luận văn thạc sĩ xác định một số tính chất hóa lý và đặc điểm cấu trúc của pectin từ cỏ biển enhalus acoroides ở khánh hòa

Cỏ biển từ lâu đã được sử dụng trong những bài thuốc dân gian để điều trị một số bệnh như: sốt, bệnh về da, đau cơ, bỏng, các vấn đề về dạ dày, thuốc giảm đau cho trẻ con,… Các công dụng

VÀ ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÖC CỦA PECTIN TỪ CỎ BIỂN

ENHALUS ACOROIDES Ở KHÁNH HÕA

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Nha Trang – 2020

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Huỳnh Ánh Quốc

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT HÓA LÝ

VÀ ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÖC CỦA PECTIN TỪ CỎ BIỂN

ENHALUS ACOROIDES Ở KHÁNH HÕA

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 8440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS Phạm Đức Thịnh Nha Trang – 2020

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự

hướng dẫn của TS Phạm Đức Thịnh và tham khảo thêm các tài liệu đã được

công bố trước đó có nguồn gốc rõ ràng Các số liệu nêu trong luận văn là kết quả làm việc của tôi trong suốt quá trình thực nghiệm tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và tại đơn vị Trung tâm Kiểm soát bệnh tật nơi tôi đang công tác

Nha Trang, tháng 12 năm 2020

Tác giả

Huỳnh Ánh Quốc

Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Ban chủ nhiệm Khoa Hóa học và Phòng Đào tạo đã tổ chức công tác giảng dạy, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thiện luận văn và các thủ tục cần thiết

Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc đến thầy TS Phạm Đức Thịnh – Phó Viện trưởng Viện nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha

Trang đã luôn tận tâm, nhiệt tình giúp đỡ, hướng dẫn và cho tôi nhiều góp ý trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Bên cạnh đó, tôi chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi

mặt của Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang cũng như các anh chị em công tác tại phòng Hóa Phân tích đã tạo mọi điều

kiện tốt nhất để tôi làm thực nghiệm và luôn động viên, giúp đỡ để tôi hoàn thành đề tài luận văn này

Trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp, tôi cũng đã nhận được nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô, bạn bè và gia đình để hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn Trung tâm Kiểm soát bệnh tật Ninh Thuận, đơn vị tôi đang công tác đã tạo kiện cho tôi thời gian thực hiện khóa luận

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến gia đình, người thân

và bạn bè đã luôn bên cạnh chia sẽ khó khăn và động viên giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, tháng 12 năm 2020

Học viên

Huỳnh Ánh Quốc

Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

DE Degree of esterification Mức độ ester hóa

DMSP Dimethylsulfoniopropionate Dimetylsulfopropionat

1,1-diphenyl-2-picrylhyrazyl

picrylhyrazyl

GlucA Glucuronic acid Acid glucuronic

hóa cao

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

1

H-NMR Proton NMR Spectroscopy Phổ CHTHN proton

HT29 Colorectal cancer cell line Dòng tế bào gây ung thƣ

ruột kết

LDL Low Density Lipoprotein Lipoprotein có tỉ trọng

thấp

Man Mannose Đường mannose

Resonance

Cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN)

RG-II Rhamnogalacturonan II Ramnogalacturonan II

Environment Programme

Chương trình môi trường Liên hiệp quốc

Bảng 1.1: Hàm lượng pectin trong các loại nguyên liệu khác nhau…………19 Bảng 3.1: Các giá trị mật độ quang mẫu chuẩn chuẩn xác định hàm lượng carbohydrate tổng bằng phương pháp phenol – acid sulfuric…….….…… 55 Bảng 3.2: Các giá trị mật độ quang của mẫu chuẩn xác định hàm lượng uronic acid bằng phương pháp Carbazole……… ……….…… 56

Bảng 3.3: Thành phần hóa học của pectin từ E acoroides ……….… …….57

Bảng 3.4: Các giá trị mật độ quang của mẫu chuẩn xác định hàm lượng sulfate bằng phương pháp K2SO4……….….…… 58 Bảng 3.5: Thành phần monosaccharide của pectin từ các loài khác nhau……….….…….… 61 Bảng 3.6: Các chỉ số đặc trưng của pectin từ phần rễ, thân và lá của cỏ biển

E.acoroides……… 65

Hình 1.1: Hình thái chung của cỏ biển……… 9

Hình 1.2: Cỏ biển Enhalus acoroides ……….……….……… 11

Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của pectin……… ……… 20

Hình 1.4: Pectin trong cấu tạo của thành tế bào thực vật……… 21

Hình 1.5: Các dạng cấu trúc hóa học của pectin……….22

Hình 1.6: Cấu trúc của pectin có mức độ methoxyl hóa cao…….………… 23

Hình 1.7: Cấu trúc của pectin có mức độ methoxyl hóa thấp……….23

Hình 1.8: Cấu trúc chính của homogalacturonan………24

Hình 1.9: Mô hình đặc điểm cấu trúc của Rhamnogalacturonan-I………… 25

Hình 2.1: Các bộ phận của cỏ biển Enhalus acoroides.……….40

Hình 2.2: Sơ đồ khối về nội dung nghiên cứu của đề tài.……… 43

Hình 2.3: Sơ đồ chiết tách và thu nhận pectin từ cỏ biển ……… ……… 44

Hình 3.1: Sự phân bố hàm lượng pectin trong cỏ biển E.acoroides……… 52

Hình 3.2: Các giai đoạn xử lý cỏ biển……….52

Hình 3.3: Dịch chiết pectin……… 53

Hình 3.4: Chế phẩm pectin thô sau khi sấy khô……… 53

Hình 3.5: Đường chuẩn xác định hàm lượng carbohydrate ……… 55

Hình 3.6: Đường chuẩn xác định hàm lượng uronic acid ……… 56

Hình 3.7: Thành phần hóa học của 2 phân đoạn pectin từ E.acoroides 57

Hình 3.8: Đường chuẩn xác định hàm lượng sulfat……….…… 59

Hình 3.9: Sắc ký đồ HPLC của các mẫu đường đơn chuẩn………60

Hình 3.10: Sắc ký đồ HPLC mẫu pectin chiết tách từ cỏ biển E.acoroides…60 Hình 3.11: Phổ IR của phân đoạn F2 – rễ của cỏ biển E.acoroides ……… 66

Hình 3.12: Phổ IR của phân đoạn F2 – thân của cỏ biển E.acoroides … … 66

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 5

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 8

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CỎ BIỂN 8

1.1.1 Giới thiệu và sự phân bố cỏ biển 8

1.1.1.1 Giới thiệu chung về cỏ biển 8

1.1.1.2 Cỏ biển Enhalus acoroides 11

1.1.1.3 Phân bố của hệ sinh thái cỏ biển 12

1.1.2 Một số thành phần hóa học của cỏ biển 14

1.1.2.1 Thành phần hóa học của cỏ biển 14

1.1.2.2 Một số hợp chất có hoạt tính sinh học ở cỏ biển 15

1.2.1 Giới thiệu chung về pectin 18

1.2.2 Đa dạng cấu trúc của pectin 19

1.2.2.1 Cấu tạo chung 19

1.2.2.2 Cấu trúc hóa học của pectin ở vách tế bào sơ cấp 23

1.2.3 Tính chất của pectin 26

1.2.3.1 Tính chất hóa học của pectin 26

1.2.3.2 Tính chất vật lý của pectin 27

1.2.4 Hoạt tính sinh học và ứng dụng của pectin 28

1.2.4.1 Hoạt tính sinh học 28

1.2.4.2 Ứng dụng của pectin 30

1.3 TỔNG QUAN CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH PECTIN 32

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CẤU TRÚC PECTIN 34

1.4.1.1 Xác định thành phần đường đơn 35

1.4.1.2 Xác định chỉ số methoxyl hóa và chỉ số ester hóa 35

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU PECTIN TỪ CỎ BIỂN TRÊN THẾ

GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 36

1.5.1 Tình hình nghiên cứu pectin từ cỏ biển trên thế giới 36

1.5.2 Tình hình nghiên cứu pectin từ cỏ biển ở Việt Nam 38

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

2.1 VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 40

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 40

2.1.2 Dụng cụ - Thiết bị - Hóa chất 40

2.1.2.1 Dụng cụ 40

2.1.2.2 Thiết bị 41

2.1.2.3 Hóa chất 41

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41

2.2.1 Cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu đề tài 41

2.2.2 Chiết tách và thu nhận pectin 44

2.2.3 Phương pháp xác định tính chất lưu biến gel của pectin 45

2.2.4 Phương pháp xác định thành phần hóa học của pectin 45

2.2.4.1 Phương pháp xác định hàm lượng tổng carbohydrate 45

2.2.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng Sulfate 45

2.2.4.3 Phương pháp xác định hàm lượng uronic acid 45

2.2.4.4 Phương pháp xác định thành phần monosaccharide 45

2.2.5 Phương pháp xác định các chỉ số đặc trưng của pectin 45

2.2.6 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) 46

2.3 THỰC NGHIỆM 46

2.3.1 Chiết tách và thu nhận pectin từ cỏ biển 46

2.3.2 Xác định tính chất lưu biến gel của pectin 47

2.3.3 Xác định hàm lượng tổng carbohydrate 47

2.3.4 Xác định hàm lượng sulfate 48

2.3.5 Xác định hàm lượng uronic acid 48

2.3.6 Xác định thành phần monosaccharide 48

2.3.7 Xác định các chỉ số đặc trưng của pectin 49

2.3.7.1 Xác định trọng lượng tương đương 49

2.3.7.2 Xác định chỉ số methoxyl (MI) và hàm lượng acid anhydro uronic tổng (AUA) 50

2.3.7.3 Xác định mức độ ester hóa (DE) 50

2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 50

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51

3.1 CHIẾT TÁCH VÀ THU NHẬN PECTIN 51

3.2 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT HÓA LÝ CỦA PECTIN 53

3.2.1 Tính chất lưu biến gel của pectin 54

3.2.2 Thành phần hóa học của pectin 54

3.2.2.1 Hàm lượng tổng carbohydrate và acid uronic 54

3.2.2.2 Hàm lượng sulfate 58

3.2.2.3 Thành phần đường đơn 59

3.2.3 Các chỉ số đặc trưng tính chất hóa lý của pectin 62

3.2.3.1 Trọng lượng tương đương 62

3.2.3.2 Hàm lượng AUA 63

3.2.3.3 Hàm lượng methoxyl và ester hóa 63

3.2.4 Đặc trưng cấu trúc của pectin 66

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69

4.1 KẾT LUẬN 69

4.2 KIẾN NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71

MỞ ĐẦU

Việt Nam được quốc tế công nhận là một trong những quốc gia có tính

đa dạng sinh học cao nhất thế giới, với nhiều kiểu rừng, đầm lầy, sông suối, biển,… Nằm ở trung tâm Đông Nam Á, Việt Nam có tổng chiều dài bờ biển khoảng 3.260 km làm ranh giới phía tây của biển Đông, với diện tích mặt nước rộng hơn 1.000.000 km2

là một trong những vùng biển quan trọng của thế giới Bên cạnh đó, vùng biển Việt Nam có hệ sinh thái rất đa dạng và phong phú, trong đó có cỏ biển

Cỏ biển (seagrass) là nhóm thực vật có hoa duy nhất sống trong môi trường biển và nước lợ Tuy có số lượng loài tương đối ít so với các nhóm sinh vật biển khác, nhưng cỏ biển có vai trò sinh thái rất quan trọng không kém rạn san hô và rừng ngập mặn Hội nghị quốc tế về cỏ biển lần thứ III họp

tại Manila – Philipin tháng 4/1998 đã nhất trí thông qua ―Hiến chương cỏ biển‖ gửi Tổng thư ký Liên hợp quốc và các nước có biển cần phải quan tâm

tới việc bảo vệ và phát triển nguồn lợi cỏ biển [1]

Hệ sinh thái cỏ biển là một trong ba hệ sinh thái biển điển hình của vùng biển nhiệt đới (gồm rừng ngập mặn, cỏ biển, san hô) Hệ sinh thái cỏ biển đóng vai trò rất quan trọng, chúng tham gia chu trình dinh dưỡng trong biển và đại dương thế giới ước tính khoảng 3,8 nghìn tỷ USD và giá trị trung bình đạt 212.000 USD/ha cỏ biển/năm Ngoài giá trị sinh thái như điều chỉnh môi trường, bãi đẻ của một số loài hải sản Cỏ biển còn được sử dụng trực tiếp trong nhiều ngành kinh tế quốc dân (như làm giấy viết, hóa chất, chất cách âm cách nhiệt, thuốc chữa bệnh, thực phẩm, thủ công mỹ nghệ, phân bón, thức ăn gia súc,…) [1]

Hiện nay, có khoảng 14 loài cỏ biển được ghi nhận tại Việt Nam

(Cymodocea rotundata, Cymodocea serrulata, Enhalus acoroides, Halodule pinifolia, Halodule uninervis, Halophila beccarii, Halophila decipiens, Halophila nhỏ, Halophila ovalis, Ruppia maritima, Syringgodium isoetifolium, Thalassia hemprichii, Ciliatum Thalassodendron và Zostera japonica), trong số này có loài cỏ lá dừa Enhalus acoroides là một trong

những loài cỏ biển có phân bố rộng rãi với trữ lượng lớn ở vùng biển Nha Trang

Cỏ biển từ lâu đã được sử dụng trong những bài thuốc dân gian để điều trị một số bệnh như: sốt, bệnh về da, đau cơ, bỏng, các vấn đề về dạ dày, thuốc giảm đau cho trẻ con,… Các công dụng trị bệnh của cỏ biển được cho

là do trong thành phần của chúng có chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học như polyphenol, flavonoid, terpenoid, pectin,… Trong đó, pectin là một trong 03 polysaccharide tự nhiên chủ yếu của thành tế bào thực vật, thuật ngữ pectin được sử dụng cho một nhóm các acidic heteropolysaccharide Mạch polymer của pectin được tạo nên bởi các gốc acid D-galacturonic liên kết với nhau thông qua liên kết α(14)-, mạch nhánh có thể được tạo thành bởi các gốc đường khác thông qua liên kết α(12)- với gốc acid galacturonic như: arabinose, galactose, rhamnose, galactopyranse, arabinofuranose, fucopyranose, apiose,… Tương tự như các polysaccharide thực vật khác, cấu trúc và thành phần của pectin của cỏ biển thay đổi theo loài cũng như điều kiện môi trường sống

Pectin chủ yếu được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm nhờ tính chất tạo gel của chúng Ngoài ra, pectin cũng được sử dụng làm thuốc và thực phẩm chức năng nhờ các hoạt tính sinh học quý như: chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng virus, kháng ung thư, kháng viêm, liên kết mạnh với một số kim loại nặng như Hg, Pb, Cd, Ce,…

Vùng biển Nha Trang với nguồn thảm cỏ biển dồi dào và đa dạng, nhưng các nghiên cứu về cỏ biển ở Việt Nam lại tập trung chủ yếu về sinh thái, sự phân bố, phân loại và bảo tồn Trong khi đó các hợp chất có hoạt tính sinh học quý có trong cỏ biển chưa được quan tâm nghiên cứu, trong đó có

pectin Vì vậy, việc “Xác định một số tính chất hóa lý và đặc điểm cấu trúc

của pectin từ cỏ biển Enhalus acoroides ở Khánh Hòa” là cần thiết nhằm

đánh giá giá trị của cỏ biển về mặt dược liệu và đồng thời tìm ra các hoạt tính sinh học mới từ cỏ biển

Mục tiêu của luận văn:

 Phân tích thành phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của pectin thu

nhận được từ cỏ biển Enhalus acoroides

Để đạt được các mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu của luận văn

bao gồm:

 Thu thập cỏ biển Enhalus acoroides tại vùng biển Cam Lâm

(Khánh Hòa)

 Tách chiết và phân đoạn pectin từ cỏ biển thu được

 Phân tích thành phần hóa học của pectin và các phân đoạn của chúng

 Xác định một số chỉ số đặc trưng của pectin thu được

 Xác định đặc điểm cấu trúc của phân đoạn pectin thu được từ cỏ

biển Enhalus acoroides

Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp thông tin

về phương pháp chiết tách, thu nhận và đặc điểm cấu trúc của pectin có trong

cỏ biển Enhalus acoroides tại vùng biển Cam Lâm (Khánh Hòa) Từ đó làm

cơ sở khoa học cho các nghiên cứu sâu hơn về loại cỏ biển này và một số loài

cỏ biển khác

Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả của đề tài sẽ góp phần đánh giá giá trị của

cỏ biển như là nguồn hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học, đồng thời giúp định hướng nghiên cứu khai thác và sử dụng bền vững nguồn lợi từ cỏ biển nhằm tạo ra các sản phẩm có giá trị sử dụng cao trong lĩnh vực: thực phẩm, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và dược phẩm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CỎ BIỂN

