luận văn thạc sĩ khảo sát một số yếu tố liên quan đến chất lượng tế bào gốc tạo máu phân lập từ máu dây rốn tại ngân hàng tế bào gốc, bệnh viện đa khoa tâm anh

Tuy nhiên, một trong những hạn chế của nguồn tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn so với máu ngoại vi được huy động và từ tủy xương là số lượng tế bào gốc tạo máu trong một đơn vị thấp, do

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Nguyễn Thị Bích

KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT LƢỢNG

TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU PHÂN LẬP TỪ MÁU DÂY RỐN TẠI NGÂN HÀNG TẾ BÀO GỐC, BỆNH VIỆN ĐA KHOA TÂM ANH

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2021

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Nguyễn Thị Bích

KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT LƯỢNG

TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU PHÂN LẬP TỪ MÁU DÂY RỐN TẠI NGÂN HÀNG TẾ BÀO GỐC, BỆNH VIỆN ĐA KHOA TÂM ANH

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hướng dẫn 1: TS Thẩm Thị Thu Nga Hướng dẫn 2: TS Nguyễn Trung Nam

Hà Nội - 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của bản thân dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Thẩm Thị Thu Nga và TS Nguyễn Trung Nam Các số liệu và kết quả thu được trong luận văn hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kì công trình nào khác Toàn bộ trích dẫn trong luận văn đều chỉ rõ nguồn gốc

Tôi xin chịu mọi trách nhiệm liên quan đến nội dung đề tài này

Hà Nội, tháng 04 năm 2021

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Bích

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Thẩm Thị Thu Nga – giáo viên hướng dẫn của tôi Cảm ơn cô đã cho tôi cơ hội, hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành luận văn này Nhờ có sự hỗ trợ của cô tôi mới có được điều kiện tốt nhất để học tập và nghiên cứu

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Thị Thanh Mai, người đã giải đáp cho tôi rất nhiều kiến thức về chuyên môn trong quá trình làm luận văn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Trung Nam, phó viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn, hỗ trợ trong quá trình hoàn thiện luận văn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả đồng nghiệp của tôi tại Trung tâm Tế bào gốc, Bệnh viện đa khoa Tâm Anh, Hà Nội đã hỗ trợ rất nhiều trong công việc suốt 2 năm học tập và nghiên cứu

Xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện học tập và giảng dạy tốt nhất cho học viên để hoàn thành khóa học thành công và hiệu quả

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Bệnh viện đa khoa Tâm Anh

Hà Nội đã tạo điều kiện, hỗ trợ thời gian, kinh phí để tôi có thể hoàn thành nghiên cứu này

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình và bạn bè đã là chỗ dựa tinh thần cho tôi khi gặp phải khó khăn, áp lực trong thời gian 2 năm học tập và nghiên cứu vừa qua

Hà Nội, ngày 11 tháng 04 năm 2021

Nguyễn Thị Bích

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Chú giải

AABB American Association of Blood Banks (Hiệp hội

truyền máu Hoa Kỳ)

CD Cluster of Differentiation (Cụm biệt hóa)

CFU Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc)

FDA Food and Drug Administration (Cục quản lý thuốc và

dược phẩm Hoa Kỳ GVHD Graft versus host disease (Bệnh ghép chống chủ)

HLA Human leukocyte antigen (Kháng nguyên bạch cầu

người)

HPC Hematopoietic progenitor cell (Tế bào tiền thân tạo

máu) HSC Hematopoietic Stem Cell (Tế bào gốc tạo máu)

HSCT Hematopoietic Stem Cell Transplantation (Cấy ghép

tế bào gốc tạo máu)

iPSC Induced Pluripotent Stem Cells (Tế bào gốc đa năng

cảm ứng)

IT-HSC Intermediate-term Hematopoietic Stem Cell (Tế bào

gốc tạo máu trung hạn)

LT-HSC Long-term Hematopoietic Stem Cell (Tế bào gốc tạo

máu dài hạn)

MEP Megakaryocyte/erythrocyte progenitors (Tế bào tiền

thân Megakaryocyte/erythrocyte) MPP Multipotent progenitors (Tế bào tiền thân đa năng)

NK Natural Killer cell (Tế bào giết tự nhiên)

ST-HSC Short-term Hematopoietic Stem Cell (Tế bào gốc tạo

máu ngắn hạn) TNC Total Nucleated Cell (Tế bào đơn nhân)

WBMT Worldwide Network for Blood & Marrow

Transplantation (Hiệp hội ghép tủy toàn cầu)

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 TẾ BÀO GỐC 4

1.1.1 Khái niệm 4

1.1.2 Phân loại 4

1.2 TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU 5

1.2.1 Khái niệm 5

1.2.2 Sự hình thành và phát triển của tế bào gốc tạo máu 6

1.2.3 Quá trình biệt hóa tế bào gốc tạo máu 6

1.2.4 Nguồn phân lập của tế bào gốc tạo máu 10

1.3 TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU TỪ MÁU DÂY RỐN 11

1.2.1 Cấu tạo dây rốn 11

1.2.2 Đặc điểm tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn 12

1.2.3 So sánh HSC từ máu dây rốn với tủy xương và máu ngoại vi 13

1.2.4 Ưu điểm của máu dây rốn trong cấy ghép 15

1.2.5 Nhược điểm của máu dây rốn trong cấy ghép 15

1.2.6 Ứng dụng tế bào gốc máu dây rốn 15

1.2.7 Ngân hàng tế bào gốc máu dây rốn 17

1.2.8 Nghiên cứu trên thế giới về các yếu tố liên quan đến chất lượng máu dây rốn 20

1.2.9 Tình hình nghiên cứu tế bào gốc tạo máu tại Việt Nam 22

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 24

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.2.2 Hóa chất 24

2.2.3 Thiết bị 24

2.2.4 Vật tư tiêu hao 25

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 27

2.3.2 Nội dung nghiên cứu 28

2.3.3 Kỹ thuật thu thập máu dây rốn 29

2.3.4 Kỹ thuật xử lý máu dây rốn 31

2.3.5 Kỹ thuật đánh giá chất lượng máu dây rốn sau xử lý 33

2.3.6 Phân tích thống kê 37

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39

3.1.1 Kết quả thu thập mẫu 39

3.1.2 Đặc điểm thống kê các đơn vị máu dây rốn đạt tiêu chuẩn 40

a) Đặc điểm sản phụ 40

b) Đặc điểm trẻ sơ sinh 42

c) Đặc điểm chỉ số chất lượng máu dây rốn 44

3.1.3 Các yếu tố liên quan đến chỉ số chất lượng tế bào gốc tạo máu 48

a) Các yếu tố sản phụ và trẻ sơ sinh với thể tích máu dây rốn 48

b) Các yếu tố sản phụ và trẻ sơ sinh với số lượng TNC 50

c) Các yếu tố sản phụ và trẻ sơ sinh với số lượng tế bào CD34 + 52

d) Các yếu tố sản phụ và trẻ sơ sinh với tỷ lệ tế bào CD34 + 53

3.1.4 Tương quan giữa các yếu tố sản phụ và chỉ số đánh giá chất lượng của đơn vị máu dây rốn 54

3.1.5 Tương quan giữa yếu tố trẻ sơ sinh và các chỉ số đánh giá chất

lượng đơn vị máu dây rốn 55

3.1.6 Tương quan của một số yếu tố khác 56

3.1.7 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến chất lượng của đơn vị máu dây rốn 57 a) Ảnh hưởng của thể tích máu dây rốn đến số lượng TNC 57

b) Ảnh hưởng của thể tích máu đến số lượng tế bào CD34 + 59

c) Ảnh hưởng của thời gian bảo quản mẫu đến tỷ lệ tế bào sống 60

3.1.8 Mô hình ước lượng số lượng TNC 61

3.2 THẢO LUẬN 64

3.2.1 Các yếu tố sản phụ 64

3.2.2 Các yếu tố trẻ sơ sinh 67

3.2.3 Thời gian bảo quản mẫu trước xử lý 70

3.2.4 Các chỉ số chất lượng tế bào gốc máu dây rốn 71

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75

4.1 KẾT LUẬN 75

4.2 KIẾN NGHỊ 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO 77

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Sự khác biệt giữa tế bào gốc tạo máu có nguồn gốc khác nhau 14

