Bài viết trình bày việc đánh giá được độc tính cấp và bán trường diễn của viên nang cứng Kaviran trên động vật thực nghiệm. Phương pháp nghiên cứu: Chuột nhắt trắng được chia làm 8 lô, mỗi lô 12 con để thử độc tính cấp; thỏ chia 3 lô, mỗi lô 12 con để đánh giá độc tính bán trường diễn trên thỏ trong 42 ngày.
Trang 1Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn
trên động vật thực nghiệm của viên nang cứng Kaviran bào chế từ quả nhàu, cúc hoa vàng
và sâm ngọc linh sinh khối
Ngày nhận bài: 10/11/2020 Ngày phản biện: 23/12/2020 Ngày chấp nhận đăng: 28/12/2020
Nguyễn Trọng Điệp, Nguyễn Thị Thanh Hải Nguyễn Tùng Linh, Trịnh Nam Trung, Đỗ Quyết
Học viện Quân y
TÓM TẮT
Mục tiêu: Đánh giá được độc tính cấp và bán
trường diễn của viên nang cứng Kaviran trên động
vật thực nghiệm
Phương pháp nghiên cứu: Chuột nhắt trắng
được chia làm 8 lô, mỗi lô 12 con để thử độc tính
cấp; thỏ chia 3 lô, mỗi lô 12 con để đánh giá độc
tính bán trường diễn trên thỏ trong 42 ngày;
Kết quả: Kaviran dùng đường uống trên chuột
nhắt trắng đến mức liều cao nhất có thể cho chuột
nhắt uống là 36g/kg KLCT/24h, sau 72 giờ đến 7
ngày không thấy chuột thí nghiệm nào chết Khi
cho thỏ uống Kaviran liều 240mg và 1.200mg/ kg/
24 giờ liên tục trong 42 ngày không nhận thấy có sự
ảnh hưởng đến khối lượng cơ thể, không biến đổi
điện tim thỏ và các chỉ số huyết học (bạch cầu, hồng
cầu, HST, tiểu cầu); các chỉ số đánh giá chức năng
gan (hoạt độ ALT, AST), thận (nồng độ creatinin,
ure) trong giới hạn bình thường; trên đại thể và mô
bệnh học gan, thận, lách thỏ không nhận thấy các
dấu hiệu bất thường
Kết luận: Chưa tìm thấy LD50 trên chuột nhắt
trắng theo đường uống; Kaviran uống liều 240 và
1.200mg/ kg/ 24 giờ trong 42 ngày không ảnh
hưởng đến khối lượng cơ thể, chỉ số huyết học, chức năng gan, thận và lách của thỏ thực nghiệm
Từ khóa: Kaviran, LD50, độc tính bán trường diễn ĐẶT VẤN ĐỀ
Viên nang cứng Kaviran được bào chế từ bột cao khô quả nhàu (180mg/viên), bột cao khô cúc hoa vàng (180mg/viên) và bột cao khô sâm Ngọc Linh sinh khối (60mg/viên) Các nghiên cứu gần đây cho thấy quả nhàu và cúc hoa vàng (CHV) có nhiều tác dụng sinh học quí như: tăng cường miễn dịch, chống oxy hoá, ức chế khối u, kháng khuẩn, chống nấm, chống viêm…[1], [2] Sâm Ngọc linh sinh khối (NLSK) có tác dụng tăng lực, tăng quá trình nhận thức và ghi nhớ, chống oxy hóa, bảo vệ gan [3] Hiện nay, chưa có chế phẩm thuốc nào kết hợp ba loại dược liệu này Do đó, nhằm nghiên cứu bào chế một loại thuốc mới từ ba dược liệu trên nhằm tăng cường miễn dịch, bảo vệ gan và chống gốc tự do, chúng tôi đã nghiên cứu bào chế thành công viên nang Kaviran Tuy nhiên, qua quá trình chiết xuất, bào chế và việc phối hợp ba thành phần dược liệu trong cùng công thức bào chế có thể làm thay đổi độc tính và tác dụng của chế phẩm so với
Trang 2dược liệu ban đầu Do vậy, việc đánh giá độc tính
cấp, bán trường diễn cũng như tác dụng sinh học
trên động vật thực nghiệm là rất cần thiết Trong
nghiên cứu này, chúng tôi công bố kết quả đánh giá
độc tính cấp và bán trường diễn của viên nang trên
động vật thực nghiệm
NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu, thiết bị và động vật nghiên cứu
- Nguyên vật liệu: Viên nang cứng Kaviran do
Học viện Quân y nghiên cứu và sản xuất đạt tiêu
chuẩn cơ sở
- Thiết bị: Máy xét nghiệm sinh hoá tự động
Chemix 180, hãng Sysmex; máy xét nghiệm huyết
học tự động XE2100, hãng Sysmex; máy điện tim
NIHON KOHDEN Corporation (Đức)
- Động vật thí nghiệm: Thỏ chủng Orytolgus
cuniculus, cả 2 giống, trưởng thành, khỏe mạnh, cân
nặng 2,0 ± 0,2kg Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả
hai giống, khỏe mạnh, cân nặng 20,0 ± 2,0g Động
vật được nuôi trong phòng thí nghiệm, ánh sáng tự
nhiên, uống nước và ăn thức ăn được nấu chín, bảo
đảm theo nhu cầu
Phương pháp nghiên cứu
Đánh giá độc tính cấp
Tiến hành theo hướng dẫn của Bộ Y tế, OECD
và WHO [4], [5], [6] Chuột nhắt trắng được chia
ngẫu nhiên thành các lô, mỗi lô 12 con Cho chuột
uống viên nang cứng Kaviran với các mức liều tăng
dần Chuột được nuôi dưỡng chu đáo, theo dõi tình
trạng chung và xác định tỷ lệ chuột chết trong 72
giờ của từng lô sau uống thuốc và tiếp tục theo dõi
đến ngày thứ 7
Đánh giá độc tính bán trường diễn
Tiến hành theo quy định của WHO và Bộ Y tế
[4], [6]
- Thỏ trắng được chia ngẫu nhiên thành 3 lô, mỗi
lô 12 con:
+ Lô chứng: uống dung dịch natri clorid 0,9%,
liều 2,5 ml/kg/24 h
+ Lô thử liều 1: uống viên Kaviran mức liều
240mg/kg/24h
+ Lô thử liều 2: uống viên Kaviran mức liều
1200mg/kg/24h
Tất cả thỏ nghiên cứu được uống liên tục trong thời gian 42 ngày
- Các chỉ tiêu đánh giá:
+ Sinh lý - dược lý: Theo dõi tình trạng chung,
hoạt động, ăn uống, đặc biệt là khối lượng cơ thể (KLCT) và điện tim
+ Huyết học: Hồng cầu, hemoglobin, bạch cầu,
tiểu cầu
+ Sinh hóa: AST, ALT, ure, creatinin.
+ Mô bệnh học: Vào ngày thứ 42, giết thỏ, quan
sát hình ảnh đại thể gan, lách, thận Sau đó sinh thiết các tạng để nghiên cứu hình ảnh mô bệ`nh học tại Khoa Giải phẫu bệnh - Học viện Quân y
- Thời điểm xét nghiệm: Lấy máu xét nghiệm các chỉ số sinh hóa, huyết học, ghi điện tim, tại 3 thời điểm: xuất phát điểm, sau 3 tuần, sau 6 tuần
Xử lý số liệu
Các dữ liệu được phân tích bằng phần mềm Microsoft excel 2007 Sự khác biệt giá trị trung bình giữa các lô chuột đánh giá bởi Duncan’s Multiple Range Test bằng phần mềm SAS (α = 0,05) Quy ước: Khi so sánh giữa các nhóm, giá trị trong cùng một cột
có cùng một trong các ký tự (biểu thị theo a, b, c, d )
là khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1 Kết quả đánh giá độc tính cấp của viên nang Kaviran theo đường uống
Chuột nhắt trắng được phân chia ngẫu nhiên thành các lô và được uống Kaviran với mức liều tăng dần Theo dõi tình trạng chuột, tỷ lệ sống chết ở mỗi
lô trong 72 giờ đến 7 ngày sau khi uống thuốc Kết quả được trình bày ở bảng 3.49
Trang 3Bảng 1 Tỷ lệ chuột sống, chết sau 72 giờ uống Kaviran
Số lượng động vật chết
Số lượng động vật sống
Bảng 1 cho thấy: Dùng Kaviran đến mức liều
cao nhất có thể cho chuột nhắt uống là 36g/kg
KLCT/24h (gấp 50 lần liều dự kiến lâm sàng), đây
cũng là lượng thuốc tạo thành dịch đặc nhất còn có
thể qua kim đầu tù Sau 72 giờ đều không thấy chuột
