luận văn nghiên cứu tách chiết và nâng cao hàm lượng hoạt chất 6 shogaol trong cao gừng (zingiber officinale), fucoidan trong cao rong nâu (sargassum mcclurei) và apigenin trong cao cần tây (apium graveolens)

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Lê Nguyễn Tường Vi NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ NÂNG CAO HÀM LƯỢNG HOẠT CHẤT 6-SHOGAOL TRONG CAO GỪNG Zingiber officinale, FUCOIDAN TRONG CAO RONG NÂU Sargas

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Lê Nguyễn Tường Vi

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ NÂNG CAO HÀM LƯỢNG HOẠT CHẤT 6-SHOGAOL TRONG CAO GỪNG (Zingiber

officinale), FUCOIDAN TRONG CAO RONG NÂU (Sargassum mcclurei) VÀ APIGENIN TRONG CAO CẦN TÂY (Apium

graveolens)

LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2021

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Lê Nguyễn Tường Vi

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ NÂNG CAO HÀM LƯỢNG HOẠT CHẤT 6-SHOGAOL TRONG CAO GỪNG (Zingiber officinale), FUCOIDAN TRONG CAO RONG NÂU (Sargassum mcclurei) VÀ APIGENIN TRONG CAO CẦN TÂY (Apium

graveolens)

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 8440114

LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS Nguyễn Cửu Khoa

Thành phố Hồ Chí Minh – 04/2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan luận văn thạc sĩ ngành Hóa hữu cơ với đề tài “Nghiên cứu tách chiết và nâng cao hàm lượng hoạt chất [6]-shogaol trong cao gừng

(Zingiber officinale), fucoidan trong cao rong nâu (Sargassum mcclurei) và apigenin trong cao cần tây (Apium graveolens)” là công trình khoa học do tôi

thực hiện dưới sự hướng dẫn của GS TS Nguyễn Cửu Khoa

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác Nếu có bất kỳ sự gian dối nào, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Học viên cao học

Lê Nguyễn Tường Vi

LỜI CẢM ƠN

Luận văn Thạc sĩ này được thực hiện và hoàn thành tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam dưới sự hướng dẫn của GS TS Nguyễn Cửu Khoa

Trong thời gian học tập chương trình đào tạo thạc sĩ tại Học viện Khoa học và Công nghệ, tôi nhận được rất nhiều kiến thức bổ ích từ tập thể Giảng viên khoa Hóa học – Học viện Khoa học và Công nghệ Những kiến thức này giúp tôi có thể phát triển được kĩ năng và tri thức, áp dụng vào đơn vị tôi đang công tác cũng như hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này

Để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ, tôi xin bày tỏ lòng biết

ơn sâu sắc đến GS TS Nguyễn Cửu Khoa đã hết lòng hướng dẫn, định hướng

và tạo điều kiện cho tôi thực hiện luận văn một cách tốt nhất

Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô thuộc khoa Hóa học

đã luôn sẵn sàng hỗ trợ tôi về kiến thức và tạo điều kiện về trang thiết bị, máy móc có liên quan đến luận văn Cảm ơn các cán bộ của Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng đã trực tiếp hỗ trợ và giải đáp thắc mắc trong suốt quá trình tôi thưc hiện Cảm ơn gia đình và tập thể lớp cao học khóa 2018B đã luôn động viên tôi khi thực hiện luận văn tốt nghiệp

Kính chúc quý thầy cô luôn dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp khoa học Chúc các bạn học viên khóa 2018B thành công

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 06 tháng 06 năm 2021

Học viên cao học

Lê Nguyễn Tường Vi

Correlation

Phổ tương tác dị hạt nhân qua

nhiều liên kết

Quantum Coherence

Phổ tương tác dị hạt nhân qua

một liên kết

proton và carbon

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Danh mục nguyên liệu và hóa chất 18

Bảng 2.2 Danh mục thiết bị và dụng cụ 20

Bảng 2.3 Dung dịch chuẩn khảo sát khoảng tuyến tính [6]-shogaol 30

Bảng 2.4 Dung dịch chuẩn khảo sát tính tuyến tính của apigenin 33

Bảng 2.5 Dung dịch chuẩn khảo sát tính tuyến tính fucoidan 37

Bảng 3.2 Ảnh hưởng thời gian đến khả năng trích ly cao gừng 40

Bảng 3.3 Ảnh hưởng thể tích dung môi đến khả năng trích ly cao gừng 41

Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến khả năng trích ly cao gừng 42

Bảng 3.5 Dữ liệu NMR của hợp chất phân lập được từ gừng so với TLTK 45 Bảng 3.6 Kết quả định lượng [6]-shogaol trong nguyên liệu gừng 46

Bảng 3.7 Kết quả định lượng [6]-shogaol trong mẫu gừng thị trường 47

Bảng 3.8 Kết quả định lượng [6]-shogaol trong mẫu sản phẩm chiết tách 47

Bảng 3.9 Kết quả tính tương thích hệ thống [6]-shogaol 49

Bảng 3.10 Độ đặc hiệu của [6]-shogaol 50

Bảng 3.11 Đường chuẩn [6]-shogaol bằng phương pháp HPLC 51

Bảng 3.12 Độ lặp lại của quy trình định lượng [6]-shogaol bằng HPLC 52

Bảng 3.13 Độ đúng của quy trình thẩm định [6]-shogaol 52

Bảng 3.14 Ảnh hưởng thời gian đến khả năng trích ly cao cần tây 54

Bảng 3.15 Ảnh hưởng thể tích dung môi đến khả năng trích ly cao cần tây 55 Bảng 3.16 Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến khả năng trích ly cao cần tây 56 Bảng 3.17 Kết quả NMR hợp chất phân lập từ cần tây so với TLTK 59

Bảng 3.18 Kết quả định lượng apigenin trong nguyên liệu cần tây 61

Bảng 3.19 Kết quả định lượng apigenin trong cao cần tây thị trường 62

Bảng 3.20 Kết quả định lượng apigenin trong sản phẩm chiết tách 63

Bảng 3.21 Kết quả tính tương thích hệ thống apigenin 64

Bảng 3.22 Độ đặc hiệu của quy trình thẩm định apigenin 65

Bảng 3.23 Độ lặp lại của quy trình thẩm định apigenin bằng HPLC 66

Bảng 3.24 Đường chuẩn apigenin bằng phương pháp HPLC-PDA 66

Bảng 3.25 Độ đúng của quy trình thẩm định apigenin 68

Bảng 3.26 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả năng trích ly rong nâu 69