1.1.1 Giới thiệu và sự phân bố cỏ biển

1.1.1.1 Giới thiệu chung về cỏ biển

Cỏ biển (seagrasses) là nhóm thực vật có hoa duy nhất sống trong môi

trường biển và nước lợ, thuộc ngành Anthophyta, lớp một lá mầm Monocotyledoneae, bộ Helobiae Cũng giống như các loài thực vật bậc cao

trên cạn, cỏ biển có rễ, thân bò, thân đứng, lá, bẹ lá, cuống lá, hoa, quả và hạt

Cỏ biển khác các cây trên cạn là có một số cấu trúc thích nghi với môi nước biển ven bờ, ven đảo Cùng với các loài sinh vật phù du, rong biển và cây ngập mặn, cỏ biển đã tạo nên nhóm những loài thực vật biển rất quan trọng đối với hệ sinh thái biển nói chung [2]

Thảm cỏ biển cùng với rạn san hô và rừng ngập mặn tạo thành ba hệ sinh thái quan trọng bậc nhất vùng bờ Thảm cỏ biển được mệnh danh “rừng mưa nhiệt đới dưới biển” vì tính phức tạp về cấu trúc và tính đa dạng sinh học

đi kèm, cũng như năng suất sinh học rất cao [2]

Hệ sinh thái cỏ biển là một trong những hệ sinh thái biển nhiệt đới điển hình, đóng vai trò quan trọng trong điều hòa và ổn định môi trường của vùng nước biển ven bờ, tạo nguồn thức ăn, nơi cư trú và sinh sản cho các loài thủy sản và là nguồn cung cấp vật chất hữu cơ Cách đây 100 triệu năm, các nhà khoa học dựa vào kết quả nghiên cứu hóa thạch đã tìm ra loại cỏ biển đầu tiên, cho đến nay trên thế giới có khoảng 60 loài thuộc 4 họ [3] Do đặc điểm sống trong môi trường có độ muối cao, khả năng thẩm thấu mạnh nên cỏ biển

có chứa một số hợp chất chuyển hóa thứ cấp khác so với các thực vật sống ở nước ngọt và ở trên cạn Cỏ biển nói riêng và thực vật biển nói chung là nguồn tạo ra một lượng lớn và đa dạng về cấu trúc các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học cao như (polyphenol, flavonoid, terpenoid, polysaccharide, polysaccharide sulfat hóa…) Các hợp chất này có tiềm năng rất lớn để phát triển thành các sản phẩm hữu ích có giá trị cao trong các lĩnh vực như: thực phẩm bổ sung, mỹ phẩm, dược phẩm Chính nhờ các hợp chất có hoạt tính

sinh học tốt mà cỏ biển từ xa xưa cũng đã được sử dụng trong những bài thuốc dân gian để điều trị một số bệnh như: sốt, các bệnh về da, đau cơ, bỏng, các vấn đề về dạ dày, thuốc giảm đau cho trẻ con,… [4]

Khi nhắc đến cỏ biển, rong biển và tảo biển, thông thường dễ bị nhầm lẫn các loài này với nhau Tuy nhiên, chúng có rất nhiều điểm khác nhau như:

cỏ biển thường phát triển thành đồng cỏ rộng lớn nơi chúng mọc Xét về tiến hóa thì cỏ biển tiến hóa cao hơn tảo; cỏ biển có hoa, quả và hạt, còn tảo thì chỉ

có bào tử; tảo có rễ giả nhưng cỏ biển thì có rễ, lá và thân ngầm; cỏ biển là thực vật có mạch, hệ thống các mạch có nhiêm vụ dẫn truyền các chất đến khắp nơi nuôi dưỡng cơ thể, còn tảo chỉ có các quản bào nên khả năng dẫn truyền kém [4]

Về đặc điểm hình thái, các loài cỏ biển đã được nghiên cứu tương đối đầy đủ Hầu hết cỏ biển có hình thái ngoài khá giống nhau, bao gồm thân bò phân đốt, thân đứng, rễ, chồi mang lá, hoa và quả tùy thuộc vào từng thời điểm sinh trưởng [5, 6] (Hình 1.1)

Hình 1.1: Hình thái chung của cỏ biển

(Nguồn: www.seagrasswatch.org) + Rễ (root): Rễ thường mọc ra từ các đốt ở phần dưới của thân bò, hệ thống rễ phát triển mạnh, rễ của mỗi loài đều có đặc điểm riêng, phân nhánh

như ở chi Cymodoceae hoặc ít phát triển, không phân nhánh kèm theo nhiều

lông mịn như ở chi Halophila Số lượng rễ ở mỗi đốt có thể là một hay nhiều

tùy vào mỗi loài

+ Thân (rhizome): Thân gồm có phần thân bò hoặc thân ngầm và chồi đứng hoặc thân đứng (shoot) Thân thường có dạng hình trụ tròn hoặc dẹp; chia nhánh theo kiểu đơn trục hay không có qui luật Trên thân bò có nhiều đốt, khoảng cách giữa các đốt là lóng (gióng) Tùy loài mà thân bò mọc ngầm dưới lớp bùn (cát) đáy hoặc bò lan trên mặt nền đáy Từ đốt mọc lên một hay nhiều chồi đứng, chồi đứng thường mang các lá

+ Lá – phiến lá (leaf blade): Lá hình thành từ mô sinh trưởng ở các mấu thân; có hình dải dài, ô van hay trụ tròn Đây là chỉ tiêu hình thái quan trọng trong định loại cỏ Đa phần các loài cỏ có lá không có cuống, ngoại trừ ở một

số chi Halophila Lá có cuống thường có hình ô van, còn các lá không cuống

có hình dải dài như ở chi Cymodoceae Trên lá có các gân chạy song song hay

gần hình lông chim, các gân song song được nối với nhau bằng cách vách ngăn Chóp lá tròn nhẵn hay có gai nhọn Lưỡi (bìa) lá nhẵn hoặc có răng cưa nhỏ

+ Bẹ lá (sheath): Bẹ lá là phần cuống lá phình ra ôm lấy chồi đứng (thân đứng) và bọc lấy những lá non đang phát triển Bẹ lá có dạng lưỡi nhỏ, màu trắng do không có lục lạp nên không có chức năng quang hợp

+ Sẹo lá (leaf scars): Khi các lá rụng đi sẽ để lại các sẹo trên thân đứng,

sẹo lá mở (như ở loài Cymodoceae serrulata) hay sẹo lá đóng (như ở loài Cymodoceae rotundata) là tùy vào mỗi loài Các sẹo lá là một kiểu biểu thị

cách sắp xếp của lá

+ Hoa, quả và hạt: Hoa, quả và hạt là cơ quan sinh sản hữu tính của thực vật hạt kín nói chung và của cỏ biển nói riêng Ở cỏ biển, một số có hoa đực và hoa cái trên cùng một cây (đơn tính cùng gốc), số khác có hoa đực và hoa cái riêng biệt trên mỗi cây (đơn tính khác gốc) Quả được hình thành từ

sự phát triển của bầu sau thụ tinh (giao phấn) và mang các hạt bên trong Hạt được hình thành từ sự phát triển của noãn Hoa, quả và hạt của mỗi loài tùy vào điều kiện sống mà chúng có cấu trúc và hình dạng khác nhau

1.1.1.2 Cỏ biển Enhalus acoroides

Cỏ biển Enhalus acoroides thuộc bộ Trạch tả (Alismatales); họ Hydrocharitaceae (Hình 1.2)

Hình 1.2: Cỏ biển Enhalus acoroides

E acoroides là loài cỏ biển lớn nhất, được phân bố rộng rãi dọc theo bờ biển Bắc Úc, Đông Nam Á, Tây Nam Bộ, Nam Mỹ và Đông Phi [7]

Ở Thái Lan, loài này thường được tìm thấy ở Vịnh Thái Lan và biển

Andaman E acoroides được tìm thấy trong khu vực bãi triều và có sinh khối cao Ở Thái Lan, nó được phát hiện ở các kênh nước lợ xuống các vùng bãi triều, cát bùn và các rạn san hô ở độ sâu 0,5 - 1,0 m Tại Indonesia, E acoroides phát triển trong nhiều loại trầm tích khác nhau, từ cát đến cát thô, ở

các khu vực có sự gia tăng sinh học cao Ở Philippines, nó tập trung các vùng đồi yên tĩnh và cửa sông Ở bán đảo Malaysia, nó phổ biến quanh bờ biển và các khu vực tiếp xúc khi triều thấp [7]

