Phân tích biến đổi di truyền của bệnh nhân mắc tật khuyết mống mắt ở việt nam

Vai trò quan trọng của gen PAX6 đối với sự phát triển của mắt lần đầu tiên được chú ý khi gen này được tìm thấy bị đột biến ở những bệnh nhân KMM.. Bên cạnh đột biến điểm, 30% số ca bện

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Vũ Đình Chất LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN CỦA BỆNH NHÂN MẮC TẬT

KHUYẾT MỐNG MẮT Ở VIỆT NAM

Hà Nội – tháng 5 năm 2021

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Vũ Đình Chất

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN CỦA BỆNH NHÂN MẮC TẬT

KHUYẾT MỐNG MẮT Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.Nguyễn Hải Hà

Hà Nội – tháng 5 năm 2021

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Phân tích biến đổi di truyền của bệnh nhân mắc tật khuyết mống mắt ở Việt Nam” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi và các cộng sự tại Viện nghiên cứu Hệ gen thuộc Viện Hàn Lâm Khoa Học Việt Nam Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong các công trình khác Nếu không đúng như

đã nêu trên, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đề tài của mình

Hà Nội, tháng 5 năm 2021

Học viên

Vũ Đình Chất

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hải Hà – Phó Trưởng Phòng phân tích hệ gen, Viện nghiên cứu hệ gen, người thầy – người chị đã theo sát và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập và làm luận văn Thời gian làm tốt nghiệp cũng là lúc tôi gặp nhiều khó khăn và nghĩ tới bỏ cuộc, tuy vậy, chị Hà đã tận tình giúp tôi để tôi có thể hoàn thành Luận văn này Những câu chữ ngắn gọn khó có thể giúp tôi diễn tả lòng biết ơn của mình đối với chị Khoảng thời gian hơn một năm làm việc với chị giúp tôi học được nhiều điều và chắc chắn những kiến thức tôi thu lượm được sẽ là hành trang tốt cho tôi trên con đường phía trước Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm

ơn đặc biệt tới TS Nguyễn Đăng Tôn – Trưởng Phòng phân tích hệ gen, Ths Nguyễn Thị Thanh Hoa cùng toàn thể các anh chị em đang làm việc và học tập tại đây

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ đã dành tâm huyết xây dựng môi trường nghiên cứu

và học tập sáng tạo cho toàn thể học viên Bên cạnh đó, để có thể hoàn thành được khoá học với nhiều thông tin bổ ích không thể không nhắc tới sự tận tuỵ của các thầy cô trong Học viện, đặc biệt thầy cô đang công tác tại Khoa Công nghệ Sinh học Đồng thời thôi cũng xin gửi lời cám ơn chân thành tới toàn thể anh chị em cán bộ học viện đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong thời gian theo học tại đây

Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân tới bố mẹ, vợ con, những người thân trong gia đình và bạn bè, các đồng nghiệp tại Labo IVF Hồng Ngọc đã luôn

hỗ trợ, khích lệ và động viên tinh thần từ lúc tôi đăng ký thi và trong suốt quá trình học tập tại Học viện

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

aCGH Microarray-based Comparative

Genomic Hybridization Lai so sánh hệ gen aCGH BAC/YAC Bacterial/Yeast artificial

chromosome

Nhiễm sắc thể vi khuẩn/ nấm nhân tạo

CTS C-terminal subdomain Tiểu vùng đầu C

CTE C-terminal exptension Kéo dài đầu C

DRR Downstream Regulatory Region Vùng điều hoà xuôi dòng

EE Ectodermal enhancer

ELP4 Elongator complex protein 4

FISH Fluorescence in situ hybridization Kỹ thuật lai huỳnh quang tại

chỗ FOXC1 Forkhead Box C1

ITPR1 Inositol 1,4,5-Trisphosphate

Receptor Type 1 KMM Khuyết mống mắt

LOVD Leiden open variation database Cơ sở dữ liệu đột biến mở

MLPA Multiplex Ligation-dependent

Probe Amplification NMD Nonsense-mediated decay Phân huỷ qua trung gian vô

nghĩa NTS N-terminal subdomain Tiểu vùng đầu N

OMIM Online Mendelian Inheritance in

Man

Cơ sở dữ liệu trực tuyến bệnh di truyền Menden ở người

PAX6 Paired box 6

PITX2 Paired-like homeodomain

transcription factor 2 P0/1/ α Promoter 0/1/α

PST Proline-serine-threonine domain Vùng giàu proline, serine,

threonine PTC Premature termination codon Mã kết thúc sớm

TRIM44 Tripartite Motif Containing 44

UTR Untranslated region Vùng không dịch mã

WAGR Wilms tumor-aniridia-genital

anomalies-retardation

WES Whole Exom Sequencing Giải trình tự toàn bộ hệ gen

biểu hiện WGS Whole Genome Sequencing Giải trình tự toàn bộ hệ gen WT1 Wilms' tumor 1

Danh mục bảng biểu và hình ảnh HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Bệnh nhân KMM với đột biến PAX6 dị hợp tử biểu hiện kiểu hình

mắt rất đa dạng 5

Hình 1.2: Lô-cut PAX6 ở người 10

Hình 1.3: Các mất đoạn ADN trong locus 11p13 chứa vùng điều hoà 3' của PAX6 16

Hình 1.4: Tần xuất các kiểu đột biến trong cơ sở dữ liệu đột biến PAX6 17

Hình 1.5: Chiến lược xét nghiệm di truyền đối với những bệnh nhân khuyết mống mắt 24

Hình 2.1: Sơ đồ phương pháp nghiên cứu 28

Hình 3.1: Điện di kiểm tra ADN tổng số trên gel agarose 0.8% 38

Hình 3.2: Kết quả phân tích MLPA của bệnh nhân TMM4 41

Hình 3.3: Kết quả phân tích MLPA của hai mẫu có đột biến mất đoạn 42

Hình 3.4: Ảnh minh hoạ điện di đồ sản phẩm PCR từ mẫu dị tật mống mắt 44

Hình 3.5: Kết quả so sánh trình tự vùng chứa exon 5 của gen PAX6 trên các mẫu KMM với trình tự chuẩn 44

Hình 3.6: Kết quả so sánh trình tự vùng chứa exon 7 của gen PAX6 trên các mẫu KMM với trình tự chuẩn 45

Hình 3.7: Kết quả so sánh trình tự vùng chứa exon 8 của gen PAX6 trên các mẫu KMM với trình tự chuẩn 46

Hình 3.8: Kết quả so sánh trình tự vùng chứa exon 9 của gen PAX6 trên các mẫu KMM với trình tự chuẩn 47

Hình 3.9: Kết quả so sánh trình tự vùng chứa exon 11 của gen PAX6 trên các mẫu KMM với trình tự chuẩn 48

Hình 3.10: So sánh kết quả phân tích MLPA của bệnh nhân TMM12 (A) và người mẹ cũng mắc KMM (B) 54

Hình 3.11: Sơ đồ phả hệ của bệnh nhân TMM11 55

BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Các thành phần điều hoà bảo thủ và sự điều hoà biểu hiện trong và ngoài mắt của gen PAX6 [26] 13

Bảng 2.1: Thông số cài đặt máy điện di mao quản để chạy phân tích MLPA 31

Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi đặc hiệu cho khuếch đại vùng giáp ranh exon-intron và toàn bộ các exon của gen PAX6 32

