Xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen ABCD1 liên quan đến loạn dưỡng não chất trắng

Bài viết trình bày việc xây dựng quy trình chẩn đoán sớm đột biến gây bệnh ở giai đoạn tiền làm tổ nhằm giúp đỡ những gia đình có tiền sử mắc bệnh nhưng mong muốn sinh con khỏe mạnh. Bằng việc kết hợp sử dụng các phương pháp giải trình tự, đặc biệt là giải trình tự theo nguyên lí Sanger với việc thực hiện các phản ứng PCR đơn cặp mồi, có thể xây dựng được quy trình phát hiện đột biến trên gen ABCD1 liên quan đến bệnh.

Ngày nhận bài: 19/10/2020 Ngày phản biện: 20/11/2020 Ngày chấp nhận đăng: 09/12/2020

Xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen ABCD1 liên quan đến loạn dưỡng não chất trắng

Triệu Tiến Sang 1 , Trần Văn Khoa 1 , Nguyễn Thanh Tùng 2

Lê Thị Thu Hiền 3 , Hoàng Xuân Cường 4 , Trần Ngọc Thảo My 5

1 BM Sinh học và Di truyền y học, Học viện Quân y

2 Viện Mô phôi và lâm sàng Quân đội, Học viện Quân y

3 Bệnh viện Nam học và hiếm muộn Hà Nội

4 Phòng Khoa học Quân sự, Học viện Quân y

5 Khoa Khoa học và Kỹ thuật, Trường Đại học Sorbonne, Pháp

TÓM TẮT

Loạn dưỡng não chất trắng thượng thận

(X-ALD) là một bệnh lí di truyền lặn liên kết giới

tính hiếm gặp làm rối loạn chức năng tuyến thượng

thận, dây thần kinh tủy sống và chất trắng của hệ

thần kinh Theo các thống kê về dịch tễ học, bệnh

lí này gây ảnh hưởng đến 1 trên 15000 người, tuy

nhiên, tỷ lệ mắc bệnh trong thực tế được ước tính là

cao hơn nhiều nhờ vào việc áp dụng kết hợp các kĩ

thuật hiện đại giúp chẩn đoán sớm bệnh Khả năng

phát hiện ra bệnh ở thời điểm càng sớm sẽ giúp các

gia đình có tiền sử mắc bệnh loạn dưỡng não chất

trắng xây dựng những phương án sinh con cũng

như chữa trị triệu chứng bệnh một cách chủ động

và an toàn Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi

xây dựng quy trình chẩn đoán sớm đột biến gây

bệnh ở giai đoạn tiền làm tổ nhằm giúp đỡ những

gia đình có tiền sử mắc bệnh nhưng mong muốn

sinh con khỏe mạnh Bằng việc kết hợp sử dụng các

phương pháp giải trình tự, đặc biệt là giải trình tự

theo nguyên lí Sanger với việc thực hiện các phản

ứng PCR đơn cặp mồi, chúng tôi đã có thể xây dựng

được quy trình phát hiện đột biến trên gen ABCD1

liên quan đến bệnh Sau đó, chúng tôi ứng dụng quy trình này cho các mẫu tế bào phôi sinh thiết của gia đình có tiền sử mắc bệnh nhằm sàng lọc các phôi không mang alen gây bệnh loạn dưỡng não chất trắng Kết quả của nghiên cứu cho thấy đã có thể phát hiện được alen đột biến ở 5/8 phôi (62,5%) và

3 phôi còn lại (37,5%) không mang alen đột biến nên 3 phôi này tiếp tục được sử dụng trong các bước sàng lọc tiền làm tổ tiếp theo trong quá trình thụ tinh nhân tạo

ĐẶT VẤN ĐỀ Loạn dưỡng não chất trắng thượng thận (X-linked adrenoleukodystrophy, X-ALD (MIM

#300100)), là bệnh di truyền liên kết nhiễm sắc thể X liên quan tới rối loạn quá trình β-oxi hóa tại

hóa cho protein xuyên màng của peroxisome gây ra dẫn tới sự tích tụ quá mức những chuỗi axit béo rất dài (VLCFA - very long-chain fatty acid; ≥ C22) ở trong huyết tương và mô, bao gồm phần chất trắng

