CÁC PHƯƠNG PHÁP hóa lý TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC p3

Khi sắc ký, các phân tử của các chất phân tích được lọctheo cỡ của khối lượng phân tử: Các phân tử có MW quálớn, chạy nhanh qua cột, chúng không bị lưu giữ; Các phân tử có MW nhỏ hơn thì

Giảng viên: Phan Thị Thu Trang Email: phantttrang47@gmail.com

Điện thoại: 0702396147

NỘI DUNG

Quang phổ phân tử

Quang phổ hấp thụ UV-VISQuang phổ hồng ngoại

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

2 – Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquic Chromatography – HPLC)

Sắc ký phân bố hiệu năng cao

Sắc ký lỏng- lỏng (LLC): lớp

mỏng pha lỏng hữu cơ bao

trên bề mặt của các tiểu phân

chất mang

Nhược điểm: bị rửa trôi dần

theo dòng pha động → hiệu

lực cột bị giảm dần trong quá

trình sử dụng.

Sắc ký pha liên kết (BPC): được liên kết hóa học với chất mang Các nhóm chức hữu cơ liên kết với bề mặt của các tiểu phân silica qua các nhóm silanol

Pha tĩnh

2.3 Các kỹ thuật HPLC

Một số pha liên kết thường dùng

Pha tĩnh

Sắc ký phân bố hiệu năng cao

2.3 Các kỹ thuật HPLC

❖ Pha động có thể là dung môi đơn hay hỗn hợp của

2, 3 hay 4 thành phần Người ta có thể thay đổi độphân cực của pha động bằng cách thay đổi tỷ lệ củacác thành phần dung môi trong hỗn hợp

❖ Kỹ thuật thay đổi liên tục thành phần dung môitrong thời gian chạy sắc ký được gọi là rửa giảigradient hoặc chương trình hóa dung môi

Pha động

2.3 Các kỹ thuật HPLC

Tuỳ thuộc vào việc sử dụng pha động và pha tĩnh

người ta chia sắc ký phân bố thành 2 loại (sắc ký phathuận và sắc ký pha đảo)

Sắc ký phân bố hiệu năng cao

2.3 Các kỹ thuật HPLC

Sắc ký pha thuận (Nomal Phase Chromatography)

và Sắc ký pha đảo (Reversed-Phase Chromatography)

Link xem:

https://www.youtube.com/watch

?v=MLoitPJQH3g

2.3 Các kỹ thuật HPLC

Thông số Sắc ký pha thuận Sắc ký pha đảo

Pha tĩnh Phân cực Không phân cực

Pha động Ít phân cực đến phân cực

trung bình

Phân cực trung bình đến phân cực mạnh

Thứ tự rứa giải Chất ít phân cực ra trước Chất phân cực ra

trước

Sắc ký pha thuận (Nomal Phase Chromatography)

và Sắc ký pha đảo (Reversed-Phase Chromatography)

2.3 Các kỹ thuật HPLC

Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao (LSC)

❖ Là kỹ thuật phát triển sớm nhất và được dùng phổbiến

❖ Chất cần phân tích bị giữ trên bề mặt pha tĩnh (chấthấp phụ) và bị dung môi đẩy ra (phản hấp phụ)

❖ Pha tĩnh có thể là silicagel, nhôm oxyd

❖ Pha động thường là những dung môi ít hoặc không

phân cực Khi rửa giải, các chất không phân cực sẽ ratrước, các chất càng phân cực càng ra chậm

2.3 Các kỹ thuật HPLC

Chất tan hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh

Sắc ký trao đổi ion (IEC)

❖ Phân tách các thành phần ion hóa tan trongnước, có phân tử lượng nhỏ hơn 1500

Pha tĩnh là các nhựa trao đổi ion dưới dạng bột

mịn (hợp chất hữu cơ cao phân tử có chứa nhómchức có khả năng trao đổi): Nhựa có nhóm hoạtđộng mang điện tích âm, dùng để tách các chấtbase Nhựa có nhóm hoạt động tích điện dương đểphân tách các chất có nhóm mang điện âm

2.3 Các kỹ thuật HPLC

Sắc ký trao đổi ion (IEC)2.3 Các kỹ thuật HPLC

Sắc ký rây phân tử (SEC)

❖ Phân tách các chất có phân tử lượng (MW) >2000

Pha tĩnh là những hạt xốp của silicagel hay polyme.

Khi sắc ký, các phân tử của các chất phân tích được lọctheo cỡ của khối lượng phân tử: Các phân tử có MW quálớn, chạy nhanh qua cột, chúng không bị lưu giữ; Các phân

tử có MW nhỏ hơn thì bị lưu giữ trên cột Khi rửa giảichúng sẽ lần lượt ra khỏi cột với thời gian lưu tăng theochiều giảm của khối lượng phân tử

2.3 Các kỹ thuật HPLC

Sắc ký rây phân tử (SEC)2.3 Các kỹ thuật HPLC

2.4 Hướng dẫn chọn kỹ thuật HPLC

Muốn chọn một kỹ thuật sắc ký thích hợp để phântách một hỗn hợp, phải dựa vào các đặc tính lý, hóahọc của các chất thành phần:

+ Tính tan: tan hay không tan trong nước.

+ Phân tử lượng (MW).

+ Tính phân cực: ion hóa hay không ion hóa.

