên đất vườn đồi Bắc Thái Sau đó cũng chính tác giảNguyễn Văn Tý đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ acid boric đến sinh trưởng vàhàm lượng stevioside của cây cỏ ngọt trồng trên đất Trung Du Việt Bắc

1.1.3 Bảo quản

Phần lá sau khi thu hoạch đem rửa sạch, phơi nắng hoặc sấy thông gió cho đến khikhô Sau khi phơi 1 – 2 ngày thì tuốt lá và bảo quản lá khô trong túi nilông để tránhhút ẩm Bảo quản trong nơi khô mát, hàm lượng nước trong lá khô dưới 10%, tạp chấtdưới 5%

Trong thời kỳ có mưa phải sấy bằng máy hoặc là sấy ở 30oC trong 24h Trong quátrình phơi sấy phải đảo nhẹ và không xếp lớp

Để sản phẩm lá khô có chất lượng cao, cần đảm bảo các đặc điểm cơ bản sau:

 Hình dáng bên ngoài: Lá khô có 1 phần cành ngọn

 Màu sắc: Nguyên liệu có màu xanh tự nhiên

 Mùi: Có mùi cỏ khô và mùi thơm đặc trưng của cỏ ngọt

 Độ ẩm: <12%

 Tạp chất: không có lá mốc và đen, các tạp chất khác nhỏ hơn 5%[9]

1.1.4 Thành phần hóa học

Cây cỏ ngọt (chủ yếu là lá) chứa những diterpene glycoside đă ̣c biê ̣t, tạo ra vị ngọtnhưng không tạo ra hay tạo ra rất ít năng lượng Steviol glycoside, tên gọi chung chocác diterpene glycoside ngọt chiết xuất từ cỏ ngọt, là một hứa hẹn tái tạo những thứthực phẩm sống mới trên thị trường thế giới và thực vật không calorie, vị ngọt tự nhiên

có thể được sử dụng như một loại đường thay thế hoặc thay thế cho các chất làm ngọtnhân tạo [10]

Hiện nay, cỏ ngọt được biết nhiều đến về nồng độ diterpene ngọt cao khoảng 5-20%khối lượng lá khô [11], khoảng 0.9-1% khối lượng trong hoa[12] Trong 240 loài thuộc

chi Stevia, chỉ có loài rebaudiana và phlebophylla chứa các steviol glycoside [13].Những hợp chất ngọt trong lá cỏ ngọt là nhóm các dẫn xuất diterpene glycoside, ngàynay đã ghi nhận hơn 30 chất trong tài liệu khoa học [14] Hợp chất chính trong lá cỏngọt là stevioside (4-13% khối lượng lá khô), và tiếp theo có nhiều nhất làrebaudioside A (2-4%) Một số steviol glycoside khác như dulcoside A (0.3%),rebaudioside B, C (1-2%), D và F và steviolbioside cũng được xác định nhưng nồng

độ thấp [15] Các glycoside tìm thấy chủ yếu trong lá của cây, nồng độ lên đến 15% ,tùy thuộc vào giống [16] Nồng độ của các glycoside ngọt trong lá cỏ ngọt các nguồnkhác nhau không giống nhau, nhiều nghiên cứu [17] cho thấy nồng độ của nó phụ thuộcvào điều kiện phát triển [18], cũng như về việc áp dụng các kỹ thuật nông học hiện đại

[19, 20] Đa số các giống cỏ ngọt đều chứa lượng rebaudioside A ít hơn nhiều so vớistevioside [18] Ở Viê ̣t Nam đã có vài nghiên cứu về nồng đô ̣ steviol glycoside trong cây

cỏ ngọt Viê ̣t Nam Năm 2001, Nguyễn Kim Cẩn và Lê Nguyệt Nga đã định lượngstevioside trong lá cỏ ngọt khô là từ 3% đến 6% Năm 2009, Phạm Thành Lộc và LêNgọc Thạch cũng đã xác được định hàm lượng stevioside trong lá cỏ ngọt khô là3,38% Năm 2014, Trương Hương Lan đã xác định hàm lượng stevioside trong cácgiống cỏ ngọt của nước ta dao đô ̣ng từ 2,13% đến 7,72% và rebaudioside A thay đổi từ2,05% đến 9,32%, trong đó lá cỏ ngọt S77 của Viê ̣t Nam có hàm lượng steviolglycoside lớn nhất 11,53%[21]

Tuy nhiên, cũng có một số công bố của các bằng sáng chế nước ngoài cho thấy một sốgiống cỏ ngọt có hàm lượng rebaudioside A lớn hơn stevioside Các giống cỏ ngọt này

đã được sử dụng để sản xuất rebaudioside A tinh khiết phục vụ cho chế biến một sốloại thực phẩm phẩm và đồ uống Chiết xuất tinh khiết lấy từ lá cỏ ngọt và được cungcấp trên thị trường có chứa chủ yếu là stevioside (> 80%) hoặc rebaudioside A (>90%) [22]

Tất cả các glycosides diterpene phân lập từ lá cỏ ngọt có cùng khung steviol (Hình 1.)

và chủ yếu khác nhau về gốc carbohydrate (R1 và R2), mono-, di-, và trisaccharide cóchứa glucose (C6H12O6) và / hoặc rhamnose (C6H12O5) và/ hoă ̣c xylose (C5H10O5) tạicác vị trí C13 và C19 [23]

Bảng 1.1 Cấu tạo của một số glycoside chủ yếu trong lá cỏ ngọt Glc, Xyl, and

Rha tương ứng với glucose, xylose, and rhamnose [19]

|

β-Glc(3→1)Rebaudioside E β-Glc-β-Glc(2→1) β-Glc-β-Glc(2→1)

|

β-Glc(3→1)

Tích chất hóa lý

Vị ngọt của steviol glycoside tăng với sự gia tăng số lượng các đơn vị đường gắn vớisteviol aglycone Tuy nhiên, nồng độ của chúng trong nguyên liệu thực vật giảm cùngmột lúc [24] Stevioside tinh khiết thường tạo ra một dư vị đắng đáng kể [25].Rebaudioside A có thêm một đơn vị glucose so với stevioside, cả độ ngọt và chất

lượng của hương vị đều tốt hơn, là chất duy nhất trong cỏ ngọt không có dư vị đắngkhi sử dụng [17]