ở não, tủy sống và vỏ thượng thận [2, 4] Cho đến

thời điểm hiện tại, thế giới đã ghi nhận nhiều ca mắc

bệnh loạn dưỡng não chất trắng thượng thận xuất

hiện với tần suất tương tự giữa các quốc gia Với tỷ

lệ mắc bệnh là khoảng 1 trên 14,700 trẻ sơ sinh (cả

nam lẫn nữ), đây chính là hội chứng rối loạn liên

quan đến peroxisome phổ biến nhất từng gặp [9]

Tuy nhiên, tỷ lệ thực tế của căn bệnh này chưa được

ước tính chính xác bởi hầu hết các khảo sát liên quan

đến bệnh đều được thực hiện ở Mỹ hoặc các nước

châu Âu, rất ít khảo sát được thực hiện tại châu Phi

và châu Á, đặc biệt là vùng Trung Đông [1]

Loạn dưỡng não chất trắng thường được phân

loại thành ba kiểu bệnh chính: X-ALD não, bệnh

lý thượng thận – tủy – rễ thần kinh (AMN), kiểu

chỉ có bệnh Addison [3] Đây đều là những thể

bệnh với những triệu chứng có ảnh hưởng nặng nề

tới người mắc bệnh, đặc biệt là ở nam giới Một số

triệu chứng lâm sàng chung giữa ba thể bệnh này

bao gồm thoái hóa hệ thần kinh (vận động, thị

giác,…) và suy giảm tuyến thượng thận khiến cho

loạn dưỡng não chất trắng trở thành một căn bệnh

phát triển nhanh chóng, nghiêm trọng và chưa thể

xác định được một phác đồ điều trị dứt điểm thực

sự hiệu quả [2]

Hiện nay có nhiều phương pháp chẩn đoán

bệnh loạn dưỡng não chất trắng thượng thận, bao

gồm phương pháp chẩn đoán trước sinh và chẩn

đoán sau sinh Đối với phương pháp chẩn đoán

trước sinh, việc chọc dịch ối sau đó thực hiện một

số xét nghiệm di truyền có thể đưa ra chẩn đoán về

tình trạng mắc bệnh của thai nhi, tuy nhiên đây là

phương pháp xâm lấn gây ảnh hưởng tiêu cực đến

sức khỏe người mẹ đồng thời phát hiện bệnh ở giai

đoạn muộn [5, 6] Ngoài ra, một số phương pháp

chẩn đoán sau sinh bao gồm việc sàng lọc ở trẻ sơ

sinh sử dụng kĩ thuật quang phổ khối kế tiếp (MS/

MS) để đo nồng độ 26:0-lyso-PC hay các kĩ thuật

chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng như chụp

ảnh MRI não, xét nghiệm sinh hóa và phân tích di truyền đều tồn tại một nhược điểm chung là đều phát hiện ra người bệnh ở giai đoạn khá muộn [10]

Do vậy, hướng nghiên cứu nhằm xây dựng một quy trình giúp chẩn đoán bệnh ở giai đoạn sớm, đặc biệt

ở giai đoạn tiền làm tổ, có thể giúp những gia đình

có tiền sử mắc bệnh loạn dưỡng não chất trắng có

cơ hội sinh con không mang gen gây bệnh và sinh ra thế hệ sau một cách chủ động và an toàn

Tất cả những bệnh nhân mắc chứng ALD đều mang đột biến trên gen ABCD1 [8] Đây là bệnh di

truyền do alen lặn trên nhiễm sắc thể X qui định và cho tới thời điểm này chỉ xác định được khoảng 5%

ca bệnh gây ra bởi các đột biến de novo Gen ABCD1

nằm ở gần cuối cánh dài của nhiễm sắc thế X: vị trí Xq2.8 và có độ dài 19.9 kb bao gồm 10 exon ABCD1

mã hóa cho một loại protein xuyên màng cấu tạo từ

745 amino axit được gọi là adrenoleukodystrophy protein, hay ALDP (protein ALD) Protein này nằm xuyên màng peroxisome thực hiện chức năng vận chuyển VLCFA-CoA từ tế bào chất qua màng vào bên trong bào quan để tham gia vào quá trình β-oxi

hưởng trực tiếp tới protein ALD khiến cho protein

bị thay đổi về mặt cấu trúc cũng như số lượng khiến cho nó không thể thực hiện chức năng vận chuyển

từ đó gây tích tụ các chuỗi axit béo rất dài trong tế bào chất Sự tích tụ này để lại ảnh hưởng tiêu cực tới

tế bào, đặc biệt là các tế bào hệ thần kinh [3] Chính

vì vậy, nghiên cứu tập trung vào phát hiện đột biến

não chất trắng Quy trình được xây dựng nhằm ứng dụng lên các mẫu phôi sinh thiết của những gia đình

có tiền sử mắc bệnh X-ALD

ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Mẫu máu của một cặp vợ chồng (vợ: N.T.T –