thí nghiệm nào chết ở tất cả các lô nghiên cứu Sau
7 ngày, giết chuột quan sát đại thể cho thấy trạng
thái và màu sắc các tạng (Gan, thận, phổi, tim, lách)
của tất cả các chuột không có phù nề, xuất huyết, không thay đổi màu sắc so với lô chứng, trong lòng
dạ dày và ruột không có xuất huyết và hoại tử Như vậy, không xác định được LD50 của Kaviran theo đường uống trên chuột nhắt trắng
Kết quả đánh giá độc tính bán trường diễn của Kaviran
Ảnh hưởng của Kaviran đến khối lượng cơ thể thỏ
Bảng 2 Ảnh hưởng của Kaviran đối với khối lượng cơ thể thỏ, n=12
Thời điểm
nghiên cứu
Khối lượng cơ thể thỏ (kg) ở các lô nghiên cứu
p
Giá trị trong cùng cột có cùng ký tự là khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)
Bảng 2 cho thấy: KLCT của thỏ ở hai lô dùng Kaviran và lô chứng sinh học tại cùng thời điểm là khác biệt không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 KLCT ở ba lô thỏ tăng dần sau tuần thứ 3 và tuần thứ 6 đều tăng
so với thời điểm ban đầu (p < 0,05) Tuy nhiên, KLCT thỏ ở tuần thứ 6 tăng lên so với tuần thứ 3 là không
có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)
Ảnh hưởng của Kaviran đến điện tim thỏ
Trang 4Bảng 3 Ảnh hưởng của Kaviran đối với điện tim thỏ, n = 12
Tần số tim (CK/phút, TB ± SD)
> 0,05
Biên độ QRS (mV)
> 0,05
Bảng 3 cho thấy: So sánh trong từng lô giữa các thời điểm thí nghiệm và giữa các lô ở cùng một thời điểm, tần số và biên độ của điện tim thỏ thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Không có sóng bất thường trên điện tim của các lô thỏ tại các thời điểm nghiên cứu
Ảnh hưởng của Kaviran đến một số chỉ tiêu huyết học của thỏ
Bảng 4 Chỉ số hồng cầu, huyết sắc tố, bạch cầu và tiểu cầu ở các lô thỏ nghiên cứu (n = 12)
Chỉ tiêu Thời
điểm
Bạch cầu
(109/l)
> 0,05
Hồng cầu
(1012 /l)
> 0,05
HST (g/l)
Tiểu cầu
(109/l)
> 0,05
Giá trị trong cùng cột của cùng chỉ số có cùng ký tự là khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05), không ghi
ký tự là khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
Bảng 4 cho thấy: Khi so sánh ở cùng thời điểm thì chỉ có hồng cầu ở lô uống Kaviran liều 2 là thấp hơn lô chứng ở thời điểm ban đầu (p < 0,05) và huyết sắc tố ở lô Kaviran liều 1 cao hơn lô chứng ở thời điểm sau 3 tuần (p < 0,05) Khi so sánh ở các thời điểm khác nhau của cùng một lô thì chỉ có
Trang 5huyết sắc tố của lô Kaviran liều 1 ở thời điểm sau
3 tuần là tăng lên so với ban đầu, nhưng ở sau 6
tuần lại giảm xuống và tương đương với thời điểm
ban đầu (p > 0,05) Ở lô uống Kaviran liều 2 sau
3 tuần và 6 tuần đều có tiểu cầu cao hơn so với
ban đầu, nhưng so với lô chứng là không khác biệt (p > 0,05), còn lại là khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)
Ảnh hưởng của Kaviran lên chức năng gan, thận thỏ thực nghiệm
Bảng 5 Nồng độ AST, ALT, Creatinin và Ure của các lô thỏ (n = 12)
ALT (U/l)
> 0,05
AST (U/l)
> 0,05
Creatinin
(mmol/l)
> 0,05
Ure (mmol/l)
> 0,05
Giá trị trong cùng cột của cùng chỉ số có cùng ký
tự là khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05),
không ghi ký tự là khác biệt không có ý nghĩa thống kê
(p>0,05).