Vị ngọt của bất kỳ hợp chất steviol glycoside đều lớn hơn so với saccharose:stevioside (250-300 lần), rebaudioside A (250-450 lần); rebaudioside B (300-350 lần);rebaudioside C (50-120 lần); rebaudioside D (250-450 lần); rebaudioside E (150-300lần); dulcoside A (50-120 lần); và steviolbioside (100-125 lần) Tính trung bình, vịngọt của các hợp chất steviol glycoside lớn 250-300 lần so với đường saccharose

Bảng 1.2 Tính chất vâ ̣t lý của các hợp chất steviol glycoside trong cỏ ngọt[26]

phân tử Nhiê ̣t đô ̣ nóngchảy (oC) Đô ̣ tan trongnước (%)

xảy ra ở mức độ pH lớn hơn 9 dưới điều kiện tương tự hay nhiê ̣t đô ̣ quá 140oC ở điềukiê ̣n tương tự [17]

Ngoài ra, cỏ ngọt còn chứa các hợp chất khác như sterol (stigmasterol, sitosterol,campesteol), flavonoid (Apigenin 4'-O-glucoside, Kampferol 3-O-rhamnoside,Luteolin 7-O-glucoside, 5,7,3'-Trihydroxy 3,6,4'-trimethoxyflavone), sterebin,cosmosiin, chất dễ bốc hơi caryophyllenm spathuienol, chlorophyll A, triterpenoid.Tannin, carotennoid, protein, xơ, cacbonhydrate, rutin… cũng tìm thấy trong cỏ ngọtvới hàm lượng thấp Và một số thành phần vi lượng như phosphorus, sắt, canxi, kali,magie, kẽm,mangan,… vitamin A, vitamin B2, vitamin C và axit folic cũng tồn tạitrong cây cỏ ngọt[26]

1.1.5 Tác dụng dược lý

Khả năng kháng khuẩn, kháng nấm

Nhiều nghiên cứu cho thấy lá cây cỏ và chiết xuất callus có thể là một ứng cử viên lýtưởng để nghiên cứu sâu hơn về sử dụng của chúng trong việc bảo quản thực phẩm vàdược phẩm do các chất chống oxy hoá và các hoạt động kháng khuẩn[30]

Dịch chiết cỏ ngọt có tính chất ức chế rotavirus[31], chống vi khuẩn Helicobacter

ngọt có thể dùng để uống giảm hay chữa viêm tế bào[33] Những người bị bệnh đáiđường không những có thể dùng stevioside mà chất này có khả năng hạ đường trongmáu[34], giảm huyết áp trên chuột[35], trên chó[36] Cũng ở trên chuột, nó ức chế sự pháttriển ung thư trên da Cho trộn trong thuốc đánh răng, nó có tác dụng lên vi

khuẩn Streptococcus mutans kết dính lên răng và cấu thành các mảng răng[37-39] Nó đãđược dùng làm thuốc kích thích tóc mọc[40, 41], khử dioxin trong đất[42, 43] Lá và cành cótính chất chống histamin nên có thể dùng để kiềm chế những triệu chứng như ngứangáy, đau đớn[44]

Khả năng kháng oxi hóa

Dịch chiết cỏ ngọt có khả năng kháng oxi hóa cao Khả năng kháng oxi hóa của dịchchiết cỏ ngọt được cho là khử các eletron tự do và superoxide[45] Mô ̣t nghiên cứu in

vitro năm 2009, chỉ ra rằng dịch chiết ethanol lá cỏ ngọt có tiềm năng được sử dụng

như mô ̣t chất kháng oxi hóa tự nhiên[46]

Độc tính [47]

 Nhiều thí nghiệm tiến hành cho chuột uống stevioside hoặc rebaudioside A tớiliều 2g/kg vẫn không thấy biểu hiện độc tính hay những sai lệch về trọng lượng

cơ thể, cũng như các phủ tạng sau 2 tuần theo dõi

 Những thí nghiệm ở Nhật và Hàn Quốc cho thấy những chỉ tiêu cân nặng, huyếthọc, sinh học và xét nghiệm tế bào mô học gan đều tỏ ra bình thường sau 56ngày cho chuột ăn 0.25 hoặc 0.5g stevioside

 Độc tính với thận: Năm 1988, Panichkul T thực nghiệm trên chuột, đã thôngbáo stevioside có thể gây độc với thận, làm tăng urê và creatinin huyết thanhkhi cho quá liều, gây bại niệu, natri niệu và làm ức chế sự vâ ̣n chuyển para-aminohippurate (PAH) trong ống gần thâ ̣n[48-50]

 Theo GS Ryan Huxtable- đại học University of Arizona, Tuscon - cho biếtstevioside có thể ảnh hưởng đến hoạt động của chức năng sinh dục, như làmgiảm số lượng tinh trùng ở chuột đực, giảm kích thước tinh nang hoặc có thểdẫn đấn tình trạng vô sinh

Nhưng trong những thí nghiệm này người ta đã sử dụng những liều lượng steviosidekhổng lồ, thực tế hằng ngày chúng ta chỉ sử dụng những liều lượng stevioside rất thấp

xa so với những liều lượng đã dùng để thí nghiệm ở trên

Một số đánh giá an toàn của stevioside và chiết xuất cỏ ngọt đã được thực hiện để xácđịnh mức độ độc tính, gây đột biến, gây ung thư, độc tính di truyền và các vấn đề sinhsản, tất cả đều được tìm thấy là âm tính[51-55] Các kết quả này khẳng định rằngstevioside và các glycosid khác có trong chiết xuất Stevia có khả năng an toàn đối vớingười tiêu dùng và không ngụ ý bất kỳ mối nguy hiểm nào về sức khoẻ khi sử dụnglâu dài

1.1.6 Ứng dụng

Từ những năm đầu của thế kỷ 20, người dân Paraguay đã biết dùng cỏ ngọt như mộtloại nước giải khát, cho đến những năm 1960, việc trồng thương mại bắt đầu ởParaguay và Nhật Bản, và sau đó ở các nước khác Stevioside và rebaudioside A là

chất chiết xuất từ lá cỏ ngọt hiện nay được sử dụng rộng rãi ở Nhật Bản, Hàn Quốc,Trung Quốc, Đông Nam Á và Nam Mỹ, như chất làm ngọt trong nhiều loại thực phẩm.