26 tuổi; chồng: V.Đ.H – 28 tuổi) có tiền sử gia

đình phía vợ có người mắc bệnh loạn dưỡng não

chất trắng Tám mẫu phôi thụ tinh nhân tạo của

cặp vợ chồng đó được nuôi cấy rồi sinh thiết,

trong đó 7 mẫu (TR1 – TR7) được sinh thiết vào

ngày 5, 1 mẫu (TR8) được sinh thiết vào ngày 6

Các mẫu được sinh thiết từ 3 đến 5 tế bào phôi

ngày 5 hoặc ngày 6, rửa phôi bằng dung dịch PBS

1X + 1% PVP, lấy tế bào phôi vào ống PCR 0,2 ml

Tổng toàn bộ dung dịch cả tế bào và dung dịch

môi trường là 4 µl

Các loại mẫu sử dụng trong nghiên cứu đều

được bảo quản ở nhiệt độ âm Toàn bộ cam kết liên

quan đến mẫu bệnh phẩm và mẫu tế bào phôi sinh

thiết cũng như hồ sơ, mô tả chi tiết về nghiên cứu đã

được xét duyệt và thông qua bởi Hội đồng đạo đức

trong nghiên cứu Y sinh học, Học viện Quân y

Vật liệu

Hóa chất và trang thiết bị: bộ kit tách chiết

G-spin™ Total DNA Extraction Kit (iNtRON

Biotechnology – Hàn Quốc); bộ kit REPLI-g®

Single Cell (QIAGEN – Đức); GoTaq Green

buffer) (Promega – Hoa Kỳ); Agarose, TBE 1X,

ethidium bromide, thang chuẩn ADN (100 bp –

1000 bp và 100 bp – 1500 bp) (Cleaver Scientific

– Anh); hệ thống trang thiết bị và máy móc đạt yêu

cầu về kỹ thuật và an toàn phòng thí nghiệm tại

Labo thuộc Bộ môn Sinh học và Di truyền y học,

Học viện Quân y

Phương pháp

Giải trình tự thế hệ mới nhằm khảo sát đột biến:

Mẫu bệnh phẩm của người có tiền sử gia đình mắc

bệnh loạn dưỡng não chất trắng (N.T.T.) sẽ được

gửi đi giải trình tự thế hệ mới nhằm khảo sát đột

biến trên gen ABCD1 Sau khi có kết quả, mẫu sẽ

được làm giải trình tự Sanger nhằm xác nhận lại đột

biến đã được xác định bằng phương pháp NGS Kết

quả giải trình tự thế hệ mới đã phát hiện được đột

biến dị hợp tử c.854G>C (p.Arg285Pro) trên exon

1 của gen ABCD1 Đồng thời, thực hiện quy trình

xác nhận lại đột biến bằng cách khảo sát đột biến

Genetic Analyzer và đều cho kết quả giống với giải trình tự thế hệ mới Đây là một đột biến lặn nên thể đồng hợp tử mang 2 alen đột biến sẽ gây bệnh loạn dưỡng não chất trắng Ngoài ra, theo thống kê trên

c.854G>C chỉ được ghi nhận 2 lần trong quá khứ nên đột biến được xác định ở bệnh nhân này có thể được coi là xuất hiện lần thứ 3 trong lịch sử nghiên cứu về bệnh [7]

Thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR: Dựa vào kết

quả giải trình tự của bệnh nhân N.T.T cùng với trình

tự gen ABCD1 được tham khảo trên ngân hàng trình

tự gen quốc tế GenBank, chúng tôi tiến hành thiết

kế cặp mồi đặc hiệu sử dụng công cụ NCBI Primer-BLAST và đặt tổng hợp cặp mồi tại hãng Integrated DNA Technologies (IDT), Hoa Kỳ Cặp mồi nhận được ở dạng bột đông khô, vì vậy khi sử dụng, mồi

sẽ được pha loãng bằng nước khử ion đến nồng độ hoạt động là 10 µM

Tách chiết ADN từ máu toàn phần: ADN

được tách chiết sử dụng bộ kit G-spinTM Total Extraction của iNtRON Biotechnology: 200 μl máu toàn phần được cho vào ống ly tâm 1,5 ml; thêm 200 μl BL Buffer, 20 μl Proteinase K, 5 μl RNase, trộn đều, ủ ở 56°C trong thời gian 15 phút; thêm 200 μl EtOH 100%, trộn đều; chuyển

800 μl dung dịch từ ống ly tâm 1,5 ml vào cột lọc,

ly tâm 13000 vòng/ phút trong 1 phút ở 25°C, đổ dịch; chuyển hết toàn bộ dung dịch còn lại trong ống vào cột lọc và lặp lại bước trước đó; thêm 700

μl Buffer WA vào cột lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút ở 25°C, đổ dịch; thêm 700 μl Buffer

WB vào cột lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút ở 25°C, đổ dịch; ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút ở 25°C làm khô màng lọc, chuyển

cột lọc sang một ống ly tâm 1,5 ml mới; thêm 85

μl nước khử ion đã được ủ ở 56°C vào cột lọc, ủ

ở nhiệt độ phòng tối thiểu 5 phút, ly tâm 13000

vòng/phút trong 1 phút ở 25°C, thu ADN ở ống ly

tâm 1,5 ml ADN được đo nồng độ và giá trị A260/

A280 để kiểm tra chất lượng bằng máy SpectraMax

QuickDrop

Khuếch đại toàn bộ hệ gen của mẫu tế bào phôi sinh

thiết: Pha dung dịch D2 với tỷ lệ 33 µl Buffer DLB : 3

µl DTT 1M; spin nhẹ các ống chứa tế bào phôi sinh

thiết và nhỏ lên thành mỗi mỗi ống 3 µl dung dịch

D2; ủ các ống chứa mẫu tại nhiệt độ 65ºC trong

vòng 10 phút; thêm vào mỗi ống 3 µl Stop Solution;

spin nhẹ các ống và ủ tại nhiệt độ 4ºC trong vòng ít

nhất là 3 phút; chuẩn bị hóa chất khuếch đại hệ gen

theo tỷ lệ thể tích (cho một mẫu) như sau: 9 µl H2O

sc, 29 µl REPLI-g Reaction Buffer, 2 µl REPLI-g sc

DNA Polymerase; thêm vào mỗi ống chứa mẫu tế

bào phôi 40 µl hóa chất khuếch đại hệ gen đã chuẩn

bị rồi spin nhẹ, ủ các ống chứa mẫu tại nhiệt độ

30ºC trong vòng 2 giờ; bất hoạt enzyme REPLI-g

sc DNA Polymerase bằng cách ủ mẫu tại nhiệt độ

65ºC trong vòng 3 phút; mẫu ADN sau khi khuếch

đại sẽ được pha loãng tới nồng độ hoạt động trong

khoảng 2 – 20 ng/µl và kiểm tra nồng độ bằng máy

SpectraMax QuickDrop

Tối ưu hóa phản ứng PCR: Dựa và nhiệt độ nóng

chảy Tm của cặp mồi đã thiết kế, nghiên cứu thiết lập

phản ứng PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi với dải nhiệt

độ dao động quanh giá trị Tm ± 5ºC với tổng thể tích

là 25 µl với 12,5 µl GoTaq Green Mastermix 2X, 7,5

µl nước khử ion, 0,5 µl mỗi mồi, 4,0 µl dịch ADN tách chiết Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR đơn cặp mồi sẽ được thể hiện ở phần kết quả của quá trình tối ưu phản ứng

Phát hiện đột biến gen ABCD1 bằng phương pháp PCR và giải trình tự theo phương pháp Sanger: Sau khi

xác định được nhiệt độ gắn mồi thích hợp, phản ứng PCR sẽ được tiến hành với cặp mồi đã được thiết

kế nhằm khuếch đại đoạn gen mang đột biến Sản phẩm phản ứng PCR sau đó sẽ được điện di kiểm tra và tinh sạch nhằm gửi đi giải trình tự Sanger để khảo sát đột biến trên gen ABCD1 Quá trình này