Bảng 3.27 Ảnh hưởng thời gian đến khả năng trích ly rong nâu 70

Bảng 3.28 Ảnh hưởng thể tích dung môi đến khả năng trích ly rong nâu 71

Bảng 3.29 Kết quả định lượng fucoidan bằng HPLC 75

Bảng 3.30 Kết quả định lượng fucoidan bằng UV-Vis 76

Bảng 3.31 Tính tương thích hệ thống fucoidan bằng phương pháp UV-Vis 76 Bảng 3.32 Độ đặc hiệu của fucoidan dùng phương pháp UV-Vis 77

Bảng 3.33 Khoảng tuyến tính của fucoidan sử dụng phương pháp UV-Vis 78 Bảng 3.34 Độ lặp lại của quy trình định lượng fucoidan bằng UV-Vis 79

Bảng 3.35 Độ đúng của phương pháp định lượng fucoidan bằng UV-Vis 79

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Củ gừng (Zingiber officinale) 6

Hình 1.2 Một số hợp chất có trong gừng 8

Hình 1.3 Cấu trúc hợp chất [6]-shogaol 9

Hình 1.4 Cần tây (Apium graveolens L.) 10

Hình 1.5 Một số hợp chất trong cần tây 11

Hình 1.6 Cấu trúc hợp chất apigenin 13

Hình 1.7 Rong nâu (Sargassum mcclurei) 14

Hình 1.8 Một số hợp chất có trong rong nâu 15

Hình 1.9 Cấu trúc hợp chất fucoidan 17

Sử dụng dung môi chiết ban đầu là ethanol đối với gừng 39

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng trích ly cao gừng 39

Hình 3.2 Ảnh hưởng thời gian đến khả năng trích ly cao gừng 40

Hình 3.3 Ảnh hưởng thể tích dung môi đến khả năng trích ly gừng 41

Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến quá trình trích ly gừng 42

Hình 3.5 Quy trình chiết xuất [6]-shogaol trong cao gừng 43

Hình 3.6 TLC các phân đoạn cao gừng và so chuẩn 45

Hình 3.7 Cấu trúc hợp chất phân lập từ củ gừng 46

Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu nguyên liệu gừng 47

Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu gừng thị trường 47

Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu sản phẩm cao gừng chiết tách 48

Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu thẩm định tính tương thích hệ thống [6]-shogaol 49 Hình 3.12 SKĐ độ đặc hiệu của [6]-shogaol 50

Hình 3.13 Đồ thị đường chuẩn [6]-shogaol bằng phương pháp HPLC 51

Hình 3.14 SKĐ khoảng tuyến tính [6]-shogaol bằng phương pháp HPLC 51

Hình 3.15 Ảnh hưởng thời gian đến khả năng trích ly cao cần tây 54 Hình 3.16 Ảnh hưởng thể tích dung môi đến khả năng trích ly cao cần tây 55 Hình 3.17 Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến khả năng trích ly cao cần tây 56

Hình 3.18 Quy trình chiết xuất apigenin từ cần tây 59

Hình 3.19 TLC cao cần tây (a) và apigenin (b) soi dưới đèn UV 59

Hình 3.20 Cấu trúc hợp chất phân lập được từ cần tây 61

Hình 3.21 Sắc ký đồ mẫu apigenin chuẩn 5 ppm 61

Hình 3.22 Sắc ký đồ mẫu nguyên liệu cần tây 62

Hình 3.23 Sắc ký đồ apigenin trong cao cần tây thị trường 62

Hình 3.24 Sắc ký đồ mẫu apigenin của sản phẩm chiết tách 63

Hình 3.25 Sắc ký đồ thẩm định tính tương thích hệ thống apigenin 64

Hình 3.26 Độ đặc hiệu mẫu trắng (a); apigenin chuẩn (b); mẫu thử 10 ppm (c) 65

Hình 3.27 Đồ thị đường chuẩn apigenin bằng phương pháp HPLC-PDA 67

Hình 3.28 SKĐ đường chuẩn apigenin bằng phương pháp HPLC 67

Hình 3.29 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả năng trích ly rong nâu 69

Hình 3.31 Ảnh hưởng thể tích dung môi đến khả năng trích ly rong nâu 72

Hình 3.32 Cấu trúc hợp chất phân lập từ rong nâu 73

Hình 3.33 Quy trình chiết xuất fucoidan từ rong nâu 74

Hình 3.34 Sắc ký đồ mẫu fucoidan chuẩn (a), mẫu nguyên liệu (b), mẫu sản phẩm thị trường (c), mẫu sản phẩm chiết (d) 76

Hình 3.35 Phổ đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử fucoidan 50 ppm 77

Hình 3.36 Đồ thị đường chuẩn fucoidan bằng phương pháp UV-Vis 78

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN 1

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ vii

MỤC LỤC 1

MỞ ĐẦU 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 6

1.1 CỦ GỪNG (ZINGIBER OFFICINALE) 6

1.1.1 Mô tả thực vật 6

1.1.2 Phân bố 6

1.1.3 Thành phần hoá học của gừng 7

1.1.4 Hoạt tính sinh học của gừng 8

1.1.5 Một số nghiên cứu về [6]-shogaol trong gừng (Zingiber officinale) 8

1.2 CẦN TÂY (APIUM GRAVEOLENS L.) 9

1.2.1 Mô tả thực vật 9

1.2.2 Phân bố 10

1.2.3 Thành phần hóa học của cần tây 10

1.2.4 Hoạt tính sinh học của cần tây 11

1.2.5 Một số nghiên cứu về apigenin trong cần tây (A.graveolens L.) 12

1.3 RONG NÂU (SARGASSUM MCCLUREI) 13

1.3.1 Mô tả thực vật 13

1.3.2 Phân loại và phân bố 13

1.3.3 Thành phần hóa học của rong nâu 14

1.3.4 Hoạt tính sinh học của rong nâu 15

1.3.5 Một số nghiên cứu về fucoidan trong rong nâu 16

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 NGUYÊN LIỆU - HÓA CHẤT 18

2.2 DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 19

2.3 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 20

2.4 TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.4.1 Khảo sát điều kiện chiết tách 21

2.4.2 Chiết xuất, phân lập hợp chất 22

2.4.3 Phương pháp định lượng bằng HPLC 23

2.4.4 Phương pháp định lượng bằng UV-Vis 24

2.4.5 Thẩm định phương pháp định lượng 24

2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu 27

2.5 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH, NÂNG HÀM LƯỢNG, ĐỊNH LƯỢNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG [6]-SHOGAOL TRONG CỦ GỪNG 28

2.5.1 Chiết tách [6]-shogaol từ củ gừng 28

2.5.2 Định lượng [6]-shogaol bằng phương pháp HPLC 28

2.5.3 Thẩm định quy trình phân tích [6]-shogaol từ củ gừng 29

2.6 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH, NÂNG HÀM LƯỢNG, ĐỊNH LƯỢNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG APIGENIN TRONG CẦN TÂY 31

