Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử để đưa gen fea làm tăng số hàng hạt vào các dòng bố, mẹ giống ngô lai LVN 10 phục vụ công tác tạo giống ngô lai năng suất cao

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ---Họ và tên: Phạm Thùy Chi NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ ĐƢA GEN fea* LÀM TĂNG SỐ HÀNG HẠT VÀO CÁC DÒNG BỐ, MẸ GIỐNG NGÔ LAI LVN 10 PHỤC VỤ CÔNG

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-Họ và tên: Phạm Thùy Chi

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ ĐƢA

GEN fea* LÀM TĂNG SỐ HÀNG HẠT VÀO CÁC DÒNG BỐ, MẸ

GIỐNG NGÔ LAI LVN 10 PHỤC VỤ CÔNG TÁC TẠO

GIỐNG NGÔ LAI NĂNG SUẤT CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Hà Nội – Năm 2021

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-Họ và tên: Phạm Thùy Chi

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐỂ ĐƢA

GEN fea* LÀM TĂNG SỐ HÀNG HẠT VÀO CÁC DÒNG BỐ, MẸ

GIỐNG NGÔ LAI LVN 10 PHỤC VỤ CÔNG TÁC TẠO

GIỐNG NGÔ LAI NĂNG SUẤT CAO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Khuất Hữu Trung và TS Đỗ Tiến Phát Các

số liệu và tài liệu được trích dẫn trong luận văn là trung thực Kết quả nghiên cứu này không trùng với bất cứ công trình nào đã được công bố trước đó.

Tôi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình.

Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2021

Tác giả

Phạm Thùy Chi

hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn:

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Khuất Hữu Trung – Phó

viện trưởng – Viện Di truyền Nông nghiệp đã hướng dẫn, tạo động lực và đưa

ra những lời khuyên quý báu cho tôi trong quá trình làm thí nghiệm và thực hiện

đề tài

Tôi xin được cảm ơn TS Đỗ Tiến Phát – Phụ trách Phòng Công nghệ tế

bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, người đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi

hoàn thành luận văn này

Tôi xin được cảm ơn các giảng viên của Viện Khoa học và Công nghệ nơitôi theo học và tập thể cán bộ Bộ môn Kĩ thuật Di truyền - Viện Di truyền Nôngnghiệp luôn động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất -trang thiết bị để tôi có thể hoàn thành khóa học và thực hiện luận văn này

Đồng thời, tôi xin cảm ơn tập thể nhóm nghiên cứu Bộ môn Kĩ thuật Ditruyền - Viện Di truyền Nông nghiệp đã đồng ý cho tôi được tham gia vào đề

tài: “ Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử để đưa gen fea* làm tăng số hàng

hạt vào các dòng bố mẹ của Việt Nam phục vụ tạo giống ngô lai năng suất cao”.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô cùng sâu sắc tới gia đình, bạn bè,đồng nghiệp những người đã luôn bên cạnh, động viên, góp ý cho tôi trong suốtquá trình học tập

Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2021

Tác giả

Phạm Thùy Chi

fea*

MABCMASML10PCR

Hình 1.1: Bắp giống ngô LVN10 ở công ty giống cây trồng TháiBình 9

Hình 1.3: Quá trình backcross qua các thế hệ và tỷ lệ phần trăm gen có trongcác đời backcross 16Hình 2.1 Sơ đồ và kế hoạch lai tạo backcross 21

Hình 3.1 Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST1 giữa cácdòng ML10, BL10, và W223 34Hình 3.2 Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST2 giữa cácdòng ML10, BL10, và W22 34Hình 3.3 Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST3 giữa cácdòng ML10, BL10, và W22 35Hình 3.4 Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST4 giữa cácdòng ML10, BL10, và W22 35Hình 3.5 Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST5 giữa cácdòng ML10, BL10, và W22 36Hình 3.6 Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST6 giữa cácdòng ML10, BL10, và W22 36Hình 3.7 Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST7 giữa cácdòng ML10, BL10, và W22 37Hình 3.8 Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST8 giữa cácdòng ML10, BL10, và W22 37

Hình 3.10 Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST9 giữa cácdòng ML10, BL10, và W22 38

Hình 3.11: Ảnh sản phẩm PCR các cá thể BC5F1 của tổ hợp lai ML10/W22 sử

dụng cặp mồi OVS1-OVS2 39

dụng cặp mồi OVS1-OVS2 40Hình 3.13 Kết quả kiểm tra nền di truyền nhóm cá thể BC5F1 của 31 chỉ thịtrên 10 nhiễm sắc thể 44Hình 3.14 Kết quả kiểm tra nền di truyền của các cá thể BC5F1 thuộc nhóm

3 với các chỉ thị umc1160 và umc1166 45Hình 3.15 Kết quả kiểm tra nền di truyền nhóm các cá thể BC5F1 của 26 chỉthị trên 10 nhiễm sắc thể 48Hình 3.16 Kết quả kiểm tra nền di truyền của các cá thể BC5F1 thuộc nhóm

1 và nhóm 3 với các chỉ thị umc1160 và phi070 48

Hình 3.17: Ảnh sản phẩm PCR các cá thể BC5F2 của tổ hợp lai ML10/W22 sử

dụng cặp mồi OVS1-OVS2 50

dụng cặp mồi OVS1-OVS2 51Hình 3.19: Hình thái các dòng ngô trên đồng ruộng Thái Bình vụ Xuân 2020

ở giai đoạn tung phấn 54Hình 3.20: Hình thái các dòng ngô trên đồng ruộng Thái Bình vụ Xuân 2020

ở giai đoạn tung phấn 55

Hình 3.22: Ảnh bắp sau thu hoạch của các dòng ngô thu tại Thái Bình vụXuân 2020 59Hình 3.23: Ảnh bắp sau thu hoạch của các dòng ngô thu tại Thái Bình vụXuân 2020 60

Bảng 3.1 Các thông tin chi tiết chỉ thị cho đa hình trên 10 nhiễm sắc thể giữadòng ML10 và W22…

Bảng 3.2 Các thông tin chi tiết chỉ thị cho đa hình trên 10 nhiễm sắc thể giữa dòng BL10 và W22… 33

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 3

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ CHỌN TẠO GIỐNG NGÔ TRÊN THẾ GIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM 5

1.1.1 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam 5

1.1.1.1 Sản xuất ngô trên thế giới 5

1.1.1.2 Sản xuất ngô tại Việt Nam 6

1.1.2 Phương pháp chọn tạo giống ngô 7

1.1.2.1 Phương pháp chọn tạo giống ngô trên thế giới 7

1.1.2.2 Nghiên cứu chọn tạo giống trong nước 7

1.2 GIỚI THIỆU VỀ GIỐNG NGÔ LVN10 8

1.3 KHÁI QUÁT VỀ GEN FEA* 9

1.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới về QTLs quy định tính trạng năng suất ngô và gen liên quan đến số hàng hạt trên bắp ngô 9