Bảng 5 cho thấy: So sánh trong từng lô giữa
các thời điểm thí nghiệm và giữa các lô ở cùng
một thời điểm thì hoạt độ enzym AST, ALT và
hàm lượng creatinin, ure máu thay đổi không có ý
nghĩa thống kê (p > 0,05) Chỉ riêng nhóm dùng Kaviran liều 1 và liều 2, sau 3 tuần có hàm lượng ALT cao hơn thời điểm ban đầu (p < 0,05), nhưng sau 6 tuần lại giảm xuống và so với thời điểm ban đầu và sau 3 tuần thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)
Đại thể và mô bệnh học gan, thận và lách của thỏ thí nghiệm
Hình 1 Hình ảnh đại thể gan, thận, lách thỏ của lô chứng sinh học (A), Kaviran liều 1 (B), Kaviran liều 2 (C)
Trang 6Hình 1 cho thấy: Quan sát đại thể bằng mắt thường và dưới kính lúp có độ phóng đại 25 lần cho thấy: Màu sắc, hình thái của gan, lách và thận ở lô dùng Kaviran liều 1 và 2 không khác so với lô chứng
Kết quả đánh giá về mô bệnh học được trình bày ở bảng 6 và bảng 7
Bảng 6 Hình ảnh mô bệnh học gan, thận và lách của thỏ thí nghiệm
Lô thỏ Hình ảnh mô bệnh học gan, thận, lách thỏ của đại diện của các nhóm thỏ
Lô chứng sinh
học
Kaviran liều 1
(240mg/ kg/
24h)
Kaviran liều
2 (1200mg/
kg/ 24h)
Bảng 7 Tóm tắt nhận xét mô bệnh học gan, thận, lách thỏ thí nghiệm
Chứng sinh
học
- Gan: Có cấu trúc gồm các tiểu thùy gan và khoảng cửa Các tế bào gan bình thường
- Thận: có cùng vỏ và vùng tủy Các tiểu cầu thận và các ống thận bình thường Mô kẽ không có tổn thương
- Lách: Cấu trúc lách bình thường vùng tủy trắng và tuỷ đỏ rõ Tuỷ trắng có các nang lympho, trung tâm có động mạch bút lông, bao xung quanh là lưới tế bào võng Tuỷ đỏ gồm thừng lách (dây Billroth) xen kẽ với các xoang tĩnh mạch được lót bởi lớp tế bào nội mô Thừng lách có các tế bào lympho, tế bào võng, mẫu tiểu cầu và các tế bào máu khác
Kaviran liều
1 (240mg/
kg/ 24h)
- Gan: Cấu trúc gan rõ các tiểu thùy gan và khoảng cửa Các tế bào gan bình thường hoặc thoái hóa hạt nhẹ
- Thận: Vùng vỏ thận với các tiểu cầu thận và ống thận có cấu trúc bình thường
- Lách: Vùng tuỷ trắng với các nang lympho có tăng sinh nhiều lympho bào sắp xếp xung quanh động mạch bút lông Vùng tuỷ đỏ giãn rộng với các xoang mạch xung huyết, thấy có các mẫu tiểu cầu
Trang 7Kaviran
liều 2
(1200mg/
kg/ 24h)
- Gan: Cấu trúc gan rõ các tiểu thùy gan và khoảng cửa Các tế bào gan bình thường hoặc có thoái hóa hạt nhẹ
- Thận: Vùng vỏ thận với các tiểu cầu thận và các ống thận có cấu trúc bình thường
- Lách: Vùng tuỷ trắng với các nang lympho có tăng sinh nhiều lympho bào sắp xếp xung quanh động mạch bút long Vùng tuỷ đỏ giãn rộng với các xoang mạch xung huyết, thấy có các mẫu tiểu cầu
BÀN LUẬN
Việc đánh giá tính an toàn là điều kiện bắt buộc
đối với chế phẩm bào chế từ dược liệu, vì qua quá
trình bào chế có thể vẫn xảy ra các quá trình hóa
học làm thay đổi thành phần hóa học Thêm nữa,
việc kết hợp nhiều dược liệu trong cùng chế phẩm
không những làm thay đổi tác dụng mà cả độc tính
Do đó, cần đánh giá tính an toàn của sản phẩm cuối
cùng, cho dù các dữ liệu về độc tính của nguyên liệu
đã được dự báo trước Bảng 1 cho thấy: Viên nang
Kaviran uống với liều cao nhất là 36g/kg cân nặng
(Gấp 50 lần liều dự kiến lâm sàng), sau 24 giờ và 7
ngày không thấy các bất thường và không có chuột
nào chết, chứng tỏ viên nang Kaviran có tính an
toàn cao
Căn cứ theo liều thường dùng của các dược
liệu và hàm lượng hoạt chất trong viên, đã xác định
được mức liều dự kiến lâm sàng của viên Kaviran
là 6 viên/ ngày, từ đó tính được liều thử trên thỏ
(gấp 4 lần liều dự kiến lâm sàng) Trong đó, mức