Bảng 2.3: Thành phần PCR khuếch đại gen PAX6 34

Bảng 3.1: Đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân KMM 37

Bảng 3.2: Nồng độ ADN tổng số được xác định bằng 39

Bảng 3.3: Bảng mối liên hệ giữa giá trị DQ và số lượng bản sao 40

Bảng 3.4 Các đột biến gen phát hiện trên bệnh nhân KMM 49

Bảng 3.5: Đột biến và kiểu hình ở mỗi bệnh nhân 50

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

TỔNG QUAN BỆNH KHUYẾT MỐNG 4

1.1.1 Đặc điểm lâm sàng 4

1.1.2 Hội chứng WGAR 8

1.1.3 Hội chứng Gellespie 8

CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA BỆNH KHUYẾT MỐNG MẮT 9

1.2.1 Cấu trúc và chức năng của gen PAX6 9

1.2.2 Sự điều hoà PAX6 12

1.2.3 Các đột biến trên PAX6 16

1.2.3.1 Đột biến mã kết thúc sớm 17

1.2.3.2 Biến dị kéo dài đầu C (CTE) 18

1.2.3.3 Đột biến sai nghĩa 18

1.2.3.4 Các đột biến trong vùng không mã hoá 19

1.2.3.5 Đột biến cấu trúc 19

1.2.3.6 Đột biến hai alen 20

1.2.4 Các gen khác 20

PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN 21

1.3.1 Chẩn đoán lâm sàng 21

1.3.2 Chẩn đoán di truyền 22

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH KHUYẾT MỐNG MẮT 24

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

NGUYÊN VẬT LIỆU 27

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 27

2.1.2 Hoá chất và thiết bị 27

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.2.1 Thu mẫu 29

2.2.2 Tách chiết và đánh giá chất lượng ADN 29

2.2.3 Xác định các đột biến cấu trúc bằng MLPA 29

2.2.4 Giải trình tự gen Sanger 32

2.2.4.1 Thiết kế mồi và PCR 32

2.2.4.2 Giải trình tự gen 35

2.2.4.3 Phân tích kết quả tìm đột biến sau giải trình tự 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

KẾT QUẢ 37

3.1.1 Kết quả thu thập mẫu nghiên cứu 37

3.1.2 Tách chiết ADN tổng số 38

3.1.3 Phân tích đột biến cấu trúc bằng MLPA 39

3.1.4 Kết quả PCR khuếch đại gen PAX6 43

3.1.5 Phát hiện đột biến bằng phương pháp giải trình tự 44

3.1.6 Đánh giá mối liên hệ kiểu gen và kiểu hình cho mỗi bệnh nhân 49

THẢO LUẬN 51

KẾT LUẬN 57

KIẾN NGHỊ 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

1

MỞ ĐẦU

Dị tật khuyết mống mắt (aniridia/KMM) là rối loạn gây nên hậu quả không có mống mắt thường ở cả 2 mắt của bệnh nhân Đây là bệnh di truyền trội với tỉ lệ mắc khoảng 1/40,000 – 100,000 ca sinh, không phân biệt chủng tộc và giới tính [1] Dị tật khuyết mống mắt thường được biểu hiện trong 6 tuần đầu sau khi sinh với biểu hiện mống mắt bất thường (mất hoàn toàn hoặc một phần) hoặc rung giật nhãn cầu Dị tật này có thể khiến cho bệnh nhân nhìn không được rõ nét và mắt bị nhạy cảm với ánh sáng Một số vấn đề với mắt cũng có thể gặp phải ở bệnh nhân như tăng nhãn áp thường xảy ra vào giai đoạn muộn của tuổi niên thiếu hoặc giai đoạn sớm của tuổi dậy thì Khoảng 50-80% bệnh nhân mắc KMM sẽ có biểu hiện đục thủy tinh thể và 10% số bệnh nhân bị kém phát triển dây thần kinh thị giác

Đột biến gây mất chức năng của gen PAX6 là nguyên nhân gây nên KMM [2] Vai trò quan trọng của gen PAX6 đối với sự phát triển của mắt lần

đầu tiên được chú ý khi gen này được tìm thấy bị đột biến ở những bệnh nhân

KMM Gen PAX6 nằm trên nhiễm sắc thể số 11 và mã hóa cho một protein

tham gia vào giai đoạn phát triển sớm của mắt, não, cột sống (hệ thống thần kinh trung ương) và tụy Với vai trò là 1 yếu tố phiên mã, protein PAX6 bám vào các trình tự ADN đặc hiệu và qua đó điều hòa hoạt động của các gen khác Sau khi sinh, protein PAX6 tham gia điều hòa một số gen khác, các gen này dường như góp phần duy trì các cấu trúc khác nhau của mắt Đột biến gen

PAX6 tạo nên protein PAX6 không mang chức năng, không có khả năng bám

và hoạt hóa các gen Từ đó sẽ gây ức chế quá trình hình thành mắt trong giai đoạn phát triển của phôi Cho tới nay, có khoảng 500 đột biến dị hợp tử trên

gen PAX6 đã được phát hiện là nguyên nhân gây nên KMM và chiếm đến 2/3

số ca bệnh [2] Trong số đó, 94% đột biến điểm trong gen hình thành tín hiệu kết thúc sớm hoặc làm thay thế axít amin [3] Nghiên cứu trên chuột trước đó

đã cho thấy đột biến dị hợp tử trên gen PAX6 gây nên tính trạng mắt nhỏ [4] Các đột biến gây tín hiệu kết thúc sớm ở gen PAX6 sẽ kích hoạt quá trình

phân hủy sản phẩm ARN mang bộ ba mã kết thúc sớm trước khi protein ngắn

bất thường được hình thành Những đột biến sai nghĩa trong gen PAX6 làm

2 thay đổi trình tự axít amin tạo nên sản phẩm protein gấp cuộn sai hoặc có chức năng bất thường, điều này là nguyên nhân gây nên kiểu hình khiếm khuyết ở mống mắt hoặc có thể tạo nên dạng nguy hiểm hơn là biến dạng dây thần kinh thị giác hoặc kiểu hình mắt nhỏ [1, 5] Bên cạnh đột biến điểm, 30%

số ca bệnh KMM có nguyên nhân từ sự tái sắp xếp của nhiễm sắc thể tại vùng

11p13 bao gồm mất toàn bộ gen PAX6 hoặc mất cả vùng gen PAX6 với vùng gen liền kề (đặc biệt là gen WT1-gây nên hội chứng WAGR) [2] Ngoài ra, một dạng đột biến trong đó xảy ra tại 2 vị trí của gen PAX6 đều ở dạng dị hợp

tử (compound heterozygous) đã được công bố ở 2 bào thai có bố mẹ đều mắc KMM, các bào thai này có đặc điểm là biến dạng cấu trúc não [6]

Các nhóm nghiên cứu trên thế giới đã sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp một số phương pháp phân tích phân tử như giải trình tự Sanger, lai huỳnh quang tại chỗ (Fluorescence in situ hybridization), MLPA (Multiplex Ligation-Depent Probe Amplification) và aCGH (Microarray-basedComparative Genomic Hybridization) trong chẩn đoán di truyền cho các bệnh nhân KMM [7 – 9] Gần đây vào năm 2017, Blanco-Kelly và cộng sự đã phát triển phương pháp aCGH trong chẩn đoán phân tử cho những ca bệnh dị tật khuyết mống mắt và hội chứng WAGR [9] Bên cạnh đó, có một số nghiên cứu đã kết hợp phương pháp giải trình tự Sanger và MLPA trong sàng lọc các

đột biến trên gen PAX6 ở bệnh nhân KMM [10 – 12] Việc kết hợp hai kỹ

thuật này đã giúp nâng tỷ lệ xác định đột biến từ 49% lên 60% Như vậy chứng tỏ việc sử dụng đồng thời cả hai phương pháp giải trình tự Sanger và MLPA đã tăng độ nhạy cho chẩn đoán [12]

Cho tới nay, vẫn chưa có nghiên cứu nào tại Việt Nam công bố về di truyền phân tử của bệnh KMM Mặc dù có rất nhiều vấn đề với mắt, nhưng hầu hết những bệnh nhân mắc dị tật khuyết mống mắt đều có thể bảo tồn thị lực nếu được chăm sóc phù hợp Trong số bệnh nhân KMM, hơn 2/3 số ca mắc bệnh là do yếu tố di truyền trội từ cha/mẹ, 1/3 số còn lại là đột biến mới phát sinh [1] Do đó, chẩn đoán di truyền đóng vai trò quan trọng để xác định nguyên nhân gây bệnh, tư vấn di truyền cũng như dự đoán nguy cơ hình thành khối u khác của bệnh nhân (khối u thận) Hơn nữa, kết quả nghiên cứu của đề

3 tài cũng sẽ đóng góp vào cơ sở dữ liệu về các đa hình của gen gây KMM ở Việt Nam

là tự phát Kiểu hình của người mắc KMM có thể khác nhau giữa các gia đình

và thậm chí khác nhau trong cùng gia đình Hơn nữa, người bệnh thường cho thấy có sự khác biệt nhỏ giữa hai mắt Hầu hết các trường hợp biểu hiện trong sáu tuần sau sinh với một bất thường mống mắt hoặc đồng tử rõ ràng hoặc rung giật nhãn cầu Mặc dù có nhiều vấn đề về mắt, hầu hết bệnh nhân KMM

có thể giữ lại thị lực nếu chăm sóc mắt thích hợp Bệnh này có thể biểu hiện như một bất thường tại mắt mà không có liên quan rõ ràng đến các bất thường

có hệ thống khác hoặc là một phần của hội chứng gen tiếp giáp WAGR [16] Những người mắc hội chứng WAGR có nguy cơ cao sẽ phát triển u nguyên bào thận (Wilms), đây là dạng ung thư thận ác tính ở thời kỳ niên thiếu Tỷ lệ hiện hành của khuyết mống mắt là 1:40,000 tới 1:100,000 không bị ảnh hưởng bởi nguồn gốc chủng tộc hay giới tính [1, 13]