So với các nước trong khu vực thì Việt Nam đứng thứ 3 về đa dạng loài

cỏ biển chỉ sau Australia đứng thứ nhất (20 loài) và Philippines đứng thứ hai

(16 loài) (UNEP, 2004) E acoroides phân bố đặc trưng ở Bắc, Trung, Nam

tại các tỉnh Khánh Hòa, Bình Thuận, đảo Phú Quốc… Điều này không chỉ thể hiện ở thành phần loài, diện tích phân bố mà còn ở cả đặc trưng sinh học của

cỏ biển, là kết quả của sự tương tác của các quần thể của từng loài với điều kiện môi trường

E acoroides có đặc điểm: lá dạng dải băng rất dài từ 30 - 150 cm, lá có đầu cong vào trong, vỏ bọc cuống lá dày, có các rễ và lông dài màu đen, tìm

thấy ở vùng nước cạn, bãi cát vùng triều và những bãi bùn

Các cạnh của lá được cán nhỏ và có các kênh không khí trong đó Lá dài phát triển để nắm bắt nhiều ánh sáng Đây là loài duy nhất giải phóng hạt phấn lên bề mặt nước trong sinh sản, hạn chế sự phân bố của nó tới vùng bãi triều cạn Đây là loài đang phát triển chậm và sức đề kháng kém [7]

Hoa nâu rất nhỏ (1 cm) và khi chúng nổi trên bề mặt nước, chúng trông giống như những miếng polystyrene trắng hoặc dạng xốp cách nhỏ Các hoa đực được tạo ra từ một cụm hoa hình thành dưới gốc cây Hoa đực có một đầu không thấm nước, còn đầu kia lại hấp dẫn nước Vì vậy, hoa sẽ đứng thẳng trên mặt nước Những bông hoa đực có xu hướng hình thành bè

Hoa cái lớn và được giữ trên một cuống dài Nó có ba cánh hoa trắng gân (2-3 cm), thường rơi rụng một ngày sau khi nở Khi thủy triều xuống, những cánh hoa trải dài trên bề mặt nước tiếp xúc với hoa đực nổi Các cánh hoa dài của hoa cái là không thấm nước, trừ phần trung tâm

Quả có hình tròn và có đường kính lớn (đường kính 4 - 6 cm) với lớp lông dày, có gân Khi chín, trái cây tách ra nở 6 - 7 hạt trắng Hạt giống trôi nổi chỉ khoảng 5 giờ trước khi chúng bắt đầu chìm, do đó chúng không đi xa Các rễ phát triển nhanh và hạt mọc nhanh Giống như các loài cỏ biển khác,

cỏ biển E acoroides phát tán chủ yếu bằng sự sinh sản sinh dưỡng

Ngoài ra hạt của cỏ biển E acoroides được những người dân sống trên

bờ biển của Úc và Philippines dùng làm thức ăn Khi ăn sống hạt cỏ biển được coi là hương vị giống như hạt dẻ nước Một chất xơ bền hữu ích và được

ứng dụng làm lưới đánh cá [8]

1.1.1.3 Phân bố của hệ sinh thái cỏ biển

Liên Hợp Quốc đã công bố bản đồ đầu tiên về sự phân bố cỏ biển trên toàn cầu và nhận thấy 15% đã biến mất trong 10 năm qua Theo Trung tâm giám sát và bảo vệ môi trường thế giới của Liên Hiệp Quốc tại Cambridge, đã xác định được diện tích phân bố của cỏ biển trên toàn cầu là 177.000 km2

,

bằng 2/3 diện tích nước Anh Hiện có khoảng 60 loài cỏ biển khác nhau mọc thành những thảm cỏ lớn ở cả biển nhiệt đới và ôn đới [4] Trong một vùng cỏ biển thường chỉ có một hoặc vài loài chiếm ưu thế nhưng cũng có những khu vực lên đến trên 10 loài Ở các vùng biển nhiệt đới, cỏ biển thường đa dạng hơn vùng biển ôn đới

Các thảm cỏ biển tập trung ở Ấn Độ - Tây Thái Bình Dương, vịnh Caribbe và vùng Thái Bình Dương thuộc Trung Mỹ Vùng Đông Á có hệ cỏ biển đa dạng nhất thế giới và có thể đây là trung tâm phát tán của cỏ biển Chính vì vậy, chúng rất phong phú ở dải ven biển thuộc vùng này [9] Vịnh Shark ở Nam Phi tuy không phong phú về số lượng loài (12 loài) nhưng lại là một trong những nơi có thảm cỏ biển lớn nhất thế giới Tại đây thảm cỏ biển

có diện tích khoảng 4000 km2, trong đó loài chiếm 85% diện tích cỏ biển của

khu vực này là Amphibolis Antarctica

Cỏ biển cũng như các sinh vật khác đều chịu nhiều tác động tổng hợp của các yếu tố môi trường đặc biệt là ánh sáng, vì chúng cần ánh sáng để quang hợp, do đó cỏ biển chỉ mọc ở tầng nước mà ánh sáng có thể chiếu tới được Cỏ biển cũng không thể tồn tại được ở khu vực thủy triều quá thấp nơi chúng dễ bị đốt nóng bởi ánh sáng mặt trời Cỏ biển được tìm thấy gần các rừng ngập mặn, cửa sông, vịnh, đầm, chúng phát triển mạnh ở các bờ biển cạn, mặc dù vậy có những nơi người ta tìm thấy chúng ở độ sâu 32 m tới 68m,

đối với một số loài thuộc chi Halophila ở Đại Tây Dương còn có thể gặp ở độ

sâu lên tới 90m [4]

Hiện nay, Việt Nam có 14 loài cỏ biển Theo thống kê chưa đầy đủ, diện tích phân bố cỏ biển hiện nay ở Việt Nam khoảng trên 10.000 ha, vùng ven biển Việt Nam, nơi có nhiều đầm phá và vịnh rất phù hợp cho sự phát

triển của các loài cỏ biển Các loài cỏ biển ưu thế là Enhalus acoroides, Thalassia hemprichii, Cymodocea serrulata, Halodule uninervis, Halophila ovalis và Zostera japonica, chủ yếu tập trung ở các tỉnh miền Trung và phía

Nam, ven các đảo Phú Quý (Bình Thuận), Côn Sơn (Bà Rịa – Vũng Tàu), Phú

Quốc (Kiên Giang): 10 loài Trong số các loài thì cỏ biển lá dừa Enhalus

acoroides được phát hiện có phân bố rộng, mật độ dày trong vùng biển Khánh

Hòa (Phụ lục 1) [4]

Ở nước ta, cỏ biển thường phát triển ở vùng thủy triều ven biển, ven đảo, các vùng cửa sông, rừng ngập mặn, đầm phá Các loài cỏ biển phát triển hầu như quanh năm, nhưng tốt nhất là vào mùa xuân và đầu hè, phát triển kém vào mùa mưa bão Chúng phân bố từ vùng thủy triều đến độ sâu 3 – 15m, thậm chí là 28 m (Đảo Bạch Long Vĩ) và thích nghi với độ muối từ 5 đến 34‰, chất đáy là bùn bột nhỏ, bùn cát, cát san hô, cát thô và sỏi (Phụ lục 1)

Hầu như các nghiên cứu về cỏ biển ở Việt Nam tập trung chủ yếu về điều tra, phân loại và hệ sinh thái của chúng và chưa có nghiên cứu nào về các hoạt chất sinh học được tìm thấy ở cỏ biển [4]

1.1.2 Một số thành phần hóa học của cỏ biển

1.1.2.1 Thành phần hóa học của cỏ biển

 Polysaccharide

Glucose, galactose và mannose là các loại đường hòa tan thường có trong các polysaccharide ở cỏ biển Hàm lượng các thành phần không hòa tan của polysaccharide là cao hơn nhiều so với các thành phần tan có trong polysaccharide Dữ liệu cho thấy các thành phần chính của thành tế bào

Posidonia là cellulose và lignin (lần lượt là 190 – 209 và 145 – 154 g kg-1) Carbohydrate ở cỏ biển tồn tại khác biệt với thực vật trên cạn Trong chất inositols có thể có năm chất được biết là có trong thực vật như myo-, 1-chiro, muco- và O-methyl-muco inositol xuất hiện ở cỏ biển Lá và thân rễ của một

số loài cỏ biển, đặc biệt là Zosteraceae, chứa một lượng tương đối lớn inositol, tối đa là 2,2% trọng lượng khô Zosteranoltii rhizomes [10]

myo- Dimethylsulfoniopropionate (DMSP)