Bảng 1.2 Tổng hợp các yếu tố có thể ảnh hưởng đến chất lượng máu dây rốn 20

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất 24

Bảng 2.2 Danh mục thiết bị 24

Bảng 2.3 Danh mục dụng cụ, vật tư tiêu hao 25

Bảng 2.4 Tóm tắt thông tin nhuộm mẫu với kháng thể 36

Bảng 3.1 Thống kê các đơn vị máu dây rốn được tiến hành thu thập 39

Bảng 3.2 Đặc điểm về độ tuổi của sản phụ 40

Bảng 3.3 Đặc điểm sản khoa 41

Bảng 3.4 Đặc điểm thống kê tuổi thai và cân nặng trẻ sơ sinh 42

Bảng 3.5 Đặc điểm thống kê của các chỉ số chất lượng máu dây rốn đạt tiêu chuẩn sau khi xử lý 44

Bảng 3.6 Một số yếu tố liên quan với thể tích máu thu thập 48

Bảng 3.7 Một số yếu tố liên quan đến số lượng TNC 50

Bảng 3.8 Một số yếu tố liên quan với số lượng tế bào CD34+ 52

Bảng 3.9 Một số yếu tố liên quan với tỷ lệ tế bào CD34+ 53

Bảng 3.10 Tương quan giữa một số yếu tố sản phụ và các chỉ số đánh giá chất lượng đơn vị máu dây rốn 54

Bảng 3.11 Tương quan giữa một số yếu tố sơ sinh và các chỉ số đánh giá chất lượng đơn vị máu dây rốn 55

Bảng 3.12 Tương quan giữa một số yếu tố khác và các chỉ số đánh giá chất lượng đơn vị máu dây rốn 56

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của thể tích máu dây rốn lên số lượng TNC 57

Bảng 3 14 So sánh chỉ số TNC với ngưỡng thể tích 80mL 58

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của thể tích máu đến số lượng CD34+

59Bảng 3.16 Kết quả phân tích hồi quy tuyến tính giữa thể tích máu và số lượng

tế bào CD34+

60Bảng 3.17 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến tỷ lệ tế bào sống 60Bảng 3.18 Kết quả phân tích hồi quy tuyến tính đa biến cho số lượng TNC 62

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Sơ đồ quá trình biệt hóa HSC cổ điển (A) và sửa đổi (B) 9

Hình 1.2 Quá trình biệt hóa HSC (A) mô hình biệt hóa rời rạc, (B) mô hình biệt hóa liên tục 9

Hình 1.3 Cấu tạo dây rốn ở người 11

Hình 1.4 Quy trình từ khi thu thập máu cho đến khi cấy ghép 17

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 27

Hình 2.2 Túi máu dây rốn sau khi thu thập 31

Hình 2.3 Phân lớp các thành phần máu dây rốn trên một gradient Ficoll-Hypaque 32

Hình 3.1 Phân bố độ tuổi của sản phụ 40

Hình 3.2 Phân bố giới tính trẻ sơ sinh 42

Hình 3.3 Phân bố tuổi thai 43

Hình 3.4 Phân bố cân nặng trẻ sơ sinh 43

Hình 3.5 Phân bố thể tích máu dây rốn của các đơn vị được thu thập 45

Hình 3.6 Phân bố số lượng TNC 45

Hình 3.7 Phân bố số lượng tế bào CD34+ 46

Hình 3.8 Phân bố tỷ lệ tế bào sống 47

Hình 3.9 Liên hệ tuyến tính giữa thể tích máu dây rốn và TNC 58

Hình 3.10 Liên hệ tuyến tính giữa thời gian bảo quản mẫu và tỷ lệ tế bào sống 61

MỞ ĐẦU

Tế bào gốc tạo máu là tế bào gốc đa năng có chức năng quan trọng trong việc sản xuất và duy trì tất cả các dòng tế bào máu trưởng thành trong suốt cuộc đời con người [1]

Tế bào gốc tạo máu được sử dụng trong điều trị lâm sàng có hiệu quả được lấy từ ba nguồn khác nhau: tủy xương, máu ngoại vi và máu dây rốn Ghép tế bào gốc tạo máu đòi hỏi sự phù hợp HLA rất chặt chẽ nên việc tìm được người phù hợp hoàn toàn về HLA là một khó khăn lớn Khó khăn này tăng thêm ở các quốc gia đa chủng tộc vì hệ HLA có những đặc trưng riêng theo từng chủng tộc Theo báo cáo thường niên năm 2019 về ghép tế bào gốc tại châu Âu, năm 2018 trong số gần 18000 bệnh nhân tìm người cho không cùng huyết thống chỉ có khoảng hơn 9000 người được ghép mặc dù có khoảng 1.4 triệu người đăng ký hiến tế bào gốc tạo máu ở Châu Âu trong năm

2018, nâng tổng số người hiến lên hơn 14 triệu tại các nước thành viên EU và gần 37 triệu trên toàn thế giới [2, 3]

Ghép tế bào gốc tạo máu bao gồm ghép tự thân và ghép đồng loài Trong trường hợp ghép đồng loài, người hiến tủy xương hoặc tế bào gốc tạo máu ngoại vi sẽ được huy động vào thời điểm bệnh nhân đã được điều trị hóa chất đủ điều kiện ghép Vì vậy, hiện nay nhiều quốc gia trên thế giới đã có chương trình đăng ký hiến tủy và hiến tế bào gốc tạo máu từ máu ngoại vi, tế bào gốc sử dụng trong các trường hợp này hoàn toàn không cần phải lưu trữ

Tế bào gốc tạo máu sử dụng trong trường hợp ghép tự thân được lưu trữ đông lạnh nhưng chỉ trong một thời gian ngắn phải sử dụng ngay sau khi bệnh nhân được điều trị hóa chất và đủ điều kiện ghép

Từ khi được phát hiện vào năm 1980, tế bào gốc tạo máu phân lập từ máu dây rốn được coi là nguồn tiềm năng cho ghép tế bào gốc tạo máu trong điều trị Máu dây rốn được thu thập ngay sau khi sản phụ sinh con, sau đó trải qua quá trình xử lý, lưu trữ đông lạnh để kéo dài đời sống Chứng minh thành công rằng máu dây rốn có khả năng phục hồi hệ thống tạo máu và miễn dịch của bệnh nhân cùng với việc xác nhận rằng máu dây rốn có thể bảo quản lạnh

để sử dụng sau này dẫn đến việc thành lập các ngân hàng máu dây rốn trên

khắp thế giới đáp ứng nhu cầu ghép tế bào gốc tạo máu đang ngày càng gia tăng Những bệnh nhân có chỉ định ghép tế bào gốc máu có thể tìm những đơn vị máu dây rốn phù hợp thông qua những dữ liệu lưu trữ trong ngân hàng máu dây rốn