liều 240mg/kg là tương đương liều dự kiến lâm
sàng, liều 1200mg/kg cao gấp 5 lần liều dự kiến lâm
sàng Hiện nay, thời gian thử độc tính bán trường
diễn thường tính theo 2 cách: Thời gian thử thuốc
gấp 3 - 4 lần thời gian dự kiến lâm sàng Hoặc thử theo từng khoảng thời gian xác định: 14, 28 hoặc 90 ngày Đối với viên Kaviran, thời gian dự kiến dùng trên người là 7 - 10 ngày Do vậy, theo cách tính thứ nhất thì thời gian thử nghiệm là 10 ngày x 4 lần =
40 ngày Để thuận tiện cho việc thử nghiệm, đề tài lựa chọn thời gian thử nghiệm là 42 ngày (6 tuần) Các lô thỏ được đánh giá ở thời điểm ban đầu, sau
3 và 6 tuần Kết quả thử nghiệm trên thỏ cho thấy: Chế phẩm Kaviran uống liên tục trong 42 ngày với mức liều 240mg và 1200mg/kg/24h không thấy có những biến đổi bất thường về sinh hóa, huyết học và
mô bệnh học (gan, thận, lách)
KẾT LUẬN Không xác định được LD50 của Kaviran theo đường uống trên chuột nhắt trắng khi thử đến mức liều cao nhất có thể cho chuột nhắt uống là 36g/
kg KLCT/24h (gấp 50 lần liều dự kiến lâm sàng) Kaviran uống liên tục trong 42 ngày với mức liều 240mg và 1200mg/kg/24h trên thỏ thực nghiệm đều không thấy có những biến đổi bất thường về khối lượng cơ thể, điện tim, chỉ số huyết học và mô bệnh học (gan, thận, lách)
SUMMARY
Evaluation of the acute and subchronic toxicity of kaviran capsule
Objectives: To evaluate the acute and subchronic toxicity of Kaviran capsule
Methods: Mice were divided into 8 groups, each group included 12 mice to evaluate the acute toxicity;
rabbits were divided into 3 groups, 12 rabbits in each groups for the evaluation of subacute toxicity in 42 days
Results: the median lethal dose, LD50 hasn’t been found with maximum oral dosage of 36 g/kg/24h on mice At the dosage of 240mg and 1200 mg/kg/24h on rabbit, continuously administrated for 42 days didn’t
Trang 8affect the normal increment of body weight of rabbit, didn’t change the electrocardiogram, hematological indices such as red blood cell, white blood cell, platelet and hemoglobin content, hepatic indices (AST, ALT activity), renal indices (urea, creatinin levels) were within normal limits There were no abnormality on the liver, kidney and spleen of the rabbits macro-and micro-morphologically
Conclusion: LD50 hasn’t been found with maximum oral dosage At the dosage of 240mg and 1200 mg/kg/24h on rabbit, continuously administrated for 42 days didn’t affect the functions of liver, kidney and spleen of the rabbits
Key words: Kaviran, antioxydants, hepatoprotective effects.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Phạm Thị Vân Anh (2011) Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch và chống oxy hóa của cao quả nhàu
trên thực nghiệm, Luận án Tiến sỹ y học, Trường Đại học Y Hà Nội.
2 Trần Vân Hiền, Trần Thanh Loan, Nguyễn Đặng Dũng và cộng sự (2008), “Tác dụng chống oxy hóa,
chống gốc tự do của flavonoid chiết xuất từ cúc hoa vàng (Chrysanthemum indicum L.)”, Tạp chí Y – Dược
học quân sự, số 3 -2008
3 Nguyễn Văn Long (2011), Nghiên cứu qui trình tạo sinh khối tế bào và đánh giá một số tác dụng sinh học
của sâm Ngọc linh sinh khối, Luận án tiến sỹ y học, Học viện Quân y.
4 Đỗ Trung Đàm (2014), Phương pháp xác định độc tính của thuốc, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr
184-215
5 OECD 423 (2001), OECD guideline for testing of chemicals - Acute oral toxicity – Acute toxic class method.
6 World Health Organization (2000), General Guidelines for Methodologies on Research and Evaluation of
Traditional Medicine.