Cỏ biển tự sinh ra dimethylsulfonioproponate như là một chất bảo vệ thực vật, phần lớn chúng bị phân hủy bởi vi khuẩn biển, đảm bảo vai trò quan trọng trong chu trình vòng lưu huỳnh Trong các loài cỏ biển, nồng độ DMSP

khác nhau được tìm thấy: Halodule wrightii là 3,3mol g-1

trọng lượng tươi,

Syringodium filiforme là 0,1 mol g-1 trọng lượng tươi, Thalassia testudinum

trong các lá tế bào biểu mô và ngoài tế bào biểu mô, nằm ở khoảng giữa 0,18

và 4,0 mol g-1 trọng lượng tươi và ở thân rễ thì hàm lượng thấp Những kết quả này chỉ ra rằng mức độ giống nhau cũng như vai trò chính của cỏ biển với

sự đóng góp tổng hàm lượng DMSP [10]

 Protein và peptit

Cỏ biển có khả năng hấp thụ kim loại nặng từ môi trường xung quanh

và để tích lũy chúng trong các mô với mức độ khác nhau Sự hấp thụ và tích

tụ của chúng qua trung gian protein và peptit Các chuỗi peptit gắn kim loại

có chứa glutathione thường có cấu trúc –Gly (11) là các peptit tổng hợp enzym và được biết là có ảnh hưởng đến các kim loại nặng, chủ yếu là Cd và

As, đã được chứng minh trong thực vật, tảo và một số loại nấm men phát triển khi ở nồng độ cao Cho đến nay, không có thành phần chính xác của phytochelatin (PC) trong cỏ biển hoặc enzym tổng hợp, khi PC đã được phân tích trên cỏ biển Metallothionein (MT) là một nhóm với các protein có khối lượng phân tử thấp và hàm lượng cystein cao gắn kết các kim loại nặng và được cho là có vai trò trong quá trình trao đổi chất và giải độc Các tiêu chí xác định protein hoặc peptit như MT là (i) trọng lượng phân tử thấp (<10 KDa) (ii) hàm lượng kim loại và lưu huỳnh cao (>10%), (iii) các đặc tính quang phổ điển hình của liên kết M – S và (iv) không có hoặc ít các acid amine thơm Tuy nhiên, khi tất cả các tiêu chí không được hoàn thành, các protein thường được gọi là các protein giống như MT [10]

1.1.2.2 Một số hợp chất có hoạt tính sinh học ở cỏ biển

 Polyphenol

Polyphenol là chất chống oxy hóa đặc biệt quan trọng, với tiềm năng chống oxy hóa cao, cho phép chúng hoạt động như các tác nhân khử Cỏ biển chứa nhiều chất polyphenol như acid phenolic, flavonoid, anthocyanidin, lignin, tannin, catechin, epicatechin, epigallocatechin và acid gallic Các hợp chất polyphenolic này đã cho thấy nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sức khoẻ như chống oxy hoá, chống ung thư, thuốc kháng virus, chống viêm và

khả năng ức chế sự kết tập tiểu cầu ở người Một số nghiên cứu cho thấy mối tương quan giữa lượng chất chống oxy hoá tự nhiên tăng lên và giảm bệnh tim mạch, tử vong do ung thư và tuổi thọ kéo dài [11] Hơn nữa, chúng có hoạt tính chống oxy hoá cao có thể được sử dụng thành công để ngăn ngừa nhiều rối loạn chức năng cơ quan do ion kim loại độc hại gây ra Các báo cáo trước đó cho thấy các polyphenol có thể tái tạo α-tocopherol thông qua việc giảm gốc tự do α-tocopheroxyl Sự kết hợp chặt chẽ giữa hoạt động chống ung thư và hoạt động chống oxy hoá đã được báo cáo trong một hệ thống gây

ung thư ở chuột với các polyphenol có trọng lượng phân tử thấp

Các hợp chất phenol đã được phân lập từ Zostera marina, loài cỏ biển

thường được gọi là thạch đỏ, và có một vai trò quan trọng trong việc ức chế

sự phát triển của vi sinh vật Thực tế là các chất được chiết xuất từ Z marina

đã được tìm thấy có khả năng ức chế sự gắn kết của các vi khuẩn biển, tảo và

giun nhiều tơ trên bề mặt của các hợp chất phenolic từ Z marina Ít nhất 23

hợp chất phenolic được xác định trên cỏ biển [12]

 Flavonoid

Sự hiện diện của flavone sulfate đã được báo cáo ở các loài Halophila, Thalassia và Zostera, nhưng chúng lại không có trong Syringodium spp hoặc Posidonia oceanica Flavonoid sulfate cũng được phát hiện trong Halophila ovalis và Thalassia testudinum Bốn flavone như luteolin, apigenin, luteolin-3

glucoronide, và luteolin-4-O-glucoronide, có tiềm năng kháng khuẩn đã được xác định từ các chiết xuất bằng ethanol Sau đó, họ đã tìm thấy sự hao hụt đáng kể của flavonoid khi phân tích lá khô đông lạnh và gần như ngược lại

với lá tươi và sấy khô của Posidonia oceanica Bitam và cộng sự đã phân lập

và xác định các chất dẫn xuất flavone glycosid malonylated từ Halophila stipulacea nhờ sử dụng HPLC và NMR Heglmeier và Zidorn đã biên soạn và đánh giá dữ liệu về các chất chuyển hóa thứ sinh của Posidonia oceanica và

tổng kết có 51 sản phẩm tự nhiên bao gồm phenol, phenylmethane, phenylethane, dẫn xuất phenylpropane và ester của chúng, chalkones và flavonoid Lượng flavonoid cao hơn đáng kể đã được quan sát thấy ở các lá

của Halophila johnsonii và lá của Halophila decipiens trong bãi triều [10]

 Terpenoid

Các phân tử được tìm thấy trong các loại thực vật trên cạn như acid caffeic, inositol, sucrose, monoglucoside quercetin, monoglucoside của isoramnetin, acid cichoric, cũng như các polyamines như putrescine, spermidine và spermine đã được báo cáo là thành phần có ở cỏ biển

Cymodocea nodosa Hơn nữa, 24α-etyl sterol và 24α-metyl sterol cùng với

24ꞵ-epimers, cymodiene và cymodienol, các diarylheptanoid đầu tiên được phân lập từ sinh vật biển, bao gồm tổng số chất chuyển hóa được phân lập từ

C nodosa cho đến nay Gần đây, các hợp chất mới terpenoid từ lớp cấu trúc

của các diarylheptanoid, meroterpenoid đầu tiên được phân lập từ cỏ biển Tất

cả các hợp chất mới phát hiện đã được thí nghiệm về hoạt tính kháng khuẩn của chúng đối với các chủng vi khuẩn kháng thuốc (MDR) và kháng methicillin Hoạt động từ yếu đến mạnh và do đó mở ra cánh cửa cho việc xây dựng các kháng sinh mới cần thiết một cách nhanh chóng do sự gia tăng các dòng kháng thuốc, đặc biệt là trong các bệnh viện Có một số lượng lớn các hoạt chất với hoạt tính kháng sinh tiềm năng có thể được chiết xuất từ cỏ biển

Các nghiên cứu hóa học và sinh học của dịch chiết chloroform từ Posidonia oceanica, đã được phân lập và xác định chất mới: (E)-3, 7, 12-

Trimethyltridec-2-en-1-ol có tên posidozinol với andsitosterol và bốn acid béo

đã biết: palmitic, palmitoleic, oleic và acid linoleic Terpenoid tách khỏi P oceanica có hoạt tính kháng nấm tốt [10]

Như vậy, có rất ít nghiên cứu đã được thực hiện về hoạt tính sinh học

của cỏ biển và ở một số loài như Thalassia testudinum, hoạt tính kháng nấm,

thuốc kháng vi-rút [13], hoặc chống viêm [14], độc tính [15] Thành phần hóa học của một số loài cỏ biển cũng đã được mô tả, bao gồm một kháng sinh

flavone glycosid từ T testudinum [16], đường từ Ruppia maritima L [17], các hợp chất phenol từ P oceanica [18], steroid và acid béo từ Zostera japonica

[14]