Tuy nhiên, một trong những hạn chế của nguồn tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn so với máu ngoại vi được huy động và từ tủy xương là số lượng

tế bào gốc tạo máu trong một đơn vị thấp, do vậy máu dây rốn phù hợp để ghép cho trẻ em hơn là người lớn Xử lý và bảo quản tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn đòi hỏi thời gian và chi phí tốn kém, do đó người ta thường cố gắng chỉ xử lý những đơn vị máu dây rốn cho số lượng tế bào có nhân và tế bào CD34+

tối ưu – hai chỉ số được coi là quyết định thành công của các ca ghép tế bào gốc tạo máu Do vậy, việc xác định chiến lược hợp lý từ khâu sàng lọc, thu thập mẫu cho đến xử lý mẫu và cuối cùng là ghép không chỉ tránh lãng phí chi phí, tiết kiệm không gian lưu trữ có giá trị cho các đơn vị chất lượng tốt mà còn tạo ra hiệu quả điều trị tốt hơn người bệnh Trong đó bước đầu khảo sát các yếu tố có khả năng ảnh hưởng đến chất lượng tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn có vai trò quan trọng chiến lược cải thiện chất lượng ngân hàng máu dây rốn Đồng thời từ kết quả phân tích các yếu tố, đưa

ra những khuyến cáo, tư vấn cho bệnh nhân cũng như giúp tìm ra những nguyên nhân sai sót, cải thiện quy trình kỹ thuật, nâng cao hiệu quả

Có nhiều yếu tố khác nhau ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn bao gồm: các yếu tố sản khoa, yếu tố thuộc

về sản phụ, các yếu tố trẻ sơ sinh, các yếu tố trong thu thập và xử lý mẫu Trong rất nhiều yếu tố có khả năng ảnh hưởng, các yếu tố sản phụ bao gồm: tuổi người mẹ, nhóm máu, phương pháp sinh, số lần mang thai, số lượng thai; các yếu tố trẻ sơ sinh bao gồm: tuổi thai, cân nặng, giới tính; yếu tố trong xử

lý mẫu gồm: thời gian bảo quản mẫu, thể tích máu là những yếu tố được quan tâm nhiều nhất vì đặc điểm dễ tiếp cận, dễ thu thập thông tin và có nhiều nghiên cứu cho kết quả không thống nhất Do đó, trong phạm vi của nghiên cứu này, chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng đến các chỉ số chất lượng tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn của một số yếu tố kể trên

Trên thế giới, có nhiều chương trình tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng máu dây rốn, tuy nhiên các yếu tố này có thể thay đổi ở các quốc gia và chủng tộc khác nhau khiến cho các tiêu chuẩn mà thế giới đưa

ra có thể không phù hợp với Việt Nam Ngân hàng tế bào gốc thuộc Bệnh viện đa khoa Tâm Anh được xây dựng theo mô hình ngân hàng máu dây rốn

tư nhân, được thành lập vào năm 2019 Với mục đích lưu trữ nguồn tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn chất lượng dùng trong điều trị chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu này với các mục tiêu sau :

1- Đánh giá chất lượng các đơn vị máu dây rốn thu thập tại Bệnh viện đa khoa Tâm Anh từ 2019-2021

2- Khảo sát sự ảnh hưởng của một số yếu tố liên quan đến chất lượng tế bào gốc tạo máu phân lập từ máu dây rốn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TẾ BÀO GỐC

1.1.1 Khái niệm

Tế bào gốc là những tế bào có khả năng biệt hóa thành các dòng tế bào chuyên biệt trong cơ thể Hai đặc điểm xác định một tế bào gốc là khả năng tự làm mới (Self-renewal) và khả năng biệt hóa (Differentiation) thành tế bào trưởng thành chuyên biệt về chức năng Khả năng tự làm mới là khả năng tế bào gốc có thể phân chia không giới hạn để tạo thành tế bào con giống hệt tế bào mẹ mang tính gốc Đặc điểm này giống với tế bào ung thư, tuy nhiên khác với tế bào ung thư phân chia không kiểm soát, tế bào gốc được cơ thể điều khiển một cách chính xác và chặt chẽ [4]

1.1.2 Phân loại

 Phân loại theo giai đoạn phát triển

Theo giai đoạn phát triển của cơ thể, tế bào gốc chia thành: tế bào gốc phôi, tế bào gốc trưởng thành Tuy nhiên các thuật ngữ này hiện nay trở nên không đầy đủ để mô tả các loại tế bào gốc Năm 2006, nghiên cứu của giáo sư Takahashi cho biết có thể tái lập trình tế bào trưởng thành về trạng thái giống

tế bào gốc phôi, gọi là tế bào gốc đa năng cảm ứng (Induced Pluripotent Stem Cell - iPSC) [5] Ngược lại, tế bào gốc trưởng thành cũng đã được tìm thấy trong thai nhi, nhau thai, máu dây rốn và trẻ sơ sinh [6, 7]

 Phân loại theo tiềm năng biệt hóa

Dựa theo khả năng biệt hóa thành các dòng tế bào chuyên biệt trong cơ thể, tế bào gốc được chia thành:

- Tế bào gốc toàn năng (Totipotent stem cells): là tế bào gốc có khả năng phân chia và biệt hóa thành toàn bộ các dòng tế bào trong cơ thể, có thể hình thành nên cấu trúc phôi và ngoài phôi Ví dụ như hợp tử - tế bào hình thành sau khi trứng được thụ tinh Hợp tử sau

đó có thể phát triển thành thành tất cả các tế bào thuộc ba lớp mầm

và nhau thai

- Tế bào gốc vạn năng (Pluripotent stem cells): là tế bào gốc có thể biệt hóa thành tất cả các tế bào thuộc ba lớp mầm ngoại trừ cấu trúc ngoài phôi như nhau thai Ví dụ như tế bào gốc phôi, iPSC

- Tế bào gốc đa năng (Multipotent stem cells): là tế bào gốc có khả năng biệt hóa thành các loại tế bào chuyên biệt trong một dòng tế bào cụ thể Ví dụ như tế bào gốc tạo máu có khả năng biệt hóa ra các tế bào thuộc dòng máu; tế bào gốc thần kinh; tế bào gốc trung

1.2 TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU

1.2.1 Khái niệm

Tế bào gốc tạo máu (Haematopoietic Stem Cells – HSCs) là tế bào gốc

đa năng đặc biệt có khả năng tự đổi mới và biệt hóa tạo thành toàn bộ hệ thống tạo máu trong cơ thể Tế bào gốc tạo máu có thể bổ sung thay thế tất cả các loại tế bào máu Mỗi tế bào gốc tạo máu được lập trình để sản xuất các thành phần của máu với các chức năng khác nhau từ hồng cầu vận chuyển oxy, tiểu cầu liên quan đến các yếu tố đông máu, đến các tế bào của hệ thống miễn dịch bẩm sinh hoạt động chống lại sự tấn công của vi khuẩn [10] Đồng thời, một số lượng nhỏ tế bào gốc tạo máu có vai trò tự tăng sinh vẫn giữ tính gốc nhằm duy trì số lượng tế bào gốc trong cơ thể, luôn sẵn sàng khi cơ thể có nhu cầu

Giống như các tế bào gốc trưởng thành trong cơ thể, hầu hết tế bào gốc tạo máu đều tồn tại ở trạng thái không hoạt động Khi cơ thể xảy ra tổn thương, các tế bào gốc tạo máu sẽ thoát khỏi sự im lặng và bắt đầu đi vào chu

kỳ tế bào, phân chia, biệt hóa thành các tế bào chuyên hóa chức năng Chúng cũng có thể di chuyển từ tủy xương ra máu ngoại vi, từ tủy xương này sang

tủy xương khác,…Điều này cho phép các tế bào gốc tạo máu có thể được thu hoạch trực tiếp từ máu ngoại vi Bất kỳ rối loạn nào xảy ra trong quá trình chuyển đổi này có thể dẫn đến cạn kiệt tế bào gốc máu, gây thiếu máu và các bệnh lý về máu, miễn dịch khác