Mống mắt

Suy sản mô mống mắt là hiện tượng bất thường đặc trưng nhất ở những bệnh nhân KMM Mức độ bất thường mống mắt có thể biểu hiện rất khác nhau giữa các bệnh nhân (xem hình 1.1) Trong trường hợp nghiêm trọng nhất, mống mắt bị suy giảm chỉ còn là một điểm nhỏ của phần mô còn sót lại Ngược lại, ở những trường hợp nhẹ nhất, mống mắt chỉ có bất thường trên phần truyền sáng hoặc với cấu trúc bề mặt [8, 17] Những thay đổi khác bao gồm khiếm khuyết mống mắt một phần, bất thường hoặc lạc vị trí đồng tử và lộn màng bồ đào

6

Thuỷ tinh thể

Đục thuỷ tinh thể bẩm sinh cũng xuất hiện ở bệnh nhân KMM đặc biệt phần cực [8, 13, 14, 17] Đôi khi còn tồn tại tàn dư mạch máu thai nhi của ống trước hoặc màng đồng tử vẫn còn Đục thuỷ tinh thể hiếm gặp ở trẻ sơ sinh, nhưng nó phát triển trong khoảng 50-85% bệnh nhân KMM thường ở tuổi niên thiếu hoặc giai đoạn đầu của thời kỳ trưởng thành Dịch chuyển thuỷ tinh thể cũng có thể xuất hiện nhưng không thường xuyên

Áp lực nội nhãn

Hiện tượng áp lực nội nhãn tăng lên mà không thay đổi đĩa thị giác và thị trường (tăng nhãn áp) và glôcôm (chèn đĩa thị giác và giảm thị trường) xuất hiện khá phổ biến, với tỷ lệ hiện hành cuối cùng là 30-50% [8, 13, 14,

17, 18] Tăng nhãn áp luôn xuất hiện ở giai đoạn muộn thời niên thiếu hoặc thời kỳ trưởng thành nhưng có thể có mặt lúc sơ sinh với đường kính giác mạc lớn và kèm với hiện tượng đục giác mạc (chứng mắt trâu)

Hố thị giác

Suy sản hố thị giác luôn xuất hiện ở bệnh nhân KMM Biểu hiện của tình trạng này là phản xạ hố thị giác giảm, giảm sắc tố điểm vàng và các mạch máu võng mạc đi xuyên qua vùng vô mạch của hố thị giác [8, 14]

7

Thần kinh thị giác

Suy thần kinh thị giác (thần kinh thị giác nhỏ, dị dạng) xuất hiện lên tới 10% trường hợp bệnh nhân KMM Ngoài ra tật khuyết dây thần kinh thị giác đôi khi cũng được quan sát thấy ở những bệnh nhân này [8]

Tật khúc xạ, lác và sụp mí

Cận thị, viễn thị, loạn thị, cũng như lác mắt thường thấy ở người KMM Ngoài ra, có tới 10% bệnh nhân bị sụp mí

Hội chứng xơ khuyết mống mắt

Một số phẫu thuật nội nhãn đôi khi kích hoạt sự phát triển của một màng xơ từ phần còn lại của mô mống mắt mà nằm bên dưới thuỷ tinh thể và giác mạc Hiện tượng này có thể gây ra dịch chuyển hoặc vướng vào thuỷ tinh thể và đục giác mạc

Các đặc điểm hệ thống

Đã có nhiều báo cáo cho rằng bệnh nhân KMM có thể có thiếu hụt cảm giác và thần kinh mà không liên quan tới mắt Bởi vậy, người ta ngày càng có niềm tin rằng KMM đơn có thể có những đặc đểm hệ thống đặc trưng

Hệ thần kinh trung ương

Ở bệnh nhân KMM đơn, khứu giác giảm dường như là khiếm khuyết chức năng phổ biến nhất Các nghiên cứu MRI đã chứng minh các bất thường của mép trước não, vùng vòng cung vỏ não trước, tiểu não, thuỳ thái dương

và chẩm, thể chai, tuyến tùng và khứu giác [19] Tuy nhiên, dường như không phát hiện ra bất kỳ dấu hiệu bất thường nào của chức năng thận [15] Rất hiếm bệnh nhân có biểu hiện khó khăn về hành vi và chậm phát triển [20]

Thính giác

Người khuyết mống mắt có thể có khiếm khuyết xử lý thính giác trung tâm do chuyển giao bất thường giữa bán cầu, có thể gây khó nghe Để chẩn đoán cần đánh giá thính giác chi tiết, nhưng quan trọng ở bệnh nhân, đặc biệt

là trẻ em, người mà đã có một sự suy giảm thị lực [19]

8

1.1.2 Hội chứng WGAR

Đối với trường hợp KMM bột phát người ta thường xét nghiệm để sàng

lọc nguyên nhân do mất đoạn nhiễm sắc thể WT1 một gen hàng xóm của

PAX6 và cùng nằm trên vùng 11p13, đây là gen có khuynh hướng sinh ra khối

u Wilms Do đó, những bệnh nhân bị mất đoạn nhiễm sắc thể bao gồm hai gen này có nguy cơ cao (lên tới 50%) với phát sinh khối u nguyên bào thận (Wilms – OMIM 195070) ở giai đoạn thơ ấu Hội chứng WAGR cổ điển (OMIM 194072) bao gồm khối u Wilms với khuyết mống mắt, bất thường sinh dục và chậm phát triển trí tuệ, nhưng kiểu hình có thể khác nhau nhiều [1, 7, 16] Khuyết mống mắt là triệu chứng phù hợp nhất [16] Thuật ngữ hội chứng WAGR được sử dụng chung thậm chí nếu bệnh nhân không biểu hiện tất cả bốn đặc điểm cổ điển Tương tự, mất đoạn WAGR mô tả một mất đoạn

bao gồm PAX6 và WT1 nếu không có u Wilms Khối u Wilms ở bệnh nhân

WAGR thường có cả hai bên và xuất hiện sớm hơn các loại u Wilms khác [16] Các bất thường thận phát triển, và xuất hiện phổ biến hơn là tình trạng viêm cầu thận phân đoạn khu trú giống như bệnh thận giai đoạn cuối [21] Các bất thường sinh dục bao gồm tinh hoàn lạc chỗ (trong 60% trường hợp nam giới), lỗ đái lệch thấp và cơ quan sinh dục mơ hồ, bất thường niệu, buồng trứng, bất thường tử cung và u tuyến sinh dục [16] Chậm phát triển trí tuệ (IQ<74) đã được chứng minh trong 70% trường hợp bệnh nhân WAGR và có

xu hướng liên quan tới các mất đoạn lớn [1, 16] Một loạt các đặc điểm dị hình và các bất thường về hành vi, thần kinh và chuyển hoá, bao gồm cả béo phì, cũng có thể xuất hiện

1.1.3 Hội chứng Gellespie

Bệnh nhân mắc hội chứng Gellespie (GS – OMIM 206700) khuyết mống mắt một phần rõ ràng, biểu hiện như giãn đồng tử bẩm sinh và bao gồm các đặc điểm liên quan tới suy sản tiểu não tiến triển, mất kiểm soát vận động, chậm phát triển trí tuệ và giảm trương lực bẩm sinh Đối với hội chứng GS với hình thái KMM hai mắt và có dạng vỏ sò riêng biệt do sự bất sản của mô trung tâm tới ống nối Hiện tượng này dường như là hậu quả của sự phát triển bất thường cơ vòng có nguồn gốc ngoại bì và mô đệm có nguồn gốc trung bì

9 xung quanh đầu xa của mống mắt thai nhi Trái ngược với bệnh KMM do PAX6, bất thường trong GS thường giới hạn ở mống mắt và sự thay đổi của các sợi thấu kính Suy sản hố thị giác hiếm khi được quan sát [22]

Vào năm 2016, hai dự án độc lập sử dụng giải trình tự toàn bộ hệ gen

biểu hiện đã xác định được đột biến trên gen ITPR1 là nguyên nhân gây ra hội

chứng Gellespie [22, 23] Tất cả những trường hợp được báo cáo đều có đột

biến đồng hợp tử hoặc dị hợp tử trên ITPR1 do đó, hội chứng GS hiện nay

được coi như bệnh do rối loạn di truyền đơn gen gây nên Đáng chú ý là có 17 trong số 22 trường hợp được báo cáo là nữ dù cho những báo cáo ban đầu về hội chứng này khi mà chưa có xét nghiệm di truyền không cho thấy xu hướng lệch giới tính như vậy

CƠ SỞ DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA BỆNH KHUYẾT MỐNG MẮT