1.3.2 Gen FEA2 và allele fea* 10

1.4 SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG PHÉP LAI TRỞ LẠI 11

1.4.1 Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng 11

1.4.2 Phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp với lai hồi giao (Marker Assited Backcrossing - MABC) 15

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 VẬT LIỆU 19

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 19

2.1.2 Các loại hóa chất 19

2.2.1 Bố trí thí nghiệm lai trở lại (BC) 21

2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử 22

2.2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA- CTAB 22

2.2.2.2.Phương pháp PCR bằng mồi dCAPs 23

2.2.2.3 Phương pháp sử dụng enzyme cắt giới hạn PstI 24

2.2.2.4.Phương pháp PCR với mồi SSR 25

2.2.2.5 Phương pháp điện di trên gel poly-acrylamide 26

2.2.2.6 Phương pháp điện di trên gel Agarose 26

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 KẾT QUẢ 28

3.1.1 Kết quả xác định chỉ thị đa hình giữa các dòng ML10, BL10 và dòng W22 trên 10 NST 28

3.1.1.1 Kết quả xác định chỉ thị phân tử đa hình ngoài vùng gen fea* giữa dòng ML10 và dòng W22 28

3.1.1.2 Kết quả xác định chỉ thị phân tử đa hình ngoài vùng gen fea* giữa dòng BL10 và dòng W22 30

3.1.2 Kết quả chọn lọc các cá thể trong quần thể BC5F1 mang gen fea* bằng phương pháp chỉ thị phân tử 38

3.1.2.1 Kết quả chọn lọc các cá thể trong quần thể BC5F1 ở dòng ML10 38

3.1.2.2 Kết quả chọn lọc các cá thể trong quần thể BC5F1 ở dòng BL10 38

3.1.3 Kết quả đánh giá nền di truyền các cá thể mang gen fea* trong quần thể BC5F1 40

3.1.3.1 Kết quả đánh giá nền di truyền các cá thể mang gen fea* trong quần thể BC5F1 ở dòng lai ML10 40

3.1.3.2 Kết quả đánh giá nền di truyền các cá thể mang gen fea* trong quần thể BC5F1 ở dòng lai BL10 43

3.1.4.1 Kết quả chọn lọc các cá thể trong quần thể BC5F2 ở

dòng ML10 47

3.1.4.2 Kết quả chọn lọc các cá thể trong quần thể BC5F2 ở dòng BL10 48

3.1.5 Đặc điểm hình thái nông sinh học của các dòng BC5F3 mang gen fea* trong vụ Thu Đông năm 2019 49

3.1.5.1 Đặc điểm hình thái nông học của các dòng BC3F3 49

3.1.5.2 Đánh giá sơ bộ về năng suất của các dòng cải tiến BC5F3 và dòng bố mẹ gốc 53

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

4.1 KẾT LUẬN 59

4.2 KIẾN NGHỊ 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Ngô (Zea mays L.) thuộc chi Zea, tông Androppogoneae, họ Poaceae,

bộ Poales Ngô là cây ngũ cốc quan trọng trong nền kinh tế toàn cầu vì nónuôi sống ít nhất 30% dân số thế giới và là cây lương thực đứng thứ 3 sau lúa

mì và lúa Ngô là nguồn cung cấp lương thực và an ninh dinh dưỡng chủ yếucho hàng triệu người ở các nước đang phát triển, đặc biệt là ở Châu Phi vàChâu Mỹ Latinh Ngô có thể được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhaunhư được dùng làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và sản xuất công nghiệp(nguyên liệu cho sản xuất nhiên liệu sinh học)

Theo số liệu thống kê của USDA (United States Department ofAgriculture) (tháng 1 năm 2017), Mỹ và Trung Quốc vẫn là hai cường quốcsản xuất ngô lớn nhất thế giới với sản lượng lần lượt là 384 triệu tấn và 219triệu tấn (http://worldofcorn.com) Năng suất trung bình ngô của Mỹ là 11.7tấn/ ha (2016) Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng đứng thứ 2 saucây lúa và là cây màu quan trọng nhất được trồng ở nhiều vùng sinh thái khácnhau, đa dạng về mùa vụ gieo trồng và hệ thống canh tác Cây ngô khôngnhững cung cấp lương thực cho người, làm thức ăn cho vật nuôi mà còn giúpxóa đói giảm nghèo tại các tỉnh có điều kiện kinh tế khó khăn Tuy nhiên, ngôlại chỉ được trồng ở những khu vực không có lợi cho việc trồng cây côngnghiệp Do ngô chủ yếu được gieo trồng trong điều kiện không thuận lợi nênsản lượng mặt hàng này của Việt Nam đang rất thấp.Theo số liệu thống kêcủa tổng cục thống kê (http://www.gso.gov.vn/) năm 2016, năng suất ngô

trung bình cả nước vào khoảng 45,3 tạ/ha, sản lượng đạt khoảng 5,23 triệu tấn

trên diện tích gieo trồng khoảng 1,15 triệu ha

Theo thống kê của FAO, Hoa Kỳ và Trung Quốc là hai nước sản xuấtngô hàng đầu thế giới với lần lượt là 377,5 triệu tấn và 224,9 triệu tấn

Sản xuất ngô cả nước qua các năm không ngừng tăng về diện tích,năngsuất, sản lượng: năm 2001 tổng diện tích ngô là 730.000 ha, đến năm 2005 đãtăng lên 1 triệu ha, năm 2010 diện tích ngô cả nước là 1126,9 nghìn ha, năngsuất đạt 40,9 tạ/ha, sản lượng trên 4,6 triệu tấn Tính đến thời điểm năm 2016,diện tích cả nước gieo trồng giảm chủ yếu do hạn hán không gieo trồng được,năng suất ngô năm 2016 đạt 46 tạ/ha (tăng 1,2 tạ/ha so với 2015) Sản lượngước đạt 5,1 triệu tấn Năm 2020 , sản lượng chỉ còn 4,5 triệu tấn do giảmmạnh diện tích gieo trồng cả nước ảnh hưởng của mưa, bão, lũ lụt tại các địaphương phía Bắc [1]

Giống ngô LVN10 của Viện nghiên cứu Ngô, là giống ngô cho năngsuất cao nhất hiện nay ở nước ta, màu sắc và dạng hạt đẹp, độ đồng đều cao,chịu hạn, chịu chua phèn, chống đổ tốt, ít nhiễm sâu bệnh Đây là giống thíchứng với mọi vùng sinh thái trong cả nước Giống LVN10 có trung bình 10-12hàng hạt/bắp, bắp dài 18-22cm, năng suất trung bình 55-65 tạ/ha, thâm canhtốt có thể đạt 80-90 tạ/ha.[2]

Do có nhiểu đặc tính tốt và năng suất cao mà LVN10 được trồng kháphổ biến ở nước ta Nhận thấy tiềm năng phát triển của chúng, chúng tôi chọncách tiếp cận tăng năng suất ngô hơn nữa bằng cách làm tăng số hàng hạt trên

một bắp ngô nhờ sử dụng đột biến fea* có khả năng làm giảm họat tính của

gen kiểm soát sự phân chia của đỉnh sinh trưởng ở bắp ngô.[3]

FEA2 (FASCIATED EAR2) là gene điều khiển kích thước mô phânsinh, do đó có ảnh hưởng đến số hàng hạt trên bắp ngô Bommert và cộng sự

