Nghiên cứu mối tương quan giữa mức độ biểu hiện của các gen a20, OTUB1, OTUB2, cezanne và nồng độ các cytokine viêm trên bệnh nhân ung thư bạch cầu

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ---Bùi Kiều Trang NGHIÊN CỨU MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN A20, OTUB1, OTUB2, CEZANNE VÀ NỒ

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-Bùi Kiều Trang

NGHIÊN CỨU MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA MỨC ĐỘ

BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN A20, OTUB1, OTUB2, CEZANNE VÀ NỒNG ĐỘ CÁC CYTOKINE VIÊM TRÊN

BỆNH NHÂN UNG THƯ BẠCH CẦU

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Hà Nội - 2021

BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-Bùi Kiều Trang

NGHIÊN CỨU MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA MỨC ĐỘ

BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN A20, OTUB1, OTUB2, CEZANNE VÀ NỒNG ĐỘ CÁC CYTOKINE VIÊM TRÊN

BỆNH NHÂN UNG THƯ BẠCH CẦU

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Nguyễn Thị Xuân

Hà Nội - 2021

Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực, chínhxác và chưa không trùng lặp với bất kỳ công trình nào đã công bố Mọi thôngtin nội dung tham khảo trong báo cáo đều được trích dẫn cụ thể, rõ ràng.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan trên.

Phòng Hệ gen học miễn dịch, Viện Nghiên cứu hệ gen, người thầy – người chị

đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm việc và hoànthành luận văn Thái độ làm việc chuyên nghiệp của chị đã truyền cảm hứng chotôi và giúp tôi cải thiện bản thân mình rất nhiều sau thời gian thực tập này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến anh Nguyễn Hoàng Giang, chị Đỗ ThịTrang trong phòng Hệ gen học miễn dịch đã nhiệt tình giúp đỡ và chỉ bảo chotôi những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Qua đây tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô của Học viện Khoa học và Côngnghệ đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi rất nhiều để tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đãluôn ủng hộ, khích lệ và động viên tinh thần tôi trong suốt quá trình học tậpcũng như hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Tác giả luận văn

Bùi Kiều Trang

ALL Acute lymphocytic leukemia Bạch cầu dòng lympho cấp tínhAML Acute myeloid leukemia Bạch cầu dòng tủy cấp tínhANOVA Analysis of Variance Phân tích phương sai

cDNA Complement deoxyribonucleic DNA bổ sung

acidCLL Chronic lymphocytic leukemia Bạch cầu dòng lympho mạn tínhCML Chronic myeloid leukemia Bạch cầu dòng tủy mạn tínhDEPC Diethyl pyrocarbonate

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

dNTP Deoxynucleotide

ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Xét nghiệm chất hấp thụ miễn

HRP Horseradish peroxidase

IL-1ββ Interleukin-1ββ

IL-6 Interleukin-6

M-MuLV Moloney Murine Leukemia Virus

mRNA Messenger ribonucleic acid RNA thông tin

OD Optical Density Mật độ quang học

qRT-PCR Quantitative reverse transcription Phản ứng tổng hợp chuỗi

RIP-1β Tumor necrosis factor

receptor-interacting protein-1β

SPSS Statistical Package for the Social

SciencesSTAT Signal transducer and activator of

transcription

TLR Toll-like receptor

TMB 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine

TNFR Tumor necrosis factor receptor

TNF-α Tumor necrosis factor-α

TRAF6 TNF receptor-associated factor 6

Bảng 3.1β: Tương quan giữa mức độ biểu hiện gen A20 với nồng độ của các

cytokine IL-6, TNF-α, IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho cấp tính 40

Bảng 3.2: Tương quan giữa mức độ biểu hiện gen OTUB1 với nồng độ của các

cytokine IL-6, TNF-α, IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho cấp tính42

Bảng 3.3: Tương quan giữa mức độ biểu hiện gen OTUB2 với nồng độ của các

cytokine IL-6, TNF-α, IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho cấp tính43

Bảng 3.4: Tương quan giữa mức độ biểu hiện gen Cezanne với nồng độ của các

cytokine IL-6, TNF-α, IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho cấp tính44

Bảng 3.5: Tương quan giữa mức độ biểu hiện gen A20 với nồng độ của các

cytokine IL-6, TNF-α, IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho mạn tính45

Bảng 3.6: Tương quan giữa mức độ biểu hiện gen OTUB1 với nồng độ của các

cytokine IL-6, TNF-α, IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho mạn tính46

Bảng 3.7: Tương quan giữa mức độ biểu hiện gen OTUB2 với nồng độ của các

cytokine IL-6, TNF-α, IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho mạn tính48

Bảng 3.8: Tương quan giữa mức độ biểu hiện gen Cezanne với nồng độ của các

cytokine IL-6, TNF-α, IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho mạn tính49

Bảng 3.9: Tương quan giữa mức độ biểu hiện gen A20 với nồng độ của các

cytokine IL-6, TNF-α, IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng tủy cấp tính 51β

Bảng 3.1β1β: Tương quan giữa mức độ biểu hiện gen OTUB2 với nồng độ của các

cytokine IL-6, TNF-α, IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng tủy cấp tính 53

Bảng 3.1β2: Tương quan giữa mức độ biểu hiện gen Cezanne với nồng độ của các

cytokine IL-6, TNF-α, IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng tủy cấp tính 55

Bảng 3.1β3: Tương quan giữa mức độ biểu hiện gen A20 với nồng độ của các

cytokine IL-6, TNF-α, IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng tủy mạn tính 56

Bảng 3.1β4: Tương quan giữa mức độ biểu hiện gen OTUB1 với nồng độ của

các cytokine IL-6, TNF-α, IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng tủy mạn tính 57

Bảng 3.1β5: Tương quan giữa mức độ biểu hiện gen OTUB2 với nồng độ của

các cytokine IL-6, TNF-α, IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng tủy mạn tính 59

Bảng 3.1β6: Tương quan giữa mức độ biểu hiện gen Cezanne với nồng độ của

các cytokine IL-6, TNF-α, IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng tủy mạn tính 60

Hình 1β.2: Hình ảnh tế bào bạch cầu dòng lympho trong bệnh ALL 1β1βHình 1β.3: Hình ảnh tế bào bạch cầu dòng lympho trong bệnh CLL 1β2Hình 1β.4: Hình ảnh tế bào bạch cầu dòng tủy trong bệnh AML 1β4Hình 1β.5: Sự hình thành nhiễm sắc thể Philadelphia 1β5Hình 1β.6: Hình ảnh tế bào bạch cầu dòng tủy trong bệnh CML 1β5Hình 1β.7: Cấu trúc của protein A20 1β8Hình 3.1β: Ảnh minh họa điện di đồ sản phẩm RNA tổng số tách chiết từ mẫumáu bệnh nhân và người khỏe mạnh ……… 31β

Hình 3.2: Biểu hiện mRNA của các gen A20, OTUB1, OTUB2 và Cezanne trên

bệnh nhân bạch cầu dòng lympho cấp tính (cột màu đen) và mẫu người khỏe(cột màu xám) 32

Hình 3.3: Biểu hiện mRNA của các gen A20, OTUB1, OTUB2 và Cezanne trên

bệnh nhân bạch cầu dòng lympho mạn tính (cột màu đen) và mẫu người khỏe(cột màu xám) 33

Hình 3.4: Biểu hiện mRNA của các gen A20, OTUB1, OTUB2 và Cezanne trên

bệnh nhân bạch cầu dòng tủy cấp tính (cột màu đen) và mẫu người khỏe (cộtmàu xám) 34

Hình 3.5: Biểu hiện mRNA của các gen A20, OTUB1, OTUB2 và Cezanne trên

bệnh nhân bạch cầu dòng tủy mạn tính (cột màu đen) và mẫu người khỏe (cộtmàu xám) 35Hình 3.6: Nồng độ các cytokine IL-6, TNF-α và IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầudòng lympho cấp tính 36Hình 3.7: Nồng độ các cytokine IL-6, TNF-α và IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầudòng lympho mạn tính 37