1.2.1 Cấu trúc và chức năng của gen PAX6

Đột biến gen PAX6 được coi là nguyên nhân chính gây nên KMM [1] Lô-cut PAX6 (OMIM 607108) đã được lập bản đồ gen cùng với vùng 11p13 Gen PAX6 có chiều dài là 22 Kb, tuy nhiên vùng điều hoà của nó kéo dài tới xấp xỉ 450 Kb trong hệ gen [24, 25] PAX6 bao gồm 14 exon, trong đó có ba

vùng không mã hoá

10

Hình 1.2: Lô-cut PAX6 ở người (A) Cấu trúc gen PAX6 trong vùng

11p13, với 14 exon (các hộp màu sắc thể hiện các vùng protein tương ứng), promoter P0, P1 và Pα (các hộp với đường mũi tên) và các thành phần điều hoà (hình ovan với đường kẻ ngang) bao gồm vùng tăng cường ở biên (EE), nằm ngược dòng với PAX6, và vùng điều hoà xuôi dòng (DRR) và SIMO nằm trong các intron của gen hàng xóm ELP4 (kéo dài bốn exon thể hiện bởi các hộp màu cam) EE: vùng tăng cường bên ngoài; DRR: vùng điều hoà xuôi dòng (B) Hai đồng phân chính của PAX6: PAX6 chính tắc, PAX6(5a) và cấu trúc tương ứng của chúng với các domain chức năng PD: paired domain; NTS: N-terminal subdomain; CTS: C-terminal subdomain; LNK: Liker region; HD: Homeodomain; PST: proline-serine-threonine domain; aa: amino acid [26]

Phân tử protein chính được mã hoá bởi gen PAX6 chứa 422 axít amin

và trọng lượng phân tử xấp xỉ 46 KDa Protein PAX6 có hai vùng gắn ADN

là paired domain (PD) và homeodomain (HD), giữa HD và PD có một đoạn gọi là vùng nối (LNK) (hình 1.2B) Ở đầu C, tiếp giáp với HD là một vùng chuyển hoạt hoá giàu proline-serine-threonine (PSTD) Vùng PSTD này cần thiết cho hoạt động khởi đầu phiên mã và nó điều hành việc gắn ADN bởi HD [27] Ngược lại, PD bao gồm một tiểu vùng đầu N (NTS hoặc PAI) và một tiểu vùng đầu C (CTS hoặc RED) (hình 1.1B) [28] Cả hai tiểu vùng gắn các

11 trình tự ADN liên kết tương ứng với hai đồng phân: PAX6 chính tắc và PAX6(5a) để điều hành hoạt động của chúng [29] Phiên bản phụ PAX6(5a) được hình thành nhờ sự cắt ghép thay đổi của exon 5a nằm giữa exon 5 và 6, dẫn tới một đồng phân lớn hơn với 436 amino axít (48 KDa) (hình 1.1B) Mười bốn amino axít mã hoá bởi exon 5a được chèn trong tiểu vùng NTS của

PD, khoá hoạt động gắn ADN của nó, và để lộ hoạt động gắn ADN của CTS [29]

Một đồng phân thứ ba đã được báo cáo ở chuột và chim cút là Pax6∆PD Đồng phân này thiếu hoàn toàn vùng PD và nó được dự đoán dẫn đến một protein bị cắt ngắn [30] Tuy nhiên, Kim và Lauderdale chỉ ra rằng Pax6∆PD có một chức năng giới hạn trong sự phát triển mắt của động vật có

vú so với PAX6 và PAX6(5a), vì sự biểu hiện quá mức của Pax6∆PD, trong khi sử dụng hệ thống chuyển gen BAC và YAC, dẫn đến tình trạng mắt nhỏ nghiêm trọng ở cả kiểu dại và chuột thiếu Pax6 [31] Các hệ thống báo cáo kép trong sự phát triển phôi chuột cho thấy rằng đồng phân Pax6∆PD, mặc dù

ở mức độ thấp hơn các đồng phân chứa PD, hầu như được xác định trong ngoại vi võng mạc thần kinh và phát triển thể mi, nhưng nó vắng mặt trong thuỷ tinh thể và giác mạc đang phát triển [32]

Sự điều hoà và các gen đích của mỗi đồng phân trong mắt vẫn chưa được hiểu biết rõ ràng Người ta giả thiết rằng PAX6 chính tắc là phổ biến hơn trong sự phát triển các mô mắt giai đoạn phôi thai và liên quan tới sự biệt hoá và xác định số phận tế bào, trong khi PAX6(5a) có vẻ liên quan đến sự phát triển hoặc sau sinh và tăng sinh tế bào [33] Theo đó, các nghiên cứu biểu hiện ở thuỷ tinh thể mắt chuột chỉ ra rằng, trong quá trình phát triển phôi,

sự biểu hiện Pax6 chính tắc là cao hơn (8:1) khi được so với Pax6(5a) Tuy nhiên, ở các mô mắt trưởng thành (thuỷ tinh thể, giác mạc và võng mạc), tỷ lệ thay đổi thành 1:1 [34] Cùng xu hướng được quan sát trong võng mạc của phôi gà, ở đó Pax6 chính tắc được biểu hiện cao trong giai đoạn sớm ở mầm mắt và tấm thấu kính, trong khi đó sự biểu hiện Pax6(5a) thực sự vượt sự biểu hiện Pax6 chính tắc trong tiền võng mạc của gà, vì các loài chim sở hữu mật

độ thụ thể ánh sáng cao hơn so với các loài linh trưởng [33] Những nghiên

12 cứu biểu hiện này dường như chứng minh cho kiểu hình ở người, vì các đột biến ảnh hưởng tiểu vùng CTS, phần gắn ADN của đồng phần PAX6(5a), liên quan tới suy sản hố thị giác [29] Trong giác mạc, PAX6 và PAX6(5a) đều được biểu hiện trong lớp biểu mô, đồng thời mức độ biểu hiện của keratin đặc hiệu biểu mô có mối tương quan với các đồng phân PAX6 Các nghiên cứu dựa trên sự tăng cường biểu hiện cho thấy dường như PAX6 chính tắc kích

thích KRT3, trong khi PAX6(5a) kích thích sự biểu hiện KRT12 thông qua

mỗi tiểu vùng tương ứng của chúng [35]

Mặc dù các đồng phân PAX6 có thể có các vai trò độc lập và các đích tác động khác nhau trong sự phát triển mắt, sự tồn tại của một hệ thống phản hồi dương giữa Pax6 và Pax6(5a) ở chuột đã được báo cáo [36] Hơn nữa, tỷ

lệ biểu hiện giữa hai đồng phân có vẻ cần thiết cho sự phát triển bình thường của mắt, và tỷ lệ thay đổi liên quan tới bất thường mắt và não [37]

1.2.2 Sự điều hoà PAX6

Do sự tương đồng cao giữa Pax6 ở chuột, ruồi giấm, hoặc chim cút với

PAX6 ở người, những sinh vật này được sử dụng rộng rãi như các hệ thống

mô hình để nghiên cứu và tìm hiểu chức năng cũng như mạng lưới điều hoà

phức tạp của gen này Hai promoter chính tham gia vận hành phiên mã PAX6

là P0 và P1 Promoter Pα nằm trong gen tham gia với mức độ thấp hơn và tạo

ra nhiều bản phiên mã mà mã hoá cho các đồng phân khác nhau (hình 1.2) [38, 39] Các thí nghiệm lai huỳnh quang tại chỗ trong mắt chuột đang phát triển cho thấy promoter P0 khởi đầu sự biểu hiện gen ở biểu mô giác mạc và biểu mô kết mạc, tấm thuỷ tinh thể, và võng mạc, trong khi promoter P1 chủ yếu khởi động phiên mã trong tấm thuỷ tinh thể, túi thị giác, và hệ thần kinh trung ương, nhưng chỉ yếu ở giác mạc và kết mạc Pα trực tiếp biểu hiện trong các tế bào amacrine của võng mạc, thể mi, và mô mống mắt [39]

Tuy nhiên, sự điều hoà biểu hiện PAX6 theo kiểu đặc hiệu mô hoặc thời

gian vẫn còn nhiều vấn đề chưa được giải đáp rõ ràng Hơn nữa, không có mối liên hệ trực tiếp giữa promoter và sự biểu hiện của các bản phiên mã đặc biệt Ở chuột, P0 và P1 cùng khởi đầu sự biểu hiện của các bản phiên mã Pax6 và Pax6(5a), trong khi các bản phiên mã được tạo ra bởi Pα dường như

13 liên quan trực tiếp tới đồng phân Pax6∆PD [38] Những kết quả này chỉ ra rằng có thành phần điều hoà bổ sung mà hoạt động cùng với các promoter

trong kiểu điều hoà và biểu hiện phức tạp của PAX6 Vùng điều hoà bảo thủ cis đã được xác định nằm cả hai chiều xuôi và ngược với gen PAX6 như được

[80] agCNE5

Chú thích: IT – Intron; RGC – Tế bào hạch võng mạc

Vùng điều hoà tăng cường (EE) nằm bên ngoài, ngược với gen và cách

promoter P0 khoảng 3.5 Kb EE tham gia vào điều khiển sự biểu hiện PAX6

trong quá trình phát triển của bề mặt các mô có nguồn gốc ngoại bì (thuỷ tinh thể, giác mạc, kết mạc) [36, 38] Ở chuột, người ta thấy rằng Pax6 tương tác trực tiếp với EE đối với cơ chế tự điều hoà, nhưng nó cũng có thể tương tác với Sox2 và Sox3, đây là các nhân tố phiên mã có mặt trong quá trình phát triển thuỷ tinh thể và mắt giai đoạn sớm [36] Phức hệ Pax6-Sox2 có thể cũng hoạt động trên vùng tăng cường của Sox2 là N-3, cho thấy một cơ chế tương

hỗ giữa hai nhân tố phiên mã trong điều hoà sự biểu hiện gen crystallin [40]