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ PECTIN

1.2.1 Giới thiệu chung về pectin

Pectin là chất phụ gia thực phẩm ngày nay thường được dùng để tạo đông, tạo gel Tiền thân của pectin là protopectin không tan trong nước và có nhiều trong mô khi cây còn xanh, quá trình chín sẽ kèm theo sự thủy phân protopectin thành pectin Sau đó kết hợp với sự demetyl hóa dưới tác dụng của enzym và sự depolymer hóa của pectin thành pectate và cuối cùng là các loại đường hòa tan và acid Từ thời tiền sử chất pectin đã là thành phần trong khẩu phần ăn của con người Nhưng chỉ mới nửa thế kỷ trước, ngành công nghệ thực phẩm mới nhận biết được vai trò quan trọng của phụ gia pectin trong việc đa dạng các sản phẩm thực phẩm Pectin được xem như là thành phần thiết yếu của thành tế bào các thực vật nở hoa bậc cao [9, 19] Hàm lượng trung bình của pectin trong thành tế bào thực vật có thể đạt 30% Cùng với các thành phần khác, pectin tạo ra độ bền và khả năng giãn nở của các thành tế bào cũng như một số chức năng cần thiết duy trì cho sự sinh trưởng

và phát triển của thực vật Thêm nữa, pectin còn có chức năng tăng sức đề kháng của cây để chống lại dịch bệnh [20] Pectin được chiết xuất ở qui mô công nghiệp từ các nguyên liệu như củ cải đường, bã táo ép, vỏ cam và quýt [11] Trong công nghiệp pectin thường được sử dụng trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm làm chất tạo gel, làm dày và chất ổn định cũng như chất nhũ hóa Bên cạnh các thực vật trên cạn, pectin cũng có thể được thu nhận từ

nguồn thực vật biển như cỏ biển thuộc họ Zosteraceae [21]

 Nguồn nguyên liệu giàu pectin

Trong thực vật pectin thường được liên kết với cellulose ở vách tế bào Pectin tồn tại với hàm lượng khác nhau trong củ, quả, thân của một số loài thực vật: bưởi, táo, mận, cam, chanh, cà rốt… Bảng 1.1 sau đây sẽ thể hiện một số loại nguyên liệu chứa pectin

Pectin có nguồn gốc từ cỏ biển được biết hiện nay vẫn chưa được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm mà chủ yếu dùng để làm thực phẩm chức năng

Bảng 1.1: Hàm lượng pectin trong các loại nguyên liệu khác nhau [22]

1.2.2 Đa dạng cấu trúc của pectin

1.2.2.1 Cấu tạo chung

Pectin là một polysaccharide tồn tại phổ biến trong thực vật, là thành phần tham gia xây dựng cấu trúc tế bào thực vật và nó có chứa ít nhất 65% acid galacturonic được liên kết với nhau bằng liên kết α-1,4-glycoside, trong

đó một số gốc –COOH được methoxyl hóa thành –CH3O Pectin là hợp chất cao phân tử polygalactoronic có đơn phân tử là galactoronic và rượu metylic Trọng lượng phân tử từ 20.000 - 200.000 đvC Hàm lượng pectin 1% trong dung dịch có độ nhớt cao, nếu bổ sung 60% đường và điều chỉnh pH từ 3,1 - 3,4 sản phẩm sẽ tạo đông

Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của petin (a) phân tử acid galacturonic,

(b) cấu trúc của pectin homogalacturonan

Pectin gồm có 3 loại polysaccharide: (1) dạng homopymer mạch thẳng

là homogalacturonan (HG); (2) dạng polymer mạch nhánh là rhamnogalacturonan I (RG-I) và dạng (3) là rhanogalacturonan II (RG-II) với các gốc galacturonan ở mạch nhánh Đây là dạng có phân bố rộng rãi nhất [25] HG cấu tạo nên 57-69% pectin với các gốc acid α-D-galacturonic liên kết 1,4 trong đó 8-74% các nhóm cacboxyl được ester hóa bởi methanol RG-

I được tạo nên bởi các gốc galacturonan liên kết với nhau thông qua một hoặc hai gốc α-L-rhamnose bằng liên kết 1,2 Chiều dài đoạn mạch HG vẫn chưa được biết nhưng mức độ polymer hóa của nó nằm trong khoảng từ 30-200 RG-I chiếm từ 7-14% pectin, khoảng 20-80% rhamnose được chẻ nhánh bởi các gốc L-arainose, D-galactose, L-aranbinan, galactan, hoặc arabinogalactan, mạch nhánh gồm các kiểu liên kết khác nhau của các gốc arabinan liên kết α-1,5; α-1,3 và các gốc galactan và arabinogatactan liên kết ꞵ-1,4 hoặc ꞵ-1,3 và ꞵ-1,6 Pectin cỏ biển được đặc trưng bởi sự thể hiện của các mảnh apiogalacturonan trong đó các gốc D-apiose liên kết với gốc acid D-galacturonic bởi các liên kết 1,2- và 1,3- [26] Khoảng 10-11% pectin được tạo nên RG-II bao gồm mạch chính là các gốc galacturonan với 4 kiểu mạch nhánh có cấu trúc phức tạp có thể cấu tạo bởi 12 loại đường khác nhau, bao

gồm cả gốc đường như 2-O-methylxylose, 2-O-methylfucose, apiose, v.v [27]

Những nghiên cứu mới về cấu trúc phân tử pectin cho thấy pectin có hai vùng cấu tạo chính là vùng suôn thẳng (smooth regions) chiếm khoảng 60 – 90% khối lượng và vùng rậm (vairy region) chiếm 10 – 40% khối lượng

Pectin là một hợp chất tự nhiên có nhiều trong màng tế bào của các loài thực vật bậc cao, phân bố chủ yếu ở các bộ phận như quả, củ, thân Trong màng tế bào, pectin có mặt ở phiến giữa (với hàm lượng cao nhất) và ở vách

tế bào sơ cấp (Hình 1.4)

Hình 1.4: Pectin trong cấu tạo của thành tế bào thực vật

Ở thực vật pectin tồn tại chủ yếu ở 2 dạng là pectin hòa tan và protopectin không hòa tan Dưới tác dụng của acid, enzyme protopectinaza hoặc khi gia nhiệt thì protopectin chuyển thành pectin

Protopectin: Là dạng không tan, chủ yếu ở thành tế bào

Pectin hòa tan: tồn tại chủ yếu ở dịch tế bào

Phân tử lượng của các loại pectin tách từ các nguồn quả khác nhau thay đổi trong giới hạn rộng 25000 – 50000

Cấu trúc hóa học của pectin được thể hiện trong Hình 1.5 [24]

Hình 1.5: Các dạng cấu trúc hóa học của pectin

Cấu trúc của HG và RG-I biến đổi theo loài thực vật và các dạng tế bào khác nhau do sự khác biệt về kích thước phân tử polymer, mô hình acetyl hóa, mức độ methoxyl hóa cũng như sự khác biệt về chiều dài và loại mạch nhánh của RG-I Các pectin thương mại thường được thu nhận theo phương pháp chiết acid, dẫn tới kết quả là sự phá vỡ hoặc làm mất nhóm pectin RG-II và một lượng nào đó nhóm RG-I Trong một số trường hợp pectin cũng được thu nhận bằng phương pháp chiết kiềm hoặc chiết ở nhiệt độ cao để thu nhận các phân mảnh hoặc các pectin bị biến đổi về cấu trúc Do cấu trúc phức tạp và đa dạng nên pectin sở hữu nhiều hoạt tính sinh học khác nhau

Pectin đặc trưng bởi 2 chỉ số quan trọng là chỉ số methoxyl “MI” biểu hiện cho phần trăm khối lượng nhóm methoxyl –OCH3 có trong phân tử pectin và chỉ số DE thể hiện mức độ ester hóa của các phân tử acid galactoronic trong phân tử pectin Dựa trên mức độ methoxyl hóa và ester hóa, trong thương mại chia pectin thành 2 loại: pectin có độ methoxyl hóa cao

và pectin có độ methoxyl thấp Pectin methoxyl hóa cao (Hight Methoxyl Pectin – HMP) : DE > 50% hay MI >7% (Hình 1.6) Pectin methoxyl hóa thấp (Low Methoxyl Pectin- LMP): DE<50% hay MI<7% (Hình 1.7) [28] Pectin tự nhiên được đặc trưng bởi mức độ methoxyl hóa trên 50% ngoại trừ pectin từ cỏ biển có mức độ methoxyl hóa chỉ từ 8-10% Pectin methoxyl thấp

có thể tạo đông trong không có đường Chúng thường được dùng làm màng bao bọc các sản phẩm

Hình 1.6: Cấu trúc của pectin có mức độ methoxyl hóa cao

Hình 1.7: Cấu trúc của pectin có mức độ methoxyl hóa thấp

Tóm lại, các nghiên cứu trước đây về chiết tách và xác định cấu trúc

của pectin từ cỏ biển Zostera marina L (hợp chất Zosterin) lần đầu tiên được

nghiên cứu bởi Miroshnikov và cộng sự, 1940 [29], tiếp sau đó đã có một số công trình nghiên cứu về sự chiết tách và đặc điểm cấu trúc của pectin từ cỏ

biển thuộc họ Zosteraceae và từ loài Phyllospadix iwatensi [10, 30, 31] Bên

cạnh đó cũng có một số công trình nghiên cứu tách chiết pectin từ một số loài trên cạn như: vỏ chanh [32], vỏ cam [33], vỏ chanh dây [34], vỏ măng cụt Indonesia [35], … Tuy nhiên, cho tới nay so với các thực vật trên cạn thì các nghiên cứu về pectin từ cỏ biển vẫn còn rất ít