1.2.2 Sự hình thành và phát triển của tế bào gốc tạo máu

HSC bắt đầu được xác định trong phôi bằng sự xuất hiện đầu tiên được nhận thấy ở vùng AGM (Aorto-Gonado-Mesonephros) [11], là vùng thuộc trung bì phôi phát triển trong suốt quá trình phát triển phôi, gần với hệ thống niệu sinh dục, tạo ra tuyến sinh dục, võ não của tuyến thượng thận và hậu thận [12] Sau đó, HSC chuyển sang gan của thai nhi, tại đây, HSC được nhân lên rồi di chuyển đến lá lách và sau đó đến tủy xương, nơi tế bào gốc tạo máu sẽ cư trú trong suốt đời sống sau này [13, 14]

Bên cạnh đó, năm 2005, hai nhóm nghiên cứu độc lập đã xác định nhau thai là một vị trí ngoại phôi có sự phát triển và nhân lên của tế bào gốc tạo máu [15, 16] Các nghiên cứu này cho thấy sự xuất hiện của các tế bào gốc tạo máu với hoạt động tái tạo trong nhau thai xảy ra song song với quá trình ở

vùng AGM Nhưng liệu nhau thai có khả năng tạo ra HSC de novo hay chỉ hỗ

trợ nhân lên vẫn còn tranh cãi và cần nghiên cứu thêm [17]

1.2.3 Quá trình biệt hóa tế bào gốc tạo máu

Để xác định mối quan hệ giữa HSC và các thế hệ con cháu của chúng,

hệ thống phân cấp tạo máu được xây dựng để mô tả quá trình biệt hóa từ HSC sang các loại tế bào máu khác nhau Sự biệt hóa của HSC xảy ra thông qua một quá trình nhiều bước từ đa dòng (multilineage), đến các tế bào chỉ có khả năng biệt hóa hạn chế cho một số dòng (oligo-lineage), rồi đến các tế bào đơn dòng (single lineage) và cuối cùng là tế bào máu trưởng thành [18]

Trước đây, HSC tinh sạch được coi là quần thể tế bào đồng nhất vì các

tế bào này chia sẻ các dấu hiệu bề mặt tế bào giống nhau Về mặt chức năng, mỗi tế bào trong quần thể đồng nhất này cũng được coi là có khả năng biệt hóa giống hệt nhau [19] Tuy nhiên hiện nay, nhiều công cụ phân tích –omics

ở độ phân giải đơn bào đã cho thấy những hiểu biết mới về tế bào gốc tạo

máu, từ đó tiết lộ về sự không đồng nhất trong quần thể HSC [20, 21] Tính không đồng nhất của HSC được phản ánh trong thực tế rằng mỗi HSC riêng biệt khác nhau về đặc điểm phân tử, số phận tế bào và kết quả chức năng Việc phát hiện ra tính không đồng nhất của HSC đã định hình lại sự hiểu biết của các nhà khoa học về quá trình biệt hóa phức tạp của loại tế bào gốc đặc biệt này

Các nghiên cứu trước đây về quá trình biệt hóa của HSC (Hình 1.1A)

đã phát hiện ra rằng HSC có thể được phân loại thành 2 dưới quần thể: HSC dài hạn (Long-term HSC – LT-HSC) và HSC ngắn hạn (Short-term HSC – ST-HSC) LT-HSC là quần thể tế bào hiếm của tủy xương, sở hữu khả năng phục hồi vĩnh viễn ở những người nhận bị chiếu xạ Ở trạng thái ổn định, LT-HSC không hoạt động Tuy nhiên, một khi tiếp xúc với kích thích, các tế bào này sẽ kích hoạt trở lại và đi vào chu kỳ tế bào ST-HSC thì có khả năng phục hồi ngắn hạn, khoảng 8-12 tuần sau ghép ST-HSC biệt hóa thành tế bào tiền thân đa năng (Multipotent progenitors – MPP), so với HSC, ST-HSC có tần suất tiến triển chu kỳ tế bào cao hơn, hoạt động biệt hóa mạnh mẽ hơn, nhưng không có khả năng tự đổi mới [22] Tiếp sau MPP là các tế bào tiền thân lympho phổ biến (Common lymphoid progenitors – CLP) có khả năng biệt hóa thành các tế bào bao gồm: tế bào giết tự nhiên (Natural killer – NK) là những tế bào gây độc tế bào cần thiết cho hệ miễn dịch bẩm sinh; tế bào B trưởng thành trong tủy xương kích hoạt hình thành tế bào plasma tiết ra kháng thể; và tế bào T trưởng thành trong tuyến ức thành tế bào T gây độc tế bào CD8+ hoặc tế bào T trợ giúp CD4+ với khả năng biệt hóa sâu hơn khi kích hoạt Cùng với tế bào tiền thân lympho phổ biến còn có tế bào tiền thân dòng tủy phổ biến (Common myeloid progenitors – CMP) có thể biệt hóa thành các

tế bào tiền thân megakaryocyte/hồng cầu (Megakaryocyte/erythrocyte progenitors – MEP) – biệt hóa sản xuất tiểu cầu, hồng cầu; và tế bào tiền thân bạch cầu hạt/đại thực bào (Granulocyte/macrophage progenitors – GMP) – biệt hóa cho bạch cầu hạt và đại thực bào Bạch cầu hạt bao gồm: bạch cầu trung tính (neutrophil) là loại bạch cầu chiếm tỷ lệ lớn nhất (50-60%); bạch cầu ái toan (eosinophil)) có đặc tính gây độc tế bào đặc biệt chống lại ký sinh

trùng (1-3% bạch cầu); bạch cầu ái kiềm (basophil) có vai trò trong phản ứng viêm và là loại bạch cầu ít phổ biến nhất (<2%); và các tế bào mast hoạt động theo cách tương tự như bạch cầu ái kiềm đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của dị ứng

Mặc dù sơ đồ phân cấp HSC cổ điển có thể mô tả được phần lớn quá trình biệt hóa từng bước của HSC, nhưng sự phức tạp trong biệt hóa các dòng

tế bào cùng với việc xác định các loại quần thể tế bào tạo máu mới vẫn chưa được làm rõ Vì vậy, sơ đồ biệt hóa HSC được sửa đổi một số điểm nhằm cung cấp đầy đủ và chính xác thông tin hơn (Hình 1.1B) Theo đó, ngoài LT-HSC và ST-HSC, còn có HSC trung hạn (Intermediate-term HSCs – IT-HSC) được xác định bởi khả năng tự đổi mới nằm giới hạn giữa ST-HSC và LT-HSC Trong sơ đồ mới, IT-HSC nằm giữa LT-HSC và ST-HSC, hoạt động như một quần thể tế bào tạm thời Ngoài ra, quần thể MPP được chia thành 4 nhóm MPP1, MPP2, MPP3 và MPP4 Trong số các quần thể con này, kiểu hình miễn dịch, trạng thái chu kỳ tế bào và khả năng biệt hóa của chúng đều khác nhau Trong hệ thống biệt hóa HSC đã sửa đổi, MPP1 giống với ST-HSC, trong khi MPP2-4 là các quần thể phụ tương đương, hoạt động cùng nhau để duy trì việc sản xuất máu ở trạng thái ổn định [23] Ngoài ra, một dưới quần thể của HSC có biểu hiện gene tạo máu cao được định nghĩa là tế bào tiền thân lymphoid-primed đa năng (Lymphoid-primed multipotent progenitors – LMPP) Về mặt chức năng, quần thể này ưu tiên tạo ra các dòng bạch huyết Về mặt kiểu hình miễn dịch, LMPP có các dấu hiệu bề mặt tương

tự với MPP4

Hình 1.1 Sơ đồ quá trình biệt hóa HSC cổ điển (A) và sửa đổi (B) [19] Như vậy, từ việc cho rằng sự biệt hóa HSC trải qua một số bước trung gian rời rạc để tạo ra các tế bào máu trưởng thành, các quần thể tế bào trung gian được xác định bằng các dấu hiệu bề mặt được phân biệt bằng các ranh giới thứ bậc rõ ràng, giờ đây, các nghiên cứu mở rộng sử dụng các xét nghiệm chức năng và phân tích omics đã cho thấy quá trình biệt hóa từ một HSC đến các tế bào máu trưởng thành chuyên hóa chức năng là một quá trình liên tục, không có ranh giới rõ ràng giữa các quần thể tế bào nằm ở các cấp độ khác nhau [24] (Hình 1.2)