Ngoài EE, PAX6 còn có một vùng điều hoà xuôi dòng quan trọng khác

là DRR, nằm trong vùng intron 7 tới 9 của gen ELP4 bên cạnh cách PAX6 tới

150 Kb DRR chứa một vài thành phần bảo thủ mà nếu vắng mặt sẽ ảnh

hưởng sự biểu hiện PAX6 và sự phát triển bình thường của mắt [24, 31, 41,

42] Mặc dù vai trò của tất cả các thành phần này vẫn chưa được khám phá, nhưng DRR được cho là có vai trò tăng cường biểu hiện trong võng mạc và mống mắt, vì mất đoạn vùng DRR ở chuột thủ tiêu hoàn toàn sự biểu hiện của

PAX6 trong cả hai mô, cũng như trong thể mi [31] Mất đoạn DRR không

thay đổi nhiều sự biểu hiện PAX6 tại thuỷ tinh thể; hiện tượng này cũng được quan sát khi mất vùng EE, nó chỉ khiến sự biểu hiện PAX6 trong thuỷ tinh thể

giảm chứ không bị triệt tiêu [43] Kết quả từ những nghiên cứu này chỉ ra rằng các vùng tăng cường tham gia điều hành phiên mã đặc hiệu mô [31]

Trong vùng DRR, có một thành phần tăng cường đặc hiệu dài 800 bp được đặt tên là SIMO SIMO có một đoạn trình tự có thể gắn kết với tiểu

15 phần PD của PAX6, hướng sự biểu hiện của gen này trong các giai đoạn sớm

và muộn của sự hình thành mắt, ví dụ bề mặt ngoại bì sớm, thuỷ tinh thể, và

sự biệt hoá võng mạc thần kinh, cũng như ở cơ thể trưởng thành, trong biểu

mô thuỷ tinh thể, võng mạc, và mô mống mắt [25] Vai trò của SIMO trong

sự biểu hiện Pax6 ở động vật cũng đã được chỉ ra trong một số nghiên cứu, chỉ riêng yếu tố này bị phá vỡ là đủ triệu tiêu sự biểu hiện của Pax6 trong thuỷ tinh thể đang phát triển ở chuột chuyển gen và cá ngựa vằn [25] Hơn nữa, đột biến mất nucleotide hoặc đột biến điểm trong SIMO được mô tả gây

ra kiểu hình KMM ở người [25] Tuy nhiên, sai hỏng biểu hiện của PAX6 trong thuỷ tinh thể khi SIMO bị đột biến có thể do cơ chế tự điều hoà của

chính PAX6 Trường hợp này tương tự với cơ chế điều hoà của EE, nghĩa là

SIMO sẽ gắn với PAX6 thông qua tiểu phần PD và điều hoà sự biểu hiện của chính nó trong một vòng phản hồi dương [25] Trong thuỷ tinh thể của chuột, hai yếu tố phiên mã họ homeoprotein TALE, Meis1 và Meis2, đã được xác định như nhân tố điều hoà ngược dòng của Pax6 bằng cách can thiệp vào hoạt động của cả hai vùng tăng cường EE và SIMO [44] Tuy nhiên, vai trò chính

xác và các cơ chế điều hòa của những vùng này lên sự biểu hiện của PAX6

trong các mô mắt khác hầu như chưa được biết

Ngoài ra khi sử dụng công nghệ lai so sánh hệ gen CGH đối với những

bệnh nhân KMM không có đột biến trong trình tự mã hoá PAX6, người ta thấy xuất hiện các mất đoạn trong vùng điều hoà 3’ của PAX6 (hình 1.3),

chứng tỏ có một số thành phần điều hoà bổ sung nằm trong vùng không mã hoá này [9, 45 – 47] Do đó, Ansari và cộng sự đề xuất một vùng điều khiển

quan trọng đối với hoạt động phiên mã của PAX6 kéo dài xấp xỉ 254 Kb và bao gồm một số bên cạnh là DNALC24, IMMP1L, và ELP4 [45] Gần đây, Plaisancie và cộng sự đã xác định lại vùng này khoảng 18 Kb trong ELP4 mà

không bao gồm SIMO, tuy nhiên, nó chứa thêm một vùng tăng cường bảo thủ cao khác trong DRR, là E180 (hình 1.3) [48] Những kết quả này nhấn mạnh vai trò của E180B trong bệnh khuyết mống mắt [47]

1.2.3 Các đột biến trên PAX6

Dữ liệu đột biến PAX6 trên thư viện LOVD (http://lsdb.hgu.mrc.ac.uk/home.php?select_db=PAX6) cập nhật đến năm

2018 cho thấy có gần 500 đột biến khác nhau được báo cáo Trong số đó, 4%

là đột biến mất toàn bộ gen hoặc nằm tại các vùng không mã hoá 5’ hoặc 3’, còn lại 96% là đột biến trong gen Đối với các đột biến trong gen, khoảng 80% nằm trên các exon, nhưng phần lớn tập trung tại vùng mã hoá PD (exon

5, 6) và HD (exon 9) của protein PAX6 Tỷ lệ các loại đột biến bao gồm: vô

17 nghĩa (39%), dịch khung (27%), sai nghĩa (12%), thay đổi điểm cắt nối (15%), đột biến chèn hoặc mất đoạn nhỏ (2%), và kéo dài đầu C (2%) (hình 1.4 ) [49, 50]

Hình 1.4: Tần xuất các kiểu đột biến trong cơ sở dữ liệu đột biến PAX6 (A) Tất cả đột biến được báo cáo trong cơ sở dữ liệu (B) Tần số đột

biến liên quan tới KMM (C) Sự phân bố của đột biến PAX6 trong kiểu hình không phải KMM PCT (mã kết thúc sớm) bao gồm tất cả đột biến được dự đoán gây ra một mã kết thúc sớm và bao gồm vô nghĩa, dịch khung và điểm cắt CTE là các biến dị mà gây ra kéo dài đầu C của PAX6 [26]

1.2.3.1 Đột biến mã kết thúc sớm

Những thay đổi nucleotide tạo ra một mã kết thúc sớm (PTC) là các đột

biến phổ biến nhất được thấy trong PAX6 Đột biến vô nghĩa, dịch khung, và

phá vỡ điểm cắt nối dẫn đến chèn một mã kết thúc sớm chiếm 65-70% tổng số

đột biến gen PAX6 (hình 1.4A) Bệnh nhân với đột biến PTC có xu hướng

biểu hiện kiểu hình khuyết mống mắt cổ điển [49]

Đầu tiên người ta nghĩ rằng các đột biến với mã kết thúc sớm sẽ tạo ra các protein bị cắt ngắn và tạo ra một ảnh hưởng âm tính trội Tuy nhiên, hiện nay người ta chấp nhận rằng các bản phiên mã mRNA chứa mã kết thúc sớm nằm trước mối nối exon cuối cùng 50 bp có thể bị phân huỷ theo cơ chế Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) [51] Vì vậy, đối với trường hợp đột biến PTC dị hợp tử sẽ dẫn đến phân huỷ các bản phiên mã bị đột biến và mức độ protein giảm 50% [49] Có 4 đột biến PTC đặc biệt chiếm tới 20% tất

cả các loại trong cơ sở dữ liệu bao gồm: c.607C>T, p.Arg203* (exon 8);

18 c.718C>T, p.Arg240* (exon 9); c.781C>T, p.Arg261* (exon 10), và, c.949C>T, p.Arg317* (exon 11) [49] Những đột biến này nằm trong các đảo CpG được methyl hoá thuộc exon 8-13, và tạo thành điểm nóng đột biến với bệnh khuyết mống mắt

Vẫn chưa có bằng chứng về cơ chế NMD hoạt động trên các bản phiên

mã của PAX6 chứa đột biến PTC mà nằm cuối đầu 3’ của gen [50] Một số tác

giả cho rằng PTC trong vùng này sẽ thoát khỏi cơ chế NMD và chúng tạo ra một sản phẩm protein cắt ngắn gây ra ảnh hưởng âm tính trội và kiểu hình nghiêm trọng hơn [52] Tuy nhiên, đột biến tạo mã kết thúc sớm trong vùng này rất hiếm khi xảy ra Thật vậy, không có đột biến vô nghĩa nào trong 50 nucleotide cuối của exon 12 và exon 13 được báo cáo ngoại trừ c.1183G>T (p.Gly395*) Điểm đột biến này nằm tại vị trí nucleotide cuối cùng của exon

