Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protein bcla của vỏ bào tử vi khuẩn bacillus anthracis

Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protein BclA của vỏ bào tử vi khuẩn Bacillus anthracis BỘ MÔN: KỸ THUẬT GEN GVHD: PSG.TS TRẦN LIÊN HÀ... NỘI DUNGQuá trình tách dòng gen mã hóa BclA Tạ

Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protein BclA của vỏ bào tử vi khuẩn

Bacillus anthracis

BỘ MÔN: KỸ THUẬT GEN

GVHD: PSG.TS TRẦN LIÊN HÀ

Thành viên nhóm

• Nguyễn Thu Ngân 20162893

• Đào Thanh Mai 20162621

• Phan Thị Khánh Linh 20162471

NỘI DUNG

Quá trình tách dòng gen mã hóa BclA

Tại sao phải sản xuất protein BclA?

Biểu hiện gen mã hóa đoạn CTD của protein BclA

Tại sao phải sản xuất protein BclA?

Tại sao phải sản xuất protein BclA

• Bệnh Than là một bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng do vi khuẩn gọi

là Bacillus anthracis gây ra

Trong những cuộc chiến nó được coi là vũ khí sinh học nhằm sát hại đến chính con người với một cách lây lan hàng loạt và có khả năng

tử vong cao nếu không được phát hiện nhanh

Vào tháng 9 và tháng 10,năm

2001, nhóm khủng bố Al Qaeda một loạt bức thư chứa bào tử vi khuẩn bệnh than gửi tới bưu

điện,cơ quan công quyền và văn phòng truyền thông , khiến 5

người thiệt mạng và gây hoang mang trong dư luận.

• Vi khuẩn B.anthracis được Robert Koch phân lập từ năm 1877

vi khuẩn than hình thẳng, hai đầu vuông, có kích thước từ 11,5 310m, thường xếp thành từng chuỗi giống như cây tre, bắt màu Gram (+)

Có khả năng tồn tại trong tự nhiên dưới dạng bào tử trong thời gian hơn 10 năm, có khả năng chịu nhiệt lên đến

160⁰C trong 5 phút và 100⁰C trong 10 phút.

Bào tử của B anthracis bao gồm các lớp chính sau: lõi (spore core), vỏ lõi (cortex), vỏ bào tử (exosporium)

Lớp vỏ bên ngoài lõi là peptidoglucan dày trong đó gồm nhiều loại

protein khác nhau, thường chứa protein lắp ráp và các yếu tố quy

định hình thái

Lớp áo bào tử chứa protein BclA

Trong protein BclA có 1 vùng có tên CTD:có cấu trúc bậc 3 ổn định,

nằm thò ra ngoài bề mặt bào tử B.anthracis, đây là lợi thế để phát

hiện nhanh bào tử mà không cần tách chiết và phá vỡ bào tử

Quá trình

biểu hiện gen

mã hóa protien BclA

Nghiên cứu tách dòng gen mã hóa protein BclA

CÁC BƯỚC CỤ THỂ

2

5

4 3

Tách chiết DNA genome của vk Bacillus anthracis

• Nuôi cấy vk qua đêm ở nhiệt độ 37°C

• Phá vỡ màng tế bào bằng lysozyme

• Thêm EDTA để ức chế proteinase và nuclease, proteinase K thủy phân màng và

protein nội bào

• Thêm phenol/choloroform/isoamylalcohol loại bỏ mảnh vỡ tb và protein biến tính

(kết tủa)

• Ly tâm thu DNA

• Làm sạch và kiểm tra bằng điện di agarose (điện di thấy có một băng DNA của vk

đậm nét có kích thước lớn, không có vệt sáng phía dưới => không có DNA, RNA đứt gãy)

Phản ứng PCR - Cặp mồi được lựa chọn

Chuẩn bị vector biểu hiện pET32a

• Cho phép cài đoạn DNA cần

thiết

• có khả năng tái bản không

phụ thuộc vào sự phân chia của tế bào

• tồn tại trong tế bào vật chủ

qua nhiều thế hệ không gây biên đổi bộ gen của tế bào vật chủ

Ghép nối gen

• Vector pET32a(+) và sản phẩm PCR sau điện di được ủ với enzyme

cắt hạn chế Nco I, Xho I, nước ion vô trùng và đệm ở 37°C

• Sản phẩm thu nhận được từ gel agarose đã làm sạch sẽ được trộn

với đệm, nước vô trùng ủ ở 16°C để T4 – ligase gắn các điểm nối trên sợi DNA

Biến nạp vào vi khuẩn

Kiểm tra biến nạp

Kiểm tra ghép nối gen

• Lấy ngẫu nhiên khuẩn lạc trên đĩa có ampicillin, cấy chuyển vào môi

trường LB lỏng + amp, nuôi qua đêm và tiến hành tách plasmid

• Điện di kiểm tra trên gel agarose thu được 2 băng DNA (vòng và

xoắn), nếu bằng hoặc cao hơn so với mẫu đối chứng thì chứng tỏ có đoạn DNA ngoại lai chèn vào vector