đã phát hiện ra 4 đột biến điểm ở gene FEA2, trong đó có một đột biến lặn

fea* làm giảm hoạt tính của gene FEA2 và tăng số hàng hạt trên bắp nhưng

không gây ảnh hưởng đến các tính trạng khác trên bắp ngô

Cho đến nay, ở Việt Nam chưa tìm thấy kết quả nghiên cứu nào trongnước công bố về tăng năng suất ngô bằng cách tăng số hàng hạt Các gen quyđịnh số hàng hạt trên bắp mới bắt đầu được phát hiện và làm rõ chức năng

Do đó mà nguồn vật liệu mang những đột biến tiềm năng trong việc tăng năngsuất ngô bằng cách tăng số hàng hạt là chưa phổ biến và khó tiếp cận Việc sửdụng chỉ thị phân tử ở ngô đã được sử dụng rất thành công trên thế giới đểchọn tạo giống ngô nhưng chưa được áp dụng ở Việt Nam Do vậy, việc ứng

dụng chỉ thị phân tử trong việc nghiên cứu đưa gen fea* làm tăng số hàng hạt

của các dòng ngô bố mẹ ưu tú sẽ nhanh chóng tạo ra giống ngô lai có năngsuất cao phục vụ cho sản xuất là thực sự cần thiết

Bằng cách lai tạo chuyển đột biến lặn fea* vào các dòng bố mẹ của tổ

hợp lai ngô LVN10 thông qua phương pháp lai trở lại (MABC: markerassisted backcross) có thể cải tiến năng suất của giống ngô này MABC đãđược áp dụng cho lai tạo ngô trên thế giới [4], là phương pháp lai chuyển mộtvài tính trạng ưu việt (đã biết chỉ thị phân tử) từ dòng cho gene sang dòngnhận gene (là dòng muốn cải tiến) bằng lai trở lại có sử dụng chỉ thị phân tử

để chọn lọc con lai Qua mỗi thế hệ lai trở lại (backcross-BC), trong hệ genecủa cây lai thành phần gene (genetic component) của cây cho gene sẽ giảm đimột nửa 50% (F1) , 75% (BC1), 87.5% (BC2), 93.75% (BC3), 96.88%(BC4), 98.43% (BC5) Vì thế, độ giống nhau của cây lai so với dòng nhậngene sẽ tăng dần qua các thế hệ BC

Dòng BC6F1, BC6F2 mang di truyền của giống ngô LVN10, mangthêm gen đột biến fea* có độ đồng hợp cao (>98%) cho năng suất cao hơn sovới dòng bố, mẹ Tổ hợp lai F1 giữa các dòng bố mẹ cải tiến mang gen fea* secho năng suất vượt trội giống ngô lai LVN10 Chính vì vậy chúng tôi tiến

hành đề tài “Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử để đưa gen fea* làm tăng

số hàng hạt vào các dòng bố, mẹ giống ngô lai LVN10 phục vụ công tác tạogiống ngô lai năng suất cao”

2 Mục đích nghiên cứu

Mục tiêu chung : Đánh giá khả năng làm tăng hàng hạt và tăng năngsuất của gen fea* trong giống ngô LVN10 phục vụ chọn tạo giống ngô mới có

năng suất cao hơn.

Mục tiêu cụ thể :

Cải tiến được dòng bố mẹ của LVN10 mang gen fea* bằng phươngpháp chỉ thị phân tử và lai trở lại, từ đó chọn được dòng bố mẹ cải tiến ưu tú,lai tạo được dòng F1 mới tăng lên 2 hàng hạt, năng suất cao hơn giốngLVN10 thương mại hiện nay ít nhất 10%

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: dòng ngô LVN10 của Việt Nam và 2 dòng bốmẹ

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 09/2018 tới tháng 10/2020

Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu thực nghiệm ngoài đồng ruộng tiếnhành tại ruộng ngô Đông Anh, Hà Nội và ruộng ngô tại Viện nghiên cứu câytrồng- Tập đoàn Thái Bình Seed Các thí nghiệm sinh học phân tử được thựchiện, tại Bộ môn Kỹ thuật di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

các gen đồng hợp có mặt trong nền di truyền của cá thể chính xác hơn so vớichọn lọc rút dòng bằng mắt thường, từ đó xây dựng quy trình nghiên cứu trêncác thí nghiệm tương tự để chọn lọc dòng hiệu quả Phương pháp chọn lọcdòng dựa trên chỉ thị phân tử nhanh và chính xác hơn, khắc phục được nhữngnhược điểm của phương pháp chọn lọc dòng truyền thống

fea*, từ đó lai tạo được dòng F1 mới tăng lên 2 hàng hạt, năng suất cao hơngiống LVN10 thương mại, năng suất tăng ít nhất 10% Góp phần làm tăng sảnlượng ngô cả nước và tạo ra một giống ngô mới đưa ra thị trường, tạo tiền đềcho các nghiên cứu lai tạo giống ngô mới ở Việt Nam

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ CHỌN TẠO GIỐNG NGÔ TRÊN THẾGIỚI VÀ TẠI VIỆT NAM

1.1.1 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam

1.1.1.1 Sản xuất ngô trên thế giới

Ngô là cây ngũ cốc nuôi sống gần 1/3 dân số thế giới Ở các nước trồngngô, nó được sử dụng làm lương thực với các mức độ khác nhau Đặc biệt ngô

là cây lương thực đóng vai trò chủ lực tại các nước Nam Á (42.6%), Trung Mỹ(66.3%) và Châu Phi (75%) [5] Ngoài việc được sử dụng làm lương thực, ngôngày nay còn có thể được sử dụng như là nguồn thực phẩm cho con người vớinhiều cách chế biến khác nhau, hoặc thức ăn cho gia súc và tạo sinh khối, haytrong công nghiệp sản xuất cồn, bánh kẹo, tinh bột Gần đây, ngô còn được chútrọng hơn trong công nghiệp vì được sử dụng làm nguyên liệu sản xuất xăngsinh học thay thế cho các nguồn nhiên liệu hóa thạch đang cạn kiệt dần Theo sốliệu thống kê của FAOSTAT năm 2018, Mỹ vẫn đứng đầu trong các cường quốcsản suất ngô trên thế giới với sản lượng 392.5 triệu tấn (million metric tons) vàđóng vai trò rất quan trọng đóng góp cho nên kinh tế nước này Khoảng 20% sảnlượng ngô hàng năm được Mỹ xuất khẩu Diện tích chuyên canh cho cây ngô ở

Mỹ là khoảng 96 triệu ha phân bố ở hầu hết các bang của Mỹ Cường quốc thứhai là Trung Quốc với sản lượng là 257.3 triệu tấn (million metric tons) (năm2018) Mặc dù lúa gạo là thực phẩm chính của quốc gia này, nhưng mấy năm trởlại đây, sản lượng ngô đã tăng lên là do nhu cầu sử dụng ngô trong chăn nuôităng lên Hơn 25 năm qua, sản lượng ngô đã tăng 125%, trong khi sản lượng lúachỉ tăng 7%, và hiện nay, khoảng 60% lương thực được sử dụng cho chăn nuôi.Brazil cũng là cường quốc thứ ba trong sản xuất ngô với sản lượng hàng nămđạt gần 83 triệu tấn (million metric tons) Tiếp theo là Ấn Độ, với sản lượng ngôhàng

năm là 42,3 triệu tấn.Tiếp theo trong bảng xếp hạng là Argentina (40 triệutấn), Ukraine (39.2 triệu tấn), Mexico (32,6 triệu tấn), Indonesia (19 triệu tấn,đứng đầu trong các nước ASEAN, sau đó là Philippines và Việt Nam), Pháp(17,1 triệu tấn), và Nam Phi (15,5 triệu tấn) [6].