2.6.1 Chiết tách apigenin từ cần tây 31

2.6.2 Định lượng apigenin bằng phương pháp HPLC-PDA 32

2.6.3 Thẩm định quy trình phân tích apigenin từ cần tây 32

2.7 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH, NÂNG HÀM LƯỢNG, ĐỊNH LƯỢNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FUCOIDAN TRONG RONG NÂU 34

2.7.1 Chiết xuất fucoidan từ rong nâu 34

2.7.2 Định lượng fucoidan bằng phương pháp HPLC 35

2.7.3 Định lượng fucoidan bằng phương pháp UV-Vis 35

2.7.4 Thẩm định quy trình phân tích fucoidan từ rong nâu bằng UV-Vis 36

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU [6]-SHOGAOL TỪ CỦ GỪNG 39

3.1.1 Điều kiện chiết tách [6]-shogaol 39

3.1.2 Quy trình chiết xuất [6]-shogaol 42

3.1.3 Định lượng [6]-shogaol bằng phương pháp HPLC 46

3.1.4 Thẩm định quy trình định lượng [6]-shogaol từ củ gừng 48

3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU APIGENIN TỪ CẦN TÂY 53

3.2.1 Điều kiện chiết tách apigenin 53

3.2.2 Quy trình chiết xuất apigenin 56

3.2.3 Định lượng apigenin bằng phương pháp HPLC-PDA 61

3.2.4 Thẩm định quy trình định lượng apigenin từ cần tây 63

3.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU FUCOIDAN TỪ RONG NÂU 69

3.3.1 Điều kiện chiết tách fucoidan từ rong nâu 69

3.3.2 Quy trình chiết xuất fucoidan từ rong nâu 72

3.3.3 Định lượng fucoidan bằng phương pháp HPLC 75

3.3.4 Định lượng fucoidan bằng phương pháp UV-Vis 76

3.3.5 Thẩm định quy trình định lượng fucoidan bằng UV-Vis 76

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 81

4.1 KẾT LUẬN 81

4.2 KIẾN NGHỊ 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO 83

PHỤ LỤC 90

MỞ ĐẦU

Hóa học các hợp chất thiên nhiên nói chung và hợp chất có hoạt tính sinh học nói riêng là một trong những hướng đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm Theo Tổ chức y tế thế giới (WHO), khoảng 80% dân số hiện nay vẫn dựa vào thuốc có nguồn gốc tự nhiên trong chăm sóc sức khỏe Sự kết hợp những phương pháp phân tích hiện đại như: quang phổ hồng ngoại (IR), cộng hưởng

từ hạt nhân (NMR), phổ hấp thu quang (UV-Vis)… trong lĩnh vực nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên cùng với việc làm sáng tỏ cấu trúc, hoạt tính của các hợp chất có dược tính đã góp phần củng cố và phát triển, nâng cao công dụng

Loài gừng (Zingiber officinale), cần tây (Apium graveolens), rong nâu (Sargassum mcclurei) từ lâu đã được dùng làm thực phẩm và có công dụng trị

bệnh trong dân gian Các nhà khoa học đã xác định trong củ gừng có chứa hợp chất [6]-shogaol, trong cần tây chứa hợp chất apigenin, trong rong nâu chứa hợp chất fucoidan có nhiều hoạt tính sinh học như ức chế tế bào ung thư, kháng virus, chống gốc tự do…Tuy nhiên, vẫn cần có những nghiên cứu cụ thể hơn

về các tác dụng sinh học của những loài cây này, nhằm đưa vào phục vụ cho việc chăm sóc và nâng cao sức khỏe con người Xuất phát từ thực tế này, luận

văn “Nghiên cứu tách chiết và nâng cao hàm lượng hoạt chất [6]-shogaol

trong cao gừng (Zingiber officinale), fucoidan trong cao rong nâu (Sargassum mcclurei) và apigenin trong cao cần tây (Apium graveolens)”

được thực hiện với ba mục tiêu chính như sau:

1 Xây dựng quy trình điều chế cao chiết chứa hợp chất [6]-shogaol trong củ gừng với hàm lượng trên 15%, hợp chất apigenin trong cần tây với hàm lượng trên 85% và fucoidan trong rong nâu với hàm lượng trên 85%

2 Xây dựng quy trình định lượng các hợp chất [6]-shogaol, apigenin, fucoidan bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp quang phổ tử ngoại – khả kiến (UV-Vis)

3 Thẩm định quy trình phân tích định lượng để ứng dụng định lượng hợp chất [6]-shogaol, apigenin, fucoidan trong tương lai

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 CỦ GỪNG (Zingiber officinale)

1.1.1 Mô tả thực vật

Gừng (Zingiber officinale) thuộc họ Zingiberaceae, là cây thảo sống lâu năm,

mọc nơi đất ẩm, thường có mùi thơm Thân rễ (thường gọi là củ) không có hình dạng nhất định, do các bẹ lá ôm chặt nhau tạo thành thân giả, cao dưới 1 m, thường phân nhánh, dài 3 cm đến 7 cm, dày 0,5 đến 1,5 cm, nằm ngang dưới mặt đất, chứa nhiều chất dự trữ [1-3, 4] Mặt ngoài màu trắng tro hay vàng nhạt,

có vết nhăn dọc Mặt cắt ngang có sợi thưa Mùi thơm, vị cay nóng [4] Lá gồm có: bẹ lá, cuống lá, lưỡi lá và phiến lá Hoa lưỡng tính, đối xứng hai bên, có màu sắc, kích thước trung bình hoặc lớn [1-3]

Hình 1.1 Củ gừng (Zingiber officinale)

1.1.2 Phân bố

Với 150 loài gừng khác nhau trên thế giới đã được nghiên cứu, chi gừng được đánh giá là chi quan trọng trong các loài thực vật cho vị cay Loài gừng phân

bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới, đặc biệt là Đông Nam Á Ở Việt Nam, loài gừng

Z officinale được trồng từ Bắc vào Nam, đặc biệt là các tỉnh miền núi và hải

đảo [1,5] Việt Nam có khoảng 14 chi, 64 loài đã được khai thác và sử dụng

trong nhiều lĩnh vực khác nhau Trong đó, loài Zingiber officinale được sử dụng

rộng rãi lâu đời, đồng thời còn là nguồn dược liệu với nhiều tác dụng như chữa

nôn mửa, cảm lạnh, viêm khớp, kháng viêm…[6]

1.1.3 Thành phần hoá học của gừng

Nhựa dầu gừng có màu vàng sậm, mùi thơm đặc trưng, vị cay, là chất lỏng sệt, chứa 20-25% tinh dầu và 20-30% chất cay Có khoảng 100 hợp chất trong nhựa

dầu gừng [7-10] Các hợp chất tạo nên vị cay trong gừng gồm zingerone,

gingerol, gingerdiol, shogaol… [3,5,6,11] Gừng tươi nhiều gingerol nhưng khi mất nước dần chuyển thành nhóm hợp chất shogaol, vì thế gừng khô cay hơn [12]