đầu tiên sẽ được ứng dụng với mẫu ADN của người

mẹ (N.T.T.) đã được làm giải trình tự NGS để so sánh kết quả, sau đó mới được ứng dụng lên các mẫu tế bào phôi sinh thiết

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Trình tự cặp mồi cho phản ứng PCR

Chúng tôi thiết kế cặp mồi có độ dài là 18 base –

độ dài lí tưởng để sử dụng trong nghiên cứu Đồng thời chúng tôi áp dụng một số tiêu chí để thiết

kế cặp mồi mong muốn như sau: kích thước sản phẩm PCR < 500 bp, nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi nằm trong khoảng từ 50º - 65ºC, tránh lặp lại nhiều lần trong trình tự mồi dễ gây bắt cặp nhầm Qua đánh giá các thông số, chúng tôi sàng lọc kết quả trên hệ thống và lựa chọn cặp mồi sao cho hợp

mong muốn là ABCD1F và ABCD1R chúng tôi thiết kế sẽ được thể hiện ở bảng 1

Bảng 1 Trình tự cặp mồi và kích thước sản phẩm PCR dự tính.

PCR (bp)

ABCD1F 5’ - GTG TTC CTC ACG GCC AAC - 3’ 56,6

199 bp

Kết quả tách chiết ADN từ máu toàn phần và kết

quả khuếch đại toàn bộ hệ gen mẫu tế bào phôi

sinh thiết

Mẫu bệnh phẩm của người mẹ mang đột biến

(NTT-ABCD1) sau khi tách chiết ADN và đo OD

đạt nồng độ theo yêu cầu là 10,0 ng/µl với chỉ số

A260/A280 là 2,0 Mẫu ADN này hoàn toàn đạt

chất lượng để được sử dụng trong các bước tiếp theo

của quy trình Tám mẫu tế bào phôi sau khi được

sinh thiết được tiến hành khuếch đại toàn bộ hệ gen

và pha loãng với tỷ lệ thể tích 10 µl ADN : 200 µl

nước khử ion Kết quả nồng độ ADN các mẫu tế

bào phôi sinh thiết sau khi được khuếch đại và pha

loãng được thể hiện ở bảng 2 Dựa vào bảng kết quả,

các mẫu tế bào phôi sinh thiết đã được khuếch đại

hệ gen thành công và nồng độ ADN đã đạt ngưỡng

phù hợp để được sử dụng cho các bước tiếp theo

trong chu trình

Bảng 2 Kết quả nồng độ ADN sau khi khuếch đại toàn

bộ hệ gen các mẫu tế bào phôi sinh thiết.

mẫu

Nồng độ

Mã mẫu

Nồng độ (ng/µl)

Kết quả phản ứng PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi

Quá trình tối ưu phản ứng PCR sử dụng

mẫu ADN của người mang gen gây bệnh

(NTT-ABCD1) làm khuôn để khuếch đại đoạn gen

ABCD1 Dựa vào nhiệt độ nóng chảy của mồi

xuôi và mồi ngược tương ứng là 56,6ºC và 59ºC,

chúng tôi tiến hành hai phản ứng PCR độc lập với

dải gradient nhiệt độ gắn mồi lần lượt từ 51ºC

đến 58ºC và từ 59ºC đến 64ºC, sau đó sản phẩm PCR sẽ được điện di kiểm tra trên gel agarose 2% Kết quả điện di sản phẩm PCR của phản ứng tối

ưu nhiệt độ gắn mồi của cặp mồi ABCD1F và ABCD1R với dải gradient nhiệt độ từ 51ºC đến 64ºC được thể hiện ở hình 1

Hình 1 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của phản ứng tối ưu với gradient nhiệt độ gắn mồi từ 51ºC đến 64ºC M: Thang chuẩn marker (100 bp).