Theo thống kê của ETC Group và NGO, tốp 7 công ty hạt giống chiphối 71% thị trường hạt giống trên thế giới bao gồm Monsanto, DuPontPioneer, Syngenta, Vilmorin, WinField, KWS, và Bayer (theo số liệu báo cáonăm 2013) Trong đó ba công tyMonsanto, DuPont Pioneer, và Syngentachiếm 60% thị trường hạt giống cho bông, đậu tương, và ngô

1.1.1.2 Sản xuất ngô tại Việt Nam

Tại Việt Nam, ngô là cây lương thực chính chỉ đứng thứ hai sau lúa gạo.Cùng với cám gạo, sắn, ngô là nguyên liệu quan trọng trong công nghiệp sảnxuất thức ăn chăn nuôi Từ 1990 đến nay, sản xuất ngô trong nước có nhữngbước nhảy vọt đáng kể do đưa những giống ngô lai thay thế giống bản địangày càng nhiều, thay đổi phương pháp canh tác phù hợp với các giống ngôlai Năng suất ngô Việt Nam có tốc độ tăng nhanh hơn tốc độ trung bình thếgiới trong suốt 20 năm qua Tuy nhiên, 70% ngô được trồng trên các vùng cóđịa hình phức tạp, đất cao, phụ thuộc vào nước trời, ít đầu tư thâm canh, bịhạn chế việc áp dụng khoa học kĩ thuật vào sản xuất, hoặc trồng xen canh cùngnhững cây trồng có giá trị cao, do đó năng suất ngô vẫn còn thấp Cùng với đó,côn trùng dịch bệnh gây hại cũng ảnh hưởng rất nhiều làm giảm sản lượngdẫn đến việc năng suất ngô tại Việt Nam thấp, chưa đủ đáp ứng nhu cầu sửdụng ngày càng tăng của người dân

Do sản lượng ngô trong nước không đủ đáp ứng nhu cầu của thị trườngnên mỗi năm nhà nước phải chi hàng tỉ đồng nhập khẩu ngô từ Ấn Độ, Brazil,Argentina, Campuchia, Lào và Thái Lan Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển

Nông thôn Việt Nam và Hiệp hội chăn nuôi Việt Nam năm 2013, nước ta phảinhập khẩu 2,19 triệu tấn ngô Đến năm 2018, kim ngạch nhập khẩu ngô là 3triệu tấn.

1.1.2 Phương pháp chọn tạo giống ngô

1.1.2.1 Phương pháp chọn tạo giống ngô trên thế giới

Để tạo được một giống ngô lai thường trải qua 3 bước: phát triển dòngthuần, thử khả năng kết hợp giữa các dòng thuần, tạo con lai giữa các dòngthuần ưu tú

Phương pháp tạo các dòng thuần từ truyền thống đến hiện đại: rút dòng

tự thụ phấn, nuôi cấy bao phấn và noãn chưa thụ tinh, dùng cây kích đơn bội(haploid inducer) được các nhà lai tạo và chọn giống áp dụng để tạo ra dòngthuần Trong đó, các phương pháp hiện đại như nuôi cấy bao phấn và noãnchưa thụ tinh, và đặc biệt công nghệ inducer rất phát triển, làm rút ngắn thờigian tạo ra dòng thuần

Từ những năm 2007-2010, với sự ra đời của công nghệ giải mã genome,việc chọn tạo giống ngô đã có nhiều bước ngoặt lớn Nhiều tính trạng sốlượng (QTLs) được tìm ra, ứng dụng chỉ thị phân tử để đưa các QTL này vàodòng bố mẹ tốt bằng lai trở lại Chọn lọc trên cả hệ gen (Genomic selection)được đưa vào ứng dụng mạnh Chọn lọc trên cả hệ gen (Genomic selection) làmột dạng của chọn lọc dựa trên marker, trong đó có hàng chục, hàng trăm,hàng nghìn marker bao phủ toàn bộ hệ gen được sử dụng Genomic selection

là chiến lược lai tạo giống đầy hứa hẹn cho việc cải tiến nhanh chóng các tínhtrạng phức tạp

1.1.2.2 Nghiên cứu chọn tạo giống trong nước

Hiện nay, ở Việt Nam, chọn tạo giống ngô vẫn chủ yếu bằng phương pháp rút dòng và lai tạo truyền thống Gần đây, kĩ thuật nuôi cấy bao phấn và

noãn chưa thụ tinh, dùng cây kích đơn bội (haploid inducer) đã được áp dụng

để nhanh chóng tạo ra dòng thuần, nhưng kết quả vẫn còn khá khiếm tốn.Ngô lai ở Việt Nam được chọn tạo cho đến nay chủ yếu dựa vào 4 phươngpháp chính:

Rút dòng bằng tự thụ phấn, tạo dòng thuần kết hợp với chọn lọc: từ cácphép lai giữa các dòng thuần, hoặc từ các dòng F1 thương mại của nướcngoài, qua việc tự thụ phấn 8 thế hệ kết hợp với chọn lọc dòng thuần và laithử (testcross) sẽ chọn ra những dòng bố mẹ để tham gia vào tổ hợp lai mới

Rút dòng bằng nuôi cấy bao phấn: Phấn của cây ngô tạo ra từ các phéplai giữa các dòng thuần, hoặc từ các dòng F1 thương mại của nước ngoài sẽđược nuôi cấy và đa bội hóa để tạo ra dòng thuần sau 1-2 thế hệ

Tạo dòng thuần bằng inducer: Bất kì một cây ngô nào khi nhận phấncủa các dòng tạo đơn bội (female haploid inducer) này có thể tạo ra các hạtđơn bội (8% số hạt sẽ là đơn bội) Cây từ hạt này sẽ được xử lí đa bội hóa đểtạo ra cây nhị bội thuần chủng 100%

Dùng các chỉ thị SSR để xác định khoảng cách di truyền giữa các dòng

bố mẹ tiềm năng: Dùng các chỉ thị phân tử để xác định mối quan hệ về ditruyền giữa các dòng ngô từ đó có thể giới hạn chỉ tiến hành lai những dòngngô nào xa cách về di truyền để có thể tạo ưu thế lai

1.2 GIỚI THIỆU VỀ GIỐNG NGÔ LVN10

Giống ngô lai LVN10 của Viện nghiên cứu Ngô được Bộ Nông nghiệp

và Phát triển nông thôn cho phép khu vực hoá và quy trình sản xuất hạt laiLVN10 được công nhận là tiến bộ ky thuật mới vào tháng 8/1994