Hình 3.9: Nồng độ các cytokine IL-6, TNF-α và IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầudòng tủy mạn tính 39

Hình 3.1β0: Sự tương quan giữa mức độ biểu hiện gen A20 và nồng độ cytokine

IL-6, TNF-α và IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho cấp tính 41β

Hình 3.1β1β: Sự tương quan giữa mức độ biểu hiện gen OTUB1 và nồng độ các

cytokine IL-6, TNF-α, IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho cấp tính42

Hình 3.1β2: Sự tương quan giữa mức độ biểu hiện gen OTUB2 và nồng độ các

cytokine IL-6, TNF-α và IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho cấp tính43

Hình 3.1β3: Sự tương quan giữa mức độ biểu hiện gen Cezanne và nồng độ các

cytokine IL-6, TNF-α và IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho cấp tính44

Hình 3.1β4: Sự tương quan giữa mức độ biểu hiện gen A20 và nồng độ các

cytokine IL-6, TNF-α và IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho mạn tính46

Hình 3.1β5: Sự tương quan giữa mức độ biểu hiện gen OTUB1 và nồng độ các

cytokine IL-6, TNF-α và IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho mạn tính47

Hình 3.1β6: Sự tương quan giữa mức độ biểu hiện gen OTUB2 và nồng độ các

cytokine IL-6, TNF-α và IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho mạn tính48

Hình 3.1β7: Sự tương quan giữa mức độ biểu hiện gen Cezanne và nồng độ các

cytokine IL-6, TNF-α và IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho mạn tính50

Hình 3.1β9: Sự tương quan giữa mức độ biểu hiện gen OTUB1 và nồng độ các

cytokine IL-6, TNF-α và IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng tủy cấp tính 53

Hình 3.20: Sự tương quan giữa mức độ biểu hiện gen OTUB2 và nồng độ các

cytokine IL-6, TNF-α và IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng tủy cấp tính 54

Hình 3.21β: Sự tương quan giữa mức độ biểu hiện gen Cezanne và nồng độ các

cytokine IL-6, TNF-α và IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng tủy cấp tính 55

Hình 3.22: Sự tương quan giữa mức độ biểu hiện gen A20 và nồng độ các

cytokine IL-6, TNF-α và IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng tủy mạn tính 57

Hình 3.23: Sự tương quan giữa mức độ biểu hiện gen OTUB1 và nồng độ các

cytokine IL-6, TNF-α và IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng tủy mạn tính 58

Hình 3.24: Sự tương quan giữa mức độ biểu hiện gen OTUB2 và nồng độ các

cytokine IL-6, TNF-α và IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho mạn tính 59

Hình 3.25: Sự tương quan giữa mức độ biểu hiện gen Cezanne và nồng độ các

cytokine IL-6, TNF-α và IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu dòng tủy mạn tính 61β

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 5

CHƯƠNG 1β TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8

1β.1β GIỚI THIỆU VỀ BỆNH BẠCH CẦU 8

1β.1β.1β Tình hình bệnh bạch cầu trên thế giới và ở Việt Nam 8

1β.1β.1β.1β Trên thế giới 8

1β.1β.1β.2 Ở Việt Nam 9

1β.1β.2 Phân loại bệnh bạch cầu 1β0 1β.1β.2.1β Bệnh bạch cầu dòng lympho cấp tính (ALL) 1β0 1β.1β.2.2 Bệnh bạch cầu dòng lympho mạn tính (CLL) 1β1β 1β.1β.2.3 Bệnh bạch cầu dòng tủy cấp tính (AML) 1β3 1β.1β.2.4 Bệnh bạch cầu dòng tủy mạn tính (CML) 1β4 1β.2 GIỚI THIỆU VỀ CÁC GEN THUỘC NHÓM DEUBIQUITINASE 1β6 1β.2.1β Gen A20 1β7 1β.2.2 Gen OTUB1 1β8 1β.2.3 Gen OTUB2 1β9 1β.2.4 Gen Cezanne 1β9 1β.3 GIỚI THIỆU VỀ CÁC CYTOKINE 20

1β.3.1β TNF-α 21β 1β.3.2 IL-6 21β 1β.3.3 IL-1ββ 22

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU24 2.1β NGUYÊN VẬT LIỆU 24

2.1β.1β Đối tượng nghiên cứu 24

2.1β.2 Địa điểm nghiên cứu: 24

2.1β.3 Dụng cụ, trang thiết bị 24

2.1β.4 Hóa chất 25

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.2.1β Phương pháp lấy mẫu 26

2.2.2 Tách chiết RNA tổng số và phân tích mức độ biểu hiện gen bằng kỹ thuật Realtime-PCR 26

2.2.2.1β Tách chiết RNA tổng số 26

2.2.2.2 Tổng hợp cDNA từ RNA tổng số 27

2.2.2.3 Phân tích mức độ biểu hiện gen bằng kỹ thuật Realtime-PCR 27 2.2.3 Phân tích nồng độ cytokine trong dịch huyết thanh bằng kỹ thuật ELISA 29

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31β 3.1β TÁCH CHIẾT RNA TỔNG SỐ 31β 3.2 MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN A20, OTUB1, OTUB2 VÀ CEZANNE TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU 32

3.2.1β Mức độ biểu hiện của các gen A20, OTUB1, OTUB2 và Cezanne trên bệnh nhân bạch cầu dòng lympho cấp tính 32

3.2.2 Mức độ biểu hiện của các gen A20, OTUB1, OTUB2 và Cezanne trên bệnh nhân bạch cầu bạch cầu dòng lympho mạn tính 33

3.2.3 Mức độ biểu hiện của các gen A20, OTUB1, OTUB2 và Cezanne trên bệnh nhân bạch cầu bạch cầu dòng tủy cấp tính 34

3.2.4 Mức độ biểu hiện của các gen A20, OTUB1, OTUB2 và Cezanne trên

bệnh nhân bạch cầu dòng tủy mạn tính 353.3 NỒNG ĐỘ CỦA CÁC CYTOKINE TNF-α, IL-6 VÀ IL-1ββ TRÊNBỆNH NHÂN BẠCH CẦU 363.3.1β Nồng độ của các cytokine IL-6, TNF-α và IL-1ββ trên bệnh nhân bạch

cầu dòng lympho cấp tính 363.3.2 Nồng độ của các cytokine IL-6, TNF-α và IL-1ββ trên bệnh nhân bạch

cầu dòng lympho mạn tính 373.3.3 Nồng độ của các cytokine IL-6, TNF-α và IL-1ββ trên bệnh nhân bạch

cầu dòng tủy cấp tính 383.3.4 Nồng độ của các cytokine IL-6, TNF-α và IL-1ββ trên bệnh nhân bạch

cầu dòng tủy mạn tính 393.4 MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN

A20, OTUB1, OTUB2, CEZANNE VÀ NỒNG ĐỘ CỦA CÁC CYTOKINE

TNF-α, IL-6, IL-1ββ TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU 40

3.4.1β Mối tương quan giữa mức độ biểu hiện của các gen A20, OTUB1,

OTUB2, Cezanne và nồng độ của các cytokine TNF-α, IL-6, IL-1ββ trên

bệnh nhân bạch cầu dòng lympho cấp tính 40

3.4.2 Mối tương quan giữa mức độ biểu hiện của các gen A20, OTUB1,

OTUB2, Cezanne và nồng độ của các cytokine TNF-α, IL-6, IL-1ββ trên

bệnh nhân bạch cầu dòng lympho mạn tính 45

3.4.3 Mối tương quan giữa mức độ biểu hiện của các gen A20, OTUB1,

OTUB2, Cezanne và nồng độ của các cytokine TNF-α, IL-6, IL-1ββ trên

bệnh nhân bạch cầu dòng tủy cấp tính 50

3.4.4 Mối tương quan giữa mức độ biểu hiện của các gen A20, OTUB1,

OTUB2, Cezanne và nồng độ của các cytokine TNF-α, IL-6, IL-1ββ trên

bệnh nhân bạch cầu dòng tủy mạn tính 56

3.5 THẢO LUẬN 61βCHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 664.1β KẾT LUẬN 66

4.1β.1β Mức độ biểu hiện của các gen A20, OTUB1, OTUB2 và Cezanne trên

bệnh nhân bạch cầu 664.1β.2 Nồng độ các cytokine IL-6, TNF-α và IL-1ββ trên bệnh nhân bạch cầu