MW > 2000

MW < 2000

Sắc ký rây phân tử

+Mẫu thử tan/nước → dung môi là nước

+Mẫu tan/DMHC → DMHC làm pha động

Pha tĩnh: Sephadex (dextran), pha động H2OPha tĩnh: Styragel, pha động hữu cơ

Tan/ít tan/ nước Sắc ký trao đổi ion hoặc

phân bố pha đảo

Độ tan phụ thuộc pH

Sắc ký trao đổi ion

Độ tan không phụ thuộc pH

Sắc ký phân bố pha đảo

Không tan/

nước

Sắc ký phân bố pha thuận

2.4 Hướng dẫn chọn kỹ thuật HPLC

2.5 Các phương pháp định lượng HPLC

Nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic

Phương pháp chuẩn ngoại

Phương pháp chuẩn ngoại

❑ Phương pháp chuẩn ngoại là phương pháp địnhlượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đềuđược tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện

❑ So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫuthử với diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫuchuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫuthử

2.5 Các phương pháp định lượng HPLC

Phương pháp chuẩn ngoại

Chuẩn hóa 1 điểmNồng độ xấp xỉ nhau

Phương pháp chuẩn ngoạiChuẩn hóa nhiều điểm

Khoảng tuyến tính - Pha dãy dd chuấn với

Y là S (H) của dd thử

2.5 Các phương pháp định lượng HPLC

Phương pháp chuẩn nội

❑ Áp dụng trong phân tích các mẫu phải xử lý phứctạp (chiết tách ) và đặc biệt là các mẫu vừa phứctạp vừa có hàm lượng thấp của chất cần định lượng

❑ Có thể giúp cực tiểu hóa được những sai số gâynên do máy móc và kỹ thuật

2.5 Các phương pháp định lượng HPLC

Phương pháp chuẩn nội

Chuẩn

Thử

✓ Sắc ký trong cùng một điều kiện

✓ Dựa vào S (H) pic và lượng (nồng độ)của chuẩn, chuẩn nội và mẫu thử, có thểxác định được hàm lượng của thànhphần cần định lượng trong mẫu thử mộtcách chính xác

Thêm vào cả mẫu chuẩn lẫn mẫu thử những lượng bằng nhau củamột chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện Chấtđược thêm này gọi là chuẩn nội

2.5 Các phương pháp định lượng HPLC

Phương pháp chuẩn nội

- SC , SIS : lần lượt là diện tích pic chuẩn và chuẩn nội

2.5 Các phương pháp định lượng HPLC

Phương pháp chuẩn nội

Pp chuẩn 1 điểm

Ch + IS → Sch, SIS

T + IS → St, SIS

2.5 Các phương pháp định lượng HPLC

- Chuẩn bị một dãy chuẩn có chứa những lượng (nồng độ) chất chuẩn khác nhau nhưng tất cả cùng chứa một lượng (nồng độ) chuẩn nội.

- Thu được các S (H) pic của chất chuẩn, chuẩn nội.

- Vẽ đồ thị SS/SIS (H) theo CS/CIS

- Tiến hành mẫu thử tương tự

T + IS thu được S (H).

- Từ ST/ SIS tính được CT/CIS theo đồ thị.

- Từ đó suy ra CT .

Pp chuẩn nhiều điểm

Phương pháp chuẩn nội

2.5 Các phương pháp định lượng HPLC

Phương pháp chuẩn nội

Yêu cầu chất

chuẩn nội

- Trong cùng điều kiện sắc ký, chất chuẩn nội phải đượctách hoàn toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưucủa chất cần phân tích trong mẫu thử

- Có cấu trúc hoá học tương tự như chất thử

Phương pháp thêm chuẩn

❑ Kỹ thuật này phối hợp phương pháp chuẩnngoại và chuẩn nội

❑ Ưu điểm của kỹ thuật thêm chuẩn là có độchính xác cao vì nó loại trừ được sai số do các yếu

tố ảnh hưởng, đặc biệt là ảnh hưởng của quá trình

xử lý mẫu (chiết xuất, tinh chế các chất từ cácdạng bào chế )

2.5 Các phương pháp định lượng HPLC

Phương pháp thêm chuẩn

Phương pháp thêm 1 điểm

+ Chuẩn bị 2 mẫu thử song song

+ Thêm vào mẫu thử thứ 2 một lượng đã biết của chất chuẩn+ Tiến hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện

Phương pháp thêm chuẩn

Kỹ thuật thêm đường chuẩn

- Chuẩn bị dãy hỗn hợp gồm các lượng mẫu thử giống nhau và các chất chuẩn với lượng tăng dần.

- Vẽ đồ thị S (T+C) theo C thêm vào.

- Giao điểm của đường chuẩn kéo dài với trục hoành chính

là nồng độ của chất cần xác định.

2.5 Các phương pháp định lượng HPLC

Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic

Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất trong

hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc đồ.

Phương pháp này yêu cầu tất cả các thành phần đều được

rửa giải và đươc phát hiện

Tất cả các thành phần đều có đáp ứng detector (response)

như nhau

2.5 Các phương pháp định lượng HPLC

Phương pháp chuẩn hóa diện tích picVD: hỗn hợp 3 thành phần X, Y, Z

Tính lại hệ số đáp ứng liên hệ chất chuẩn

Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic

Ứng dụng:

❑ Trong sắc ký khí vì các chất phân tích có đáp ứngnhư nhau trên detector ion hóa ngọn lửa

Câu hỏi lượng giá:

Câu 1: Sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo là gì?

Cho ví dụ về pha tĩnh và pha động dùng trong sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo.

Câu 2 Hãy so sánh sắc ký lỏng hiệu năng cao với sắc

ký cổ điển

Câu3: Hãy trình bày về các loại bơm sử dụng trong

HPLC.

THANK YOU