Giống LVN10 thuộc nhóm chín muộn, thời gian sinh trưởng vụ xuân

125 - 135ngày, vụ hè thu 95 - 100 ngày, vụ thu đông 110 - 120 ngày Cây cao

200 240cm, cao đóng bắp 100 140cm có 20 21 lá Bắp dài trung bình 18

22cm, đường kính bắp 4,5 5,5cm, có từ 10 12 hàng hạt, số hạt/hàng từ 35

-45 hạt, tỷ lệ hạt/bắp từ 82 - 84%, khối lượng 1.000 hạt khoảng 300 - 330gram, hạt bán răng ngựa, màu vàng da cam Năng suất trung bình 55 - 65tạ/ha, thâm canh tốt có thể đạt 80 - 90 tạ/ha Đặc biệt LVN10 chịu hạn, chịuchua phèn tốt, khả năng chống đổ khá, ít nhiễm các loài sâu bệnh [7]

Hình 1.1: Bắp giống ngô LVN10 ở công ty giống cây trồng Thái Bình.[2]

1.3 KHÁI QUÁT VỀ GEN FEA*

1.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới về QTLs quy định tính trạng năng suất ngô và gen liên quan đến số hàng hạt trên bắp ngô

Tính trạng năng suất (grain yield-GY) ở ngô là một trong những tínhtrạng quan trọng và phức tạp nhất trong chương trình lai tạo giống ngô Trênthế giới đã tìm được 8 QTLs liên quan đến 4 đặc điểm liên quan đến năngsuất: năng suất hạt (GY), khối lượng 100 hạt (HKW), chiều dài 10 hạt (10-kernel length-KL), và chiều rộng của hàng 10 hạt (10-kernel length width

(KW) [8]

So với các tính trạng nhằm tăng năng suất của ngô, số hàng hạt của bắpngô có tầm quan trọng và tiềm năng rất lớn Bắp ngô trung bình có 12-14hàng hạt, nếu tăng thêm hai hàng (mà không làm giảm chiều dài bắp) tức lànăng suất đã tăng lên hơn 10%

Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy hệ số di truyền của tính trạng sốhàng hạt (kernel row number KRN) khá cao (0.97 [4]; hay 0.89 [3]) Đo đạctrong cùng một nghiên cứu, đã xác định hệ số di truyền của số hàng hạt là0.94, cao hơn so với năng suất hạt (0.87) hay khối lượng hạt (0.76) hay độsâu cay (0.9) [4] Điều này đồng nghĩa với việc tính trạng KRN ít chịu ảnhhưởng của môi trường và việc cải thiện gene sẽ có hiệu quả mạnh hơn ở tínhtrạng này so với các tính trạng khác

Những năm gần đây, rất nhiều QTL liên quan đến số hàng hạt và năng suất

ở ngô đã được tìm ra và lập bản đồ (Yang et al 2015 [8], Mendes-Moreira et al

2015 [9], Liu et al 2016 [10], Huo et al 2016 [11], Chen et al 2016 [12])

1.3.2 Gen FEA2 và allele fea*

Gene FEA2 (FASCIATED EAR 2) được phân lập đầu tiên từ dòng ngôđột biến toè đỉnh bắp vào năm 2001 bởi nhóm nghiên cứu của GS DaveJackson và cộng sự Một nghiên cứu năm 2013 tại phòng thí nghiệm của giáo

sư David Jackson, viện Cold Spring Harbor Laboratory, New York, Mỹ đã lần

đầu tiên lập bản đồ chi tiết tính trạng số lượng và tìm ra gene FEA2 qui định

làm tăng số hàng hạt [13] Gene FEA2 qui định một protein thụ quan lặp giàu

leucine trên màng tế bào (Leucine rich repeat receptor) FEA2 là gene tương

đồng với CLAVATA2 ở Arabidopsis Gene FEA2 được biểu hiện mạnh trênđỉnh sinh trưởng của cây ngô (cờ, bắp) và có chức năng làm hạn chế sự pháttriển của định sinh trưởng

Allele đột biến fea* được tạo ra bởi phương pháp gây đột biến bằng

EMS, gây đột biến C->T ở vị trí nucleotide 1430, làm thay đổi amino acidProline ở vị trí 477 thành Leucine trên protein) gây ra tăng hàng hạt rõ nhất

trên bắp so với các đột biến khác Cây ngô mang đột biến fea* này có bắp với

18-20 hàng hạt và đến 289 hạt/bắp so với cây không đột biến của cùng một

nền di truyền chỉ có 14-16 hàng hạt và 256 hạt/bắp Như vậy đột biến fea*

làm tăng năng suất lên 13% (hình 1.2)

Hình 1.2: So sánh ảnh hưởng của đột biến fea* lên bắp ngô

Ghi chú: (A) Bắp của cây mang đột biến fea* (đột biến làm gen FEA2

bị bất hoạt): bắp ngô có tới 30 hàng hạt nhưng bắp ngắn và hàng hạt lộn xộn,

đột biến fea* (đột biến làm gen FEA2 bị yếu đi): bắp có 18 hàng thẳng và

chiều dài bắp không đổi so với giống không đột biến của cùng một nền ditruyền hình B.[14] Ảnh dưới là mặt cắt ngang của bắp với số hàng hạt đượcghi chú ở giữa

1.4 SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG PHÉP LAI TRỞ LẠI

1.4.1 Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng

Từ lâu, các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị hình thái liênkết với một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng chúng như mộtphương tiện hữu ích trong quy trình chọn tạo giống mới Thay vì đánh giákiểu hình của cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mongmuốn, người nghiên cứu chỉ cần tìm những cá thể riêng biệt mang các chỉ thịhình thái liên kết với các gen đó Tuy nhiên các chỉ thị hình thái vốn có sốlượng không nhiều, còn những chỉ thị “may mắn” (liên kết với gen quan tâm)lại càng hiếm gặp, vì thế giá trị thực tiễn của chỉ thị hình thái trong chọn tạogiống gặp nhiều hạn chế Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chỉ thịphân tử, các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm nhiều hơn tới vấn đề “chọngiống nhờ chỉ thị phân tử” (Marker-assisted selection = MAS) với ý đồ sửdụng các chỉ thị phân tử liên kết với các gen mong muốn trong chọn tạo giốngmới So với chỉ thị hình thái, chỉ thị phân tử có những ưu thế sau:

giai đoạn nào và ở bất cứ mức độ nào: tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể,trong khi kiểu hình của phần lớn các chỉ thị hình thái chỉ có thể phânbiệt được trong những giai đoạn nhất định và thường ở mức độ toàn bộ

cơ thể

thị hình thái rất hạn chế

hiệu ứng có hại, trong khi việc đánh giá các chỉ thị hình thái thườnghay đi kèm với những hiệu ứng kiểu hình không mong muốn

phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào, còn các alen củacác chỉ thị hình thái thường tương tác theo kiểu trội - lặn, do đó bị hạnchế sử dụng trong nhiều tổ hợp lai

Đối với chỉ thị hình thái, các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc

đánh giá các cá thể phân ly ở trong cùng một quần thể phân ly, còn đối với chỉ thị phân tử, hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất hiếm gặp

* Các giả thuyết mô hình MAS

Trong những năm gần đây, một vài mô hình MAS đã được các nhàkhoa học đưa ra và được phân tích cặn kẽ Theo một số mô hình, chỉ cần tiếnhành lai trở lại qua 4 thế hệ, chứ không cần đến 6 thế hệ, ngay cả khi quần thểchọn lọc có kích thước nhỏ và các giữ liệu về chỉ thị phân tử bị hạn chế Hơnthế nữa, Frisch M (1999) đã đưa ra chiến lược “chọn lọc hai giai đoạn” để ápdụng trong trường hợp chưa biết các thông tin về bản đồ liên kết của các chỉthị phân tử [15]

Theo Robert Koebner (2003), những tính toán dựa trên cơ sở máy tính

để so sánh các chiến lược chọn lọc 2 bước, 3 bước và 4 bước (stage) về tỷ lệkiểu gen bố mẹ phục hồi (recurrent parent genotype-RPG) cho thấy:

kiểu gen giống bố mẹ (RPG) có thể đạt 96% với độ tin cậy 90% Trongkhi chọn giống truyền thống phải cần tới 6 thế hệ và với rủi ro lớn hơn

tác dụng Khi ngưỡng 1 chỉ thị/20cM đạt được, việc thêm chỉ thị nữa làkhông cần thiết (ngoại trừ các chỉ thị xung quanh locus quan tâm) Tỷ

lệ tái tổ hợp chứ không phải số lượng chỉ thị là yếu tố hạn chế trongviệc giảm các cản trở liên kết Điều đó cho thấy, việc lấy mẫu quần thểlớn hơn với ít chỉ thị hơn có tác dụng hơn việc làm ngược lại.[16]

Như vậy, chỉ thị phân tử làm tăng thêm hiệu quả sàng lọc trong các chương trình chọn giống với các ưu điểm sau:

nhiều dấu hiệu chỉ có thể sàng lọc khi chúng được biểu hiện ở

những giai đoạn muộn hơn trong quá trình sống nếu chỉ sử dụngphương pháp chọn giống cổ điển (ví dụ: chất lượng quả và hạt, tính bấtdục đực, khả năng phản ứng chu kỳ quang).

khó khăn, đắt tiền, tốn thời gian (ví dụ như hình thái rễ, tính khángnhiễm đối với các dịch hại hoặc đối với những nòi, những bệnh đặchiệu, hay tính kháng những điều kiện gây sốc sinh học như hạn, mặn,thiếu muối, các chất độc)

locus trong cùng một thế hệ mà không cần kiểm tra thế hệ sau

vậy mà có thể đưa vào cùng lúc vài gen có giá trị về mặt nông học, ví

dụ đưa vào cùng một lúc nhiều gen kháng dịch hại khác nhau Trongtrường hợp này, các phương pháp sàng lọc kiểu hình các cá thể thôngqua sự lây nhiễm (đồng thời hoặc thậm chí lần lượt từng thể gây bệnhhay từng côn trùng gây hại) rất khó đạt được kết quả Nhưng nếu ápdụng công nghệ chỉ thị phân tử có thể kiểm tra sự có mặt hay vắng mặtcủa từng alen kháng (hay nhiễm) khác nhau ở từng cá thể riêng biệt

biến

ở lúa nhưng ít được dùng cho ngô do nghiên cứu di truyền ở ngô rấtkhó và phức tạp, chỉ có rất ít các gen của ngô được tìm ra Từ khi côngnghệ giải mã hệ gen thế hệ mới (next gene sequencing) ra đời (sau2007), các gen ở ngô đã được tìm ra và công bố rất nhiều, và đang tiếptục tăng Nhiều gene tham gia qui định tính trạng số lượng được tìm ranhư: gen qui định thời gian ra hoa DWARF8 [14]; góc lá đứngLIGULELESS [17]; số hàng hạt FASCIATED EAR [3] đã thúc đẩymạnh ứng dụng của MAS và MABC (marker assisted backcrossing) để

đưa các gen quy định tính trạng số lượng này vào dòng bố mẹ tốt bằng back-cross.

1.4.2 Phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp với lai hồi giao (Marker Assited Backcrossing - MABC)

Thông thường, trong quy trình chọn tạo giống truyền thống, người tađưa nguồn gen mới có tính trạng mong muốn vào 1 giống khác bằng phươngpháp lai trở lại liên tục qua 5-6 thế hệ, hoặc chọn lọc cá thể trong quần thểphân ly từ thế hệ F2 đến các thế hệ tiếp theo Bằng phương pháp này việcđưa gen lặn vào tổ hợp lai hoặc du nhập cùng một lúc vài gen mong muốnvào một dòng ưu việt thường gặp rất nhiều khó khăn hoặc đôi khi không thểthực hiện được [18]

Trong trường hợp ta có 1 giống cây trồng ưu tú nhưng cần đưa thêm mộtvài gen mong muốn vào giống đó, người ta sử dụng quy trình lai trở lại nhiều lầnvới giống ưu tú nhằm thu được 1 giống cây trồng mới mang gen mong muốnnhưng vẫn gữ nguyên nền di truyền của giống ưu tú Theo quy trình lai trở lạitruyền thống, phải ít nhất 6-8 thế hệ mới thu được cây mang gen mong muốnnhưng giữ được gần 100% nền gen di truyền của giống ưu tú

Quy trình tổng quát quá trình lai tạo sử dụng phương pháp lai trở lạiqua các thế hệ và tỷ lệ phần trăm gen có trong dòng BC qua các thế hệ đượcminh họa ở dưới đây (hình 1.3)

Hình 1.3: Quá trình backcross qua các thế hệ và tỷ lệ phần trăm gen có trong

các đời backcross

Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chọn giống nhờ chỉ thị phân tử,các nhà khoa học đã đưa ra một phương pháp chọn giống phân tử mới – đó là

“Chọn giống lai trở lại nhờ chỉ thị phân tử (Marker-Assisted Backcrossing

– MABC) MABC là phương pháp thiết thực, hiệu quả trong việc đưa locusgen quy định tính trạng di truyền số lượng hay gen mong muốn vào giống ưu

tú nhằm chọn tạo giống mới mang gen/tính trạng di truyền số lượng mongmuốn nhưng vẫn giữ nguyên (gần 100%) nền gen di truyền của giống ưu túvới thời gian chọn giống rất ngắn: quy trình chọn giống kết thúc ở thế hệBC3, thậm chí BC2

Nguyên lý của phương pháp MABC là chuyển một tính trạng di truyền

số lượng/gen từ dòng cho gen vào dòng nhận gen trong khi chọn lọc sự hộinhập của dòng cho thông qua phần còn lại của hệ gen [19,20] Việc sử dụngcác chỉ thị phân tử cho phép khảo sát di truyền của con lai ở mỗi thế hệ, đẩynhanh tốc độ của quá trình chọn lọc, vì thế tăng cường nền di truyền qua mỗithế hệ Ưu điểm chính của phương pháp MABC là:

 Chọn lọc nền di truyền đối với hệ gen cây bố mẹ tái tổ hợp

quan

tâm

Hiệu quả của các sản phẩm MABC sẽ được thể hiện trên đồng ruộng [19]

Thông qua phương pháp MABC tốc độ của quá trình chọn lọc đượcđẩy nhanh lên gấp đôi, thậm chí gấp ba (chỉ cần đến thế hệ BC2 hoặc BC3 làđạt kết quả tương đương với BC6 theo phương pháp thông thường) Chọngiống qua phương pháp BC nhờ chỉ thị phân tử còn giúp khắc phục đượcnhững trở ngại mà công tác chọn giống truyền thống rất khó giải quyết nhờloại bỏ được các tác động gây nhiễu do các tương tác trong cùng một alenhay giữa các alen gây ra Những tương tác này thường không thể phát hiệnđược bằng cách phân tích kiểu hình Phương pháp này còn đặc biệt hiệu quảtrong trường hợp cần đưa nhiều gen khác nhau vào một nền gen ưu việt