66

4.1β.3 Mối tương quan giữa mức độ biểu hiện của các gen A20, OTUB1,

OTUB2, Cezanne và nồng độ của các cytokine TNF-α, IL-6, IL-1ββ trên

bệnh nhân bạch cầu 664.2 KIẾN NGHỊ 66TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

MỞ ĐẦU

Bệnh bạch cầu là ung thư của các mô tạo máu bao gồm tủy xương và hệbạch huyết, được gây ra bởi sự gia tăng số lượng tế bào bạch cầu trong cơ thể.Bạch cầu là một phần quan trọng trong hệ thống miễn dịch Chúng bảo vệ cơ thểkhỏi sự xâm nhập của vi khuẩn, virus và nấm cũng như từ các tế bào bất thường

và các chất lạ khác Trên lâm sàng, bệnh bạch cầu được xác định là một bệnh áctính của tế bào gốc tạo máu, tương quan với số lượng tế bào bạch cầu tăng trongmáu ngoại biên và tủy xương [1β] Bệnh ung thư bạch cầu bao gồm 4 loại chính:bạch cầu dòng lympho cấp tính (Acute Lymphocytic Leukemia - ALL), bạch cầudòng lympho mạn tính (Chronic Lymphocytic Leukemia - CLL), bạch cầu dòngtủy cấp tính (Acute Myeloid Leukemia - AML) và bạch cầu dòng tủy mạn tính(Chronic Myeloid Leukemia - CML) Bệnh bạch cầu có thể xảy ra ở cả bạch cầulympho hoặc bạch cầu tủy Ung thư phát triển trong các tế bào bạch huyết đượcgọi là bệnh bạch cầu lymphocytic Ung thư phát triển trong các tế bào tủy đượcgọi là bệnh bạch cầu dòng tủy Bệnh có thể là cấp tính (bắt đầu đột ngột vàthường sống ngắn) hoặc mạn tính (tồn tại trong một thời gian dài) Bệnh bạchcầu cấp tính liên quan đến các tế bào mới hoặc chưa trưởng thành, được gọi là tếbào non (blasts) và không thể thực hiện các chức năng của chúng Các tế bào nontăng số lượng nhanh bất thường, và bệnh tiến triển nhanh chóng Trong bệnhbạch cầu mạn tính, có một số tế bào non, nhưng chúng trưởng thành hơn và cóthể thực hiện một số chức năng của chúng Các tế bào phát triển chậm hơn nênbệnh tiến triển dần dần

Nhóm gen deubiquitin A20, OTUB1, OTUB2 và Cezanne mã hóa cho một

số protein thuộc nhóm DUB DUB đóng một số vai trò trong con đườngubiquitin Một trong những chức năng đặc trưng nhất của DUB là loại bỏ chuỗimonoubiquitin và polyubiquitin ra khỏi protein Ubiquitin được gắn vào protein

để điều hòa sự thoái hóa của protein thông qua proteasome và lysosome, điềuphối sự định vị tế bào của protein, kích hoạt và bất hoạt protein, và điều hòa cáctương tác protein – protein [2-4] DUB có thể đảo ngược các hiệu ứng này

bằng cách cắt liên kết peptide hoặc isopeptide giữa ubiquitin và protein cơchất của nó Toàn bộ vai trò của DUB trong các bệnh vẫn chưa được làm rõ.Tuy nhiên, sự tham gia của chúng vào bệnh được dự đoán do vai trò đã biếttrong các quá trình sinh lý có liên quan đến tình trạng bệnh bao gồm ung thư

và rối loạn thần kinh [5] Mặc dù có nhiều nghiên cứu về đột biến và biểu hiện

của gen A20, OTUB1, OTUB2 và Cezanne trên bệnh ung thư, nhưng mức độ

biểu hiện của các gen này ở những bệnh nhân ung thư ở Việt Nam chưa đượcnghiên cứu rộng rãi

TNF-α, IL-6 và IL-1ββ đã được mô tả là các cytokine chính tác động đếnchức năng của các tế bào tạo máu và thúc đẩy các bệnh viêm nhiễm TNF-α vàIL-1ββ được sản xuất với một lượng lớn bởi các tế bào bạch cầu đơn nhân khichúng phản ứng với nội độc tố Hai cytokine này kích thích làm tăng sản xuất lẫnnhau và kích thích sản sinh IL-6, IL-8 và IL-1β0 TNF-α và IL-1ββ gây sốt, hoạthóa hệ thống đông máu và điều hòa phản ứng viêm thông qua sự sản sinh IL-8

và thông qua kích thích biểu hiện các phân tử bám dính IL-6 lại kích thích sảnxuất các protein pha cấp từ gan (CRP, fibrinogen, orosomucoide…) và ức chếngược chính quá trình sản sinh TNF-α và IL-1ββ Điều hòa biểu hiện của các gene

mã hóa cho các cytokine này phụ thuộc vào các yếu tố sao mã, đặc biệt là κBB Trong khi đó, các gen DUB là những gen tham gia điều hòa ngược các phảnứng viêm trong quá trình đáp ứng miễn dịch và tín hiệu phân tử NF-κBB trunggian điều hòa cho hoạt động viêm của gen deubiquitinase

NF-Nhiều nghiên cứu được thực hiện về chức năng của các DUB đã chỉ ra

sự tương tác giữa các DUB và cytokine trên một số bệnh Tuy nhiên, vẫnchưa có một nghiên cứu cụ thể tại Việt Nam về mối tương quan giữa các genthuộc nhóm DUB và nồng độ của các cytokine viêm trên bệnh ung thư

Chính vì lí do nêu trên, tôi tiến hành thực hiện luận văn với tiêu đề:

"Nghiên cứu mối tương quan giữa mức độ biểu hiện của các gen A20,

OTUB1, OTUB2, Cezanne và nồng độ các cytokine viêm trên bệnh nhân

ung thư bạch cầu" với những mục tiêu cụ thể như sau:

- Xác định mức độ biểu hiện của các gen A20, OTUB1, OTUB2 và

Cezanne trên bệnh nhân ung thư bạch cầu

- Xác định nồng độ của các cytokine IL-6, TNF-α và IL-1ββ trên bệnh nhân ung thư bạch cầu

- Xác định mối tương quan giữa mức độ biểu hiện của các gen A20, OTUB1, OTUB2, Cezanne và nồng độ các cytokine IL-6, TNF-α, IL-1ββ trên bệnh

nhân ung thư bạch cầu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1β.1β GIỚI THIỆU VỀ BỆNH BẠCH CẦU