1.2.2.2 Cấu trúc hóa học của pectin ở vách tế bào sơ cấp

Pectin là một nhóm các polysaccharide phức tạp chứa dư lượng acid D-galactosyluronic (GalpA) 1,4-liên kết Ba polysaccharide pectic (homogalacturonan, rhamnogalacturonan-I, và galacturonans thay thế) đã được phân lập từ các thành tế bào sơ cấp và có đặc trưng cấu trúc đa dạng [27]

α-Homogalacturonan (HG) là một chuỗi tuyến tính các acid galactopyranosyluronic liên kết 1,4 (GalpA), trong đó một số nhóm carboxyl

α-D-được methyl ester hóa (Hình 1.8) HGs, tùy thuộc vào nguồn thực vật, cũng

có thể được O-acetyl hóa một phần ở C- 3 hoặc C-2 [36]

Hình 1.8: Cấu trúc chính của homogalacturonan

Homogalacturonan là một polymer tuyến tính có chứa các α-D-GalpA Rhamnogalacturonan-I (RG-I) là một họ polysaccharides pectic có chứa một phần của disaccharide lặp lại [-4)–α-D-GalpA- (1- 2) –α-D-Rhap- (1-) (Hình 1.8) Các dư lượng GalpA có thể được Oacetyl hóa trên C-2 và / hoặc C-3 Không có bằng chứng hóa học kết luận rằng dư lượng GalpA được methyl ester hóa, tuy nhiên, một phần RG-I đã được báo cáo là có chứa ester methyl [37] Các dư lượng GalpA thường không được thay thế bằng các dây chuyền mono oligosaccharide, mặc dù một nghiên cứu gần đây cho thấy một đơn dư ꞵ-D-GlcpA được liên kết với C-3- 2% GalpA trong xương sống của củ cải đường RG-I [11] Ngược lại, 20-80% dư lượng rhamnosyl (Rhap), tùy thuộc vào cây trồng, nguồn và phương pháp cô lập, được thay thế ở C-4 với các chuỗi bên cạnh acid oligosaccharide trung tính và acid [27] Các chuỗi bên chủ yếu có chứa α-L-arabinofuranosyl tuyến tính và phân nhánh, hoặc ꞵ-D-galactopyranosyl (Galp) (Hình 1.9), mặc dù tỷ lệ tương đối và chiều dài chuỗi của chúng có thể khác nhau tùy thuộc vào nguồn thực vật [38] Các dư lượng glycosyl α-L-fucosyl (Fucp), ꞵ-D-glucuronosyl (GlcpA), và 4-O-methyl ꞵ-D-

glucuronosyl (4-O-Me GlcpA) cũng có thể có mặt như acid ferulic và coumaric [27, 39]

Hình 1.9: Mô hình đặc điểm cấu trúc của Rhamnogalacturonan-I

Các galacturonan đã được biến đổi là một nhóm đa dạng các polysaccharide có chứa một phần của các α-D-GalpA tuyến tính liên kết 1,4 Các galacturonan thay thế gọi là rhamnogalacturonan II (RG-II) hiện diện trong tất cả các vách tế bào chính thực vật bậc cao phân tích cho đến nay RG-

II, RG-II liên kết với các kim loại nặng, rượu vang và các loại nước ép trái cây khác có hàm lượng tương đối cao (20-150 mg/l) và RG-II có các hoạt động miễn dịch đã dẫn tới sự quan tâm lớn hơn đến cấu trúc của RG- II và vai trò của polysaccharide pectic trong dinh dưỡng và sức khoẻ con người [27, 40]

RG-II không liên quan đến cấu trúc với RG-I vì nó bao gồm các đoạn

dư thừa α-D-GalpA liên kết với 1,4; chứ không phải là disaccharide lặp đi lặp lại [- 4) –α-D-GalpA- (1- 2) –α-L-Rhap- (1) Một nonasaccharide và một octasaccharide được gắn với C-2 ở một phần GalA còn lại và hai disaccharides có cấu trúc khác nhau Các chuỗi C và D được gắn vào C-3 của

tế bào [27]

Các galacturonan thay thế khác đã được mô tả có mặt trong các tế bào

có số lượng hạn chế ở thực vật Ví dụ, xylogalacturonan (XGA), chứa dư

lượng ꞵ-D-xylosyl (Xylp) gắn với C-3 của xương sống, có mặt trong các mô

ở mô sinh sản (ví dụ: táo, cà rốt, bông và thông) Apiogalacturonan, có trong các tế bào của một số loài động vật đơn giá thuỷ sinh, chứa dư lượng ꞵ-

dapiofuranosyl gắn với C-2 và C-3 [41]

1.2.3 Tính chất của pectin

1.2.3.1 Tính chất hóa học của pectin

Ở thực vật pectin tồn tại chủ yếu ở 2 dạng là pectin hòa tan và protopectin không hòa tan Dưới tác dụng của acid, enzyme protopectinaza hoặc khi gia nhiệt thì protopectin chuyển thành pectin Mức độ hòa tan trong nước của pectin tỉ lệ nghịch với kích thước phân tử và tỷ lệ thuận với mức độ methoxyl hóa, ngoài ra mức độ tan trong nước của pectin còn chịu ảnh hưởng của các yếu tố như nồng độ chất tan, độ pH và nhiệt độ của dung dịch, mức

độ methoxyl hóa càng cao thì khả năng tạo đông càng cao Khi sử dụng cần phải hòa tan pectin vào nước, khi pectin hút đủ nước thì mới sử dụng ở công đoạn cuối chế biến

Các pectin đều là những chất keo háo nước có khả năng hydrate hóa cao nhờ sự gắn các phân tử nước vào nhóm hydroxyl của chuỗi polymethyl galacturonic Ngoài ra, trong phân tử pectin có mang điện tích âm nên chúng

có khả năng đẩy lẫn nhau làm giãn mạch và làm tăng độ nhớt của dung dịch Khi làm giảm độ tích điện và hydrat hóa sẽ làm cho sợi pectin xích lại gần nhau và tương tác với nhau tạo nên một mạng lưới ba chiều rắn chứa pha lỏng

ở bên trong

Sự tương tác giữa protein và peptide với pectin dẫn đến sự hình thành các phức hòa tan và không hòa tan mà cấu trúc của chúng phụ thuộc vào tỷ lệ của các biopolymer và pH Trong quá trình này, các liên kết cộng hóa trị giữa các dư lượng tyrosine của protein và nhóm carboxyl acid uronic của pectin được hình thành, có thể dẫn đến sự hình thành của một mạng lưới pectin Có một giả thuyết khác, theo đó các protein tạo thành các phức hợp ion với pectin

Các protein hình cầu, như albumin huyết thanh ở bò (BSA) và lactoglobulin, hình thành gel, và sự pha trộn của các gel với LM pectin dẫn đến sự hình thành các loại gel hỗn hợp Trong quá trình hình thành gel, sẽ có

β-sự cạnh tranh động học giữa β-sự hình thành gel và quá trình tách pha Việc kiểm soát tỷ lệ tương đối của các quá trình này bởi các yếu tố bên ngoài, chẳng hạn như điều kiện môi trường, dẫn đến một phổ rộng các cấu trúc vi

mô Sự hình thành của gel trong quá trình tương tác giữa polysaccharides và protein hình cầu ở pectin đã được nghiên cứu rộng rãi Một loạt các cấu trúc

và tính chất lưu biến của các gel kết quả đã được mô tả khác nhau tùy thuộc vào tính chất của biopolyme và điều kiện tạo gel Người ta thấy rằng sự hiện diện của cation Na+

và Ca2+ và tỷ lệ của chúng đóng một vai trò quyết định trong sự hình thành gel của hỗn hợp các protein hình cầu với pectin Tăng lượng pectin và nồng độ canxi làm cho hỗn hợp gel cứng hơn

Trong quá trình hình thành và dự trữ gel, phản ứng giữa pectin và protein hoặc peptide có thể xảy ra sự hydroxyl của các nhóm ester trong pectin, decarboxyl, hoặc hydroxyl của glycoside do sự hiện diện của pectinase trong hỗn hợp Các quá trình này nên được xem xét trong quá trình sản xuất gel pectin - protein

1.2.3.2 Tính chất vật lý của pectin

Pectin tan trong nước và tạo thành dung dịch có độ nhớt rất cao Khi tiếp xúc với nước, pectin nhanh chóng hấp thu nước và trương nở gấp nhiều lần so với kích thước ban đầu, sau đó các phân tử pectin bắt đầu tách rời khỏi hạt pectin từ ngoài vào trong cho đến khi biến mất