Hình 1.2 Quá trình biệt hóa HSC (A) mô hình biệt hóa rời rạc, (B) mô hình

biệt hóa liên tục [19]

1.2.4 Nguồn phân lập của tế bào gốc tạo máu

Tế bào gốc tạo máu hiện nay có thể được phân lập từ các nguồn sau:

 Tủy xương

Ở người trưởng thành, quá trình tạo máu xảy ra trong tủy xương, đây là một mô mềm xốp, nhiều mạch máu nằm bên trong xương Có hai loại tủy xương: tủy đỏ (Medulla ossium rubra) – nơi các tế bào tạo máu cư trú, và tủy vàng (Medulla ossium flava) – bao gồm chủ yếu là các tế bào mỡ Lúc mới sinh, tất cả tủy xương đều có tủy đỏ, tỷ lệ tủy vàng tăng dần theo tuổi tác và tỷ

lệ giữa hai loại này khoảng 50:50 ở người trưởng thành Tuy nhiên, ở những thời điểm mất máu nặng, tủy vàng có thể chuyển ngược trở lại tủy đỏ nhằm tăng sản xuất tế bào máu thông qua quá trình tạo máu Nguồn phân lập cổ điển cho tế bào gốc tạo máu là tủy xương Trong hơn 40 năm, các bác sĩ thực hiện ghép tế bào gốc tạo máu cho bệnh nhân bằng cách chọc hút tủy xương trong mào chậu của khung chậu bằng syringe chuyên dụng Tế bào trong tủy xương gồm tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc mô đệm, tế bào tiền thân tạo máu, bạch cầu và hồng cầu trưởng thành [25] CD34 được biểu biện trong 1-4% các

tế bào có nhân phân lập từ nguồn này [26]

 Máu ngoại vi

Khi đáp ứng lại một số tín hiệu cụ thể, tế bào gốc tạo máu có thể di chuyển từ tủy xương ra máu ngoại vi (huy động) và trở lại tủy xương (homing) CD34 được biểu hiện trong khoảng 0.06% tế bào có nhân được tìm thấy trong máu ngoại vi [26] Huy động tế bào gốc tạo máu từ tủy xương ra máu ngoại vi được thực hiện thông qua việc sử dụng cytokine yếu tố kích thích tế bào hạt (Granulocyte colony stimulating factor – G-CSF) trong ba hoặc bốn ngày Điều này làm tăng tỷ lệ CD34+

lên > 1%, các tế bào này sau

đó có thể được thu hoạch bằng phương pháp Leukapheresis Máu ngoại vi trở thành nguồn tế bào gốc tạo máu bắt đầu từ những năm 2000 [27]

 Máu dây rốn

Thành phần tế bào trong máu dây rốn bao gồm: Tế bào gốc/tiền thân tạo máu, tế bào tiền thân nội mô, bạch cầu lympho, bạch cầu đơn nhân, tế bào

gốc/tiền thân trung mô [28] Kể từ khi ca ghép tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn đầu tiên thành công ở một bệnh nhi mắc bệnh thiếu máu Fanconi, việc thu thập và sử dụng nguồn tế bào này đã phát triển nhanh chóng [29] Máu dây rốn sẽ được thu thập ngay sau khi đứa trẻ được sinh ra, sau đó xử lý nhằm phân lập quần thể tế bào gốc tạo máu Tế bào thu được sau xử lý có thể được

sử dụng ngay cho việc ghép hoặc lưu trữ ở -196o

C trong nitơ lỏng trong nhiều năm

1.3 TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU TỪ MÁU DÂY RỐN

1.2.1 Cấu tạo dây rốn

Dây rốn nối liền giữa mẹ và thai nhi qua bánh nhau, có vai trò quan trọng trong việc nuôi dưỡng thai nhi trong suốt thai kỳ Dây rốn có cấu tạo bao gồm hai động mạch và một tĩnh mạch, được bao xung quanh bởi mô liên kết gọi là Wharton’s jelly, bao bên ngoài là màng dây rốn (Hình 1.3) Máu dây rốn phần lớn chứa trong tĩnh mạch Trong quá trình sinh nở, dây rốn được cắt rời khỏi trẻ sơ sinh, tĩnh mạch dây rốn có thể quan sát dễ dàng, do vậy việc thu thập máu dây rốn thông qua tĩnh mạch được thực hiện khá đơn giản

Hình 1.3 Cấu tạo dây rốn ở người [30]

Để đảm bảo lấy được lượng máu tốt nhất, thời điểm thu thập máu dây rốn thường là giai đoạn sau khi đẻ thai và trước khi xổ nhau (trẻ đã ra ngoài nhưng bánh nhau còn nằm trong tử cung người mẹ) Trong một số tình huống sản khoa đặc biệt không thể thu thập ở giai đoạn trên, có thể thu thập máu dây rốn sau khi xổ nhau Bánh nhau và dây rốn khi đó sẽ được xử lý ở khu vực riêng biệt để lấy được hết lượng máu còn lại trong các mạch máu Tuy nhiên, khi thu thập sau xổ nhau thì thể tích và số lượng tế bào máu thường thấp hơn thu thập trước xổ nhau Vì vậy đa số các trường hợp nên thu thập trước xổ nhau để được hiệu quả tốt nhất

1.2.2 Đặc điểm tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn

 Đặc điểm biệt hóa

Tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn có đặc điểm biệt hóa giống với tế bào tạo máu nguồn gốc từ tủy xương Một tế bào gốc tạo máu trong suốt vòng đời phân chia bất đối xứng thành hai tế bào con: một tế bào gốc tạo máu và một tế bào tiền thân tạo máu (Hematopoietic progenitor cell - HPC) HPC là

tế bào tiền thân sớm nhất, không giống HSC, chúng không có khả năng tự làm mới, khả năng biệt hóa bị giới hạn ở một hoặc một vài dòng Từ HPC sẽ biệt hóa tạo thành tế bào tiền thân dòng tủy, rồi hình thành bạch cầu hạt, hồng cầu, đại thực bào và megakaryocytes; hoặc tế bào tiền thân dòng lympho rồi hình thành tế bào B, tế bào T, tế bào NK

 Đặc điểm miễn dịch

Cụm biệt hóa (Cluster of differentiation – CD) là một loạt các phân tử protein được sử dụng làm dấu hiệu (marker) xác định các quần thể tế bào cụ thể Các phân tử CD thường có chức năng và có thể là thụ thể hoặc phối tử hoặc tham gia vào quá trình kết dính và di chuyển tế bào [26] Không có phân

tử chỉ thị duy nhất để xác định tất cả các HSC Điều này rất khó khăn vì các phân tử chỉ thị có thể được tăng cường biểu hiện hoặc mất đi khi tế bào biệt hóa Phân tử CD34 là marker đầu tiên được xác định trên HSC và hiện là marker được sử dụng phổ biến nhất CD34 được cho là đóng vai trò như một phân tử kết dính thông qua việc gắn các HSC và chất nền ngoại bào tủy

xương hoặc với các tế bào mô đệm Quần thể CD34+

bao gồm phần lớn các tế bào có khả năng tái tạo hệ thống tạo máu, tất cả các tế bào tạo máu dài hạn và nhiều đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony Forming Unit - CFU) Quần thể CD34+ này chứa hỗn hợp HSC và HPC có thể phân biệt bằng các mức độ biểu hiện khác nhau của các marker khác Kiểu hình miễn dịch của tế bào gốc/tiền thân tạo máu có thể được xác định bằng cách sử dụng:

- Phân tích tế bào học về sự hiện diện của proteoglycan CD34/CD38

- Phân tích chỉ thị của dòng trưởng thành (HLA-DR)

- Phân tích thụ thể tyrosine kinase c-kit

Tuy nhiên, có bằng chứng về các tế bào CD34

(không biểu hiện CD34) nguyên thủy nhưng có đặc tính HSC có thể tạo ra tế bào CD34+

in vitro và in

vivo [31, 32] Các tế bào CD34- này có thể được đặc trưng thông qua sự biểu hiện của CD133 và không biểu hiện CD38 và các marker đặc trưng cho dòng Biểu hiện của CD133 trên HSC chồng lên sự biểu hiện của CD34 CD133 biểu hiện trên phần lớn các tế bào CD34+

bao gồm các các tế bào HSC CD34- HSC và HPC không biểu hiện các marker liên quan đến các tế bào máu đã biệt hóa Những marker này có thể bao gồm: CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD10, CD11b, CD14, CD19, CD20, CD56, CD235a

1.2.3 So sánh HSC từ máu dây rốn với tủy xương và máu ngoại vi

Các tế bào gốc máu dây rốn khác với tế bào gốc máu từ máu ngoại vi

và tủy xương về cả thành phần, số lượng và đặc tính [33-35] Các tế bào trong máu dây rốn (có kiểu hình CD34+

/CD38-) được phát hiện ở pha G0 tăng sinh tốt hơn khi đáp ứng với cytokine và ít phụ thuộc vào các tế bào đệm hơn so với các tế bào tương ứng trong máu ngoại vi và tủy xương [36, 37]

Tỷ lệ tế bào biểu hiện CD34+

trong tổng số tế bào có nhân ở máu dây rốn khoảng 0.02-1.43% thấp hơn tủy xương (0.5-5%) và cao hơn so với máu ngoại vi (<0.01%) (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Sự khác biệt giữa tế bào gốc tạo máu có nguồn gốc khác nhau [38]

CFU-GM (cụm/mL) 13000 -24000 870 - 1600

Tỷ lệ CD34+ (%) 0.02 - 1.43 0.5 – 5 (Tủy xương)

< 0.01 (Máu ngoại vi)

Tế bào T (Th và Tc) Thấp hơn Cao hơn

Trong máu dây rốn, số lượng tế bào Lympho T (Th, Tc) và NK thấp, phần lớn tế bào trong trạng thái nguyên thủy, chưa trưởng thành về mặt chức năng, thể hiện ở việc đáp ứng tối thiểu với kích thích của interleukin 2, phytohemagglutinin hoặc alloantigens [39] Do đó, tế bào gốc tạo máu trong máu dây rốn có khả năng dung nạp miễn dịch cao hơn so với tế bào gốc máu trong máu ngoại vi và tủy xương Vì khả năng dung nạp miễn dịch tốt nên việc ghép tế bào gốc máu dây rốn có thể được thực hiện mà không cần phù hợp hoàn toàn HLA, ít nguy cơ gây ghép chống chủ (GVHD) - vốn là một trở ngại lớn trong ghép đồng loài với tủy xương và máu ngoại vi

Việc ghép tế bào gốc tạo máu không chỉ phụ thuộc vào số lượng mà còn phụ thuộc vào chất lượng của các tế bào này, liên quan đến khả năng tăng sinh chúng Để đánh giá khả năng tăng sinh của các tế bào gốc tạo máu đã xác định được kiểu hình, người ta sử dụng các xét nghiệm tạo khuẩn lạc (bao gồm CFU-GM (Colony Forming Unit-Granulocyte/Macrophage), CFU-M (Colony Forming Unit-Megakaryote, CFU-E (Colony Forming Unit-Erythroid) và các thí nghiệm nuôi cấy dài hạn Trong máu dây rốn, các tế bào tạo khuẩn lạc có tiềm năng tăng sinh cao (HPP) và tế bào tiềm năng tăng sinh cao có khả năng hình thành khuẩn lạc (CFC) cũng có mặt với số lượng gấp khoảng 8 lần so với trong tủy xương [40] Phân tích CFC trong máu dây rốn người cho thấy trong 1mL máu dây rốn có khoảng 8000 BFU-E (gấp 3 lần so với tủy xương

và máu ngoại vi) và khoảng 13000-24000 CFU-GM (gấp 15 lần so với tủy xương và máu ngoại vi) [41]

Các tế bào gốc máu dây rốn cũng được nghiên cứu cho thấy có DNA telomere dài hơn so với tế bào gốc máu trong tủy xương và máu ngoại vi [37,

42, 43] Do đó các tế bào gốc máu dây rốn có thời gian tạo máu dài hơn, phân chia nhiều lần hơn và tạo ra số lượng tế bào con lớn hơn, dẫn đến hiệu quả điều trị được nâng cao

1.2.4 Ưu điểm của máu dây rốn trong cấy ghép

Nhìn chung, tế bào gốc tạo máu có nguồn gốc từ máu dây rốn có một

số ưu điểm so với máu ngoại vi và tủy xương như sau:

 Nguồn cung cấp tế bào gốc sẵn có, dễ dàng thu thập, không ảnh hưởng đến người hiến

 Khả năng tăng sinh cao

 Khả năng dung nạp miễn dịch tốt dẫn đến cơ hội lựa chọn mẫu ghép cao hơn, nguy cơ mắc GVHD khi ghép không phù hợp hoàn toàn HLA giảm xuống

 Dễ dàng bảo quản lạnh và lưu trữ trong nhiều năm

1.2.5 Nhược điểm của máu dây rốn trong cấy ghép

Bên cạnh những ưu điểm, tế bào gốc tạo máu phân lập từ máu dây rốn cũng tồn tại một số hạn chế như sau:

 Số lượng tế bào gốc tạo máu thu được hạn chế, phù hợp ghép cho trẻ

em hơn là người lớn

 Số lượng tế bào thấp cũng dẫn đến thời gian mọc mảnh ghép chậm

 Chi phí xử lý và lưu trữ cao

1.2.6 Ứng dụng tế bào gốc máu dây rốn

Ghép tế bào gốc tạo máu (Hematopoiectic Stem Cell Transplantation - HSCT) là một trong những chiến lược để điều trị nhiều bệnh lý huyết học, các

rối loạn suy giảm miễn dịch khi các liệu pháp khác điều trị không hiệu quả [44] Tủy xương và máu ngoại vi từ lâu đã là hai nguồn tế bào gốc tạo máu hiệu quả trong ghép điều trị Tuy nhiên, ghép tế bào gốc tạo máu đòi hỏi sự phù hợp HLA rất chặt chẽ nên việc tìm được người cho phù hợp hoàn toàn về HLA là một khó khăn lớn Do vậy, chỉ có một số lượng nhỏ bệnh nhân có thể được điều trị nhờ ghép tế bào gốc tạo máu từ những nguồn này