• Ủ plasmid tách được với enzyme BamH I ở 37°C thu sản phẩm rồi

điện di gel agarose Nếu kết quả thu được một vạch bằng và 1 vạch cao hơn mẫu đối chúng thì mẫu khuẩn lạc đó có gen ngoại lai

• Giải trình tự gen để chắc chắn gen mã hóa vùng CTD của protein

BclA được chèn vào đúng trình tự

Biểu hiện gen mã hóa đoạn CTD của protein BclA

CÁC BƯỚC CỤ THỂ

Vector biểu hiện pET32a(+)

• Vị trí khởi đầu sao chép

E Coli

Ưu điểm: dễ nuôi cấy, phân chia tế bào nhanh và chấp nhận nhiều

loại vector

Nhược điểm:

• Khó biểu hiện protein > 50 kD, giàu cysteine, có nhiều S-S hay

protein biến đổi cấu trúc sau dịch mã vd: quá trình glycosyl hóa,…

• Tiết và tạo protein ngoại bào tương đối thấp.

• Một số gây bệnh, tạo độc tố khi biểu hiện gen của sinh vật bậc cao.

• Protease nội bào phân hủy protein ngoại lai.

Xử lí E Coli

Khả năng gây bệnh : biến đổi di truyền.

Protease phân hủy protein ngoại lai.

• Cho protein ngoại lai tiết ra ngoài bằng cách dùng đoàn tín hiệu

tiết=> không phải lúc nào cũng làm được

• Tạo chủng biểu hiện mang gen đột biến mã hóa các protease.

Chủng biểu hiện E.coli BL21

• Là một chủng đột biến gen mã hóa cho ion protease (một protein

nội bào) và ompT protease (một protease định khu ở màng ngoài)

=>không còn khả năng thủy phân protein

• DNA genome chứa gen mã hóa T7-RNA polymerase-gen có nguồn

gốc từ bacteriophage T7 dưới sự điều khiển của promotor lac

Tiến hành biểu hiện gen

1 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli BL21 bằng phương pháp sốc

nhiệt ( tương tự như tách dòng gen)

2 Nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có Ampicillin ở 37°C=> tăng

sinh khối vi khuẩn, chọn lọc E.coli chứa plasmid.

3 Bổ sung IPTG, tiếp tục nuôi cấy ở điều kiện 25°C Sau đó ly tâm

thu lấy tế bào

Bố trí Tiêu đề và Nội dung với Biểu đồ

4 Kiểm tra việc biểu hiện: Ly tâm dịch thu được, thêm nước khử ion

vô trùng và đệm phá mẫu protein Xử lý mẫu ở 100°C Điện di trên gel polyacrylamide

5 Kiểm tra dạng protein: dịch thu được để ở -72°C, sau đó sốc nhiệt

ở 65°C trong vài phút, ly tâm thu dịch và cặn tế bào cho riêng rẽ vào các ống đã có nước khử ion vô trùng và đệm phá mẫu protein,

xử lý ở 100°C rồi đem điện di trên gel polyacrylamide

6 Tinh sạch protein tái tổ hợp theo phương pháp sắc ký ái lực bằng

cột HisTrap Kiểm tra sản phẩm tinh sạch bằng điện di

7 Định lượng protein tái tổ hợp bằng phương pháp Bradford

1 Các ion liên kết với các hạt

Sepharose để nhồi vào cột

2 Protein tái tổ hợp liên kết đặc

hiệu với còn các phần tử khác được rửa trôi theo dịch đệm

3 Rửa protein tái tổ hợp tách ra

khỏi cột nhờ dung dịch đệm

có pH thích hợp

Phương pháp sắc ký ái lực

Lợi ích của His-tag.

• giúp dễ dàng tinh sạch

• Vì kích thước nhỏ, trình tự axit amin này không gây đáp úng miễn

dịch khi đưa protein tái tổ hợp vào cơ thể=> không cần loại đuôi

His-tag sau tinh sạch

• Tương tác giữa đuôi His-tag với không phụ thuộc cấu trúc bậc bốn

của protein=> quá trình tinh sạch dễ dàng hơn ngay cả khi protein bị biến tính

•

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 German L.Rosano(4/2014), Eduardo A Ceccarelli; “Recombinant

protein expression in Escherichia coli: advances and challenges”;

Frontiers in microbiology

2 Khuất Hữu Thanh,(2006),” Kỹ thuật gen –Nguyên lý và ứng

dụng”,Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội

3 Phùng Huyền Nhung(2012), Nghiên cứu tách dòng và biểu hiện

gen mã hóa protein BclA của vỏ bào tử vi khuẩn Bacillus

anthracis.Luận văn thạc sỹ khoa học chuyên ngành công nghệ sinh

học

TÀI LIỆU THAM KHẢO

4 Nguyễn Thu Hiền1 , Hoàng Thị Thu Hiền1 , Khuất Hữu Thanh2 ,

Nguyễn Huy Hoàng1* 1Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm KH

& CN Việt Nam,(2013),Chọn dòng và biểu hiện gen keratinase

trong Escheriochia coli BL21(DH3) từ vi khuẩn Bacillus , Tạp chí

sinh học 2013