1.1.1 Tình hình bệnh bạch cầu trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.1.1 Trên thế giới

Bệnh bạch cầu là bệnh ung thư được chẩn đoán phổ biến thứ 1β5 và lànguyên nhân gây tử vong do ung thư đứng hàng thứ 1β1β trên toàn thế giới Trongnăm 201β8, ước tính có tổng cộng 437 nghìn ca mắc mới và 309 nghìn ca tử vong

do ung thư bạch cầu trên toàn thế giới [6] Tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu cao nhất ởngười da trắng và thấp nhất ở người Trung Quốc, Nhật Bản và Hàn Quốc Tỷ lệmắc bệnh ở nam giới cao hơn nữ giới khoảng 50% đối với tất cả các nhóm chủngtộc/dân tộc ngoại trừ người Việt Nam, trong đó tỷ lệ nam giới cao hơn khôngđáng kể Tỷ lệ mắc bệnh bạch cầu ở nhóm tuổi trưởng thành (30-54 tuổi) thấphơn so với nhóm tuổi lớn hơn Người ta thấy rằng tỷ lệ bệnh bạch cầu ở trẻ emcao nhất ở người Philippines, tiếp theo là người gốc Tây Ban Nha da trắng,người da trắng không phải gốc Tây Ban Nha và người da đen [7] Nguyên nhâncủa bệnh bạch cầu và các dạng phụ của nó vẫn chưa được hiểu rõ, một phần là

do sự đa dạng của các kiểu đột biến và nhiều yếu tố nguy cơ có thể liên quan.Tiếp xúc với bức xạ, với một số loại hóa trị liệu hoặc với một số hóa chất nhấtđịnh (như benzen, một số thuốc trừ sâu và hóa chất trong khói thuốc lá) làm tăngnguy cơ phát triển một số loại bệnh bạch cầu, mặc dù bệnh bạch cầu chỉ pháttriển ở một số rất ít người bị phơi nhiễm Các hội chứng di truyền có liên quanđến khả năng mắc bệnh bạch cầu ở người trẻ, bao gồm hội chứng Down và Li-Fraumeni và bệnh u sợi thần kinh [8] Ở một số người, bệnh bạch cầu là do một

số bất thường của nhiễm sắc thể gây ra Một loại virus được gọi là virus lympho

T ở người 1β (HTLV-1β), tương tự như virus (HIV-1β) gây ra bệnh AIDS, bị nghingờ gây ra một loại bệnh bạch cầu tế bào lympho hiếm gặp gọi là bệnh bạch cầu

tế bào T trưởng thành Nhiễm virus Epstein-Barr (cũng gây tăng bạch cầu đơnnhân) có liên quan đến một dạng bệnh bạch cầu lymphocytic hiếm xảy ra ở châu

Á và châu Phi

Hình 1β.1β: Hình ảnh so sánh tế bào máu bình thường và bệnh bạch cầu

1.1.1.2 Ở Việt Nam

Bệnh bạch cầu là một bệnh lý ác tính có tỷ lệ tử vong cao trong số các loạibệnh ung thư Theo thống kê tại Viện Huyết học – Truyền máu trung ương, Bệnhviện Bạch Mai, tỷ lệ bệnh bạch cầu cấp chiếm 32.1β%, cao nhất trong số các bệnhliên quan đến máu được khám và điều trị tại Bệnh viện Bạch Mai Ở Việt Nam,các nghiên cứu chuyên sâu về bệnh ung thư máu vẫn còn rất hạn chế Các nghiêncứu mới chỉ dừng lại ở mức độ mô tả các đặc điểm dịch tễ, lâm sàng của bệnh.Nguyễn Quốc Thành và cộng sự đã khảo sát các đặc điểm dịch tễ, lâm sàng, sinhhọc đồng thời đánh giá hiệu quả điều trị bệnh bạch cầu dòng tủy mạn tính ở trẻ

em với Imatinib [9] Cũng trong năm 201β3, tiến sĩ Nguyễn Lê Xuân Trường vàbác sĩ Beverly S Mitchell đã nghiên cứu thành công việc ức chế sự phát triểncủa tế bào ung thư máu bằng cách tác động trực tiếp vào con đường truyền tínhiệu Phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/Akt Từ kết quả của nghiên cứu này đã

mở ra một hướng đi mới trong việc điều trị bệnh bạch cầu dòng tủy cấp tính [1β0].Nghiên cứu của Nguyễn Hữu Phúc và cộng sự đã mô tả hiệu quả và độc tính củacác tác nhân nhắm vào đường dẫn tín hiệu

PI3K/AKT/mTOR trong bệnh bạch cầu dòng tủy cấp tính (AML) Sự pháttriển của các hợp chất chống lại PI3K/Akt và mTORC và các bộ điều biến củachúng như là các tác nhân mới và mạnh để điều trị AML [1β1β].

1.1.2 Phân loại bệnh bạch cầu

Có hai loại bệnh bạch cầu chính là: bệnh bạch cầu cấp tính và mạn tính,tùy thuộc vào tốc độ tiến triển của bệnh Trong bệnh bạch cầu cấp tính, tế bàobạch cầu bị nhiễm không hoạt động hoặc hoạt động như tế bào bạch cầu bìnhthường; trong khi ở bệnh bạch cầu mạn tính, nó có thể hoạt động như tế bàobạch cầu bình thường Do đó, bệnh bạch cầu mạn tính có thể nghiêm trọng vì

nó không thể phân biệt với tế bào bạch cầu bình thường Hơn nữa, có hai phânnhóm của mỗi loại bệnh bạch cầu tùy thuộc vào kích thước và hình dạng của

tế bào bạch cầu: dòng lympho và dòng tủy Nhìn chung, bệnh bạch cầu đượcchia thành bốn phân nhóm chính bao gồm: Bệnh bạch cầu dòng lympho cấptính (ALL – chiếm 1β0%), Bệnh bạch cầu dòng lympho mạn tính (CLL –chiếm 35%), Bệnh bạch cầu dòng tủy cấp tính (AML – chiếm 33%) và Bệnhbạch cầu dòng tủy mạn tính (CML – chiếm 1β4%) Các loại bệnh bạch cầukhác nhau về cơ chế bệnh sinh, nguồn gốc, tỷ lệ mắc và tiên lượng

1.1.2.1 Bệnh bạch cầu dòng lympho cấp tính (ALL)

Bệnh bạch cầu dòng lympho cấp tính là loại ung thư máu phổ biến nhất

ở trẻ em và người trẻ tuổi, đặc biệt là trẻ trong độ tuổi 2 – 5 [1β2, 1β3] ALL là mộtbệnh lý ác tính của tế bào gốc tạo máu có nguồn gốc từ dòng tế bào tiền thân lympho

B hoặc T và được thúc đẩy bởi một loạt các sai lệch di truyền bao gồm đột biến,chuyển đoạn nhiễm sắc thể và dị bội trong các gen liên quan đến sự phát triển của tếbào lympho và điều hòa diễn biến chu kỳ tế bào [1β4] Ở những bệnh nhân mắc ALL,tủy xương tạo ra quá nhiều tế bào lympho chưa trưởng thành Những tế bào lymphonày không hoạt động như các tế bào lympho bình thường và không có khả năngchống nhiễm trùng Các dấu hiệu thường gặp nhất là sưng hạch bạch huyết, gan lách

to, sốt, thiếu máu, dấu hiệu xuất huyết và đau xương Yếu tố di truyền có thể gây bệnhbao gồm hội chứng

Down, thiếu máu Fanconi, hội chứng Bloom, ataxia-telangiectasia và hộichứng gãy Nijmegen [1β5-1β8] Các yếu tố ảnh hưởng khác bao gồm tiếp xúcvới bức xạ ion hóa, thuốc trừ sâu, một số dung môi hoặc vi rút như virusEpstein-Barr và virus gây suy giảm miễn dịch ở người [1β9-21β].