Ngay từ khi được phát hiện từ năm 1980, tế bào gốc máu dây rốn ngày càng nhận được nhiều sự đồng thuận trong việc sử dụng cho việc cấy ghép tế bào gốc tạo máu [45] Năm 1988, Broxmeyer và cộng sự là những người đầu tiên chứng minh máu dây rốn là một nguồn tế bào gốc/tiền thân tạo máu có thể dùng trong ghép điều trị hiệu quả [46] Trong cùng năm đó, Gluckman và cộng sự đã thực hiện ca ghép tế bào tạo máu đầu tiên sử dụng máu dây rốn thay vì tủy xương [47], khôi phục hệ thống tạo máu của một bệnh nhi bị thiếu máu Fanconi bằng cách sử dụng máu dây rốn từ anh chị em phù hợp HLA Một số lợi thế của tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn bao gồm có khả năng dung hợp mảnh ghép không phù hợp một hai locus HLA[48], nguy cơ mắc GVHD cấp và mạn tính thấp [49]

Ghép tế bào gốc tạo máu đã đang và sẽ đem lại nhiều hy vọng cho những bệnh nhân mắc các rối loạn về máu, ung thư bao gồm các khối u ác tính về huyết học, các rối loạn chuyển hóa và miễn dịch Hiện có khoảng 95 bệnh lý được điều trị bằng cách ghép tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn cho

cả trẻ em và người lớn [50, 51] Nhiều sản phẩm tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn cũng được FDA phê duyệt cấp bằng để điều trị như Allocord, Clevecord, Ducord, [52] Các sản phẩm này bao gồm các tế bào tiền thân tạo máu, bạch cầu đơn nhân, tế bào lympho và bạch cầu hạt từ máu dây rốn người, sử dụng trong ghép tế bào tiền thân tạo máu của người hiến không có quan hệ huyết thống với người nhận, kết hợp với một phác đồ chuẩn bị thích hợp để phục hồi hệ thống tạo máu và miễn dịch ở những bệnh nhân bị rối loạn

hệ thống tạo máu do di truyền, mắc phải hoặc kết quả của điều trị myeloablative (hóa trị liệu liều cao giết chết các tế bào trong tủy xương, bao gồm các tế bào ung thư)

Mặc dù tiềm năng ứng dụng rất lớn, nhưng lượng tế bào gốc tạo máu trong một đơn vị máu dây rốn thấp, trong khi việc cấy ghép thành công có tương quan chặt chẽ với số lượng tế bào được truyền vào Ngoài ra, việc xử lý

và bảo quản tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn là một công việc tốn thời gian

và tốn kém do đó người ta thường cố gắng chỉ xử lý những đơn vị máu dây rốn cho tổng số tế bào có nhân và CD34+

tối ưu Quy trình chiến lược cho việc từ thu thập mẫu, xử lý cho đến khi cấy ghép không chỉ tránh lãng phí chi phí, tiết kiệm không gian lưu trữ có giá trị cho các đơn vị chất lượng tốt mà còn tạo ra hiệu quả điều trị tốt hơn người bệnh

Hình 1.4 Quy trình từ khi thu thập máu cho đến khi cấy ghép [44]

Trong đó bước đầu xem xét các yếu tố có khả năng ảnh hưởng đến chất lượng tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn có vai trò quan trọng trong chiến lược cải thiện chất lượng ngân hàng máu dây rốn

1.2.7 Ngân hàng tế bào gốc máu dây rốn

 Sự thành lập các ngân hàng máu dây rốn

Nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh các tế bào tiền thân tạo máu và

tế bào tiền thân đa năng vẫn hoạt động chức năng trong máu dây rốn ở điều kiện có chất chống đông ít nhất 3 ngày ở 4oC hoặc 25o

C [46] Nhờ vậy, máu

dây rốn có thể được xử lý và sử dụng hoặc bảo quản lạnh cho điều trị bình thường sau quá trình vận chuyển và bảo quản trong một khoảng thời gian nhất định Phát hiện này dẫn đến tiềm năng ứng dụng của tế bào gốc máu dây rốn ngày càng lớn, đi cùng với đó là mạng lưới ngân hàng tế bào gốc máu dây rốn được thành lập ở nhiều quốc gia trên khắp thế giới Mô hình ngân hàng máu dây rốn gồm có: ngân hàng máu dây rốn công, nơi lưu trữ các đơn vị máu dây rốn để sử dụng cho người nhận không có quan hệ huyết thống với người hiến; ngân hàng máu dây rốn tư nhân, nơi lưu trữ máu dây rốn sử dụng ghép tự thân hoặc dùng cho người thân trong gia đình; và ngân hàng hỗn hợp, cung cấp các dịch vụ kết hợp [53] Ước tính năm 2017 có khoảng hơn 800 000 đơn vị máu dây rốn được bảo quản lạnh trong các ngân hàng công và hơn 5 triệu đơn vị khác được lưu trữ trong các ngân hàng máu dây rốn tư nhân [54]

 Tiêu chí đánh giá ngân hàng máu dây rốn

Có nhiều tổ chức trên thế giới như NetCord, AABB (American Association of Blood Banks), EDQM (European Directorate for the Quality

of Medicines & HealthCare), ARTHIQS (Assisted Reproductive Technologies and Haematopoietic stem cells Improvements for Quality and Safety throughout Europe) đưa ra những tiêu chuẩn cụ thể về các tiêu chí đánh giá ngân hàng máu dây rốn Các tổ chức khác nhau thì tiêu chuẩn cũng khác nhau, nhưng nhìn chung có một số tiêu chuẩn thống nhất giữa các tổ chức về các khía cạnh chung của tiêu chí đánh giá áp dụng cho tất cả các loại ngân hàng máu dây rốn bao gồm:

 Sử dụng để điều trị

 Kiểm soát chất lượng ngân hàng máu dây rốn

Các ngân hàng máu dây rốn phải thiết lập việc kiểm soát chất lượng đối với các quy trình và sản phẩm của ngân hàng để có thể lập hồ sơ về chất lượng và an toàn Vì mục đích đó, một danh sách các thông số quan trọng cần được kiểm soát sẽ được thiết lập và một phạm vi giá trị có thể chấp nhận được xác định Tất cả các tham số, giá trị của chúng và quy trình cho việc thực hiện các biện pháp kiểm soát phải dựa trên các tài liệu tham khảo khoa học và/hoặc được xác nhận bởi ngân hàng

Theo ARTHIQS, các thông số tối thiểu cho kiểm soát chất lượng bao gồm:

o Kiểm soát chất lượng mẫu lưu trữ:

 Số lượng TNC lưu trữ

 Số lượng CD34+

 Tỷ lệ tế bào sống

 Kiểm soát nhiễm khuẩn

o Kiểm soát chất lượng mẫu ghép:

 Xét nghiệm HLA ( tối thiểu HLA-A, HLA-B, HLA-DRB1)

 Kết quả tỷ lệ sống của tế bào sau khi rã đông

 Kết quả xét nghiệm nhóm máu ABO, Rh

 Xét nghiệm bệnh lý di truyền

 Sự phù hợp của người hiến

 Tiêu chí cấp bằng cho một đơn vị tế bào gốc tạo máu từ máu dây

1 Tuổi người mẹ [57, 58] 25 Phương pháp thu thập [57]

2 Chủng tộc [59, 60] 26 Thời gian từ thu thập - xử lý

[59, 61]

3 Cân nặng [58, 62] 27 Thời gian thu thập [63]

4 Chiều cao [58] 28 Một hay hai người thu thập

7 Virus CMV [66] 30 Đường kính lưỡng đỉnh [67]

8 Nhóm máu ABO, Rh [65] 31 Chu vi vòng đầu [67]

9 Thời gian mang thai [68] 32 Chu vi bụng [67]

10 Tiểu đường thai kỳ [61] 33 Chiều dài xương đùi [67]

11 Cao huyết áp thai kỳ [61] 34 Cân nặng [57, 59]

13 Tiền sử thai sản (số lần

mang thai) [57, 69] 36 Dây rốn quấn cổ [70]