Hình 1.2 Một số hợp chất có trong gừng

1.1.4 Hoạt tính sinh học của gừng

Y học hiện đại đã có những kết luận về tác dụng dược lý của gừng như sau:

- Chống ung thư: gingerol và shogaol được chứng minh là các hợp chất

gây độc tế bào ung thư liên quan tới chu trình apoptosis [13], ức chế hình thành mạch và là hướng nghiên cứu đầy triển vọng trong phát triển thuốc chống ung thư thế hệ mới [14-16] Tác dụng của [6]-shogaol được chứng

minh là mạnh hơn nhiều so với [6]-gingerol

- Kháng khuẩn: sự có mặt của các loại tinh dầu như camphene, linalool, α-pinene và borneol nên gừng có thể ức chế một số loại vi khuẩn như A

niger, S cerevisiae, Mycoderma spp., L acidophilus [17-20]

- Kháng viêm: Các hợp chất phenolic, đặc biệt là gingerol trong gừng đã

được chứng minh là có khả năng chống viêm [21]

- Chống oxy hóa: Hoạt tính chống oxy hóa của gừng được chứng minh trong các nghiên cứu in vitro và in vivo trên tác dụng ức chế quá trình

peroxyd hóa lipid, ngăn chặn tăng cholesterol, tăng glutathione cũng như loại bỏ các gốc tự do trên mô hình động vật [2,9,22]

- Ngoài ra gừng còn có khả năng chữa trị Đau bụng lạnh, đầy trướng không tiêu, nôn mửa, tứ chi lạnh, ho suyễn [4]

1.1.5 Một số nghiên cứu về [6]-shogaol trong gừng (Zingiber

officinale)

[6]-shogaol ((E)-1-(4-hydroxy-3-methoxy phenyl) dec-4-en-3-on) tan được trong methanol và ethanol, tan ít trong chloroform và ethyl acetate, rất khó phát hiện trong gừng tươi do hàm lượng thấp nhưng lại có tác dụng vượt trội hơn [6]-gingerol nhiều về tác dụng chống viêm, chống oxi hóa và điều trị ung thư Nhóm shogaol là nhóm hợp chất bị biến đổi bởi gingerol theo cơ chế loại nước trong quá trình gia nhiệt và nó còn cay hơn cả gingerol [23] Nhóm shogaol

thường được biết ở dạng [6]-shogaol, chúng là kết quả của việc khử nhóm OH

ở C-5 với sự hình thành của liên kết đôi giữa C-4 và C-5 sau khi gingerol bị tách nước

Năm 2007, Chen C.Y cùng cộng sự đã nghiên cứu khả năng gây apoptosic của

tế bào ung thư gan người p53 từ [6]-shogaol thông qua cơ chế phụ thuộc caspase qua trung gian stress oxy hóa [24]

Năm 2019, Uddin M.D và Sang-Youel Park đã nghiên cứu về sự giảm lượng autophagy bởi [6]-shogaol với tế bào ung thư gan người với TRAIL gây ra apoptosis thông qua p53 và ROS [25] Yếu tố hoại tử khối u (TNF) liên quan đến quá trình apoptosis tạo ra ligand TRAIL (thuộc nhóm TNF) Người ta đã chứng minh rằng [6]‑shogaol, một thành phần có hoạt tính sinh học của gừng,

có tác dụng chống viêm và chống ung thư, làm giảm sự lan truyền tế bào khối

u và gây chết tế bào ung thư gan qua trung gian TRAIL Nghiên cứu đã xác định TRAIL và [6]‑shogaol đã cùng nhau điều chỉnh tăng biểu hiện protein ức chế 53 (p53) của khối u và thay đổi màng tế bào của ty thể (MTP) Tóm lại, sử dụng TRAIL kết hợp với [6]‑shogaol có thể là phương pháp điều trị phù hợp

để điều trị ung thư tế bào gan Huh7

Hình 1.3 Cấu trúc hợp chất [6]-shogaol

1.2 CẦN TÂY (Apium graveolens L.)

1.2.1 Mô tả thực vật

Cần tây (Apium graveolens L.), thuộc họ cần (Apiaceae), là loại cây được trồng

rất phổ biến trên thế giới và được di thực về trồng ở Việt Nam, có nguồn gốc

từ châu Á và châu Âu Cây thân thảo, lưỡng tính, cao 15 – 150 cm, thân mọc thẳng đứng, nhẵn, có nhiều rãnh dọc, chia nhiều cành, mùi thơm mạnh Lá mọc xen, màu xanh lục, mỏng, cuống lá có bẹ to, lá chia ba thùy, thùy cuối có dạng hình thoi Cụm hoa chùm hình tán kép, mọc đối diện lá, mỗi tán mang 10 – 12 hoa Hoa trắng, tán hoa từ 7-25 hoa, hoa có kích thước 6-9 mm theo chiều ngang Quả hình trứng, màu nâu, cuống quả dài 1-1,5 mm, có 6 cánh, mép ngoài mỗi cánh màu vàng nhạt Rễ chùm màu nâu nhạt, có nhiều rễ con Mùi thơm đặc trưng, vị đắng, hơi cay [4] Cây ra hoa và quả từ tháng 4 đến tháng 7 [26]

Hình 1.4 Cần tây (Apium graveolens L.)

1.2.2 Phân bố

Cần tây có nguồn gốc từ châu Âu, phạm vi trồng trọt và tiêu thụ rất rộng lớn và

nó còn được tìm thấy ở các nước châu Phi, Iran, Ấn Độ và Hoa Kỳ Từ thời cổ đại, cây đã được trồng và sử dụng như một loại rau ăn và là một vị thuốc phổ biến trong nhiều nền y học cổ truyền

1.2.3 Thành phần hóa học của cần tây

Phân tích thành phần hóa học từ chiết xuất ethanol của Apium graveolens L

cho thấy sự hiện diện của:

Monoterpernes: limonene (73,14%), myrcene (1,14%), beta-pinene (0,79%), beta-caryophyllene (0,54%) …[27]

Sesquiterpenes: beta-selinene (10,15%), alpha-selinene (1,67%) … [27]

Phtalides: 4,5-dihydro-3-butyl-phtalide (5,72%), butyl-phtalide (2,09%) … [27]

Flavonoid: thành phần chính của lá cần tây là apigenin với hàm lượng 202 mg/kg, ngoài ra còn có luteolin và chrysoeriol 7-glucoside Lá cần tây cũng chứa furanocomarin, psoralen, bergapten, xanthotoxin và isopimpinellin [27]

Hình 1.5 Một số hợp chất trong cần tây

1.2.4 Hoạt tính sinh học của cần tây

Một số tác dụng sinh học chính của cần tây gồm:

- Chống ung thư: một số thành phần hoạt động rất hữu ích trong việc

chống ung thư khối u có ở cần tây như polyacetylenes và phthalides [28]

- Hạ huyết áp và lipid máu: Lợi ích của cần tây gồm khả năng làm giảm

mức cholesterol gây nguy cơ bệnh tim mạch

- Chống oxi hóa: Rễ và lá cần tây có đặc tính loại bỏ gốc OH và DPPH

[29] Nó cũng được sử dụng để điều trị đau dạ dày [28] Jung et al trong một nghiên cứu đã kiểm tra hàm lượng nhóm phenolic và flavonoid của

lá cần tây bằng phương pháp Folin-Ciocalteu Kết quả nghiên cứu cho thấy chiết xuất cồn của lá cần tây chứa lượng hợp chất phenolic cao nhất,

rễ cần tây chứa các dẫn xuất phenolic như coumarin, scopoletin và acid

aescoumlic [30] Trong một nghiên cứu in vitro đã đánh giá khả năng

loại bỏ gốc tự do DPPH và ức chế peroxid hóa lipid từ cần tây cho hiệu quả cao trong việc loại bỏ gốc tự do DPPH và giảm cường độ peroxid hóa lipid [31]

- Ngoài ra cần tây còn có khả năng trị hen suyễn, khó thở, viêm phế quản, viêm màng phổi, trướng bụng, đầy hơi, tiêu hóa kém [4]

1.2.5 Một số nghiên cứu về apigenin trong cần tây (A.graveolens L.)

Trong nhóm flavonoids của cần tây, apigenin là hợp chất được quan tâm nhiều nhất Kể từ khi Birt và cộng sự lần đầu tiên báo cáo rằng apigenin có hoạt động chống ung thư vào năm 1986 [32], ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy

apigenin có hiệu quả chống ung thư in vitro và in vivo ở chuột Tất cả các kết

quả thu thập được cho đến nay chỉ ra apigenin có hoạt động chống ung thư mạnh trên các loại ung thư khác nhau ở người và có thể kết hợp với nhiều tác nhân hóa trị liệu khác

Apigenin đã được báo cáo có thể ngăn chặn các bệnh ung thư khác nhau bằng cách kích hoạt quá trình apoptosis và autophagy, ngăn chặn di chuyển xâm lấn

tế bào và kích thích phản ứng miễn dịch [33,34] Apigenin đã được chứng minh

có tác dụng ở nhiều loại ung thư, bao gồm ung thư đại trực tràng, ung thư vú, ung thư gan, ung thư phổi, ung thư tuyến tiền liệt [35,37]

Trong tế bào ung thư biểu mô nang (ACC), apigenin ngăn chặn sự sống sót của

tế bào ACC-2 bằng cách gây ra cả apoptosis và bắt giữ pha G2/M phụ thuộc vào liều và thời gian [35] Trong tế bào ung thư ruột kết HCT116 của người, apigenin đã kích hoạt cả chu trình autophagy lẫn apoptosis [36] Hơn nữa, trong các tế bào u ác tính ở người, Zhao và cộng sự đã báo cáo rằng apigenin cho thấy tác dụng chống ung thư hiệu quả khi ngăn chặn sự di chuyển và xâm lấn

tế bào, gây ra sự bất hoạt chu kỳ tế bào ở pha G2/M và đồng thời gây ra apoptosis tế bào [37] Các hiệu ứng chống ung thư khác nhau được kích hoạt đồng thời bởi apigenin đã chứng minh rằng apigenin có khả năng chống ung thư

1.3.2 Phân loại và phân bố

Với đa dạng của thảm thực vật đại dương, rong nâu là một trong số các loài thực vật biển rất đáng chú ý Việt Nam hiện nay có khoảng 147 loài rong nâu,

trong đó chi Sargassum có trữ lượng lớn nhất với khoảng 68 loài phân bố dọc

ven biển với sản lượng ước tính trên 10.000 tấn/năm Rong nâu phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Mỹ, Pháp, Ấn Độ…Ở

Việt Nam, rong nâu phân bố chủ yếu tại vùng biển Đà Nẵng, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận, bờ biển Tây Nam

Bộ, chủ yếu là các loài S binderi, S denticarpum, S swartzii, S mcclurei, S

microcystum, S assimile, S feldmannii, S polycystum…

Hình 1.7 Rong nâu (Sargassum mcclurei)

1.3.3 Thành phần hóa học của rong nâu

Rong nâu chứa các thành phần có hoạt tính sinh học quý, có giá trị cao về mặt dinh dưỡng và dược liệu như: alginate, laminaran, fucoidan Trong số các hợp chất polysaccharide của rong nâu thì fucoidan là hợp chất đặc biệt quan tâm nghiên cứu do sở hữu nhiều hoạt tính sinh học thú vị như chống đông tụ máu, chống virus, chống ung thư, chống viêm, giảm lipid máu, chống oxy hóa, chống bệnh về gan, tiết niệu, bảo vệ dạ dày…[38]

Fucoidan là một sulfate polysaccharide có cấu trúc hóa học phức tạp bởi tính

đa dạng của liên kết glycoside và khả năng phân nhánh với vị trí nhóm sulfate sắp xếp không theo quy luật Thành phần của nó chủ yếu là fucose và một số các gốc đường khác như galactose, glucose, manose, xylose, acid uronic… [39,40] Năm 1997, Park và cộng sự đã công bố hàm lượng fucoidan từ 1-20%

trọng lượng rong khô và phụ thuộc vào loài rong Trong chi Sargassum, hàm

lượng fucoidan chiếm từ 1-2,5% trọng lượng rong khô, đây được coi là nguồn dược liệu tiềm năng của biển Việt Nam [41-43]

Hình 1.8 Một số hợp chất có trong rong nâu

1.3.4 Hoạt tính sinh học của rong nâu

Nhờ sự đa dạng về thành phần và cấu trúc mà fucoidan sở hữu nhiều hoạt tính sinh học thú vị như:

- Hoạt tính chống đông tụ máu: Nishino và cộng sự đã thử nghiệm hoạt tính chống đông máu của fucoidan được phân lập từ các loài rong E

Kurome, H.fusiforme, L.angustata Kết quả cho thấy chúng có hoạt tính

kháng đông tụ máu cao hơn so với heparin [44] Hàm lượng sulfate càng cao thì hoạt tính kháng đông tụ càng lớn [45-49] Theo các nghiên cứu [50-54] fucoidan sulfate hóa ở vị trí C-2 hoặc C-2, C-3 thể hiện hoạt tính kháng đông tụ, trong khi đó nhóm sulfate ở vị trí C-4 không thể hiện hoạt tính này Trọng lượng phân tử fucoidan cũng có ảnh hưởng lên hoạt tính

kháng đông tụ máu Fucoidan từ loài Lessonia vadosa có khối lượng

phân tử 320.000 Da MW cho thấy hoạt tính chống đông máu tốt hơn các fucoidan đề polymer hóa có khối lượng phân tử 32.000 MW [45,51,55]