12 Tuy nhiên, người ta cho rằng đột biến gây sai lệch trong cắt nối ARN [53], và tất cả các sản phẩm đều dẫn tới kéo dài dịch mã tới đầu C [50]

1.2.3.2 Biến dị kéo dài đầu C (CTE)

Các đột biến dịch khung hoặc đột biến điểm trong PAX6 dẫn đến thay

đổi vị trí mã kết thúc và dịch mã tiếp tục ở vùng 3’UTR chỉ chiếm 2% trên tổng số các loại đột biến được báo cáo trong cơ sở dữ liệu [26] Một số nghiên cứu chỉ ra rằng đột biến CTE có ảnh hưởng nghiêm trọng tương tự như đột biến tạo mã kết thúc sớm [2, 8, 54] Kết quả từ những nghiên cứu này gợi ý

rằng đột biến CTE cũng tạo ra thiếu hụt sản phẩm gen do đơn bội của PAX6

Tuy nhiên, NMD không phân huỷ các bản phiên mã này, vì chúng không có PTC, nghĩa là những thay đổi này nên tạo một protein dài và tương đối bền nhưng sự hoạt hoá vùng PST bị ảnh hưởng Cơ chế chính xác mà đột biến CTE gây ra thiếu hụt đơn bội vẫn chưa được giải thích

1.2.3.3 Đột biến sai nghĩa

Đột biến sai nghĩa khiến cho một axít amin bị thay thế bởi một cái khác trong quá trình dịch mã Tỷ lệ dạng đột biến này được báo cáo lên tới 12% trong cơ sở dữ liệu PAX6 Những đột biến sai nghĩa tập trung chủ yếu trong vùng PD Một số nghiên cứu chức năng đã dự đoán đột biến dạng này gây ra nhiều bất thường trong quá trình gắn ADN và hoạt động hoạt hoá gen của

19 PAX6 [5] Đột biến sai nghĩa luôn liên quan đến kiểu hình nhẹ hơn nhưng không điển hình, trong một số trường hợp không thấy biểu hiện của khiếm khuyết mống mắt [8] Thực vậy, Tzoulaki và cộng sự báo cáo rằng các đột biến sai nghĩa trong PAX6 chịu trách nhiệm cho 70% rối loạn di truyền không bao gồm khuyết mống mắt mà được đăng ký trong cơ sở dữ liệu (hình 1.4C) [50], như mắt nhỏ, bất thường thần kinh thị giác, coloboma, suy sản hố thị giác, và loạn sản đoạn trước [5, 55 – 57]

1.2.3.4 Các đột biến trong vùng không mã hoá

Ngày càng có nhiều báo cáo đề cập đến các đột biến trong vùng không

mã hoá ở bệnh nhân có bất thường mắt và rối loạn phát triển thần kinh [58, 59] Trong cơ sở dữ liệu đột biến PAX6, xấp xỉ 15% tất cả đột biến nằm trong vùng không mã hoá và nhìn chung chúng liên quan tới kiểu hình KMM cổ điển Mặc dù phần lớn nằm tại vị trí cho (donor) và nhận (acceptor) ở ranh giới intron-exon, các đột biến sâu trong intron gần đây đã được ghi nhận ở một số nghiên cứu trên số lượng lớn bệnh nhân KMM [47, 53] Đột biến mất đoạn hoặc đột biến điểm trong vùng không dịch mã 5’ và 3’UTR của PAX6 cũng đã được báo cáo [17, 47] Phân tích minigen hoặc phân tích in silico cho thấy rằng hầu hết các biến dị này có thể ảnh hưởng kiểu cắt bình thường, do

đó dẫn đến hình thành PTC và gây ra sự thiếu hụt PAX6 do đơn bội [60]

Những thay đổi trong vùng điều hoà 3’ của PAX6 cũng được xác định

ở bệnh nhân biểu hiện KMM cổ điển Bhatia và cộng sự đã chỉ ra đột biến một nucleotide duy nhất (chr11: 31,685,945G>T) nằm trong vùng tăng cường SIMO gây ra KMM Vị trí đột biến này nằm xuôi so với PAX6 và cách nó xấp xỉ 150Kb Tác giả cho rằng đột biến này làm ảnh hưởng tới vị trí nhận biết PAX6 tạo vùng này, do đó phá vỡ vòng tự điều hoà, và dẫn đến giảm biểu hiện protein gây ra thiếu hụt do đơn bội [25] Một vài mất đoạn mà bao gồm vùng điều hoà 3’ khác cũng đã được báo cáo gây ra khuyết mống mắt (hình 1.3) [9, 45 – 47]

1.2.3.5 Đột biến cấu trúc

Đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể (mất đoạn, lặp đoạn, chuyển đoạn,

hoặc đảo đoạn) bao gồm một phần hoặc toàn bộ gen PAX6 hoặc các thành

20 phần điều hoà chiếm tới 10% tất cả các trường hợp KMM Một số nghiên cứu thấy rằng dạng đột biến này phổ biến hơn ở các trường hợp KMM bột phát so với dạng di truyền theo gia đình, tuy nhiên một số nghiên cứu khác lại không thấy sự khác biệt nào đáng kể [2, 7, 61, 62] Mất đoạn lớn ở vùng chứa gen

PAX6 và các gen liền kề, như WT1, dẫn đến bệnh hệ thống, như WGAR, đặc

trưng bởi sự có mặt của khối u Wilms, KMM, bất thường sinh dục, chậm phát triển trí tuệ

1.2.3.6 Đột biến hai alen

Những đột biến mà ảnh hưởng cả hai alen PAX6 hiếm khi được mô tả

và gây ra những bất thường mắt và phát triển thần kinh nghiêm trọng, trong hầu hết các trường hợp dẫn tới chết phôi [6, 63] Một bệnh nhân với tổ hợp hai đột biến dị hợp tử khác nhau (compound heterozygous mutations) trên

PAX6 đã được mô tả với biểu hiện mắt nhỏ, tiểu đường sơ sinh, suy tuyến

yên, đầu nhỏ, tương tự như thể ba nhiễm 21 Bệnh nhân được di truyền một đột biến sai nghĩa ảnh hưởng vùng PD từ cha (c.112C>T, p.Arg38Trp), và một đột biến vô nghĩa trong vùng HD từ mẹ (c.718>T, p.Arg240*) Người cha có giác mạc nhỏ và đục thuỷ tinh thể nghiêm trọng, trong khi đó người

mẹ biểu hiện với KMM cổ điển theo gia đình [64] Có thể thấy rằng dù bị ảnh hưởng nhưng sản phẩm protein của biến dị sai nghĩa vẫn giữ một số chức năng PAX6, vì đây là gen rất nhạy với liều lượng Một bệnh nhân khác với tổ hợp hai đột biến dị hợp tử (c.607C>T, p.Arg203* và c.1058C>G, p.Ser353*),

có biểu hiện với không có mắt, khiếm khuyết hệ thần kinh trung ương nghiêm trọng, bao gồm não nhỏ và hoàn toàn không có thể chai và khứu giác, đáng buồn là em bé mất vài ngày sau khi sinh [63]

1.2.4 Các gen khác

Khuyết mống mắt cổ điển hầu như vẫn được coi là một rối loạn di truyền đơn gen Hiếm khi nào kiểu hình giống KMM là do các đột biến trong hai gen gây bệnh rối loạn bán phần trước của mắt Đã có công bố hai trường

hợp KMM, một với đột biến nội gen PITX2 [65] và một với đột biến trong vùng điều hoà của PITX2 nằm ở đầu mút nhiễm sắc thể [45] Hơn nữa, có bảy trường hợp với đột biến gen FOXC1 trong đó ba trường hợp là đột biến sai

21 nghĩa [45] và bốn trường hợp là mất toàn bộ gen [45, 66] Trong chín trường hợp KMM này có bảy bệnh nhân với tăng nhãn áp bẩm sinh (một trường hợp không có thông tin), nhiều bệnh nhân khi sơ sinh biểu hiện với chứng mắt trâu Điều này cho thấy rằng hiện tượng này phổ biến ở người KMM do

FOXC1 hơn là ở người với đột biến PAX6

Zhang và cộng sự năm 2015 đã mô tả một đột biến sai nghĩa tách biệt

trên gen TRIM44 ở một gia đình có bệnh KMM di truyền [67] Gen này cũng nằm trên vùng 11p13 và cách PAX6 4 Mb Tuy nhiên, một số tác giả cho rằng

nên thận trọng khi mô tả khả năng gây bệnh vì đây là phả hệ duy nhất được

hỗ trợ bởi dữ liệu nghiên cứu chức năng in vitro [45]

Vẫn còn một tỷ lệ đáng kể bệnh nhân KMM không chẩn đoán di truyền được [45] Năm 2016, Ansari và cộng sự phân tích 42 trường hợp khuyết

mống mắt nhưng âm tính với PAX6 bằng aCGH và chỉ xác định được 15

trường hợp Do đó, còn 27 trường hợp không tìm được nguyên nhân Sau đó, một số tác giả tiếp tục nghiên cứu trên số bệnh nhân này và xác định được các