Phân tích kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR đơn cặp mồi trên gel agarose 2% (hình 1) cho thấy chỉ có băng sản phẩm với kích thước như tính toán xuất hiện tại nhiệt độ gắn mồi từ 59 đến 61ºC – kích thước khoảng 199 bp Kết quả điện di thu được tại nhiệt độ gắn mồi 59ºC cho băng sáng rõ nhất, không có sản phẩm phụ và chính vì vậy, nhiệt

độ 59ºC được lựa chọn làm nhiệt độ gắn mồi để tiến hành phản ứng PCR cho các bước tiếp theo

Kết quả phản ứng PCR và giải trình tự kiểm tra lại đột biến trên mẫu ADN của mẹ

Dựa vào nhiệt độ gắn mồi đã được xác định, tiến hành thực hiện phản ứng PCR trên đối tượng

là ADN của người mẹ mang alen đột biến (NTT-ABCD1) với chu trình nhiệt như sau: 95ºC trong

5 phút, 40 chu kỳ với 94ºC – 30s, 59ºC – 30s, 72ºC

– 30s, 72ºC trong 5 phút Sản phẩm PCR được

điện di trên gel agarose 2% trong 25 phút với cường

độ dòng điện trong khoảng 125V và nhuộm với

Ethidium bromide Kết quả điện di sản phẩm PCR

của phản ứng này được thể hiện ở hình 2 cùng với

kết quả giải trình tự theo phương pháp Sanger

Hình 2 Hình ảnh ứng dụng quy trình phát hiện đột

biến lên mẫu ADN NTT-ABCD1 (A): Hình ảnh điện

di sản phẩm phản ứng PCR, M: Thang chuẩn marker

(100 bp); (B): Kết quả giải trình tự Sanger đoạn gen

được khuếch đại bằng cặp mồi ABCD1F và ABCD1R

của mẫu NTT-ABCD1

Hình 3 Kết quả điện di sản phẩm sau phản ứng PCR với ADN của 8 mẫu tế bào phôi M: Thang chuẩn marker (100 bp); (+): ADN mẫu NTT-ABCD1; TR1 – TR8: sản phẩm ADN sau khuếch đại

Qua hình ảnh điện di, sản phẩm ADN được

khuếch đại có kích thước đúng như dự kiến và

không xuất hiện băng sản phẩm phụ Sau đó, sản

phẩm phản ứng PCR được tinh sạch và gửi đi giải

rình tự Sanger với cặp mồi thiết kế, và cho ra kết

quả trình tự đoạn mang đột biến giống hệt với kết quả giải trình tự bằng phương pháp NGS – nghĩa

là đều có thể phát hiện đột biến c.854G>C Từ đây chúng tôi kết luận đã xây dựng được quy trình phát hiện đột biến trên gen ABCD1 liên quan đến

bệnh loạn dưỡng não chất trắng và sẽ ứng dụng quy trình này lên tám mẫu tế bào phôi sinh thiết

đã có sẵn

Kết quả ứng dụng quy trình trên tế bào phôi sinh thiết

Phản ứng PCR với thành phần và chu trình nhiệt đã được sử dụng ở bước trước sẽ được áp dụng cho ADN của 8 mẫu tế bào phôi đã khuếch đại Sản phẩm phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 2% và quan sát dưới ánh đèn tia UV như hình 3

Kết quả điện di sản phẩm ADN của 8 mẫu tế bào

cho thấy phản ứng PCR đã khuếch đại thành công đoạn gen mong muốn Băng sản phẩm hiện lên sáng

và rõ ràng tại vị trí tương ứng với kích thước thang chuẩn là khoảng 200 bp, chứng tỏ đoạn nhân lên

có kích thước là 199 bp phù hợp như tính toán ban đầu Từ đây, sản phẩm PCR sẽ được tinh sạch và giải trình tự Sanger nhằm khảo sát đột biến c.854G>C

ở những mẫu phôi sinh thiết Kết quả giải trình tự được đọc bằng phần mềm BioEdit và được thể hiện

ở bảng 1

Bảng 1 Tổng hợp kết quả giải trình tự theo phương pháp Sanger cho ADN của 8 mẫu tế bào phôi TR1 – TR8.