- Hoạt tính chống khối u và điều hòa miễn dịch: Fucoidan từ các loài rong

L saccharina, L digitata, F serratus, F distichus và F vesiculosus có

tác dụng khóa chặt tế bào ung thư vú MDA-MB-231 ngăn chúng kết dính với tiểu cầu [56-58] Fucoidan có thể tăng cường chức năng tế bào lympho T, tế bào B, đại thực bào… thúc đẩy kháng thể phản ứng lại với

tế bào hồng cầu cừu (SRBC) in vivo [59]

- Hoạt tính chống oxy hóa: Rất nhiều công bố cho thấy rằng fucoidan thể

hiện hoạt tính chống oxy hóa quan trọng trong các thí nghiệm in vitro

Hoạt tính chống oxy hóa liên quan đến trọng lượng phân tử và hàm lượng sulfate của fucoidan [60]

- Chống viêm: Năm 2007, Cumashi và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính

chống viêm của fucoidan từ 9 loài rong nâu Kết quả cho thấy tất cả fucoidan của 9 loài rong đều có khả năng ức chế tăng lượng bạch cầu trên mô hình chuột bị viêm [56]

1.3.5 Một số nghiên cứu về fucoidan trong rong nâu

Năm 2012, Lee H., Kim J.S., Kim E đã nghiên cứu fucoidan có trong rong

Fucus vesiculus ức chế sự di cư và xâm lấn tế bào ung thư phổi người thông

qua con đường PI3K-Akt-mTOR [61] Fucoidan thể hiện tác dụng chống di căn trên các tế bào ung thư phổi A549 thông qua việc điều chỉnh giảm ERK1/2 và Akt-mTOR cũng như các con đường truyền tín hiệu NF-kB

Năm 2016, Alwarsamy M., Gooneratne R., Ravichandran R đã nghiên cứu ảnh

hưởng của fucoidan từ Turbinaria conoides với tế bào biểu mô ung thư phổi

(A549) [62] Fucoidan làm giảm sự phụ thuộc vào liều bởi thử nghiệm MTT (GI50 0,75 μg/mL) Quá trình apoptosis trong tế bào A549 được điều trị bằng fucoidan được hiển thị bằng kính hiển vi đồng tiêu laser và phân tích chu kỳ tế bào cho thấy cảm ứng bắt giữ pha Go/G1 của chu kỳ tế bào Có thể kết luận

rằng fucoidan có khả năng hoạt động như một tác nhân chống tăng sinh tế bào ung thư biểu mô phổi (A549)

Hình 1.9 Cấu trúc hợp chất fucoidan

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU - HÓA CHẤT

Bảng 2.1 Danh mục nguyên liệu và hóa chất

13 Ethanol, 99.8+%, for analysis,

2.2 DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ

Bảng 2.2 Danh mục thiết bị và dụng cụ

Thiết bị - Xuất xứ

Hệ thống cô quay chân không Eyela

2.3 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Mẫu thực vật được dùng trong nghiên cứu là gừng (Zingiber officinale) (kí hiệu ZO110420) được thu hái tại huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng, cần tây (Apium

graveolens L.) (kí hiệu AG200720), được thu hái tại huyện Đức Trọng, tỉnh

Lâm Đồng, rong nâu (Sargassum mcclurei) (SM011219) được thu hái tại huyện

Cam Ranh, tỉnh Khánh Hòa Mẫu vật được định danh bởi TS Nguyễn Ngọc Tuấn – Viện Công nghệ sinh học và Thực phẩm, trường ĐH Công nghiệp TP

Hồ Chí Minh và được lưu tại Trung tâm Thiết bị khoa học và phân tích Sinh Hóa Lý – Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng

2.4 TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Khảo sát điều kiện chiết tách

Quá trình trích ly cao dược liệu chịu rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến lượng sản phẩm thu được như: loại dung môi, nồng độ dung môi, tỷ lệ dung môi : nguyên liệu, thời gian, nhiệt độ và một số yếu tố khác Có nhiều loại dung môi như:

diethyl ether, n-hexane, chloroform, acetone, ethanol, methanol… Tuy nhiên,

với định hướng ứng dụng vào dược phẩm và thực phẩm chức năng, dung môi ethanol hoặc nước được chọn cho quá trình trích ly ban đầu Sau đó mới tiến hành sử dụng các loại dung môi khác cho quá trình tinh chế hợp chất Sau khi chọn được dung môi phù hợp, tiến hành thí nghiệm lựa chọn nồng độ dung môi thích hợp ở các nồng độ khác nhau Yếu tố ảnh hưởng tiếp theo trong nghiên cứu là lựa chọn tỷ lệ dung môi và nguyên liệu để cho lượng sản phẩm cao nhất, lựa chọn khảo sát các tỷ lệ dung môi : nguyên liệu là 1:1, 2:1, 3:1, 5:1, 10:1, 15:1, 20:1 Thời gian trích ly cũng ảnh hưởng rất lớn đến lượng cao chiết thu được Thời gian trích ly: 1,2,3,5,8 giờ được lựa chọn khảo sát Nhiệt độ trích ly cũng ảnh hưởng rất lớn đến lượng cao chiết Do đó, ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình trích ly là: 30, 40, 50, 60, 70 và 80 ℃ được lựa chọn để nghiên cứu Với khối lượng mỗi mẫu được khảo sát ban đầu là 100 g, sau khi tiến hành trích ly, lọc lấy dịch, cô quay thu hồi dung môi, xác định lượng cao thô lớn nhất

để lựa chọn yếu tố khảo sát ban đầu

2.4.2 Chiết xuất, phân lập hợp chất

a) Chiết xuất, phân lập [6]-shogaol trong củ gừng

Chất chiết được trong dược liệu được tiến hành theo phương pháp chiết với ethanol 90% Chất chiết được trong ethanol 90 % theo quy định không được

ít hơn 6,0 % tính theo dược liệu khô kiệt [4]