Bệnh ALL đã ảnh hưởng đến khoảng 876.000 người trên toàn cầu vàonăm 201β5 và dẫn đến khoảng 1β1β1β.000 ca tử vong [22, 23] Tại Hoa Kỳ, ALL làbệnh ung thư phổ biến nhất và gây tỷ lệ tử vong cao nhất do ung thư ở trẻ em Tỷ

lệ mắc ALL ở Hoa Kỳ được ước tính là 1β,6 trên 1β00.000 dân Chỉ riêng trongnăm 201β6, ước tính có khoảng 6590 trường hợp mới được chẩn đoán, với hơn1β400 trường hợp tử vong do ALL (theo Hiệp hội Ung thư Hoa Kỳ)

Hình 1β.2: Hình ảnh tế bào bạch cầu dòng lympho trong bệnh ALL

(Nguồn: [24])

1.1.2.2 Bệnh bạch cầu dòng lympho mạn tính (CLL)

Bệnh bạch cầu dòng lympho mạn tính (CLL) được đặc trưng bởi sự tăngsinh và tích lũy các tế bào lympho B trưởng thành, điển hình là tế bào lympho BCD5+ trong máu ngoại vi, tủy xương, hạch bạch huyết, lách và gan, dẫn đến suygiảm chức năng của tủy xương và phì đại của các cơ quan trên [25] Các yếu tốrủi ro bao gồm có tiền sử gia đình mắc bệnh [26] Những người tiếp xúc với chấtđộc màu da cam và một số loại thuốc trừ sâu cũng có nguy cơ mắc bệnh [27].Cũng có bằng chứng yếu chỉ ra rằng viêm gan C và các bệnh truyền

nhiễm khác có thể làm tăng nguy cơ phát triển bệnh [28] Cơ chế bệnh sinhcủa CLL được giải thích là do sai lệch di truyền mắc phải, phát triển theonhiều bước Thông thường, CLL có liên quan đến sự phá hủy các phần lớncủa vật chất nhiễm sắc thể; ví dụ, sự mất đoạn của nhánh dài của nhiễm sắcthể 1β3 là bất thường nhiễm sắc thể phổ biến nhất, hiện diện ở một nửa số bệnhnhân CLL Các triệu chứng của CLL có thể bao gồm các hạch bạch huyết to,nhưng không đau; mệt mỏi; sốt; đau ở phần trên bên trái của bụng; đổ mồ hôiđêm; giảm cân và nhiễm trùng thường xuyên.

CLL là loại bệnh bạch cầu phổ biến nhất ở người trưởng thành ở cácnước phương Tây, chiếm khoảng 25 – 30% trong tất cả các loại bệnh bạch cầu[25, 29, 30] và nó ít phổ biến hơn ở những người từ châu Á [27] CLL đã ảnhhưởng đến khoảng 904.000 người trên toàn cầu trong năm 201β5 và dẫn đến60.700 người chết [31β] Tỷ lệ mắc CLL tăng theo tuổi; 75% trường hợp đượcchẩn đoán ở tuổi > 60 CLL phổ biến ở nam giới hơn nữ giới, với tỷ lệ giớitính khoảng 1β,5–2: 1β [25] Gần đây, sự gia tăng tỷ lệ mắc bệnh ở những ngườitrẻ hơn đã được báo cáo, vì một phần ba số ca mắc mới được chẩn đoán trước

55 tuổi [32] Mặc dù vậy, xu hướng này không dẫn đến sự thay đổi đáng kể về

tỷ lệ mắc bệnh nói chung [33]

Hình 1β.3: Hình ảnh tế bào bạch cầu dòng lympho trong bệnh CLL

(Nguồn: [24])

1.1.2.3 Bệnh bạch cầu dòng tủy cấp tính (AML)

Bệnh bạch cầu dòng tủy cấp tính (AML) là một rối loạn không đồngnhất được đặc trưng bởi sự nhân bản vô tính của các tế bào tiền thân myeloid(tế bào non) trong tủy xương và máu ngoại vi với khả năng biệt hóa giảm dần[34] AML là bệnh bạch cầu cấp tính phổ biến nhất ở người lớn tuổi Hiệnnay, AML được chữa khỏi ở khoảng 35 – 40% bệnh nhân dưới 60 tuổi [35].Đối với bệnh nhân trên 60 tuổi, tiên lượng vẫn được cải thiện nhưng còn thấp

Loại ung thư này bắt đầu từ tủy xương (mô mềm trong xương gây ranhững bất thường trong toàn bộ tủy, hồng cầu hoặc tiểu cầu) và nó nhanh chóng

di chuyển vào máu Nó cũng đôi khi có thể lan đến các bộ phận khác nhau của

cơ thể như gan, hạch bạch huyết, lá lách, hệ thống thần kinh trung ương (não vàtủy sống) và tinh hoàn Hậu quả là hội chứng suy tủy xương, gây ra thiếu máu,giảm bạch cầu hạt và giảm tiểu cầu, với các biểu hiện lâm sàng đặc trưng là khóthở và suy nhược, nhiễm trùng và chảy máu [36, 37] Nếu không được điều trị,AML thường gây tử vong trong vòng vài tuần kể từ khi thời gian chẩn đoán [36-38] Các yếu tố nguy cơ có thể bao gồm hút thuốc, hóa trị liệu trước đây hoặcđiều trị bức xạ, hội chứng myelodysplastic và tiếp xúc với benzen hóa học.Khoảng một triệu người trên toàn cầu bị ảnh hưởng bởi AML và AML gây ra1β47 trường hợp tử vong trong năm 201β5 [39, 40]

AML thường xuất hiện ở người lớn tuổi Tỷ lệ mắc bệnh ở Hoa Kỳ là3,5 trường hợp trên 1β00.000 người, cao hơn ở bệnh nhân trên 65 tuổi so vớibệnh nhân trẻ hơn (tương ứng là 1β5,9 so với 1β,7), và gây ra khoảng 2,1β% tổng

số ca tử vong do ung thư ở Mỹ, hàng năm tỷ lệ tử vong là 3,2 trên 1β00.000người vào năm 2007 [41β] Mặc dù, việc điều trị bệnh bạch cầu dòng tủy cấptính ở người trẻ tuổi trong những năm gần đây đã có những bước tiến đáng kểnhưng việc điều trị cho người bệnh lớn tuổi vẫn gặp nhiều khó khăn, chưa đạthiệu quả [42] Ngay cả việc áp dụng các phương pháp điều trị hiện nay thì vẫn

có khoảng 70% bệnh nhân từ 65 tuổi trở lên sẽ chết trong vòng 1β năm sau khichẩn đoán [43]

Hình 1β.4: Hình ảnh tế bào bạch cầu dòng tủy trong bệnh AML

(Nguồn: [24])

1.1.2.4 Bệnh bạch cầu dòng tủy mạn tính (CML)

Bệnh bạch cầu dòng tủy mạn tính (CML) là một rối loạn tăng sinh dòng tủy vô tính và là bệnh lý huyết học ác tính đầu tiên có liên quan đến một tổn thương di truyền cụ thể Bệnh được đặc trưng bởi sự xuất hiện của nhiễm sắc thể Philadelphia được cho là dấu hiệu chẩn đoán xác định cho CML và hiện diện ở gần 90% bệnh nhân [44] Trọng tâm của cơ chế bệnh sinh của CML là sự hợp nhất của gen bệnh bạch cầu Abelson murine (ABL) trên nhiễm sắc thể

9 với gen vùng điểm dừng (BCR) trên nhiễm sắc thể 22 tạo nên tổ hợpgen BCR-ABL Điều này dẫn đến biểu hiện của một oncoprotein được gọi làBCR ‐ ABL1 [45] BCR-ABL là một tyrosine kinase hoạt động tích cực, kíchhoạt một số con đường dẫn truyền tín hiệu ảnh hưởng đến sự phát triển vàtồn tại của các tế bào tạo máu Hầu hết các trường hợp CML dường nhưđược gây ra bởi sự chuyển vị được gọi là nhiễm sắc thể Philadelphia (Ph)(khoảng 95% bệnh nhân CML mang nhiễm sắc thể này)

Hình 1β.5: Sự hình thành nhiễm sắc thể Philadelphia (Nguồn:

là 67 tuổi, CML có thể xuất hiện ở mọi lứa tuổi Cũng như các loại bệnh bạchcầu khác, CML xuất hiện nhiều hơn ở nam so với nữ (tỷ lệ nam/nữ là 1β,4:1β)

và xuất hiện phổ biến hơn ở người lớn khoảng 60 - 65 tuổi [47]

Sự ra đời của liệu pháp ức chế tyrosine kinase (TKI) đã khiến CML từmột căn bệnh gây tử vong thành một căn bệnh mạn tính cho đa số bệnh nhân.Trước năm 1β983, tỷ lệ sống sót sau 8 năm của CML là dưới 1β5% Việc sử dụngliệu pháp dựa trên interferon-α và liệu pháp cấy ghép tế bào gốc tạo máu toàn thể(HSCT) đã cải thiện tỷ lệ sống sót sau 8 năm từ 42% (năm 1β983) lên 65% (năm2000) Với sự ra đời của liệu pháp TKI vào năm 2001β, tỷ lệ sống sót sau

8 năm là 87% và tiếp tục được cải thiện khi sử dụng liệu pháp TKI thế hệ thứ hai và thứ ba [48]

1β.2 GIỚI THIỆU VỀ CÁC GEN THUỘC NHÓM DEUBIQUITINASE

Deubiquitinase (DUB) là một nhóm lớn các protease phân táchubiquitin khỏi protein và các phân tử khác DUB có thể đảo ngược những hiệuứng này bằng cách phân cắt liên kết peptide hoặc isopeptide giữa ubiquitin vàprotein cơ chất của nó Deubiquitinase đóng một số vai trò trong con đườngubiquitin Một trong những chức năng đặc trưng nhất của DUB là loại bỏ cácchuỗi monoubiqutin và polyubiquitin khỏi protein Những sửa đổi này là mộtsửa đổi sau dịch mã trong đó các protein ubiquitin đơn lẻ hoặc chuỗi ubiquitinđược thêm vào các lysine của một protein cơ chất Ngoài ra, một vai trò ítđược hiểu hơn của DUB là sự phân cắt của các protein giống ubiquitin nhưSUMO và NEDD8 Một số DUB có thể có khả năng phân cắt các liên kếtisopeptide giữa các protein này và protein cơ chất Một số nghiên cứu chothấy chức năng của DUB thay đổi có liên quan đến một số bệnh, bao gồm cảung thư Do đó, nhiều DUB đã được phân loại là gen gây ung thư hoặc ức chếkhối u vì chức năng điều hòa của chúng đối với hoạt động của các proteinkhác liên quan đến sự phát triển khối u

1.2.1 Gen A20

A20 (còn được gọi là TNFAIP3) được phát hiện lần đầu tiên vào năm

1β990 bởi Dixit và các cộng sự như là một gen được cảm ứng bởi cytokine

trong các tế bào nội mô tĩnh mạch rốn của con người [49, 50] Gen A20 nằm

trên nhiễm sắc thể 6q23.3 và trình tự cDNA của nó dài 4440 bp với khung đọc

mở gồm 2370 nucleotide mã hóa một loại protein được dự đoán là chứa 790

axit amin Protein A20 có tính bảo thủ cao chứa miền khối u buồng trứng

(OTU) có đầu tận cùng amin ở vùng đầu cuối N và bảy miền ngón tay kẽm(ZinF) trong cùng đầu cuối C của nó Miền OTU làm trung gian cho hoạtđộng khử gốc (DUB), miền ZnF4 gắn với chuỗi Ub (ubiquitin) liên kết K63

và ZnF7 gắn với chuỗi Ub liên kết M1β và hỗ trợ hoạt động ligase E3 Ub Do

đó, A20 hoạt động như một enzym chỉnh sửa ubiquitin vì nó có khả năng khử

ubiquitin lẫn ubiquitin hóa [51β, 52]

Protein A20 được xác định là chất điều hòa quan trọng của các con đườngtruyền tín hiệu viêm và chất điều hòa “âm tính” của con đường kích hoạt yếu tốhạt nhân kappa B (NF-κBB), nó có thể làm giảm hoạt động NF-κBB thông qua việctruyền tín hiệu từ một số thụ thể bề mặt như thụ thể các yếu tố hoại tử khối

u (TNFR), thụ thể giống Toll (TLR), và thụ thể tế bào B (BCR) [53] A20 ban

đầu được mô tả là chất ức chế chết tế bào do TNF gây ra [54, 55], tuy nhiên các

nghiên cứu tiếp theo đã chứng minh rằng sự biểu hiện quá mức của A20 ức chế sự hoạt hóa NF-κBB để đáp ứng với các kích thích khác nhau [56] Sự bất hoạt của A20

dẫn đến cơ chế bệnh sinh của một số u lympho [57, 58], trong khi sự biểu hiện quá

mức của A20 được tìm thấy ở bệnh nhi B-ALL [59].

Hình 1β.7: Cấu trúc của protein A20 (Nguồn: [60])

1.2.2 Gen OTUB1

OTUB1 (còn được gọi là Otubain 1β) là một thành viên thuộc họ OTU

DUB và được báo cáo là có liên quan đến nhiều loại khối u ác tính khác nhau

[61β-64] OTUB1 thường được biểu hiện trong một số mô người, ví dụ: thận, đại trực tràng, dạ dày, não và gan [65, 66] OTUB1 có thể hoạt động như một

cysteine protease thủy phân liên kết isopeptide giữa ubiquitin và protein đích

hoặc một phân tử ubiquitin khác OTUB1 có liên quan đến việc điều chỉnh các quá trình sinh lý và bệnh lý OTUB1 có liên quan đến cảm ứng năng lượng

trong tế bào lympho T CD4+ và ảnh hưởng đến sự ổn định của E3 ligaseGRAIL (gen liên quan đến năng lượng trong tế bào lympho) [67] ProteinOTUB1β có vai trò đa dạng trong ổn định p53, ức chế chuỗi liên kết K63 đểsửa chữa đứt gãy chuỗi DNA bằng cách nhắm mục tiêu UBE2N vào sự thoái

hóa, enzyme E2 xúc tác con đường NF-κBB Sự biểu hiện cao của OTUB1

được phát hiện trong khoảng 50% ung thư đại trực tràng, di căn gan, xươngchậu và buồng trứng

Gần đây, vai trò của OTUB1 trong u thần kinh đệm ở người đã được

làm sáng tỏ [68] Các thí nghiệm miễn dịch và hóa mô miễn dịch đã xác định

các mô u thần kinh đệm biểu hiện quá mức các gen OTUB1 và các nghiên cứu thống kê cho thấy rằng kiểu biểu hiện của OTUB1 có liên quan nhiều đến các loại u thần kinh đệm Mặt khác, giảm điều hòa OTUB1 có liên quan đến việc

di chuyển kém và cũng làm tăng biểu hiện E-cadherin của protein liên quanđến hiện tượng chuyển dạng trung mô – biểu mô.

1.2.3 Gen OTUB2

OTUB2 là một trong hai thành viên đại diện của phân họ miền khối u buồng trứng (OUT) của deubiquitinase [69, 70] OTUB1 và OTUB2 thuộc về

lớp protease cystein với đặc điểm nhận dạng và độ tương đồng lần lượt là

48% và 70% OTUB1 có khả năng phân cắt chậm hơn và được ưu tiên liên kết Lys48 poly-ubiquitin [71β] trong khi OTUB2 tách các chuỗi poly-ubiquitin được liên kết khác nhau Một chuỗi xoắn dài N của OTUB1 rất quan trọng để nhận biết và ức chế E2-ubiquitin, do đó OTUB2 không thể nhận ra và ức chế

E2 vì nó thiếu chuỗi xoắn N-terminal [72] Một nghiên cứu gần đây của Li et

al đã xác định vai trò và sự biểu hiện quá mức của OTUB2 trong các mô ung

thư phổi không phải tế bào nhỏ [73] Tuy nhiên nghiên cứu về biểu hiện của

gen OTUB2 trên bệnh ung thư về máu nói chung và các bệnh bạch cầu nói

riêng vẫn chưa được nhắc đến

1.2.4 Gen Cezanne

Cezanne, một DUB thuộc họ protein A20 của miền khối u buồng trứng

(OUT), có chức năng như một chất điều hòa ngược tín hiệu viêm và NF-κBB

[74-78] Tương tự như A20, Cezanne đã được chứng minh là có thể ức chế

con đường NF-κBB bằng cách tách chuỗi K63-polyubiquitin khỏi RIP-1β vàTRAF6 [74, 79]

Cezanne có liên quan đến sinh học ung thư vì trình tự 93 kb chứa Cezanne

được chứng minh là được nhân đôi trong bệnh bạch cầu nguyên bào lympho cấp

tính và ung thư hạch Burkitt Cezanne đóng vai trò quan trọng trong việc dự đoán, cũng như sự phát triển của khối u Bên cạnh đó, Cezanne còn là dấu ấn

sinh học tiềm năng cần cho sự sống của bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan

[80] Ngoài ra, Cezanne được khuếch đại và biểu hiện quá mức trong nhiều bệnh

ung thư, bao gồm các khối u ác tính ở vú, buồng trứng và tuyến tụy

Cezanne còn được thể hiện cao trong cả ung thư biểu mô vảy phổi, ung thư

biểu mô tuyến và tương quan với tiên lượng xấu hơn

1β.3 GIỚI THIỆU VỀ CÁC CYTOKINE

Cytokine, ban đầu được xác định là sản phẩm của các tế bào miễn dịch,

là các protein nhỏ được tiết ra bởi các tế bào, tác động đến sự tương tác giữacác tế bào Cytokine là chất trung gian quan trọng của các phản ứng miễn dịchđược tiết ra để đáp ứng với các kích thích lây nhiễm và không lây nhiễm khácnhau Cytokine có thể hoạt động thông qua các thụ thể đặc và có các hìnhthức tác động:

- Cận tiết – tác động lên các tế bào đích trong không gian lân cận;

- Tự tiết – cytokine do một tế bào nào đó tiết ra lại có tác động trực tiếp lên chính nó thông qua các thụ thể trên bề mặt tế bào;

- Nội tiết – tác động đến các tế bào hay tổ chức ở xa hơn trong cơ thể nhờ cytokine di chuyển trong máu;

- Xúc tiết – chỉ tác động lên các tế bào tiếp xúc với nó

Các cytokine khác nhau có thể kích thích hoặc ức chế sự phát triển của tếbào, điều hòa sự biệt hóa của tế bào, gây ra sự điều hòa hóa học của tế bào vàđiều hòa sự biểu hiện của các cytokine khác Sự cân bằng giữa các cytokine đóngvai trò quan trọng trong việc duy trì các quá trình do chúng điều hòa, vì chúng đãđược chứng minh là tham gia vào cả sự khởi đầu và tiến triển của một số quátrình bệnh lý, chẳng hạn như viêm mạn tính và ung thư [81β]

Một số cytokine gây viêm như TNF-α, IL-6 và IL-1ββ rất cần thiết chochức năng và sự duy trì của tế bào Nồng độ các cytokine này bị thay đổikhông chỉ ảnh hưởng đến các tế bào bạch cầu mà còn tác động đến chức năngcủa các tế bào gốc tạo máu bình thường trong tủy xương [82] và thúc đẩy cácbệnh viêm nhiễm [83-85]

1.3.1 TNF-α

Yếu tố hoại tử khối u - alpha (TNF-α) là một cytokine có tác dụng ức chế

và kích thích các quá trình tế bào đa dạng, có vai trò là cơ quan điều hòa cácphản ứng miễn dịch TNF-α được tiết ra chủ yếu ở tế bào đơn nhân và đại thựcbào, mặc dù các loại tế bào khác, đặc biệt là tế bào lympho T và B và tế bàolympho dạng hạt lớn đã được chứng minh là sản xuất TNF-α khi được kích thích.Aggarwal và cộng sự đã chỉ ra rằng TNF-α có thể được tiết ra bởi nhiều loại tếbào khối u, bao gồm cả CML, B-Cell lymphoma, và có thể hoạt động như mộtchất thúc đẩy khối u nội sinh [86] TNF-α có thể hoạt động như một chất thúcđẩy sự phát triển khối u nội sinh, có liên quan đến sự hình thành khối u, bao gồmbiến đổi tế bào, sống sót, tăng sinh, xâm lấn và di căn Một số nghiên cứu đã xácđịnh nồng độ TNF-α tăng cao ở các bệnh nhân mắc bệnh CLL, AML, … và nóđóng vai trò như một yếu tố tiên lượng ở những bệnh nhân mắc bệnh này [87,88] TNF-α có vai trò trái ngược nhau trong bệnh ung thư TNF-α có thể hoạtđộng trực tiếp hoặc gián tiếp như một yếu tố tăng trưởng khối u tự tiết, trong khinhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng TNF-α gây ra quá trình apoptosis của các tếbào khối u [89, 90] Nghiên cứu cho thấy nồng độ TNF-α trung bình ở bệnh nhânAML cao hơn đáng kể so với người khỏe mạnh

[91β] Và nồng độ TNF-α huyết thanh cao là một yếu tố tiên lượng bất lợi cho khảnăng sống sót và không có biến cố ở bệnh nhân AML [88] Ngược lại, trong nghiêncứu khác, phân tích bệnh nhân AML lúc chẩn đoán hoặc trong thời gian bệnh tái phátcho thấy TNF-α tăng đáng kể ở bệnh bạch cầu mạn tính và bệnh bạch cầu nguyên bàolympho cấp tính nhưng không tăng ở bệnh AML [92]

1.3.2 IL-6

Interleukin-6 (IL-6) là một cytokine được sản xuất bởi nhiều loại tế bào,bao gồm nguyên bào sợi, tế bào nội mô, bạch cầu đơn nhân, tế bào tạo máu bìnhthường và tế bào lympho [93-95] IL-6 được sản xuất bởi các loại tế bào khácnhau và có vai trò trong một số chức năng sinh học bao gồm phản ứng miễndịch, tạo máu, viêm và phản ứng giai đoạn cấp tính của gan Trong khi ở

những người khỏe mạnh nồng độ 6 trong huyết thanh thấp, thì nồng độ

IL-6 tăng cao cũng được tìm thấy ở những bệnh nhân có khối u ác tính như đa utủy. Nồng độ IL-6 cao thường được tìm thấy trong huyết tương của những bệnhnhân mắc bệnh tự miễn [96] Một số nghiên cứu trước đó cho thấy một vai trò cóthể có đối với việc sản xuất IL-6 bị rối loạn điều hòa trong các u lympho ác tính.IL-6 có thể đóng một vai trò trong con đường tự tiết bằng cách thúc đẩy sự pháttriển của một số u lympho tế bào B và u tủy [97, 98] Một số nghiên cứu gần đâyhơn cho thấy nồng độ IL-6 trong huyết tương ở bệnh nhân CLL cao hơn so vớinhóm chứng bình thường và nồng độ này cao hơn trong một bệnh phụ thuộc vàogiai đoạn [99, 1β00] Những phát hiện này cho thấy IL-6 có thể là một dấu hiệu tiênlượng cho bệnh CLL Tuy nhiên, khả năng này vẫn chưa được kiểm tra rộng rãi

1.3.3 IL-1β

IL-1ββ là một cytokine tiền viêm mạnh, có vai trò rất quan trọng đối vớicác phản ứng bảo vệ của vật chủ đối với nhiễm trùng và tổn thương [1β01β] Nócũng là cytokine được nghiên cứu nhiều nhất trong số 1β1β cytokine của họ IL-1β.IL-1ββ được tiết chủ yếu bởi các tế bào dòng tủy [1β02, 1β03] Trong điều kiện bìnhthường, IL-1ββ được tiết ra ở mức độ thấp, và sự biểu hiện hoặc sự hoạt hóa quatrung gian caspase 1β của nó tăng lên khi bị bệnh [1β01β, 1β04] IL-1ββ được tiết raliên kết với thụ thể IL-1βR1β của nó và kích hoạt dòng tín hiệu kiểm soát sự biểuhiện gen của nhiều yếu tố phiên mã, yếu tố tăng trưởng và các interleukin khácliên quan đến chức năng huyết học [1β02] Do đó, IL-1ββ đóng một vai trò quantrọng trong các phản ứng tế bào miễn dịch bẩm sinh và thích ứng IL-1ββ kíchthích sự trưởng thành của tế bào T và tăng cường sự tăng sinh của tế bào B [1β05-1β07] Hơn nữa, IL-1ββ thúc đẩy sự biểu hiện của các phân tử gây viêm nhưcyclooxygenase type 2, phospholipase type 2 A, prostaglandin E2, yếu tố hoạthóa tiểu cầu và oxit nitric [1β08] Điều quan trọng, IL-1ββ điều hòa chức năng tếbào gốc tạo máu (HSC) Một số nghiên cứu đã chỉ ra nồng độ IL-1ββ cao có liênquan đến tiên lượng xấu trong bệnh CML [1β09, 1β1β0] IL-1ββ

tăng được thấy trong giai đoạn tế bào non tiến triển so với giai đoạn mạn tính

và người khỏe mạnh, tương quan với sự mở rộng tế bào non trong tủy xương

và máu ngoại vi, tiên lượng xấu và thời gian sống ngắn hơn ở bệnh nhân [1β09,1β1β1β] Ngoài ra, IL-1ββ còn được tiết ra bởi các tế bào non AML ở người vàbiểu hiện của nó liên quan đến tiên lượng xấu ở bệnh nhân [1β1β2, 1β1β3] Cả IL-1ββ nội sinh và ngoại sinh đều thúc đẩy tăng sinh tế bào non, bằng cách cảmứng các yếu tố tăng trưởng và các cytokine khác như yếu tố kích thích tế bàohạt - đại thực bào Tiên lượng bệnh nhân kém hơn và tỷ lệ sống thấp hơn đượcquan sát thấy ở những bệnh nhân có đáp ứng tăng sinh cao hơn với IL-1ββngoại sinh [1β1β4]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1β NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là 1β07 mẫu máu bệnh nhân mắc bệnh ung thư bạchcầu chưa được điều trị trong đó: 9 mẫu máu bệnh nhân ALL, 1β6 mẫu máu bệnhnhân CLL, 20 mẫu máu bệnh nhân AML, 62 mẫu máu bệnh nhân CML được thuthập ở Viện Huyết học và Truyền máu Trung Ương, Bệnh viện Quân Y 1β03 vàmột số bệnh viện khác Các bệnh nhân đã được thăm khám lâm sàng, làm các xétnghiệm cận lâm sàng và giải phẫu bệnh để chẩn đoán xác định từng loại bệnh.Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân: Không phân biệt nam/nữ, không có bệnh tồnthân kèm theo như các bệnh tự miễn, tim mạch, hô hấp, … Nhóm đối chứng gồm

20 mẫu máu người khỏe mạnh, trong đó không có cá nhân nào đang dùng thuốchoặc bị bất kỳ bệnh cấp tính hay mạn tính nào khác Tất cả bệnh nhân và tìnhnguyện viên đã ký văn bản đồng ý tham gia nghiên cứu Các quy trình thínghiệm và việc chăm sóc từng cá nhân được thực hiện theo luật pháp Việt Nam

và đã được phê duyệt bởi Hội Đồng Y Đức của Viện Nghiên cứu hệ gen, ViệnHàn Lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu:

Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm của Viện Nghiên cứu

2.1.4 Hóa chất

❖ Hóa chất tách chiết RNA tổng số: + RBC Lysis buffer

+ TRIzol RNA Isolation Reagents (Invitrogen, Mỹ) + Chloroform

+ Isopropanol + Ethanol+ Nước RNAse-free

+ Agarose (ThermoFisher Sciencetific, Mỹ)

+ Dung dịch TBE 1βX; RNA Gel Loading Dye (2X) (ThermoFisher Sciencetific, Mỹ)

❖ Hóa chất chuyển RNA thành cDNA: + Nước cất DEPC

+ oligo-dT primer (Invitrogen, Mỹ) + 1β0x reaction buffer (Biolabs)+ dNTP mix (Biolabs)

+ Chất ức chế Rnase (Roche)+ Enzyme phiên mã ngược M-MuLV (Biolabs)

❖ Hóa chất thực hiện phản ứng Realtime-PCR

+ cDNA Master SybrGreen I mix (Roche Molecular Biochemicals)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Quá trình nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ sau:

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu

Bệnh nhân và người khỏe mạnh được lấy 2 ml máu tĩnh mạch, cho vàoống chứa chất chống đông EDTA Quy trình lấy máu đảm bảo vô trùng tuyệtđối

2.2.2 Tách chiết RNA tổng số và phân tích mức độ biểu hiện gen bằng kỹ thuật Realtime-PCR

• Bổ sung 1β ml TRIzol Reagent, vortex đều

• Thêm 200 µl Chloroform, vortex đều

• Ly tâm 1β3000 rpm/1β0 phút/4oC

• Hút 400 µl pha trên sang ống Eppendorf 2 ml mới

• Thêm 400 µl Isopropanol, trộn đều

• Ủ mẫu ở -20oC trong 1β giờ

• Thêm 30-50 µl nước RNAse-free, bảo quản ở -80oC

Sản phẩm thu được sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên agarose

2.2.2.2 Tổng hợp cDNA từ RNA tổng số

• Lấy 1β µg RNA tổng số pha loãng vào nước cất DEPC thành 1β2.5 µl

• Sau đó, thêm 1β µl oligo-dT primer (500 µg/ml) và ủ ở nhiệt độ 70oC trong 2 phút

• Cho thêm vào ống đựng mẫu 2 µl 1β0x reaction buffer, 1β µl dNTP mix(dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 1β0 mM mỗi loại), 0.5 µl chất ức chế Rnase,

0.1β µl enzyme phiên mã ngược M-MuLV và 2.9 µl nước cất DEPC

• Trộn đều mẫu sau đó ủ ở 42oC trong 1β tiếng

• Để dừng phản ứng tổng hợp cDNA, các mẫu được ủ ở 94oC trong 5 phút

• Bảo quản mẫu ở -80oC

2.2.2.3 Phân tích mức độ biểu hiện gen bằng kỹ thuật Realtime-PCR Mẫu cDNA được phân tích mức độ biểu hiện các gen A20, OTUB1, OTUB2, Cezanne và GAPDH.

Bảng 2.1β: Các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng Realtime-PCR

PCR định lượng cho A20, OTUB1, OTUB2 và Cezanne được thực hiện trên

hệ thống LightCycler System (Roche Diagnostics) Tỷ lệ biểu hiện tương

quan giữa các gen (A20, OTUB1, OTUB2, Cezanne) và gen GAPDH đối

chứng được tính trên mỗi mẫu theo phương pháp ngưỡng chu trình

2.2.3 Phân tích nồng độ cytokine trong dịch huyết thanh bằng kỹ thuật ELISA

Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym (ELISA) là mộtphương pháp bắt giữ kháng nguyên đích (hoặc kháng thể) trong các mẫu bằngcách sử dụng kháng thể (hoặc kháng nguyên) đặc hiệu và phát hiện/địnhlượng phân tử đích bằng cách sử dụng phản ứng enzym với chất nền của nó

Trong ELISA, các phức hợp kháng nguyên - kháng thể khác nhau được

sử dụng, bao gồm kháng nguyên hoặc kháng thể được đánh dấu enzym, vàhoạt tính của enzym được đo bằng phương pháp so màu Hoạt động củaenzym được đo bằng cách sử dụng cơ chất sẽ thay đổi màu sắc khi đượcenzym biến đổi Sự hấp thụ ánh sáng của sản phẩm được tạo thành sau khithêm chất nền được đo và chuyển đổi thành các giá trị số

Mẫu máu của bệnh nhân bạch cầu và người khỏe mạnh được ly tâm ở

3000 rpm trong 7 phút, thu lớp huyết thanh bên trên Để phân tích nồng độTNF-α, IL-6 và IL-1ββ có trong mẫu huyết thanh, tôi sử dụng bộ dụng cụ kítELISA thương mại và thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất Các bướctiến hành thí nghiệm ELISA như sau:

+ Dùng kháng thể bắt gắn vào bề mặt của các giếng Đĩa được ủ qua đêm

+ Thêm kháng thể phát hiện có gắn enzyme (horseradish peroxidase) HRP vào các giếng

+ Cho cơ chất tạo màu TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine) vào để gắn với các vị trí có enzyme HRP biểu hiện màu xanh