Nếu các hạt pectin dính nhau khi tiếp xúc với nước thì tất cả chúng sẽ trương lên, dính nhau và hợp lại thành một viên to và hoà tan rất lâu Ngược lại, nếu các hạt pectin được tách rời nhau trước khi tiếp xúc với nước thì chúng sẽ có đủ chỗ trống để trương nở mà không dính vào nhau

Nồng độ ion canxi ở gel cứng được hình thành tương đối hẹp trong trường hợp sự hình thành gel xảy ra khi không có muối khác hoặc chỉ sử dụng NaCl Phạm vi này được mở rộng theo nồng độ Ca2+

cao hơn với sự hiện diện

của natri citrate, kali và natri tartrate [3] Những muối này làm cho gel đàn hồi và dễ phục hồi nhiệt hơn, ngay cả trong quá trình hủy hoại cơ học Việc điều chế pectin HM với pectin methylesterase dẫn đến sự hình thành các pectin LM có trong các dung dịch khác với hoạt động của pectin HM và phụ thuộc nhiều vào nồng độ cation đơn trị

Ngoài ra, trong quá trình sản xuất gel có hàm lượng sucrose thấp được quan sát trong hoạt động lưu biến của các gel hỗn hợp, trong đó nồng độ HM pectin cao gấp 3 lần so với nồng độ của LM pectin Trong trường hợp này, một hỗn hợp gel có nồng độ sucrose thấp hơn có các thông số lưu biến giống như HM pectin khi có sucrose có nồng độ cao hơn đáng kể [41]

1.2.4 Hoạt tính sinh học và ứng dụng của pectin

1.2.4.1 Hoạt tính sinh học

Một số đặc tính của pectin là tác dụng chống ung thư và chống huyết khối, đặc biệt là pectin chiết từ bã táo, đã được chứng minh bằng ví dụ về pectin chiết từ bã táo trong các mô hình thí nghiệm về sự hình thành ung thư

ở ruột và di căn gan Việc áp dụng chúng vào trong điều trị ung thư ruột đã được cấp bằng sáng chế tại Nhật Bản

Khả năng sinh học cao của pectin đã được sử dụng để có được một chế phẩm dược phẩm dựa trên lactoferrin, một glycoprotein sữa tạo ra hoạt tính bactericide điều trị viêm mãn tính trong viêm miệng Nó cho thấy rằng pectin

HM thích hợp nhất để chế tạo các viên nén sinh học vì cùng với khả năng sinh học cao, chúng có đặc tính giải phóng chất hoạt hóa Hơn nữa, quá trình này

có thể được quy định bởi nồng độ ion canxi, phản ứng chéo với đoạn galacturonan của phân tử pectin và tạo điều kiện giải phóng lactoferrin

Giả thiết rằng trên bề mặt các tế bào ung thư, polysaccharide pectin liên kết các protein chịu trách nhiệm cho sự kết dính của tế bào khối u bằng các

mô khỏe mạnh Một chế phẩm thương mại pectin từ cây cam quýt bị biến đổi

để ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư và di căn Nó đã được chỉ ra rằng làm tăng thời gian nhân đôi của kháng nguyên tuyến tiền liệt, ung thư biểu mô tuyến tiền liệt chủ yếu, ở nam giới khoảng 70%

Nghiên cứu cho thấy thuốc chống lao trùng khớp với các chất pectin đã chỉ ra rằng các chế phẩm thu được có hoạt tính cao hơn isoniasid nguyên chất Pectin có liên kết chéo, ít tan và ít bị phân hủy trong cơ thể, cũng như gel

pectinat canxi có chứa NaHCO3 và có hiệu quả cho những mục đích này Các gel này được đặc trưng bởi độ rỗng cao và mật độ thích hợp [41]

Trong khía cạnh khác, hoạt động của pectin đối với đường tiêu hóa, sự tương tác với chất nhầy là chủ đề nghiên cứu chuyên sâu nhất Do đó, nó đã được chỉ ra rằng pectin liên kết với mucin, thành phần chính của chất nhầy ở GIT, để tạo thành một mạng gel Theo cách này, các polysaccharide pectin làm tăng tính chất bảo vệ của chất nhầy và do đó có thể được áp dụng để điều trị các tổn thương của GIT và các bệnh truyền nhiễm Bằng cách thay đổi các đặc tính phân tử của pectin, có thể thay đổi độ cứng của gel và mô hình phân phối pectin trong phức hợp pectin-mucin Điều này cho phép điều chỉnh sự tương tác giữa pectin với mucin để đáp ứng nhu cầu phân phối thuốc và điều trị lâm sàng [41]

Ngoài ra, nhờ khả năng liên kết tốt với các cation hóa trị 2 mà pectin được sử dụng như chất thải độc kim loại nặng khỏi dung dịch nước cũng như khỏi cơ thể người Khotimchenko và cộng sự đã nghiên cứu tính chất liên kết với các kim loại nặng như Hg, Pb, Cd… của pectin được phân lập từ cỏ biển

Zostera marina [12], các nghiên cứu sau đó của nhóm tác giả này còn cho

thấy các hoạt tính sinh học khác của pectin từ cỏ biển như tác dụng làm giảm nhanh chóng hàm lượng chì trong gan, làm giảm sự peroxyl hóa của lipid, giảm tổng cholesterol, triglyceride trong máu và gan [42] Pectin còn thể hiện các hoạt tính kháng ung thư và tăng cường hệ thống miễn dịch [41]

Nhu cầu gia tăng đối với nguyên liệu sinh học sử dụng trong bao gói thực phẩm đã khuyến khích sự phát triển của màng thực phẩm thân thiện môi trường Các thành phần chính của các loại tinh dầu thực vật mang đặc tính kháng khuẩn chống tác nhân gây bệnh có trong thực phẩm và có thể được giải phóng bởi màng thực phẩm tự nhiên để thay thế các chất bảo quản tổng hợp Các hoạt tính kháng khuẩn của pectin được sử dụng làm màng bao thực phẩm trên cơ sở màng pectin ester hóa cao hoặc thấp và kết quả cho thấy,

cinnamaldehyde tạo từ pectin cung cấp đặc tính kháng khuẩn chống

Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria monocytogenes và Staphylococus aureus Sự ức chế vi khuẩn được cải thiện đáng kể khi có sự

phân phối cao hơn các hợp chất có hoạt tính và có diện tích bề mặt tăng lên [43]

Một đặc tính quan trọng có ở pectin là khả năng chống oxy hóa Chất oxy hóa là chất ức chế quá trình oxy hóa, thậm chí ở nồng độ tương đối nhỏ

và có vai trò khác nhau trong cơ thể Hoạt động chống oxy hóa của pectin là hoạt động bắt gốc tự do và giúp chuyển đổi các gốc tự do

Hoạt tính chống oxy hóa của pectin được nhiều nhà khoa học nghiên cứu và công bố Năm 2006, Kang và cộng sự đã công bố kết quả pectin oligosaccharide từ cam, quýt được xử lý bằng cách chiếu xạ thì có khả năng

ức chế sự oxy hóa và sự tăng trưởng của tế bào ung thư

Năm 2003, Khasina và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa

của pectin có ester hóa thấp từ cỏ biển Zostera marina Năm 2010, Urias-

Orona và cộng sự nghiên cứu về hoạt động bắt gốc tự do của pectin chiết từ

vỏ Cicer aretinum L cho thấy, hoạt động bắt gốc tự do của pectin phụ thuộc

vào liều lượng và được thể hiện bằng sự ức chế DPPH Việc đánh giá các hoạt động chống oxy hóa cho rằng pectin có hoạt động bắt gốc DPPH triệt để sẽ được khám phá như là một chất chống oxy hóa mới

1.2.4.2 Ứng dụng của pectin

 Trong thực phẩm [8]

Pectin được sử dụng rộng rãi như là các chất tạo gel, chất ổn định các dung dịch, chất làm đặc, chất kết dính và chất nhũ hoá trong nhiều sản phẩm thực phẩm

Khả năng tạo gel của pectin được sử dụng trong những thực phẩm cần

có sự ổn định nhiều pha Pectin được sử dụng trong các loại thạch, bánh kẹo

để cung cấp cho một cấu trúc gel tốt, sạch và để có hương vị tốt Pectin cũng

có thể được sử dụng để ổn định đồ uống protein có tính acid, chẳng hạn như sữa chua uống, để cải thiện vị giác và sự ổn định trong nước trái cây và là một