* Ứng dụng MABC trong chọn lọc ngô.

trạng phức tạp như tính trạng năng suất hạt Sử dụng MABC, 6 đoạn NST từTx303 và Oh43 được chuyển sang 2 dòng thuần B73 và Mo17 qua 3 thế hệlai trở lại và 2 thế hệ tự phối Những dòng được cải tiến được lựa chọn dựatrên những đánh giá Sau đó, phép lai đơn giữa dòng cải tiến B73 và dòng cảitiến Mo17 cho dòng lai tăng năng suất 12-15% [20]

Ribaut et al., 2007 đã mô tả kết quả MABC trong cải tiến năng suất ngôtrong điều kiện khô hạn của ngô nhiệt đới và so sánh với các phương phápthay thế MAS [21] Việc đưa các alleles từ 5 vùng đích mà tham gia vào sựbiểu hiện của các yếu tố cấu thành năng suất và đặc điểm ra hoa đã làm tăngnăng suất hạt và làm giảm sự chênh lệch thời gian ra hoa đực và hoa cái trongđiều kiện thiếu nước Khoảng 85% kiểu gen của bố mẹ (recurrent parent) ởngoài vị trí target đã được phục hồi sau 4 thế hệ MABC bằng việc sàng lọcquần thể phân ly với số lượng cá thể lớn (2200 cá thể) cho 3 thế hệ đầu Các

dòng BC2F3 được lai với 2 tester và đánh giá ở những chế độ nước khác nhaucho thấy năng suất của các dòng lai chọn lọc từ MABC cao hơn so với đốichứng trong điều kiện thiếu nước, ít nhất là 50% (dựa trên năng suất trungbình của 5 dòng lai từ MABC tốt nhất) Kết quả cũng chỉ ra rằng việc chọnlọc khoảng 10-20 kiểu gen ở mỗi chu kì MABC là hiệu quả nhất [21].

Theo báo cáo của Zhao et al., 2012, locus tính trạng số lượng chính

(qHSR1) trên NST số 2 (bin 2.09) quy định khả năng kháng bệnh than (head

smut) đã được tích hợp thành công vào 10 dòng ngô thuần năng suất cao(dòng mẫn cảm với bệnh than) Mỗi dòng thuần này được lai với dòng chogen Ji1037, rồi được lai trở lại với dòng nhận gen tương ứng qua 5 thế hệ

Việc chọn lọc foreground được tiến hành với các marker liên kết với qHSR1 Việc chọn lọc tái tổ hợp (recombinant selection) được tiến hành ở thế hệ BC4

bằng flanking marker để giảm những liên kết kéo theo Việc chọn lọcbackground (chọn lọc nền di truyền) được thực hiện ở thế hệ BC5 với cácmarker SSR bao phủ khắp hệ gen Các cá thể BC5 được chọn lọc sẽ được

cho tự thụ phấn qua hai thế hệ Cả 10 dòng thuần được cải tiến mang qHSR1 đều thể hiện tăng tính kháng với bệnh than Thế hệ lai từ các dòng thuần này

tăng tính kháng rõ rệt và đảm bảo duy trì được các đặc tính nông học ưu túkhác [22, 23]

Gupta et al., 2013 đã sử dụng phương pháp MABC để tạo ra giống ngôlai Vivek Quality Protein Maize (QPM) 9 từ phép lai giữa hai dòng thuần CM

212 và CM 145 mà đã được cải tiến khả năng tổng hợp lysin và trypyophan

bằng cách tích hợp alen opaque-2 từ dòng cho gen là CML 180 và CML170.

Giống ngô lai Vivek Quality Protein Maize (QPM) 9 tăng khả năng tổng hợptryptophan và lysin lên lần lượt là 41 và 30% so với giống ngô lai ban đầu[24]

Gần đây, Zhang et al., 2017 đã lập bản đồ của tính trạng số lượngQgls8 cho khả năng kháng bệnh đốm lá (gray leaf spot - GLS) ở ngô với vùngrộng khoản 130 kb nằm trên NST số 8 bao gồm 5 genes (predicted genes).[25]

Ở Việt Nam, phương pháp MABC cũng đã được áp dụng thành công

để cải tiến một số giống lúa như Bắc Thơm kháng bạc lá, BC15 kháng đạo

ôn, lúa chịu ngập AS996

Nguyễn Thị Lệ., 2014, sử dụng dòng chuẩn kháng IRBB21 mang genkháng bệnh Xa21 lai tạo với giống Bắc Thơm 7 tạo ra giống cải tiến kháng 3chủng bạc lá do Bộ môn bệnh cây- Khoa Nông học phân lập: Chủng 3(Isolate: 981.HUA10146); chủng 5 (Isolate: 996.HUA10147); chủng 14(Isolate: 1035.HUA10153) cho năng suất tương đương với giống Bắc Thơm

7 [26]

Năm 2017, Trần Thị Thúy và các cộng sự đã thiết kế mồi nhận biết gen

ứng viên (candidate gene) kháng đạo ôn Pik-p ở một số giống lúa địa phương Tầm soát trình tự gen Pik-p của 36 giống lúa địa phương và xác định giống

OM5629 có trình tự, thành phần Nucleotide, amino acid ở vùng CDS (CodingDNA Sequence) tương tự như gen tham chiếu Cặp mồi Pikpdel16 đã đượcthiết kế có thể khuếch đại đoạn gen với kích thước 14 bp (ở các giống có genứng viên Pikp) và 190 bp (ở các giống có trình tự sai khác với trình tự genPikp) Sự dụng phương pháp lai hồi giao, tiến hành tích hợp gen ứng viênpik-p vào giống BC5 [27]

Doãn Thị Hương Giang và các cộng sự (2017) cũng đã ứng dụng chỉthị phân tử và lai trở lại (MABC) đã được sử dụng để cải tiến giống lúaAS996 phổ biến thành giống lúa có thể chịu ngập mà vẫn duy trì các đặc tínhban đầu đang được nông dân và người tiêu dùng đón nhận QTL chịu ngậpSub1 giữ vai trò tới 70% tính chịu ngập Gen này được quy tụ vào giốngAS996 bằng lai trở lại và hỗ trợ của chỉ thị phân tử Nghiên cứu đã sử dụng

460 chỉ thị phân tử để đánh giá đa hình của bố mẹ [28]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Dòng bố (BL10) và dòng mẹ (ML10) của giống lai đơn LVN10, không

mang allen đột biến fea* (Giống ngô lai đơn LVN10 có nguồn gốc của Viện

Nghiên Cứu Ngô, được công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật tháng 8 năm

1994 Mặc dù đã được tạo ra cách đây 26 năm nhưng hiện giống LVN10 vẫn

là giống được nhiều hộ nông dân chọn lựa vì năng suất cao và khả năng thíchứng với mọi vùng sinh thái trong cả nước)

Dòng cho gene fea2-1328 (W22) cung cấp bởi phòng thí nghiệm của giáo

sư Dave Jackson (Cold Spring Harbor Laboratory-Mỹ), mang allen đột biến

Các hóa chất dùng cho phản ứng PCR: bốn loại deoxynucleotidetriphosphat (dNTPs) của hãng Sigma; Taq-DNA Polymerase của hãngFermentas

http://www.maizegdb.org

5`-GTTTGTGTCAGCTTCTGTGGAC-3`) được thiết thiết kế dựa trên trình tự

của gen FEA2 Bommert et al., 2013.