Kể từ khi có sự chấp thuận của chất làm ngọt Stevia ở Hoa Kỳ bởi FDA và EU năm

2008, lợi ích công nghiệp của cỏ ngọt đã tăng lên nhanh chóng[56, 57]

Năm 2008, Joint Expert Committee on Food Additives (JECFA) đã phát hiê ̣n và phảnhồi yêu cầu của European Commission về European Food Safety Authority (EFSA) đểđưa ra những quan điểm khoa học về đô ̣ an toàn của steviol glycoside, chất ngọt được

sử dụng trong thực phẩm Sau khi xem xét tất cả các dữ liê ̣u về đô ̣ ổn định, các sảnphẩm xuống cấp, quá trình trao đổi chất và đô ̣c tính, EFSA đã thành lâ ̣p ADI cho cáchợp chất steviol glycoside có đô ̣ tinh khiết 95% là 4 mg/kg bw/day Năm 2009,JECFA đã sửa đổi cho phép rebaudioside D và F được sử dụng như là mô ̣t phần củahỗn hợp steviol glycoside với đô ̣ tinh khiết  95% và điều này đã được EFSA phêduyê ̣t

Năm 2008, FDA đã xem xét các dữ liê ̣u về steviol glycoside và tham khảo ý kiến từcác cơ quan có thẩm quyền như JECFA và Viê ̣n hàn lâm khoa học quốc gia đã chấpnhâ ̣n hỗn hợp steviol glycoside có đô ̣ tinh khiết cao  95% được sản xuất phù hợp vớiFDA Good Manufacturing Practices được sử dụng trong thực phẩm với lượng ADInhư JECFA đưa ra.[58]

Cỏ ngọt được dùng như một loại trà dành cho những người bị tiểu đường, béo phì haycao huyết áp Trong công nghiệp thực phẩm, cỏ ngọt dùng để pha chế làm tăng độngọt mà không làm tăng năng lượng của thực phẩm Ngoài ra, cỏ ngọt còn được dùngtrong dược phẩm, mỹ phẩm như sữa làm mượt tóc, kem làm mềm da

1.2 Các công trình nghiên cứu tách chiết cỏ ngọt

1.2.1 Nghiên cứu trong nước

1.2.1.1 Phương pháp chiết và tinh chế

Ở Việt Nam chỉ mới đưa ra quy trình chiết và cô lập stevioside trong phạm vi phòngthí nghiệm, chưa ứng dụng được vào sản xuất Đây là quy trình được đưa ra bởi cáctác giả ở Viện dược liệu năm 2006

- Ethanol 80o, hồi lưu 30 phút, 60OC.

- Cô quay loại dung môi

- Lắc với ether dầu hoả

Hình 1.3 Quy trình chiết tách chất ngọt từ cỏ ngọt ở Việt Nam [59]

Cỏ ngọt khô được chiết hồi lưu 4 lần mỗi lần 30 phút bằng ethanol 80% ở 60oC Tâ ̣ptrung dịch chiết, cô quay chân không để thu hồi dung môi ethanol cho tới khi dịch cô

đă ̣c hu được cắn Thêm khoảng 20% nước cất nóng so với lượng dịch ban đầu, tạothành dịch sê ̣t Loại lipid bằng ether dầu hỏa Dịch sau khi đã loại bỏ lipid đưa đichưng cách thủy để tách ether dầu hỏa Lắc dịch chiết với n-butanol bão hòa nước, chođến khi dịch nước không còn stevioside nữa Cất thu hồi n-butanol và cô đă ̣c Cuốicùng, kết tinh lại nhiều lần trong methanol thu được stevioside tinh khiết

Chế phẩm Stevioside

Stevioside thô

Pha nướcPha BuOH

Pha nướcDịch sệt

Cắn

Bã Dịch chiết

Lá cành nhỏ

Pha ether dầu

Ưu điểm:

 Stevioside thu được tương đối tinh khiết

Nhược điểm:

 Lượng stevioside thu được ít, dễ ngã màu trong không khí

 Dung môi sử dụng tinh chế đắt tiền, tương đối đô ̣c hại

 Quy trình tốn nhiều thời gian, phức tạp

- Ngâm với nước cất (tỉ lê ̣ 25:30 g:ml)

- Sắc ký cô ̣t với silicagel

- Hê ̣ giải ly chloroform vàmethanol với đô ̣ phâncực tăng dần

- Trung hòa tới pH=7

- Chiết với n-butanol

- Loại hết dung môi

- Hòa tan trong MeOH nóng

- Làm lạnh 0-5oC , kết tinh

Theo Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Tôn Nữ Liên Hương và đồng nghiê ̣p

đã đưa ra 2 phương pháp chiết tách và tinh chế stevioside từ cỏ ngọt[60]

Hình 1.4 Quy trình chiết tách stevioside từ cỏ ngọt

Chiết cỏ ngọt với nước 2 lần mỗi lần trong 2 giờ ở 65oC Lọc dịch chiết, đuổi bớt dungmôi còn khoảng 20% dịch so với ban đầu.

Cách 1: Dịch chiết được acid hóa bằng citric acid đến pH gần bằng 3, khuấy nhẹ dungdịch trong 30 phút Dung dịch sau khi acid hóa lọc qua cô ̣t celite Dung dịch sau lọcđược kiểm hóa bằng calcium hydroxide tới pH 10.5 ở 50oC, khuấy đều trong 1 giờ.Lọc dịch qua cô ̣t celite Trung hòa dịch tới pH 7 bằng citric acid Cô quay dung dịchloại bớt nước Chiết lỏng lỏng với n-butanol để loại phần tạp còn lại, thu lấy lớp n-butanol, cô quay loại hoàn toàn dung môi Kết tinh trong methanol, làm lạnh 0-5oC và

để qua đêm, thu lấy tinh thể

Cách 2: Tiến hành sắc ký cô ̣t (SKC), sử dụng chất hấp phụ là silicagel Giải ly cô ̣t sắc

ký lần lượt với các hê ̣ dung môi là những hỗn hợp chloroform và methanol với đô ̣phân cực tăng dần Theo dõi quá trình SKC bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM), với hệ

dung môi giải ly là n–butanol:nước:acid acetic = 4:5:1 (v/v), hiện vết với dung dịch acid sulfuric:methanol = 1:10 (v/v), sấy bản mỏng ở 110C trong 2 phút Thu phân

đoạn cao chứa stevioside và tiếp tục sắc ký cột rồi kết tinh lại trong dung môi thíchhợp để thu được stevioside tinh khiết

Kiểm tra độ tinh khiết của stevioside : Dùng SKLM, hệ giải ly: n-butanol:nước:acid acetic tỉ lệ 4:5:1 (v/v).

Ưu điểm

 Cách 1 dung môi tương đối không đô ̣c hại, trừ methanol;

 Quy trình đơn giản, ít tốn thời gian

Nhược điểm

 Hiê ̣u suất chiết không cao;

 Cách 2 khó ứng dụng vào quy mô công nghiê ̣p

1.2.1.2 Phương pháp định lượng

Tất cả các bài báo nghiên cứu về thành phần và hàm lượng steviol glycoside trong cỏngọt ở nước ta đều dùng phương pháp định lượng bằng HPLC Theo bài báo củaTrương Hương Lan và đồng nghiê ̣p, điều kiê ̣n chạy HPLC của dịch chiết nước cỏ ngọtban đầu như sau[21]:

 Cô ̣t sắc ký: Supelco LC-NH2 250x4.6mm, 5

 Pha đô ̣ng: acetonitrile:nước tỉ lê ̣ 10:30

 Tốc đô ̣ dòng: 1.5 mL/phút

 Nhiê ̣t đô ̣ buồng cô ̣t: 30oC

 Đầu dò: PDA 2996 ở bước sóng 210nm

1.2.2 Nghiên cứu nước ngoài

1.2.2.1 Các nghiên cứu về phương pháp tách chiết và tinh chế các hợp chất steviol glycoside

Các kỹ thuật được sử dụng để thu được steviol glycoside có thể phân loại vào nhữnghạng mục khác nhau, như dựa trên chiết dung môi [61, 62], hấp phụ sắc ký [63-66],trao đổiion [67-69], kết tủa chọn lọc [70], phương pháp màng [67, 68, 71] và các chất lỏng siêu tới hạn

[72]

Hầu hết các quy trình chế biến cỏ ngọt được tiến hành ở Trung Quốc, Nhâ ̣t Bản, HànQuốc, Brazil hoă ̣c Paraguay Quy trình chiết steviol glycoside từ lá cỏ ngọt phổ biếnnhất bao gồm các bước sau:

 Ngâm lá trong nược ấm/nóng để hòa tan steviol glycoside

 Lọc với chất trợ lọc, lấy dịch lọc

 Loại dung môi bằng bay hơi chân không

 Sử dụng nhựa trao đổi để thu được các phân đoạn steviol glycoside có nồng đô ̣cao

 Tinh chế trao đổi ion (đôi khi)

 Bay hơi và sấy phun hoă ̣c, ít phổ biến hơn, kết tinh để tạo bô ̣t/tinh thể

Mô ̣t số chế biến thứ cấp được thực hiê ̣n tại Nhâ ̣t để cải thiê ̣n chất lượng hương vị Quytrình trên giống với quy trình chiết đường thô từ mía[26]

Phương pháp chiết dung môi

Dung môi hữu cơ thường được sử dụng để chiết xuất hợp chất tự nhiên từ thực vật, dotính chọn lọc của chúng đối với các thành phần hữu cơ Các dung môi hòa lẫn vàonước, methanol, chloroform, n-butanol, ethanol và rượu béo đã được sử dụng để chiết

xuất stevioside từ lá cỏ ngọt (Fumio 1980[73], Jackson và cộng sự, 2006[74]; Pol vàShigeji 1980[75], Tadaaki 1976[76], Tadashi và Masato 1995[77], Toyoshige và Usei

2002[78]) Stevioside và rebaudioside A được tinh chế thêm bởi quá trình kết tinh và kếttinh lại từ dung môi Tuy nhiên, nhược điểm chính của các phương pháp này là sửdụng các hóa chất độc hại có hại cho sức khoẻ Vì vậy, đa số các nghiên cứu sử dụngnước như một dung môi để chiết Việc sử dụng nước và methanol làm phương tiệnchiết xuất trong điều kiện áp suất được nghiên cứu bởi Pol (2007)[75]

Trong một nghiên cứu, Chhaya[79] đã sử dụng cách tiếp cận có hệ thống để đánh giácác điều kiện tối ưu cho việc chiết xuất stevioside từ lá cỏ ngọt bằng phương phápphản ứng bề mặt Các điều kiện tối ưu để chiết là:

Phương pháp chiết siêu âm

Chiết stevioside bằng phương pháp này đầu tiên do Jaunak và cô ̣ng sự (2009) Họ đãtiến hành chiết bột lá cỏ ngọt sử dụng các dung môi khác nhau (nước, methanol,ethanol, hỗn hợp nhị phân của methanol-nước và ethanol-nước) trong một bồn siêu âm

ở 35°C trong 30 phút Dịch chiết được lọc và sấy khô thành bột (ở 50°C) Hàm lượng4,2% đối với stevioside và 2,0% đối với rebaudioside A đối với hỗn hợp methanol-nước (80: 20) gần như tương đương với kết quả thu được bằng phương pháp thôngthường (sử dụng methanol-nước làm dung môi với thời gian 12 giờ), tức là 6,04%stevioside và 1,2% rebaudioside A[26]

Bằng sáng chế Trung Quốc (Ruihua và cộng sự, 2010)[80] cũng mô tả sự hỗ trợ siêu âmtrong quá trình chiết xuất lá cỏ ngọt Bột stevioside 85-98% được sản xuất bằng cách

sử dụng các phương pháp khác nhau (keo tụ, lọc, hấp thụ, khử màu, cô đă ̣c và sấyphun) sau khi chiết siêu âm

Phương pháp chiết bằng vi sóng

Một số lợi thế chiết xuất bằng vi sóng (MAE) giúp nó cạnh tranh với các quy trìnhthông thường khác Đây là những phương pháp tách nhanh hơn, giảm sử dụng dungmôi và tinh chế nhanh hơn MAE của stevioside và rebaudioside A lần đầu tiên đượcbáo cáo bởi Jaitak et al (2009)[81] Trong nghiên cứu này, việc chiết xuất lá cỏ ngọtbằng nước, methanol, ethanol và hỗn hợp nhị phân methanol-nước và etanol-nướcđược tiến hành với sự hiện diện của lò vi sóng ở các mức công suất khác nhau trongkhoảng từ 20 đến 160W với thời gian chiết 30 giây đến 5 giây ở nhiệt độ 10-90°C Kếtluận rằng sản lượng stevioside (8,64%) và rebaudioside A (2,34%) cao hơn so vớiphương pháp truyền thống (6,54% và 1,20%) Công suất 80W, 50°C và thời gian 1phút cho kết quả tối ưu Dung môi nước:methanol (80:20) là môi trường chiết tốt nhấtvới sự hỗ trợ vi sóng mức tới mức cao nhất

Phương pháp tinh chế bằng các chất tạo phức:

Để khắc phục việc sử dụng các hoá chất độc hại và thiết bị chậm, chuyên dụng và đắttiền như sắc ký và trao đổi ion, các chất tạo phức đôi khi được sử dụng để loại cácthành phần không mong muốn / tạo thành phức hợp với các chất này, dẫn đến sự loại

bỏ dễ dàng hơn

Kumar (1986)[70] đã đề xuất một quy trình chiết stevioside có sử dụng chất tạo phức.Trong đó lá đã được nghiền nhỏ thành kích thước mong muốn và được chiết xuất vớinước nóng ở 60-80°C trong 2-5 giờ Dịch chiết nước được cho tạo phức với axitcarboxylic, chẳng hạn như axit citric, để loại bỏ vật liệu kim loại, protein hoặc màu tạothành ở khoảng pH 2-4 Hỗn hợp được khuấy khoảng 1-2 giờ ở nhiệt độ 30-80°C vàlọc qua celite (chất trợ lọc) Độ pH của dung dịch kết quả tăng lên 10-13 bằng cách sửdụng canxi oxit hoặc canxi hydroxit, được đun nóng trong khoảng từ 35-80oC trong 1-

2 giờ và làm lạnh đến nhiệt độ phòng với sự khuấy chậm Dung dịch này được lọc lạibằng diatomit để loại bỏ các prôtêin, chất màu,… Các dung dịch đã được khử màu sau

đó được trung hòa bằng axit cacboxylic hữu cơ như axit citric Dịch lọc chiết với dungmôi như n-butanol bão hòa Lớp nước sau đó được làm lạnh đến 5-12°C trong 8-14 giờ

để lấy tinh thể stevioside đem lọc và sấy khô Hiê ̣u suất của quá trình là 7.5%

Năm 1990, Giovanetto[68] trong mô ̣t nghiên cứu về quy trình chiết cỏ ngọt đã sử dụngcanxi hydroxit cho vào dịch chiết nước để tạo tủa loại bỏ các hợp chất không mongmuốn.

Deji (2009) đã phát minh ra một phương pháp cải tiến để chiết xuất stevioside baogồm các bước sau:

 Chiết hoàn lưu với nước

 Keo tụ bằng đất sét biến tính

 Vi lọc

 Hấp thụ bằng nhựa ADS-4 và -7

 Dịch giải ly được cô đă ̣c bằng cô quay chân không

Những thuận lợi của quá trình này là: tốc độ nhanh và đô ̣ tinh khiết cao (lên đến 90%);các vật liệu nhạy nhiệt không bị phá hủy; Thông lượng cao, và có thể được thực hiệnmột quá trình liên tục

Weiping và Zhou (1999)[82] mô tả một quy trình để chiết xuất các STEVIOLGLYCOSIDE:

 Chiết cỏ ngọt trong nước nóng hoặc dung dịch ethanol trong 1-3 giờ

 Dịch chiết được trô ̣n với một dung dịch bão hoà của canxi hoặc nhôm hydroxyd

và trộn đều trong 1-3h, kết tủa các chất không mong muốn

 Dịch lọc cho qua một cột hấp phụ trung tính, nó hấp thụ các glycosid

 Giải ly cô ̣t bằng dung dịch ethanol để làm sạch các glycosid

 Dịch giải ly bằng ethanol được cho qua cột kiềm thứ hai, nơi các chất khôngmong muốn được hấp phụ, thu được dung dịch ethanol với glycosid tinh khiết

 Sau đó, dung dịch được sấy phun hoặc cô quay bằng chân không ở 50°C và thuđược bột rắn, khoảng 80% độ tinh khiết

Abelyan và cộng sự (2010)[83] đã phát minh ra một phương pháp để trích xuấtstevioside và rebaudioside A độ tinh khiết cao từ nhà máy:

 Chiết cỏ ngọt với nước ở 50-60 ° C trong khoảng 1-6 giờ

 Tăng hiê ̣u suất chiết bằng cách bổ sung enzym pectinase (2g / L)

 Dịch lọc được kết tủa bằng canxi hydroxit ở khoảng 50°C trong khoảng 1 giờđến pH khoảng 10,0 và làm mát đến nhiệt độ môi trường xung quanh

 Keo tụ dung dịch với bentonit (2-3 g / l)

 Dịch lọc trô ̣n với ethanol ở khoảng 50°C trong khoảng 30 phút); Tủa đã đượcloại ra và bột chứa khoảng 84% rebaudioside A

 Dịch thu được cho qua một cô ̣t nhựa trao đổi ion sau khi đó bay hơi ethanol, côđặc và làm khô Cắn thu được chứa stevioside tinh khiết 93%

Một loạt các bằng sáng chế của Nhật Bản có sẵn để sử dụng các chất tạo phức khácnhau để tinh chế chiết xuất cỏ ngọt Một số trong đó bao gồm việc sử dụng thiếcchloride, thiếc sulfate, axit stannic,…, các muối Ca và Fe khác nhau (Shinichi và cộng

sự, 1980[84]), và sử dụng CaCl2 và Ca(OH)2 (Kotaro Và Tokuo 1987[85], Taku và Yukio

1983[86], Yukio và cộng sự, 1983[87])

Phương pháp trao đổi ion:

Trao đổi ion là một quá trình trong đó tạp chất tích điện âm và nó được loại bỏ khỏidòng nước bằng các chất nhựa tích điện dương[88] Năm 1973, Persinos[89] đã nộp mộtbằng sáng chế về sản xuất stevioside từ nhà máy Stevia Cây và lá đã được sấy khô vànghiền nhỏ trộn với canxi cacbonat và nước và hỗn hợp được giữ ở nhiệt độ phòngtrong khoảng 20 giờ Sau đó, chất cặn được lọc, sau đó cô quay loại bớt dung môi vàquy trình được lặp lại hai lần Dịch lọc được trộn với Amberlite IR-120 nhựa trao đổiion Chất kết tủa gồm nhựa đã được lọc Dịch lọc được khử ion bằng cách cho qua hai

cô ̣t nhựa trao đổi ion (Amberlite IR-120(+) và Duolite A4 (-)) Tâ ̣p trung dịch qua cô ̣t

để qua đêm ở 50°C Cô dịch thu được cắn, sau đó hòa tan trong methanol và làm lạnhđến 5°C để có được tinh thể stevioside Tăng đô ̣ tinh khiết bằng cách kết tinh lại nhiềulần

Năm 1987, Adduci[90] báo cáo cách chiết stevioside bằng ba bước chính: trích nướcnóng và sự khử màu bằng điện phân và sau đó trao đổi ion Độ tinh khiết củastevioside đạt được 70-80% và năng suất khoảng 10% Nhiệt độ chiết nước là 90-100°C Điện phân được thực hiện bằng cách sử dụng dòng điện dòng 30 Ampe trong 2giờ bằng cách bổ sung 0,02M HCl / lít dịch chiết Lọc hỗn hợp và điện phân lần thứhai được thực hiện trong khoảng 20-30 phút theo các điều kiện hoạt động ở trên Sau

khi lọc thu được dung dịch có màu vàng, sau đó cho dịch qua một cột nhựa trao đổiion hỗn hợp bao gồm Amberlite MB-1 (Amberlite IR-120 (+) và Amberlite IRA-401(-)) Trong dịch đi ra, có một dung dịch trong suốt với độ dẫn điện nhỏ hơn 50 S/m.Cắn thu được sau khi cô quay dung dịch đó không có vị hâ ̣u, có thể kết luâ ̣n đó làrebaudioside A.

Bằng sáng chế Hàn Quốc[91] có một phương pháp trong đó dịch chiết được cho qua cô ̣tnhựa trao đổi ion tích điện dương (Diaion SKIB) và sau đó cho qua cô ̣t nhựa tích điện

âm (Amberlite IRA-904) Trong phương pháp này, thu được mô ̣t hỗn hợp các steviolglycoside Một quy trình được cấp bằng sáng chế của cùng một công ty bao gồm việc

xử lý dịch chiết nước với canxi clorua và sau đó đi qua cô ̣t nhựa phân cực vừaAmberlite XAD-7 Giải ly cô ̣t bằng methanol và được tinh chế bằng sắc ký cột.Stevioside được tinh chế tiếp bằng cách kết tinh với methanol Tuy nhiên, trongphương pháp này, cả hóa chất, canxi clorua và methanol, đều độc hại Phép sắc ký cộtcũng không khả thi về mặt thương mại Trong một bằng sáng chế khác[92], chiết xuấtnước đã được xử lý bằng nhựa anion thì stevioside thu được có độ tinh khiết thấp.Trong các bằng sáng chế khác ở Nhâ ̣t Bản, tinh chế stevioside bằng nhựa trao đổi ionkhông cần thiết (Toyoshige 1984)

Năm 1990, Giovanetto[68] công bố một phương pháp, trong đó dịch chiết nước được lytâm và sau đó xử lý bằng canxi hydroxit Dịch đã được lọc tủa được tinh chế bằngcách sử dụng nhựa trao đổi ion tích điê ̣n âm (Dowex 50 W và Rohm và Haas IRA 120,

…) và ion tích điê ̣n dương (Dowex WGR, Dowex MWA-1,Rohm và Haas IR4B,…)

Có thể lă ̣p lại nhiều lần, sau đó cô dung dịch thành cắn, chứa 75% stevioside

Năm 1999, Payzant[69] đề xuất một quy trình trao đổi ion hai bước để làm sạch steviolglycoside từ lá cỏ ngọt Tính năng nổi bật của phương pháp này là tách từng steviolglycoside riêng ra khỏi hỗn hợp của chúng Trong bước đầu tiên của phương pháp này,chiết lá cỏ ngọt bằng nước Sau khi chiết, dịch lọc được loại tạp bằng cách tủa vớiCa(OH)2 Tiếp theo, lọc loại tủa rồi cho dịch lọc qua một loạt các loại nhựa trao đổiion để loại bỏ các axit hữu cơ, muối vô cơ, các chất phenol, protein,… Dung dịch thuđược có chứa hỗn hợp 70% steviol glycoside Thu hồi dung môi, thu được bô ̣t khôđược hòa tan trong nước và được đưa đi qua một lớp nhựa Amberlite XAD-7 (nhựakhông phân cực) Steviol glycoside và tạp dầu gây ra vị đắng được hấp thụ trong lớp

nhựa, các glycoside không ngọt và tạp chất carbohydrate không bị hấp phụ Cô ̣t đượcgiải ly bằng dung dịch methanol, sau đó cô quay thu được 95% steviol glycoside Cắnhòa tan vừa đủ với methanol khan, sau đó làm mát thu được kết tinh stevioside, lọc lấytính thể Dịch lọc được đun nóng và làm mát sau đó để cho kết tủa thu đượcrebaudioside A Chất này có thể tinh chế tiếp bằng cách hòa tan với methanol và đưa

nó vào một loạt các bước đun nóng và làm mát để độ tinh khiết cuối cùng củarebaudioside A lên tới 95% Quy trình có ưu điểm:

 Quy trình đơn giản

 Ứng dụng được trong công nghiê ̣p

 Sản phẩm thu được có đô ̣ tinh khiết cao

Tủa với Ca(OH)2

Lọc loại tủa

Cô bớt dịch lọc

>70% hỗn hợp steviolglycoside

Giải ly cô ̣tbằng MeOH

>90% hỗn hợp steviolglycoside

Lọc tủa kết tinh lại nhiều lần thuđược stevioside 95%

 Cô bớt dịch lọc

 Thêm mô ̣t ít nước

Hình 1.5 Quy trình chiết cỏ ngọt theo John Donald Payzant

Năm 2006, Kumar[93] đã phát triển một quy trình sản xuất stevioside từ lá cỏ ngọt.Trong quá trình này, bột nghiền bột của lá Stevia được chiết xuất với nước ở 50-120°Ctrong 0.25-4 giờ dưới áp suất 1-8 bar Chiết xuất sau đó được trộn với calcium

Dịch chiết nước

Dịch lọc

Cột trao đổi ion

Cột nhựa phâncực vừa

Cô bớt dung môi dịch

giải lyLàm lạnh để tủa

Dịch lọc

Kết tủa

Thu được rebaudiosidetinh khiết trên 90%

hydroxide đến pH 9.2 và xuất hiê ̣n tủa Sau đó, lọc tủa và dịch lọc được cho qua cô ̣tnhựa trao đổi cation mạnh, tiếp theo là một nhựa trao đổi anion yếu Dịch thu được làhỗn hợp steviol glycoside hàm lượng 65%.

Năm 2011, Yang và cộng sự[94] đã phát triển một quy trình để thu hồi 99%rebaudioside A tinh khiết 99% từ lá cỏ ngọt Lá được chiết bằng nước hoặc ethanolhoặc một hỗn hợp của hai ở 50-80°C trong khoảng 30 phút dưới áp suất cao trongkhoảng 200-3000MPa Dịch chiết được cô đặc bằng cách bốc hơi ở nhiệt độ cao, lọc

và đi qua mô ̣t lớp nhựa phân cực chọn lọc, steviol glycoside bị hấp thụ Cô ̣t được giải

ly bằng hỗn hợp ethanol-nước thu được hỗn hợp steviol glycoside và rebaudioside Ađược tinh chế bằng cách kết tinh dung dịch giải ly thu được , thu được rebaudioside Atinh khiết 85% Sau đó tiếp tục kết tinh lại nhiều lần cho đến khi rebaudioside A đạt đô ̣tinh khiết 99%

Một phương pháp để đạt được độ tinh khiết cao stevioside và rebaudioside A đã được

đề xuất bởi Purakayastha (2010)[95] và Magomet (2011)[96] Trong phương pháp này, lácây đã được nung nóng ở 45-75°C bằng cách sử dụng nước (tỉ lệ lá:nước từ 1kg: 10 L)trong khoảng 1-6 giờ Dịch chiết lọc được làm nóng đến khoảng 50°C trong 0.5-1.0giờ bằng cách bổ sung canxi hydroxyd lên pH khoảng 10, lọc loại tủa và dung dịchđược trung hòa bằng dung dịch sắt clorua trong khoảng 10-15 phút Dịch thu được choqua cô ̣t celite (một cô ̣t nhựa) để khử ion, và qua ba cô ̣t Amberlite để khử màu Dungdịch được sấy phun và chứa khoảng 65% stevioside và 25% rebaudioside A Cắn hòatan trong methanol (ở 20-25°C trong 0.5-1.0 giờ có khuấy, tỉ lê ̣ cắn:dung môi khoảng1:5 (g:mL)) Làm lạnh để kết tinh, các tinh thể thu được sau lọc và sấy khô, đem phântích khoảng 90% stevioside Dung dịch lọc còn lại được cho bay hết methanol Cắn thuđược hòa tan trong ethanol (tỉ lê ̣ 1:5 (g:mL), ở 40-45 ° C trong khoảng 30 phút, khuấynhẹ) Chất kết tủa được lọc và sấy đạt được khoảng 90% rebaudioside A

Phương pháp tính chế bằng sắc kí và hấp phụ:

Lựa chọn tách một chất từ chất lỏng thường có thể dùng phương pháp hấp phụ Cáchợp chất có tính đă ̣c thù cao có thể được tách một cách chọn lọc bằng các quá trình sắc

ký Sắc ký là một phương pháp phổ biến để phân tách và phân tích các hỗn hợp phứctạp

Năm 2011, Chiang[97] và cộng sự đề xuất phương pháp tách rebaudioside A bằng sắc

ký trong đó hỗn hợp steviol glycoside chứa stevioside (38%), rebaudioside A (42%) vàcác glycoside khác (20%) được hòa tan trong hỗn hợp nước-ethanol Dung dịch đượcđưa qua cô ̣t nhựa với tỷ lệ cụ thể Dịch giải ly chứa 69% rebaudioside A, 31%stevioside và các glycoside khác; 93% tổng số rebaudioside A nạp vào cột đã đượctinh chế Sử dụng cột phát triển, một dòng có chứa stevioside và rebaudioside A cũng

có thể được phân chia

Một bằng sáng chế của Hoa Kỳ (Yang và các cộng sự, 2011)[94] đã tiết lộ một quy trìnhtrong đó rebaudioside A trong cỏ ngọt bằng cách sử dụng nhựa phân cực trong sắc kýcột silica gel và sử dụng dung môi thích hợp Sau đó, thu được tinh thể rebaudiosideA

Năm 2012, Liu và cộng sự[98] đề xuất một phương pháp tách sắc ký giữa hai STEVIOLGLYCOSIDE, stevioside và rebaudioside A Những ưu điểm của phương pháp này là

nó đơn giản, nhanh và hiệu quả về chi phí Việc tách và tách cả hai glycosides đượcthực hiện trong một cột đơn và một bước Một hỗn hợp gồm 41% stevioside và 35,8%rebaudioside A hòa tan trong dung dịch ethanol được đưa lên trên cột sắc ký đặc biệtbao gồm một thành phần đặc biệt của nhựa polyme polymetacrylate / DVB có chứcnăng chịu áp suất cao đến khoảng 1500 psi Cột được rửa bằng áp suất trung bình(dưới 300psi) với dung môi methanolacetone với tốc độ 4-5 mL / phút Các phân đoạncủa stevioside và rebaudioside A được thu thập lại và sau đó kết tinh Lọc tính thể thuđược stevioside và rebaudioside có đô ̣ tinh khiết 98% độ tinh khiết với mỗi chất

Sự hấp phụ chọn lọc trên zeolit X và A đã được nghiên cứu với cỏ ngọt và được báocáo bởi Moraes và Machado (2001)[99] Nghiên cứu này kết luận rằng CaX Zeolite cóhiệu quả hơn trong việc làm rõ sự trích xuất của Stevia trong nước nóng Cả zeolit bột

và hạt đều gần như hiệu quả Các điều kiện điều trị tối ưu là zeolit 40% (g/g), thời gian

tiếp xúc 60 phút ở 30°C Thu được đô ̣ tinh khiết 70% Zeolite tái sử dụng cũng chothấy hiệu suất tương đương Các tác giả cũng tiến hành thí nghiệm cột liên tục chothấy sử dụng tốc độ dòng chảy 30 L/ngày, có thể tinh chế cỏ ngọt bằng cách sử dụngzeolite lên đến khoảng 60% trong 11 giờ.

Năm 2009, Rajab [100] đã phát triển một quy trình gồm hai bước để làm trong và tinhchế dịch chiết Lá cỏ ngọt khô được đun sôi với nước (tỷ lệ lá:nước 1 kg: 5 L) trong 3giờ và lọc dịch chiết xuất Tiếp theo, dịch chiết được xử lý bằng 10% than hoạt tínhtrong 20 phút Dịch chiết được và than hoạt tính được trô ̣n với nước sôi trong 10 phút

và lọc để thu hồi stevioside Lă ̣p lại quá trình này ba lần Trong quá trình này, một sốlượng chlorophyll, phenol và carotenoid đã được loại bỏ Trong bước tiếp theo, dịchchiết vàng được xử lý với 5% celite và khuấy trong 20 phút Ly tâm dịch chiết khôngmàu ở tốc độ 12.000 vòng / phút trong vòng 15 phút và dung dịch nước sạch được thuhồi và lưu trữ Dịch thu được đem sấy khô (nhiệt độ đầu vào 180°C, nhiệt độ đầu ra95°C, áp suất 500 psi) để có bột màu trắng Nồng độ cuối cùng của Stevioside là11,6%

Năm 2002, Rongfu Shi[101] và các đồng nghiê ̣p đã tổng hợp các chất hấp phụ polymebằng cách đưa vào nhóm amoni thành vật liệu hấp phụ nhựa thông thường tinh chế cáchợp chất steviol glycoside Kết quả của thí nghiệm đã kết luận rằng khả năng hấp phụcác hợp chất steviol glycoside giảm và hiệu quả khử màu tăng vì nồng độ của nhómamoni bậc bốn trong chất hấp phụ tăng Cơ chế hấp phụ và khử màu cũng đã được đềxuất[101]

Mô ̣t số phương pháp khác

Năm 1997, Liu[102] trích stevioside từ lá cỏ ngọt khô với methanol nóng Họ cũngnghiên cứu dịch chiết của steviol glycoside, như rebaudioside A, rebaudioside C, vàdulcoside A bằng cách chiết xuất chất lỏng dưới tới hạn (Sub FE) Phương pháp đơngiản Sub FE hiệu suất nhỏ được phát triển và hiệu xuất hơn 88% dịch chiết thu đượcbằng cách sử dụng methanol

Mô ̣t số nghiền cứu tinh chế steviol glycoside bằng công nghệ màng, có thể được sửdụng ở nhiệt độ phòng dẫn đến không có sự thay đổi pha; không có hóa chất đượcthêm vào; nó rất dễ dàng để mở rộng quy mô [103] Như vậy, công nghệ đã được sử

dụng rộng rãi để xử lý nước táo, nước mosambi nước ép lựu, nước ép cà rốt…[103] Cókhá nhiều bằng sáng chế sử dụng công nghệ màng Năm 1990, Fuh và Chiang sử dụngmuối vô cơ và màng siêu lọc giảm khối lượng phân tử (MWCO) 25,000 và 100,000

Da để tinh chế stevioside, sau đó thẩm thấu ngược và sử dụng trao đổi ion, 45%stevioside thu hồi sau siêu lọc[67] Năm 2000, Zhang và Kumar[71] sử dụng màng vi lọc,sau đó dùng màng siêu lọc, cuối cùng dùng màng lọc nano để lọc sạch dịch chiết cỏngọt[71] Năm 2007, Sliva và Bergamasco đã dùng Zeolite hiệu chỉnh (NaX) trước khilọc bằng màng vi lọc, lọc sạch xấp xỉ 80-100% dịch chiết cỏ ngọt với màng kích cỡkhe lọc thay đổi và áp suất vận hành khác[104] Năm 2009, Reis sử dụng màng vi lọcceramic đê lọc dịch chiết Cỏ ngọt Một nghiên cứu khác bởi , so sánh sự khác nhau sửdụng màng PES may đo và thương mại trong lọc sạch stevioside[105]

Phương pháp Accelerated Solvent Extraction (ASE) là công nghệ chiết tự động sửdụng ở nhiệt độ và áp suất cao thực hiện trong thời gian ngắn Nhiệt độ cao dẫn đếnkhả năng hòa tan tốt hơn chất phân tích, tốc độ khuếch tán nhanh hơn, độ nhớt dungmôi thấp hơn và sự suy yếu các tương tác chất tan – chất dính Áp suất cao cho phéplàm việc với các dung môi dạng lỏng trên điểm sôi của chúng và tăng tốc quá trìnhchiết tổng thể [106] Cuối cùng, so với phương pháp thông thường khác, tự động hóa,hiệu suất chiết, độ thu hồi cao và thu được sản phẩm trong thời gian ngắn [107]

1.2.2.2 Các phương pháp định lượng các hợp chất steviol glycoside

Trước đây từ rất lâu trên thế giới, đã có rất nhiều phương pháp có sẵn để xác định độ

ổn định và độ tinh khiết của rebaudioside A và stevioside, và các phương pháp đó đãđược áp dụng cho các mẫu cỏ ngọt trồng ở các khí hậu và các nước khác nhau, cũngnhư những đồ uống và thực phẩm chứa những chất ngọt đó [1, 4, 108] Các phương pháp

cơ bản định tính và định lượng cho chất làm ngọt cỏ ngọt được phân loại trước đâydựa trên sự xác định màu, phương pháp enzyme sử dụng enzyme hesperidinase thô,phương pháp sắc kí khí-lỏng (GLC), sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc kí bảnmỏng (TLC)/phép đo tỉ trọng [1] Năm 1977, H Sugisawa cùng đồng nghiê ̣p đã địnhlượng stevioside bằng cách ứng dụng phương pháp màu Carr-Price, phản ứng tạo màuxanh lam với thuốc thử SbCl3/cloroform, đo E ở bước sóng 524 nm[109] Trước đây cómột phương pháp được công bố về stevioside, rebaudiana A và steviolbioside trong