Kết quả chẩn đoán

Bình thường, không mang gen gây bệnh

Bình thường, mang gen gây bệnh

Bình thường, mang gen gây bệnh

4 TR4

Bình thường, mang gen gây bệnh

Bình thường, không mang gen gây bệnh

7 TR7

Bình thường, không mang gen gây bệnh

Bình thường, mang gen gây bệnh

Kết quả giải trình tự theo phương pháp Sanger

cho thấy, trong tổng số 8 phôi sinh thiết sử dụng

trong nghiên cứu, có 3 phôi (37,5%) không mang

alen đột biến gây bệnh, 4 phôi (50%) mang alen

đột biến gây bệnh ở thể dị hợp và 1 phôi (12,5%)

mang alen gây bệnh ở thể bán dị hợp tử Điều

này đã chứng tỏ, những phôi mang alen gây bệnh

trong quá trình giảm phân hình thành giao tử đã

nhận được alen đột biến từ mẹ Những phôi này

sẽ được đánh giá là không phù hợp để sử dụng

cho quá trình chuyển phôi và những phôi không

mang alen đột biến sẽ tiếp tục được làm các xét nghiệm sàng lọc tiền làm tổ (PGS - Preimplanta-tion Genetic Screening) để đánh giá chất lượng phôi trước khi tiến hành thụ tinh nhân tạo Đối với mẫu ADN của các phôi TR1, TR5 và TR7 đều có kết quả bình thường và không có alen gây bệnh sẽ được thực hiện giải trình tự theo phương pháp giải trình tự thế hệ mới để sàng lọc các bất thường về nhiễm sắc thể Kết quả sàng lọc PGS cho 3 phôi không mắc bệnh loạn dưỡng não chất trắng được thể hiện ở hình 4

Hình 4 Kết quả giải trình tự thế hệ mới của quá trình

sàng lọc tiền làm tổ bộ nhiễm sắc thể của 3 mẫu tế bào

phôi (A): Kết quả của mẫu TR1; (B): Kết quả của

mẫu TR5; (C): Kết quả của mẫu TR7

Với kết quả giải trình tự như trên, bằng việc sử

dụng các công cụ tin sinh cũng như thống kê sinh

học, có thể nhận thấy rằng cả hai phôi TR1 và TR7

đều có bất thường về bộ nhiễm sắc thể, cụ thể hơn

phôi TR1 có bất thường về cấu trúc nhiễm sắc thể

số 11, còn phôi TR7 có bất thường về số lượng ở

những nhiễm sắc thể 2, 4, 6, 8, 11, 11, 18, trong khi

ABSTRACT

Establishment of the procedure to detect ABCD1 gene mutations related to X-linked

Adrenoleukodystrophy

Adrenoleukodystrophy (X-ALD) is a rare sex-linked recessive disorder that disrupts adrenal gland function, the spinal nerves, and the white matter of the nervous system According to recent epidemiological statistics, this disease affects 1 in 15,000 people, however, the actual incidence rate is estimated to be much higher with the combined application of modern genetic techniques used for early diagnosis The earlier the diagnose of the disease, the safer and the more active for families with a history of X-ALD to develop plans for childbirths and treatments of disease's symptoms Therefore, in this study, we developed an early pre-implantation diagnosis process to help families with the background of having the disease but wish to have healthy children By combining the use of sequencing methods, especially Next-Generation Sequencing (NGS) and Sanger sequencing with other molecular techniques such as PCR, we were able to develop a procedure to detect mutations on the ABCD1 gene which is involved in the disease We then applied this

đó ở phôi TR5 không phát hiện bất cứ bất thường nào trên bộ 24 nhiễm sắc thể Vì vậy, chúng tôi đưa

ra kết luận phôi TR5 có chất lượng tốt, phù hợp để tiến hành chuyển phôi vào cơ thể người mẹ trong quá trình thụ tinh nhân tạo

KẾT LUẬN Xây dựng được quy trình phát hiện đột biến gen

ABCD1 liên quan đến bệnh loạn dưỡng não chất

trắng và đồng thời ứng dụng được quy trình phát hiện đột biến gen nhằm chọn được phôi thụ tinh nhân tạo không mang alen gây bệnh

Tuy nhiên cần mở rộng thí nghiệm nhằm ứng dụng quy trình cho các thành viên khác trong đại gia đình giúp chẩn đoán bệnh cho các phôi của các cặp vợ chồng khác bởi đột biến này có thể di truyền cho nhiều thành viên từ đó luôn tồn tại khả năng sinh con mắc bệnh loạn dưỡng não chất trắng mang đột biến c.854G>C Cần nghiên cứu mở rộng thí nghiệm nhằm ứng dụng quy trình cho các

cứu mở rộng thí nghiệm nhằm ứng dụng quy trình cho các đột biến liên quan đến các bệnh hiếm di truyền đơn gen khác