(MDF-2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Bố trí thí nghiệm lai trở lại (BC)

Thí nghiệm cải tiến tổ hợp lai dòng bố (BL10), mẹ (ML10) tạo giốngLVN10 mang allele fea* bằng phương pháp lai trở lại có sự hỗ trợ của chỉ thịphân tử được khái quát trong sơ đồ lai dưới đây Cụ thể thí nghiệm thể hiệntrong hình 2.1

Ở vụ Xuân 2019, bố trí thí nghiệm với 2 tổ hợp lai BC5F1- ML10/W22

và BC5F1- BL10/W22, mỗi tổ hợp lai 140 cá thể, trồng 10 hàng, mỗi hàng

14 cây

BC5F2-ML10/W22 và BC5F2- BL10/W22 tương tự giống vụ thu 2019, mỗi tổ hợplai 140 cá thể, trồng 10 hàng, mỗi hàng 14 cây

Vụ Xuân 2020, trồng 5 dòng ưu tú, bố trí thí nghiệm với mỗi dòng 2hàng, mỗi hàng 14 cây, chọn 20 cây mỗi dòng không có bệnh đánh giá hìnhthái nông sinh học

2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử

2.2.2.1 Phương pháp tách chiết ADN- CTAB

Lấy mẫu lá ngô để kiểm tra chỉ thị phân tử ở giai đoạn thời kỳ 3-6 lá , cắt

2 lá non/cây ở các cá thể ở mỗi tổ hợp lai

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp có sử dụngCTAB có cải tiến để tiến hành tách chiết ADN từ các dòng BC

ống đầy đủ

vòng/ 1,5p, đổi chiều khay nghiên mẫu để nghiền lại lần 2

ống eppendoft 2ml vừa nghiền xong, chú ý không được để đầu pipetchạm vào thành ông, đóng nắp ống và lắc đều

15 phút

trên cùng trong suốt màu hơi xanh hoặc vàng, ở giữa là lớp bã lá, cuốicùng là chlorofom có màu xanh đậm Hút 400 µl dịch tách trên cùngcho vào ống eppendoft 1,5 µl đã bổ sung 400 µl isopropanol

8 Lắc đều ống, ủ mẫu trong tủ lạnh -40 C ít nhất 1 giờ đồng hồ.

phút

hết tủa sau đó cất mẫu vào tủ lạnh ngăn mát

2.2.2.2.Phương pháp PCR bằng mồi dCAPs

Phương pháp nghiên cứu sử dụng PCR kiểm tra sự có mặt của gene fea*

trong các con lai Sử dụng chỉ thị phân tử dCAPs đặc hiệu cho đột biến điểm

của allele fea* Bommert et al., 2013, tác giả đã có sẵn trình tự các cặp mồi kiểm tra gene fea* (allele fea2-1328) Cặp mồi này khi nhân tạo ra sản phẩm

PCR, sản phẩm PCR nhân lên từ allele đột biến sẽ bị cắt bằng enzyme SmlI,còn sản phẩm PCR nhân lên từ allele hoang dại không đột biến sẽ không bịcắt Ngoài ra chúng tôi cũng sẽ thiết kế thêm các cặp mồi OVS1 – OVS2 dựatrên trình tự của gene FEA2 Cặp mồi OVS1 – OVS2 khi nhân tạo ra sảnphẩm PCR, sản phẩm PCR nhân lên từ allele đột biến sẽ bị cắt bằng enzymePstI

Trình tự cặp mồi sử dụng cho kiểm tra đột biến fea* bởi Bommert et al.,

2013

Tên mồi

Fea*F

Fea*R

- Trình tự cặp mồi dCAPs dùng trong PCR:

Tên mồi

OVS1 –F

OVS1 –R

Phản ứng PCR được chạy với chu kỳ nhiệt với cặp mồi OSV1 và OSV2 được trình bày cụ thể 2 bước như sau:

• Bước 1: Cặp mồi OSV1/OSV2 biến tính ở 940 C trong 3 phút (táchmạch DNA khuôn), chạy 5 chu kỳ lặp lại với 940 C trong 20 giây, 52 0Ctrong 30 giây (gắn mồi), 72 0C trong 30 giây (kéo dài).

30 giây (gắn mồi), 72 0C trong 30 giây (kéo dài), cuối cùng giữ ở 72 0C trong

5 phút (hoàn thành chuỗi phản ứng)

Hình 2.2 Chu kỳ nhiệt PCR với cặp mồi OSV1 và

OSV2 2.2.2.3 Phương pháp sử dụng enzyme cắt giới hạn PstI

Sử dụng cặp mồi OSV1 và OSV2 trong PCR khuếch đại được đoạn DNAdài 212bp, sau đó sản phẩm PCR được cắt bởi enzyme cắt giới hạn PstI tạiđiểm không đột biến trên đoạn DNA nhờ đó phân biệt được các kiểu gen khácnhau của các cá thể đồng hợp trội (không đột biến), dị hợp và đồng hợp lặn(gen đột biết) Phản ứng cắt DNA nhờ eyme cắt giới hạn PstI trong điều kiện

bằng PstI

- Thành phần dung dịch phản ứng cắt sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn Pst I

2.2.2.4.Phương pháp PCR với mồi SSR

Thành phần dung dịch phản ứng PCR với mồi SSR

Phản ứng PCR được chạy với chu kỳ nhiệt:

khuôn

30 giây (gắn mồi), 72 0C trong 40 giây (kéo dài), cuối cùng giữ ở 72 0C trong

5 phút (hoàn thành chuỗi phản ứng)

2.2.2.5 Phương pháp điện di trên gel poly-acrylamide

Sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamide 6,0% và được phát hiện dưới tia cực tím bằng phương pháp nhuộm ethidium bromide

Gel polyacrylamide bao gồm các thành phần sau (bản gel có kích thước 30cm x 12cm):

kính, nhuộm EtBr nồng độ 0,5% trong 15 phút, rửa lại bằng nước sạch Soi vàchụp ảnh gel bằng máy chụp ảnh gel DigiDoc-It.

2.2.2.6 Phương pháp điện di trên gel Agarose

Khi tiến hành điện di gel agarose chúng tôi dùng thuốc nhuộm ethydiumbromide để hiện hình các băng DNA trên gel Chất này sẽ gắn vào giữa cácbase của phân tử DNA và phát huỳnh quang khi chiếu tia tử ngoại

Sản phẩm sau khi sử dụng enzyme cắt giới hạn sẽ được điện di trên gelagarose 3% để phân tách các đoạn DNA cùng với marker 100bp

Cách tiến hành:

1X lắc nhẹ cho agarose hòa lẫn trong dung dịch

trong

suốt

chứa bản gel vào máy điện di, đổ đệm TAE 1X ngập bản gel khoảng 0.5 cm