đột biến trong ITPR1 nên quy về hội chứng Gillespie [22, 23] Vì vậy, một số

tác giả ước tính rằng sẽ có khoảng 5% bệnh nhân với KMM cổ điển sẽ không tìm được nguyên nhân [68]

PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN

1.3.1 Chẩn đoán lâm sàng

Thông thường bệnh nhân được chẩn đoán với KMM bởi bác sĩ nhi khoa khi được cha mẹ cho đi khám vì nghi ngờ có vấn đề về thị lực Tuy nhiên, chẩn đoán KMM cần được khẳng định lại bởi một bác sĩ chuyên về nhãn khoa Một số xét nghiệm di truyền phân tử có thể được chỉ định để trợ giúp bác sĩ nhãn khoa đưa ra chẩn đoán cuối cùng

Phương pháp đánh giá lâm sàng quan trọng nhất là sử dụng đèn lamp để xác định bất thường mống mắt và đồng tử Những hiện tượng như đục giác mạc, giãn mạch và đục thuỷ tinh thể hoặc tăng nhãn áp cũng có thể xuất hiện Đối với trẻ sơ sinh thì đèn Slit-lamp dạng cầm tay là thích hợp nhất Sử dụng kỹ thuật soi đáy mắt có thể chứng minh suy sản hố thị giác và bất cứ bất thường thần kinh thị giác nào, nhưng đối với trẻ sơ sinh cần sử

Slit-22 dụng máy soi đáy gián tiếp Trẻ em nhỏ có thể cần được kiểm tra dưới gây

mê Sử dụng kỹ thuật chụp cắt lớp võng mạc có thể chứng minh tình trạng suy

hố thị giác [69], tuy nhiên việc này khó thực hiện ở những em nhỏ với rung giật nhãn cầu Đối với trẻ sơ sinh có đục giác mạc hoặc phù giác mạc nghiêm trọng do tăng nhãn áp bẩm sinh, sử dụng siêu âm tần số cao với phần trước trước có thể chứng minh suy sản hoặc bất sản mống mắt

1.3.2 Chẩn đoán di truyền

Việc xem xét tiền sử gia đình ở bệnh nhân nhi đã được chẩn đoán lâm sàng với KMM là cần thiết Đối với các bất thường do đột biến PAX6 ở trẻ thì cha/mẹ nên được khám mắt ngay nếu cha/mẹ đã có tiền sử rõ ràng Nếu bệnh

nhân có cha/mẹ mắc bệnh tương tự khả năng có đột biến mất gen WT1 là

thấp, tuy vậy đã có một số trường hợp hiếm được báo cáo [2, 70]

Đánh giá trạng thái phân tử PAX6

Mặc dù đột biến trong gen gặp phổ biến hơn ở bệnh nhân KMM so với đột biến mất đoạn, việc phân tích mất đoạn được khuyến cáo đầu tiên bởi vì tầm quan trọng của việc xác định mất đoạn WAGR trong lâm sàng Phương pháp aCGH độ phân giải cao dùng cho kiểm tra vi mất đoạn chỉ yêu cầu một lượng nhỏ mẫu ADN giúp làm tăng hiệu quả và giảm chi phí của xét nghiệm Những bệnh nhân không tìm ra được vi mất đoạn bằng các kỹ thuật như aCGH sẽ được kiểm tra các đột biến trong gen nhờ kỹ thuật giải trình tự (bao gồm cả công nghệ giải trình tự Sanger hoặc thế hệ mới) (hình 1.5) Tuy nhiên, phương pháp aCGH không phát hiện được những bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể mà không dẫn tới thay đổi số lượng bản sao Một số phòng thí nghiệm vẫn dùng phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) để xác định đột biến cấu trúc NST mà phá vỡ chức năng PAX6 (không thay đổi bản sao) [2, 7] Tuy nhiên, hiện nay công nghệ giải trình tự toàn bộ hệ gen có thể thay thế FISH cho xác định bất thường cấu trúc dạng cân bằng [71] Bên cạnh đó sử dụng phương pháp MLPA có thể xác định mất đoạn tại các vùng đích [12] Người ta cũng đã phát hiện ra mất đoạn hoặc lặp đoạn trên vùng 11p13 ở một gia đình mà có cha mẹ chuyển đoạn cân bằng [72]

23 Những trường hợp không có đột biến mất đoạn gen được phát hiện, nên thực hiện phân tích đột biến trong gen PAX6 Việc này có thể được yêu cầu bởi cha mẹ hoặc chính bệnh nhân sau khi đã được bác sĩ tư vấn về ý nghĩa của xét nghiệm di truyền Các đột biến điểm trong gen được xác định bởi giải trình tự trực tiếp exon và các vùng nối exon-intron Một số mất đoạn nhỏ trong gen cũng có thể xác định được bởi aCGH hoặc MLPA [12]

Chiến lược xét nghiệm di truyền được các chuyên gia đề xuất như sau (Hình 1.5):

• Sử dụng aCGH độ phân giải cao để kiểm tra vi mất đoạn đối với các trường hợp KMM được chẩn đoán mới

• Nếu phát hiện đột biến mất đoạn, xác định mức độ chính xác

• Kiểm tra mất đoạn của PAX6 và WT1 để xác nhận chẩn đoán hội chứng WAGR

• Nếu không phát hiện mất đoạn, sử dụng kỹ thuật giải trình tự để sàng lọc đột biến trong vùng mã hoá PAX6

• Nếu có họ hàng bị bệnh, kiểm tra xác định xem họ có mang cùng đột biến với bệnh nhân

• Nếu gia đình không có tiền sử, kiểm tra ADN cha mẹ để xác định liệu

có phải đây là đột biến phát sinh mới hay không Kiểm tra tình trạng khảm ở cha mẹ để dự đoán khả năng tái xuất hiện trong những đứa trẻ tiếp theo của họ

Khi xác định được đột biến trên PAX6 gây bệnh sẽ giúp xác nhận chẩn

đoán KMM đơn Những cá thể mà âm tính trong những xét nghiệm này có thể

có đột biến sâu trong vùng intron hoặc các thành phần vùng điều hoà Ngoài

ra, bệnh nhân có thể có các đột biến trong FOXC1, PITX2 hoặc PITX3 (hoặc

các gen tiềm năng khác, vẫn chưa được xác định), gây ra kiểu hình tương đồng với KMM (Hình 1.5) [65, 73, 74]

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH KHUYẾT MỐNG MẮT

Có khá nhiều nghiên cứu về KMM bẩm sinh trên thế giới được công bố trong những năm gần đây Bốn hướng tiếp cận chính của các nghiên cứu KMM bao gồm: 1) xác định đột biến di truyền gây bệnh và bổ sung vào cơ sở

dữ liệu; 2) tìm hiểu cơ chế gây bệnh của các dạng đột biến; 3) tìm hiểu về mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình ở người mắc bệnh; và 4) nghiên cứu về liệu pháp điều trị đối với những bệnh nhân mắc KMM bẩm sinh

Phần lớn các nghiên cứu xác định đột biến di truyền gây bệnh KMM sử dụng hai phương pháp chính là giải trình tự Sanger và MLPA Sự kết hợp của hai kỹ thuật này nhằm tìm kiếm đột biến trong gen PAX6 và mất đoạn vùng

25 11p13 để sàng lọc hội chứng WAGR [11] Ngoài ra, một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật aCGH với độ phân giải cao và thiết kế riêng để sàng lọc locus 11p13 nhằm nâng cao hiệu quả tìm kiếm đột biến [9] Hơn nữa, sử dụng droplet PCR các nhà khoa học còn phát hiện được tình trạng khảm đột biến PAX6 (đột biến phát sinh sau giai đoạn hợp tử) [75] Sử dụng real time PCR nhiều tác giả đã chỉ ra nồng độ mRNA ở những bệnh nhân chứa đột biến mã kết thúc sớm có nồng độ bằng một nửa so với mẫu đối chứng Từ kết quả này các tác giả cho rằng nguyên nhân gây bệnh đối với trường hợp đột biến tạo PCT là do mRNA bị phân huỷ theo cơ chế NMD [76] Một nghiên cứu khác cũng đã chỉ ra cơ chế tương tự gây ra sự thiếu hụt protein PAX6 ở những bệnh nhân có đột biến điểm cắt Điều này nghĩa là một số đột biến điểm cắt sau đó tạo ra mã kết thúc sớm và do đó mARN bị phân huỷ khiến lượng protein được sản xuất không đủ [60] Ngoài ra, một số công cụ tin sinh học cũng được sử dụng trong nghiên cứu để dự đoán chức năng protein được sinh

ra từ các gen lỗi nhằm tìm kiếm cơ chế gây bệnh KMM [77]

Hướng nghiên cứu đánh giá mối tương quan kiểu đột biến và sự biểu hiện bệnh cũng được một số tác giả trên thế giới quan tâm Pedersen và cộng

sự năm 2020 đã báo cáo nếu bệnh nhân có đột biến trong vùng mã hoá của

gen PAX6 sẽ gây ra lớp bên ngoài võng mạc mỏng hơn so với đột biến vùng

không mã hoá [78] Ngược lại, cũng có nghiên cứu chưa phát hiện được bất

cứ mối tương quan giữa kiểu đột biến và kiểu hình ở bệnh nhân mắt tật khuyết mống mắt [61]

Điều trị và chăm sóc đối với những bệnh nhân mắc chứng bệnh di truyền nói chung và tật khuyết mống mắt nói riêng được rất nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Đã có nghiên cứu nhằm tìm ra hướng điều trị cho bệnh nhân

KMM mang đột biến vô nghĩa trên PAX6 Trong một thử nghiệm in vitro Liu

và cộng sự có thể tăng việc sản xuất protein ở dòng tế bào bạch cầu từ người

bệnh có đột biến PCT trên PAX6 lên tới 30-40% [79] Hơn nữa, mô hình tế

bào giác mạc mắc bệnh do khuyết mống mắt cũng đã được tạo ra bởi công nghệ CRISPR/Cas 9, đồng thời tác giả đã sử dụng protein PAX6 tái tổ hợp để chữa trị và kết quả thể hiện khá khả quan [80] Tuy nhiên, vẫn cần nhiều

26 nghiên cứu cận lâm sàng và lâm sàng để có đủ bằng chứng cho việc ứng dụng những phương pháp điều trị này đối với bệnh nhân KMM

Cho đến nay, ở Việt Nam có ba báo cáo nghiên cứu đề cập tới các trường hợp dị tật KMM Trong đó, tác giả Phạm Thị Chi Lan là người đầu tiên báo cáo về 30 trường hợp bệnh nhân KMM tại Hội nghị nhã khoa toàn quốc năm 2008 Tuy nhiên, đây chỉ là một báo cáo nhận xét về bệnh này theo

hồ sơ bệnh án của bệnh nhân tại Bệnh viện Mắt TP Hồ Chí Minh từ năm

2000 tới 2007 [81] TS Lê Đỗ Thuỳ Lan tại Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch là tác giả thứ hai có đề cập tới dị tật KMM trong nghiên cứu của cô năm 2010 Trong nghiên cứu này bác sĩ Lan tính toán tỷ lệ của những kiểu dị tật mắt bẩm sinh chứ không thực hiện phân tích di truyền phân tử của bệnh [82] Báo cáo thứ ba về KMM do TS Vũ Thị Bích Thuỷ và cộng sự tại Bệnh viện Mắt trung ương đăng trên tạp chí Nhãn khoa Việt Nam năm 2010 Bệnh nhân nhập viện do tình trạng tăng nhãn áp nặng (Glôcôm), sau đó được chẩn đoán KMM bẩm sinh [83] Tuy nhiên, giống như hai công trình ở trên nghiên cứu này cũng không thực hiện chẩn đoán phân tử để tìm đột biến gây ra tình trạng KMM ở bệnh nhân

27

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng của nghiên cứu là mười bốn bệnh nhân đã được chẩn đoán KMM trên lâm sàng từ năm 2019 – 2020 tại các bệnh viện chuyên khoa trên địa bàn thành phố Hà Nội Chẩn đoán KMM được thực hiện bởi bác sĩ chuyên nhãn khoa dựa trên thăm khám lâm sàng Độ tuổi chẩn đoán từ 1 tới 27 tuổi Đối với các bệnh nhi việc tham gia nghiên cứu được sự đồng ý của cha mẹ Mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân và những người thân trong gia đình được thu và bảo - 20°C cho đến khi tách chiết ADN Nghiên cứu này được chấp thuận bởi Hội đồng Đạo đức trong nghiên cứu Y Sinh học (Institutional Review Board-IRB) của Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Phương pháp nghiên cứu phù hợp với các quy định của tuyên bố Helsinki và Hiệp hội nghiên cứu về thị lực và nhãn khoa (Research

in Vision and Ophthalmology ARVO) trên đối tượng con người

2.1.2 Hoá chất và thiết bị

Máy móc, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu này thuộc Viện nghiên cứu

hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Một số thiết bị được sử dụng chính yếu trong nghiên cứu bao gồm: Máy ly tâm Eppendorf (Đức) và máy ly tâm lạnh đa năng 5810R* (Đức); Máy PCR Mastercycler pro

S (Đức); Máy soi gel và chụp ảnh tự động DigiDoc-It® Imaging System của Ultra-violet production (Mỹ); Máy đo 24 quang phổ (UV- Vis BioSpectrometer Basic, Đức); Máy giải trình tự gen ABI 3500 Genetic Analyzer của hãng Applied Biosciences (Mỹ)

• Tách chiết ADN: Sử dụng bộ kít tách chiết ADN từ máu ngoại vi E.Z.N.A.® Blood DNA Mini Kit của hãng OMEGA Bio-tek,

Mỹ

• Điện di: Gel agarose của Affymetrix, Cleveland, Mỹ; Dung dịch TAE 1X; Loading Buffer 6X; Ethidium bromide

28

• Hoá chất PCR: Taq 2X Master Mix của New England Biolab, Mỹ; dNTPs, nước 3D (deionized double distilled (3D) water) và DMSO từ hãng bioWORLD, Mỹ; Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu này được tổng hợp và cung cấp bởi công ty Sinh hoá Phù Sa, Cần Thơ, Việt Nam

• Hoá chất tinh sạch sản phẩm sau PCR: Sử dụng kit Gen JETTM PCR purification của Thermo Scientific, Mỹ

• Hoá chất giải trình tự: Ethanol của Merk, Mỹ; Kit giải trình tự Big Dye Terminator v3.1 của Applied Biosciences

• Hoá chất phản ứng MLPA: Bộ kit SALSA MLPA Probemix P219 PAX6 (MRC-Holland, Amsterdam, Hà Lan)

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ như sau:

Hình 2.1: Sơ đồ phương pháp nghiên cứu

Bước 1

• Thu 2 ml máu tĩnh mạch của bệnh nhân vào ống chống đông chứa EDTA (K2-K3)

Bước 2

• Tách chiết ADN tổng số bằng kít E.Z.N.A.® Blood DNA Mini Kit

• Xác định nồng độ ADN sau tách chiết bằng máy Qubit Fluorometer

29

2.2.1 Thu mẫu

Thu 2 ml máu tĩnh mạch của bệnh nhân vào ống chứa chất chống đông EDTA với hàm lượng 1,5 mg/mL Việc lấy máu cần đảm bảo vô trùng và bảo quản ở -20°C cho đến khi tách chiết ADN

2.2.2 Tách chiết và đánh giá chất lượng ADN

Sử dụng bộ kít E.Z.N.A Blood DNA mini (Omega) để tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu tĩnh mạch của bệnh nhân Tiến hành đo nồng độ của sản phẩm ADN sau khi tách chiết bằng máy Qubit Flourometer sử dụng bộ kít và hướng dẫn sử dụng của hãng Trong phương pháp này, hỗn hợp hoá chất Qubit dye được trộn đều với dung dịch ADN tổng số và sau đó đo tín hiệu huỳnh quang mẫu sau pha trộn Cường độ tín hiệu huỳnh quang nhận được sẽ

tỉ lệ thuận với nồng độ ADN gắn với Qubit dye Từ đó, máy sẽ tính ra nồng

độ ADN trong mẫu sau tách chiết dựa vào so sánh với đường chuẩn được thiết lập dựa trên hai mẫu ADN có nồng độ chuẩn được cung cấp cùng với bộ kít

Ngoài ra, chất lượng ADN sau tách chiết còn được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0.8% Bản gel sau điện di được nhuộm với dung dịch ethidium bromide và kết quả được đánh giá dưới đèn UV

2.2.3 Xác định các đột biến cấu trúc bằng MLPA

Bộ kít SALSA MLPA Probemix P219-B4 PAX6 bao gồm 44 đầu dò MLPA và khuếch đại các sản phẩm có kích thước từ 130 tới 463 nucleotide Trong đó có 32 đầu dò cho vùng 11p13-14 bao gồm: 7 đầu dò xuôi dòng gen

PAX6, 13 đầu dò trên PAX6 (ít nhất mỗi đầu dò cho một exon trừ exon 11), 6

đầu dò nằm giữa gen PAX6 và WT1, 3 đầu dò nằm trên WT1, 3 đầu dò ngược dòng WT1 Ngoài ra, trong bộ kít còn có thêm 3 đầu dò nhắm đến vùng exon

1 của gen SOX2 và 9 đầu dò tham khảo nằm trên nhiễm sắc thể thường