14 Số lượng thai [57] 37 Giới tính [57, 59]

Yếu tố chuyển dạ và sinh con 38 Nhóm máu ABO, Rh

15 Thời gian tách em bé khỏi

16 Phương pháp sinh [57, 59] 40 Số lượng tiểu cầu [70]

17 Thời gian sinh 41 Vị trí trẻ sơ sinh khi thu mẫu

[71]

21 Phân su trong nước ối [58,

22 Thời gian chuyển dạ [58] 45 pH máu dây rốn [65]

23 Gây tê ngoài màng cứng

Nồng độ yếu tố tăng trưởng biểu bì trong máu dây rốn [73]

24 Kẹp dây rốn chậm [74] 47 Nồng độ vitamin D trong máu

dây rốn [75]

Trong 47 yếu tố được tổng hợp ở Bảng 1.2, các yếu tố sản phụ bao gồm: tuổi người mẹ, nhóm máu, phương pháp sinh, số lần mang thai, số lượng thai; các yếu tố trẻ sơ sinh bao gồm: tuổi thai, cân nặng, giới tính; yếu

tố trong xử lý mẫu gồm: thời gian bảo quản mẫu, thể tích máu là những yếu tố được quan tâm nhiều nhất vì đặc điểm dễ tiếp cận, dễ thu thập thông tin và có nhiều nghiên cứu cho kết quả không thống nhất Do đó, trong phạm vi của nghiên cứu này, chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng đến các chỉ số chất lượng tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn của một số yếu tố kể trên

Tổng hợp lại, trên thế giới, các ngân hàng tế bào gốc máu dây rốn đã được xây dựng và nghiên cứu trong nhiều năm, các tiêu chuẩn cũng được nhiều tổ chức lớn trên thế giới đưa ra cho sản phẩm tế bào gốc máu dây rốn, tuy nhiên các tiêu chuẩn này có thể tham khảo nhưng không hoàn toàn chính xác với hoàn cảnh của Việt Nam Chất lượng của một đơn vị máu dây rốn có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố sản khoa, sơ sinh và các yếu tố trong cả quy trình từ khi lấy mẫu cho đến cấy ghép Để đáp ứng được những yêu cầu chất lượng khắt khe của các tổ chức thế giới về tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn, bắt buộc phải xây dựng một quy chuẩn chất lượng đầu vào cho sản phẩm tế bào gốc máu dây rốn phù hợp với thực tế tại Việt Nam

1.2.9 Tình hình nghiên cứu tế bào gốc tạo máu tại Việt Nam

Bởi những lợi ích thiết thực mà máu dây rốn mang lại, chất lượng máu dây rốn luôn là vấn đề cần quan tâm hàng đầu Tại Việt Nam hiện đã có một

số cơ sở nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc tạo máu cho điều trị bệnh như Bệnh viện Truyền máu – Huyết học TP HCM, Bệnh viện TW Huế, Bệnh viện quân đội 108, Bệnh viện Huyết học – Truyền máu TW, Bệnh viện Nhi TW Để phục vụ cho nghiên cứu tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn, việc nghiên cứu xây dụng ngân hàng máu dây rốn cùng với đánh giá chất lượng đơn vị máu dây rốn thu thập và lưu trữ là vô cùng cần thiết Trong nước đã có một số nghiên cứu liên quan đến đánh giá chất lượng máu dây rốn được thực hiện nhằm tối ưu quy trình thu thập, xử lý, lưu trữ máu dây rốn Tuy nhiên các nghiên cứu đa số chỉ bước đầu đánh giá tình hình thu thập mẫu, sàng lọc và

xử lý máu dây rốn tại một số bệnh viện lớn Chẳng hạn như nghiên cứu của

Nguyễn Thị Duyên khảo sát một số chỉ số huyết học và chất lượng máu dây rốn lưu trữ tại Bệnh viện Nhi TW từ 2016 đến 2018 [76] Nghiên cứu của GS Huỳnh Nghĩa và đồng nghiệp về tình hình thu thập, sàng lọc và xử lý máu dây rốn tại Bệnh viện Truyền máu – Huyết học TP HCM [77] Báo cáo của Trần Trung Dũng và Lê Thị Dịu Hiền năm 2013 về việc đánh giá chất lượng máu dây rốn thu thập tại ngân hàng máu dây rốn tại Bệnh viện Truyền máu – Huyết học TP HCM [78]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu trong đề tài của chúng tôi là 355 đơn vị máu dây rốn trẻ sơ sinh được thu thập tại Ngân hàng Tế bào gốc, Bệnh viện Đa khoa Tâm Anh Hà Nội từ 06/2019 đến 03/2021

2.2.2 Hóa chất

Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê theo Bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất

Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Gibco, Mỹ

Stem-KitTM Reagent Beckman coulter, Mỹ

2.2.3 Thiết bị

Danh mục thiết bị dùng trong nghiên cứu được liệt kê trong Bảng 2.2

Bảng 2.2 Danh mục thiết bị

Tủ an toàn sinh học ESCO, Singapore

Máy hút dịch chân không Integra, Mỹ

Navios EX Flow cytometer Beckman coulter, Mỹ

Nhiệt kế hồng ngoại Fluke, Mỹ

Tủ lạnh -80o

Tủ lạnh -20o

2.2.4 Vật tƣ tiêu hao

Danh sách vật tƣ tiêu hao sử dụng trong nghiên cứu đƣợc liệt kê trong Bảng 2.3

Bảng 2.3 Danh mục dụng cụ, vật tư tiêu hao

Dụng cụ, vật tư tiêu hao Hãng sản xuất

Ống lưu chủng cryotube 1.8mL Corning, Mỹ

Pipet nhựa vô trùng Corning, Mỹ

Pank và kéo vô trùng Aesculap, Đức

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu

Phân tích ảnh hưởng của các yếu tố liên quan

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Kiểm soát nhiễm khuẩn Không đạt Đạt

Nghiên cứu mô tả cắt ngang được thể hiện trên sơ đồ thiết kế nghiên cứu (Hình 2.1) Đơn vị máu dây rốn trong nghiên cứu được thu thập, xử lý, lưu trữ với các tiêu chuẩn chấp thuận và loại trừ dựa trên trên các khuyến cáo của Hiệp hội truyền máu Hoa Kỳ - AABB [79] và các ngân hàng máu dây rốn tại Mỹ [80] bao gồm:

 Tiêu chuẩn sàng lọc sản phụ

Việc lựa chọn thu thập mẫu máu dây rốn trẻ sơ sinh được tiến hành bằng cách sàng lọc một số tiêu chuẩn áp dụng đối với sản phụ để đảm bảo mẫu thu được không có tác nhân lây truyền qua đường máu, đảm bảo chất lượng của mẫu thu được, đảm an toàn cho cả người mẹ, nhân viên thu mẫu và các mẫu đã được lưu trữ trong ngân hàng tế bào gốc

Tiêu chuẩn đối với sản phụ:

 Nhiệt độ < 38o

C trong khi sinh

 Xét nghiệm virus HIV (HIV - ½ Ab), HBV (HbsAg, HbcAb), HCV (HCV Ab), Cytomegalo virus (CMV) IgM, Giang mai

(Syphilis), Rubella virus IgM âm tính trong vòng 7 ngày

trước sinh

 Không bị bệnh lý di truyền

 Tiêu chuẩn sàng lọc mẫu sau thu thập

Tiêu chuẩn mẫu đưa vào xử lý: Thể tích máu ≥ 70mL/đơn vị túi máu

 Tiêu chuẩn sàng lọc mẫu sau xử lý

Tiêu chuẩn mẫu đưa vào lưu trữ:

 Tỷ lệ tế bào sống: ≥80%

 Kiểm soát nhiễm khuẩn: không phát hiện sự phát triển của vi khuẩn và vi nấm

2.3.2 Nội dung nghiên cứu

 Các chỉ số đánh giá chất lượng đơn vị máu dây rốn