Định tính bằng phương pháp sắc kí lóp mỏng Dung môi khai triển:

n-Hexane – Ethyl acetate - acid acetic băng (7,5 : 2,5 : 4 giọt) Dung dịch thử: Lấy 2 g bột dược liệu, thêm 5 mL ethyl acetate, lắc trong 3 phút, lọc, lấy dịch lọc làm dung dịch thử Dung dịch đối chiếu: Lấy 2 g bột thân rễ Gừng (mẫu chuẩn) chiết nbư mô tả ở phần dung dịch thừ Cách tiên hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 µL mỗi dung dịch trên Sau khi khai triển xong, lấy bản mỏng

ra để khô ở nhiệt độ phòng Phun thuốc thử vanilin – sulfuric Sấy bản mỏng ở 110℃ cho đến khi hiện vết Quan sát dưới ánh sáng thường Trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết cùng màu sắc và giá trị Rf với các vết trên sẳc ký đồ của dung dịch đối chiếu Độ ẩm quy định không được vượt quá 13,0 % [4]

b) Chiết xuất, phân lập apigenin trong cần tây

Để chiết hợp chất apigenin trong cần tây, theo Dược điển Việt Nam V, lấy 5 g bột thô được chiết với 100 mL ether dầu hỏa (40-60℃) trong 2 giờ, lấy

bã dược liệu để bay hết hơi ether, chiết tiếp như trên bằng 100 mL methanol trong 6 giờ, cất thu hồi dung môi Độ ẩm không được quá 12,0 % [4] Chất chiết được trong được liệu không được nhỏ hơn 7,0 % tính theo dược liệu khô kiệt hoặc có thể tiến hành theo phương pháp chiết nóng dùng ethanol làm dung môi Để định tính bằng phương pháp TLC, dùng dung môi khai triển: Toluen - ethvl acetate - acid formic (4:4:0,5) Dung dịch thử: Lấy 3 g bột dược liệu, thêm

15 mL ethanol 96 %, đun sôi cách thủy 10 phút, lọc nóng, Bốc hơi dịch lọc còn khoảng 2 mL, được dung dịch chấm sắc ký Dung dịch chất đối chiếu: Hoà tan apigenin chuẩn trong methanol để thu được dung dịch có nồng độ 0,1 mg/mL Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20 µL mỗi dung dịch trên Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra đề khô ở nhiệt độ phòng Quan sát dưới ánh sáng từ ngoại ở bước sóng 254 nm vả 366 nm Trên sắc ký đồ của dung

dịch thử phải có các vết cùng màu sắc và giá trị Rf với các vết trên sắc ký đồ của vết apigenin trên sắc kí đồ của dung dịch chất đối chiếu Độ ẩm không quá 11,0 % đối với dược liệu khô [4]

c) Chiết xuất, phân lập fucoidan trong rong nâu

Rong nâu được thu hoạch vào mùa hạ và mùa thu, rửa bằng nước sạch

2 lần đến 3 lần để loại muối và tạp chất, cắt đoạn nhỏ, phơi hoặc sấy khô ừ 50℃ Bảo quản nơi khô mát Độ ẩm không được quá 15,0 % [4] Bột rong nâu được chiết với ethanol 80% theo tỉ lệ 1:10 trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng và ở 70

40-℃ trong 5h để loại mannitol và các chất ít phân cực, thu dung dịch, cô quay thu hồi cồn để tái sử dụng, thu được cao thô EtOH (độ ẩm 12,22%) Nguyên liệu được chiết với CaCl2 2% (ở 60℃) để phân lập hỗn hợp laminaran và fucoidan, khuấy hỗn hợp khoảng 45 phút tạo kết tủa Dung dịch được chiết tiếp với nước ở 80 ℃ trong 5 giờ, thu được dịch chiết và phần cặn Polysaccharide tan trong dung dịch được kết tủa bằng cách thêm ethanol 99 %, giữ ở nhiệt độ

Thẩm tách loại muối và các tạp chất trọng lượng phân tử thấp bằng màng thẩm tách (12000 kDa) trong 48 giờ, đông khô thu phân đoạn fucoidan dạng bột

2.4.3 Phương pháp định lượng bằng HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp tách các chất ra khỏi hỗn hợp phân tích trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh là chất rắn dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một chất mang rắn, hay một chất mang

đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ

Xác định hàm lượng hoạt chất trong mẫu bằng phương pháp HPLC:

𝐶𝑠: nồng độ dung dịch chuẩn (𝜇g/mL)

𝑚: khối lượng cao (g)

𝑉1: thể tích pha loãng cao lần một (mL)

𝑉3: thể tích pha loãng lần hai (𝜇L)

Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao được đo trên thiết bị HPLC

Flexar/ParkinElmer đầu dò PDA tại viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng - Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.4.4 Phương pháp định lượng bằng UV-Vis

Phương pháp dựa vào hiệu ứng hấp thụ xảy ra khi phân tử vật chất tương tác với bức xạ điện từ Vùng bức xạ được sử dụng trong phương pháp này là vùng

tử ngoại gần hay khả kiến ứng với bước sóng khoảng từ 200-800 nm Phổ Vis được đo trên thiết bị UV-1800 Shimadzu tại viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

UV-2.4.5 Thẩm định phương pháp định lượng

Theo các quy định của USFDA, AOAC, USP, ICH…các thông số cần thẩm định ứng với định lượng bằng HPLC bao gồm:

▪ Tính tương thích hệ thống (System suitability determination)

Đánh giá tính thích hợp hệ thống được cấu thành bởi các yếu tố như máy móc thiết bị, hệ thống điện, cách tiến hành và mẫu thử Chuẩn bị mẫu chuẩn theo quy trình Nồng độ hoạt chất trong mẫu tương ứng với nồng độ giữa của đường chuẩn Lượng mẫu thử đủ cho ít nhất 6 lần tiêm mẫu Tiến hành sắc ký, ghi lại SKĐ và xác định giá trị thời gian lưu, diện tích peak trung bình và các thông

số khác của peak (độ phân giải, hệ số kéo đuôi ) Giá trị RSD của thời gian lưu và diện tích peak phải ≤ 2,0%, hệ số bất đối xứng peak < 2.0 và số đĩa lý thuyết > 2000 nếu không có quy định khác

▪ Độ đặc hiệu (Specificity)

Độ đặc hiệu là khả năng đánh giá chắc chắn một chất phân tích khi có mặt các thành phần khác có thể có trong mẫu thử Tiến hành sắc kí các loại mẫu trắng, mẫu chuẩn (nồng độ ở khoảng giữa của đường chuẩn) và mẫu thử (nồng độ

tương đương mẫu chuẩn) theo quy trình phân tích Yêu cầu: Sắc ký đồ mẫu

trắng không xuất hiện peak trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn Sắc ký đồ mẫu thử cho peak có thời gian lưu tương tự với peak chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn Trên sắc ký đồ mẫu thử nếu xuất hiện thêm các peak khác không phải peak chất cần phân tích, thì peak của chất cần phân tích phải tách hoàn toàn khỏi peak tạp và đáp ứng các yêu cầu chung được quy định

▪ Độ lặp lại

Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của một quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm ở khoảng thời gian ngắn Độ lặp lại có thể được đánh giá trên kết quả của tối thiểu 6 lần định lượng ở nồng độ thử 100% Độ lặp lại của phương pháp được xác định bằng giá trị RSD (%) kết quả định lượng hàm lượng hoạt chất có trong mẫu, RSD ≤ 2% nếu không có quy định riêng

▪ Khoảng tuyến tính và đường chuẩn (Linearity and Calibration

curve)

Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích Cần ít nhất 6 điểm ở nồng độ khác nhau và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu và nồng độ Có thể chuẩn bị các mẫu của dãy chuẩn bằng cách pha loãng từ một mẫu chuẩn với các hệ số pha loãng khác nhau hoặc từ các mẫu chuẩn với lượng cân chất chuẩn khác nhau Vẽ đồ thị tương quan để xác định khoảng tuyến tính Kết quả thử được đánh giá bằng phương pháp tính đường hồi quy dựa vào phương pháp bình

phương tối thiểu theo phương trình y = ax + b, hệ số tương quan tuyến tính (R)

≥ 0,999

▪ Độ đúng (Accuracy)

Độ đúng mô tả độ gần tới giá trị thực của đại lượng đo được Tiến hành bố trí thí nghiệm để xác định độ thu hồi đối với mẫu thêm chuẩn hoặc xác định độ chệch đối với mẫu chuẩn được chứng nhận Thực hiện thông qua đánh giá độ thu hồi (recovery) Chuẩn bị 03 loại mẫu tự tạo bằng cách thêm chính xác một lượng chất chuẩn vào các mẫu thử Lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với

3 mức nồng độ 80, 100 và 120% so với mức nồng độ định lượng trong quy trình và nằm trong khoảng tuyến tính Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít nhất

03 mẫu độc lập Độ đúng của phương pháp được xác định theo công thức:

Cm+c: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử thêm chuẩn (ppm) Cm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử (ppm)

Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (ppm) Yêu cầu: Độ đúng của phương pháp nằm trong khoảng 98,0% đến 102,0% và giá trị RSD ≤ 2,0%

▪ Giới hạn phát hiện (Detection of Limit - LOD), giới hạn định

lượng (Quantitation of Limit - LOQ)

Giới hạn phát hiện là lượng nhỏ nhất của chất phân tích có thể phát hiện được nhưng không nhất thiết có thể định lượng Có thể xác định bằng công thức sau:

𝑎

%100

c

m c

m

C

C C

R

Giới hạn định lượng là lượng nhỏ nhất của chất phân có thể định lượng được Giới hạn định lượng thường lớn hơn giới hạn phát hiện của phương pháp Giá trị LOQ của phương pháp được xác định theo công thức sau:

𝑎Trong đó:  là độ lệch chuẩn được tính dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu chuẩn

a là độ dốc của đường chuẩn

𝑋̅: giá trị của hàm lượng hợp chất chính

xi : giá trị của hàm lượng hợp chất chính của mẫu thứ i

n: số thí nghiệm để tính giá trị trung bình về hàm lượng của hợp chất chính

S: độ lệch chuẩn

RSD: độ lệch chuẩn tương đối

2.5 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH, NÂNG HÀM LƯỢNG, ĐỊNH LƯỢNG

VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG [6]-SHOGAOL TRONG CỦ GỪNG

2.5.1 Chiết tách [6]-shogaol từ củ gừng

Gừng khô Zingiber officinale (1 kg) được chiết trong EtOH 90% ở 60 ° C trong

3 giờ dưới hỗ trợ sóng siêu âm Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi là 1:5, cô quay thu hồi dung môi thu được cao EtOH thô (độ ẩm 17,3%) Cao thô được lắc phân

bố lỏng – lỏng hệ ether dầu hỏa – EtOAc (1:1) trong 30 phút, lặp lại 3 lần, cô quay thu hồi dung môi được cao ether dầu hỏa – EtOAc Từ cao chiết EtOAc,

tiến hành sắc kí cột hệ n-hexane - EtOAc (50:1) đến EtOAc 100% được các cao

phân đoạn Chọn phân đoạn chứa vết [6]-shogaol (kiểm tra bằng TLC) sắc kí cột hệ ether dầu hỏa - EtOAc (10:1) Hợp chất thu được tiến hành làm rõ cấu

các tài liệu tham khảo

Kiểm tra vết bằng phương pháp TLC: Sử dụng bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck), dung môi khai triển: ether dầu hỏa - EtOAc (1,5:1) Sau khi khai triển,

để khô bản mỏng ở nhiệt độ phòng Phun thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH Sấy bản mỏng ở 110 ℃ đến khi hiện vết, quan sát dưới ánh sáng thường

2.5.2 Định lượng [6]-shogaol bằng phương pháp HPLC

Chuẩn bị mẫu chuẩn: Chất chuẩn [6]-shogaol được cung cấp bởi

Sigma-Aldrich, số lô BCBZ1777, hàm lượng 90% Hòa tan 10 mg [6]-shogaol chuẩn trong 10 mL MeOH được dung dịch chuẩn 1000 ppm Từ chuẩn gốc pha loãng xuống các nồng độ 500 ppm, 200 ppm, 100 ppm, 10 ppm Từ dung dịch chuẩn

10 ppm, pha thành dãy nồng độ 1 ppm, 2 ppm, 5 ppm, 6 ppm, 8 ppm Các mẫu được lọc qua màng lọc 0,22 µm

Chuẩn bị mẫu thử: Hòa tan 1 mg cao gừng trong 100 mL MeOH bằng bình

định mức được nồng độ 10 ppm, đậy nắp, lắc đều Các mẫu được lọc qua màng 0,22 μm trước khi tiêm vào cột HPLC

Điều kiện phân tích: cột VDSpher PUR 100 C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm); tốc

độ dòng 1,0 mL/phút; thời gian 10 phút; thể tích bơm mẫu 20 µL, nhiệt độ cột

H3PO4 chế độ gradient như sau:

Thời gian (phút) % A (MeCN) %B (H 3 PO 4 0,1%)

- Cân bằng cột sắc kí bằng pha động trong 30 phút

- Sắc kí mẫu chuẩn 8,0 ppm, 6 lần liên tiếp

- Khảo sát thông số: Diện tích peak, số đĩa lý thuyết N, hệ số bất đối xứng T

▪ Độ đặc hiệu

Cách tiến hành: Chuẩn bị 3 mẫu dung dịch:

- Mẫu trắng: dung môi MeOH, lọc qua màng lọc 0,22 μm

- Tiến hành định lượng mẫu 6 lần với điều kiện sắc kí đã được tối ưu hóa Kết quả đánh giá dựa trên độ lệch chuẩn tương đối % RSD của nồng độ

▪ Giới hạn phát hiện – Giới hạn định lượng

LOD có thể được xác định dựa vào độ dốc của đường chuẩn và độ lệch chuẩn của tín hiệu đo, theo công thức sau:

a

SD LOD = 3 , 3 Trong đó:

- SD: Độ lệch chuẩn của tín hiệu

- a: độ dốc của đường chuẩn

Tính giá trị LOQ theo công thức sau: