BÁO cáo TIỂU LUẬN CÔNG NGHỆ GENE đề tài kỹ thuật gene nghiên cứu hệ vi sinh vật ở người

Một số vi khuẩn tồn tại ở cơ thể người và vị trí của chúng Hệ vi sinh vật ở người còn được xem như một cơ quan khác của cơ thể vì các sản phẩm chúng sản sinh, những phản ứng của chúng t

Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh

Trường Đại học Bách Khoa Khoa Kỹ thuật Hóa học

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-

BÁO CÁO TIỂU LUẬN CÔNG NGHỆ GENE

Đề tài: Kỹ thuật gene nghiên cứu hệ vi sinh vật ở người

GV hướng dẫn: Hoàng Anh Hoàng Nhóm: 6

Thái Đỗ Đăng Khoa 1711 Nguyễn Lê Nam Phương 1811163 Trần Phạm Thiên Phương 1811165 Huỳnh Thị Kim Trang 1811283

Lý Quang Phương 1813

Năm học: 2020 – 2021

MỤC LỤC

I Giới thiệu 4

I.1 Hệ vi sinh vật ở người 4

I.2 Lịch sử nghiên cứu về hệ vi sinh vật ở người 6

I.3 Tầm quan trọng của việc nghiên cứu về hệ vi sinh vật ở người 7

II Các kỹ thuật gene nghiên cứu hệ vi sinh vật ở người 7

II.1 Giải trình tự các gene chỉ thị (Marker gene survey) 8

II.2 Giải trình tự toàn bộ hệ gene (Whole genome sequencing) 9

II.3 Nghiên cứu đa hệ gene (Metagenomic) 11

II.4 Single-Cell Genomic 11

II.5 Metatranscriptomics 12

III Quy trình thực hiện 16

IV Tiềm năng, thách thức và định hướng trong tương lai 18

IV.1 Tiềm năng 18

IV.2 Thách thức 18

IV.3 Định hướng tương lai 19

DANH MỤC BẢNG BIỂU

I Giới thiệu

I.1 Hệ vi sinh vật ở người

Hệ vi sinh vật ở người là tập hợp các vi sinh vật bao gồm virus, sinh vật nhân sơ (vi khuẩn, vi khuẩn cổ) và sinh vật nhân chuẩn (nấm, động vật nguyên sinh, protis) được tìm thấy tại bất kì vị trí nào trên cơ thể con người (da, đường ruột, phổi,…) Một vài ước tính cho thấy hệ vi sinh vật ở người có thể có tổng cộng từ 900 – 1000 loài khác nhau, tạo nên một bộ sưu tập genome vi sinh vật vô cùng đa dạng Hệ vi sinh vật này khác biệt giữa mỗi cá nhân và thậm chí là giữa từng phần trên cơ thể mỗi người

Các vi sinh vật định cư ở nhiều vị trí khác nhau trên và trong cơ thể con người, nơi chúng thích nghi với các đặc điểm cụ thể của từng bộ phận Vi khuẩn kị khí chiếm ưu thế hơn trong đường tiêu hóa, trong khi vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối sống ở đường hô hấp, khoang mũi và bề mặt da Các sinh vật cư ngụ trong cơ thể con người thích nghi tốt với hệ thống miễn dịch, do sự tương tác sinh học của các sinh vật với hệ thống miễn dịch theo thời gian Thông thường trong cơ thể người khoẻ mạnh sẽ không có vi sinh vật tồn tại ở các bộ phận như máu, não, cơ, dịch tuỷ não mà chỉ thường xuất hiện tại các

vị trí như da, mắt (niêm mạc), mũi (đường hô hấp), khoang miệng, tai, đường tiết niệu,…

Hệ vi sinh vật của cơ thể người được chia làm 2 nhóm theo thời gian chúng tồn tại:

 Vi sinh vật cư ngụ luôn tồn tại trên cơ thể người

 Vi sinh vật tạm thời chỉ sống trong hoặc trên cơ thể người trong một khoảng thời gian (từ vài giờ đến vài tháng) sau đó chúng sẽ di chuyển đi hoặc chết Chúng không thể tồn tại lâu dài trong cơ thể người vì nhiều lý do, bao gồm:

 Sự cạnh tranh với các loại vi sinh vật khác

 Bị loại bỏ bởi các tế bào miễn dịch của cơ thể

 Những thay đổi hoá học hay cơ học trên cơ thể

Ống

tiêu

hóa

Miệng

Actinomyces naeslundii, Bifidobacterium dentium, Streptococcus salivarius, Streptococcus oralis, Streptococcus mutants, Staphylococcus epidermidis,…

Ruột

Bacteroides vulgatus, Eubacterium aerofaciens, Bacteroides uniformis, Fusobacterium prausnitzii, Bifidobacterium adolescentis, Ruminococcus bromii, Bacteroides stercoris, Bifidobacterium longum,…

Da

Actinobacteria (Corynebacterium sp., Propionibacterium sp., Micrococcus sp., Brevibacterium sp );

Firmicutes ( Staphylococcus sp., Streptococcus sp.);

Proteobacteria ( Acinetobacter sp., Methylobacterium sp )

Âm đạo

Lactobacilli, Actinomyces sp., Aerococcus sp.,

Anaerococcus sp., Arcanobacterium sp., Atopobium sp., Bacteroides sp., , Bifidobacterium sp., Blastococcus sp., Citrobacter sp., Enterobacter sp., Escherichia sp., Peptostreptococcus sp., Proteobacteria sp., Rhizobialis

sp., Salmonella sp., Shigella sp., Staphylococcus sp.,

Streptococcus sp …

Đường

hô hấp

Corynebacterium spp., Moraxella spp., Streptococcus spp

Vòm hầu

Moraxella spp., Staphylococcus spp., Corynebacterium

spp., Dolosigranulum spp., Haemophilus spp.,

Streptococcus spp.,

Prevotella spp., Leptotrichia spp

Tropheryma whipplei

Bảng 1 Một số vi khuẩn tồn tại ở cơ thể người và vị trí của chúng

Hệ vi sinh vật ở người còn được xem như một cơ quan khác của cơ thể vì các sản phẩm chúng sản sinh, những phản ứng của chúng tới môi trường và tương tác của chúng tới các bộ phận còn lại Các vi sinh vật tồn tại ở người có thể tác động đến vật chủ theo nhiều cách khác nhau Đa số chúng có lợi vì góp phần xây dựng nên những đặc trưng sinh lý của cơ thể Các vi sinh vật này cần thiết cho sự phát triển của cơ thể, liên quan đến hệ miễn dịch và dinh dưỡng ở người

Ví dụ một số chủng vi khuẩn lactic được tìm thấy ở đường ruột người có khả năng hấp thu chất dinh dưỡmg từ thức ăn để hỗ trợ quá trình phân giải chúng hoặc ngăn chặn sự xâm nhập của các hại khuẩn

Hệ vi sinh vật ở khoang miệng góp phần tạo khả năng miễn dịch thông qua việc kích thích sinh kháng thể ở mức thấp và phản ứng chéo với các mầm bệnh Ngoài ra chúng còn giúp chống lại các vi sinh không gây độc tố bằng cách sản sinh các acid béo ức chế, peroxide,…

Lactobacilli ở âm đạo phụ nữ sản sinh lactic acid và hydrogen peroxide cân bằng pH,

ức chế các vi khuẩn có hại xâm nhập, từ đó làm giảm nguy cơ viêm âm đạo

Tuy nhiên một số loài khác có khả năng gây hại cho cơ thể mà chúng có mặt Ví dụ như

Staphylococcus aureus (vi khuẩn tụ cầu vàng) gây nhiễm khuẩn huyết khi xâm nhập vào

máu qua các vết thưởng hở trên da Nhiễm khuẩn tụ cầu vàng là loại nhiễm khuẩn nặng,

có thể gây ra các ổ áp xe, viêm nội tâm mạc hay viêm tắc tĩnh mạch

Một số vi sinh vật ở khoang miệng như Treponema denticola gây phá hủy nướu và mô nâng đỡ dẫn tới bệnh viêm nha chu hay Streptococcus mutans có khả năng lên men

đường thành lactic acid làm tan men răng, gây sâu răng

Một số bệnh tự miễn như tiểu đường, viêm khớp dạng thấp, đa xơ cứng, loạn dưỡng cơ,… có liên quan tới sự rối loạn chức năng của hệ vi sinh vật Các vi sinh vật gây bệnh

sẽ tích tụ theo thời gian, thay đổi các hoạt động của gene và các hoạt động trao đổi chất, dẫn đến các phản ứng miễn dịch bất thường đối với các chất và mô bình thường trong

cơ thể

I.2 Lịch sử nghiên cứu về hệ vi sinh vật ở người

Ngay từ những năm 1680, Antonie van Leewenhoek đã so sánh và ghi chép lại những khác biệt giữa hệ vi sinh vật trong khoang miệng và trong phân của mình, cũng như từ những cá nhân khỏe mạnh và mắc bệnh Có thể xem đây chính là khởi điểm cho những nghiên cứu về sự đa dạng của hệ vi sinh vật của người Vào những năm 1880, bác sĩ nhi khoa người Áo – Theodor Escherich quan sát thấy một loại vi khuẩn (sau này xác định

là Escherichia coli) trong hệ vi khuẩn đường ruột của trẻ em khỏe mạnh và cả các trẻ

em mắc bệnh tiêu chảy Trong những năm tiếp theo, các nhà khoa học đã mô tả số lượng

các vi sinh vật phân lập được từ cơ thể người, bao gồm 1898 loài Veillonella parvula

(một vi khuẩn có mặt trong khoang miệng, hệ tiêu hóa, đường tiết niệu và đường hô hấp trên), và 1900 loài Bifidobacteria Trong suốt thế kì XX, một số vi sinh vật khác đã được phân lập từ đường mũi, khoang miệng, da, đường tiêu hóa và đường niệu sinh dục Mặc

dù nhóm những vi sinh vật này, kể từ lần đầu tiên được phát hiện, đã được định nghĩa theo nhiều cách khác nhau, nhưng khái niệm về hệ vi sinh vật ở người và những nghiên cứu chuyên sâu về nó chỉ bắt đầu được hình thành và phát triển từ những thập kỉ đầu tiên của thế kỉ XXI Những hiểu biết về hệ vi sinh vật ở người được mở rộng đáng kể từ sau năm 2007, khi dự án Human Microbiome Project (HMP) – một dự án nhằm mô tả các đặc điểm của cộng đồng vi sinh vật được tìm thấy trên người và xác định vai trò của từng loài đối với sức khỏe và các căn bệnh ở người – được khởi động

I.3 Tầm quan trọng của việc nghiên cứu về hệ vi sinh vật ở người

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng sự mất cân bằng hệ vi sinh vật trong cơ thể làm tăng sự nhạy cảm của vật chủ đối với nhiễm trùng, và bản chất của chúng phụ thuộc vào vị trí liên quan Sự đa dạng độc đáo của hệ vi sinh vật ở người giải thích cho các hoạt động trao đổi chất và chức năng cụ thể của các vi sinh vật này trong từng vị trí cơ thể Người

ta nhận ra rằng hệ vi sinh vật ở người có thể gây ảnh hưởng đến tâm trí và sức khỏe của

cơ thể, góp phần tăng cường hoặc suy giảm các chức năng trao đổi chất và miễn dịch,

có thể trở thành một phần nguyên nhân gây ra nhiều căn bệnh bao gồm ung thư, bệnh chuyển hóa tim mạch, dị ứng và béo phì Nguyên nhân gây ra các căn bệnh trên cho đến nay chỉ mới được hiểu một phần Tuy nhiên, các chất dinh dưỡng, chất chuyển hóa và

vi sinh vật ngày càng được xem là những nhân tố ảnh hưởng chính, ngay cả khi cơ chế gây bệnh hoàn chỉnh vẫn chưa rõ ràng Do đó, điều quan trọng là phải hiểu rõ về vi sinh vật và các hoạt động của chúng ở người vì sự ảnh hưởng của chúng đến sức khỏe cũng

Những nghiên cứu về hệ vi sinh vật ở người và genome của chúng được kì vọng sẽ tiếp tục làm sáng tỏ được các khía cạnh cơ bản của sinh lý con người, đặc biệt là về dinh dưỡng Những hiểu biết sâu sắc về nhu cầu dinh dưỡng sẽ làm thay đổi các khuyến nghị

về chế độ ăn uống cũng như những yêu cầu trong sản xuất thực phẩm, từ đó góp phần nâng cao chất lượng bữa ăn và sức khỏe của mỗi người Ngoài ra, những thông tin càng chi tiết về các vi sinh vật tồn tại trong cơ thể người sẽ giúp phát triển các kĩ thuật chẩn đoán và các liệu pháp điều trị mới cho nhiều căn bệnh khác nhau, cũng như thúc đẩy sự tiến bộ của các ngành sản xuất dựa trên các sản phẩm thu nhận từ những vi sinh vật này

II Các kỹ thuật gene nghiên cứu hệ vi sinh vật ở người

Mặc dù số lượng nghiên cứu về hệ vi sinh vật ở người và bộ gene của chúng ngày càng bùng nổ, đây dường như vẫn là một bí ẩn của cơ thể người Đôi khi chúng được xem như bộ gene thứ hai của người, với số lượng áp đảo bộ gene người khoảng từ 100-200 lần (riêng đường ruột đã có hơn 3 triệu gene vi khuẩn) Sự phức tạp của cộng đồng vi sinh vật ở người khiến cho việc nghiên cứu chúng trở nên đầy khó khăn và thách thức Trong hơn 100 năm, các nhà vi sinh vật học đã sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền thống trong phòng thí nghiệm để phân lập các khuẩn lạc và nghiên cứu các dòng này Nhờ những nỗ lực to lớn đó, chỉ tính riêng đường tiêu hóa người đã có khoảng hơn 100 loài vi khuẩn khác nhau đã được nuôi cấy thành công (McPherson, 2014), và toàn bộ các đặc điểm của chúng cũng như những khám phá và chức năng của gene đã trở thành nền tảng cho các kĩ thuật sinh học phân tử hiện đại sau này Cách tiếp cận này cũng cho phép con người khai thác các tiềm năng của vi sinh vật cho nhiều mục đích điều trị nếu các vi sinh vật được nuôi cấy cho thấy các đặc tính có lợi

Tuy nhiên, có thể có tới hàng trăm loài khác nhau, và việc liệt kê sự hiện diện của chúng bằng các kĩ thuật vi sinh truyền thống như trên là bất khả thi vì nhiều lý do hạn chế khả năng nuôi cấy chúng trong phòng thí nghiệm Có nhiều vi sinh vật chưa từng được phân lập hay nuôi cấy trước đây, khiến việc nuôi cấy trở nên thách thức vì chúng có thể cần tới những môi trường cũng như các điều kiện đặc biệt để phát triển

Để việc nghiên cứu hệ vi sinh vật ở người trở nên dễ dàng hơn, việc phân tích bộ gene

vi sinh vật và các đặc tính của chúng được thực hiện với các hướng tiếp cận mới (có hoặc không phụ thuộc vào nuôi cấy) thông qua việc giải trình tự các đoạn gene với sự trợ giúp của kĩ thuật giải trình tự Sanger hay các kĩ thuật giải trình tự thế hệ tiếp theo (next generation sequencing – NGS)

II.1 Giải trình tự các gene chỉ thị (Marker gene survey)

Một trong số các hướng tiếp cận thường được sử dụng nhất là giải trình tự gene chỉ thị, với gene chỉ thị được sử dụng phổ biến nhất là các gene SSU rRNA (small subunit ribosomal RNA): 16S rRNA ở các vi khuẩn và vi khuẩn cổ, 18S rRNA ở các sinh vật nhân chuẩn

Mỗi tế bào vi khuẩn chứa khoảng từ 5-10 copy của 16S rRNA, mỗi gene gồm khoảng 1500bp chứa các vùng bảo tồn và vùng biến đổi xen kẽ Vùng bảo tồn giống nhau ở tất

cả các vi khuẩn, trong khi vùng biến đổi có các mức độ khác biệt khác nhau theo từng

vi khuẩn khác nhau, theo đặc trưng của từng chi hoặc từng loài Chính các đặc điểm này

đã khiến cho 16S rRNA trở thành một gene chỉ thị hiệu quả cho việc định danh vi khuẩn

ở mức độ lâm sàng và giải trình tự 18S rRNA cũng có các tính chất tương tự

Hình 1 Cấu trúc gene 16S rRNA

Nguyên tắc của việc giải trình tự gene chỉ thị là các đoạn gene SSU rRNA trong DNA

từ mẫu mô ờ người người sẽ được khuếch đại bằng phản ứng PCR, với mục tiêu là tạo

ra một hỗn hợp các amplicon có nguồn gốc từ nhiều loài vi khuẩn có mặt trong mẫu ban đầu nhất có thể Sau đó chúng sẽ được giải trình tự đồng loạt Kết quả thu được thường được phân loại thành các đơn vị phân loài (Operational Taxonomic Units – OTUs) dựa trên các đoạn trình tự giống nhau

Ban đầu, người ta sử dụng những cặp mồi đặc hiệu cho các vùng siêu bảo tồn trên gene trong quá trình PCR và phương pháp Sanger được dùng để giải trình tự toàn bộ đoạn gene 16S rRNA Tuy nhiên phương pháp này rất dễ gây ra sai sót khi gene 16S rRNA tương đối dài và yêu cầu từ 2-3 lần đọc để giải được toàn bộ trình tự Do đó các đoạn cũng phải có độ tương đồng từ 98.7-99% để được phân loại vào các OTUs theo cấp loài (Stackbrandt & Ebers, 2011) Đồng thời phương pháp giải trình tự Sanger cũng vấp phải các giới hạn trong việc lấy mẫu do chi phí và công sức cần để thực hiện

Sự ra đời của các kĩ thuật NGS cho phép việc giải trình tự một lần nhiều đoạn gene, tuy nhiên độ dài của mỗi đoạn lại bị giới hạn Vì vậy, người ta chuyển hướng tập trung vào giải trình tự các vùng siêu biến thay vì toàn bộ đoạn gene Yêu cầu về độ tương đồng của các đoạn cũng giảm xuống còn khoảng 97% để được phân loại vào OTUs Nhưng một nghiên cứu mới đây (Jinuk Jeong et al., 2021) chỉ ra rằng việc giải trình tự những đoạn ngắn cho ra kết quả kém chính xác hơn giải trình tự toàn bộ đoạn gene 16S rRNA Bên cạnh các gene SSU rRNA, giải trình tự gene chỉ thị còn có thể áp dụng cho một số gene chức năng ít phổ biến hơn ở hệ vi sinh vật (Walket et al., 2014) Nguyên tắc thực hiện cũng tương tự, với cặp mồi PCR đặc hiệu cho các vùng bảo tổn có mặt trên đoạn gene chức năng đó Phương thức này đã được sử dụng để định danh các nhóm vi khuẩn sản xuất butyrate/propionate mới, thu nhận từ đại tràng người (Louis et al., 2010; Reichardt et al., 2014; Brulc et al., 2011)

II.2 Giải trình tự toàn bộ hệ gene (Whole genome sequencing)

Giải trình tự toàn bộ hệ gene được sử dụng để mô tả toàn bộ genome của vi sinh vật, kết hợp với việc giải trình tự gene chỉ thị, cho phép thu thập thêm nhiều thông tin chi tiết hơn về vi sinh vật có mặt trong mẫu ban đầu (thông tin di truyền, chức năng,…), đồng thời giải quyết được những khó khăn gặp phải khi các vi sinh vật có gene SSU rRNA

tương tự nhau Ví dụ cả hai dòng Escherichia coli là O15:H7 và K-12 đều có trình tự gene 16S rRNA của E coli nhưng lại khác nhau ở hàng trăm gene khác

Để giải trình tự toàn bộ hệ gene, người ta áp dụng phương pháp giải trình tự shotgun Genome của vi sinh vật (có kích thước lớn) sẽ được cắt ngẫu nhiên thành các đoạn DNA

có kích thước nhỏ hơn để giải trình tự riêng rẽ và sau đó được lắp ráp lại thành các contigs thông qua việc tìm ra các đoạn chồng chéo lên nhau dựa trên các dữ liệu genome

có sẵn (nếu có) hoặc sắp xếp mới hoàn toàn Phương pháp này yêu cầu phải có một lượng lớn DNA, vì vậy thường phải nuôi cấy các tế bào trước khi tách chiết gene

Haemophilus influenzae là vi khuẩn đầu tiên có bộ genome được giải trình tự hoàn toàn

(Fleischmann et al., 1995) Trước đây việc giải trình tự này được thực hiện bằng phương pháp Sanger truyền thống Nhưng để hoàn thành một bộ genome vi khuẩn như vậy cần đầu tư đến hàng trăm nghìn dollar với thời gian làm việc kéo dài nhiều năm liền Sự phát triển của các kĩ thuật giải trình tự hiện đại đã khiến công việc này trở nên nhanh chóng hơn với chi phí rẻ hơn hàng nghìn lần Hiện nay, kĩ thuật giải trình tự đa kênh (multiplex sequencing) của Illumina cho phép giải trình tự nhiều đoạn DNA khác nhau trong cùng một lần thông qua việc gắn các barcode đặc trưng cho từng đoạn, nhờ vậy mà các mẫu

có thể được trộn lại với nhau, tăng số lượng mẫu trong một lần chạy mà không làm tăng đáng kể chi phí hay thời gian thực hiện

Hình 2 Nguyên tắc của phương pháp giải trình tự shotgun

Dự án MetaHIT đã sử dụng phương pháp giải trình tự shotgun và các dữ liệu genome sẵn có để phân loại các vi sinh vật vào từng enterotype (một phương thức phân loại các sinh vật sống dựa trên thành phần vi khuẩn trong hệ vi sinh vật đường ruột của chúng) Kết quả thu nhận được gợi ý rằng hệ vi sinh vật ở mỗi người sẽ tồn tại ở các trạng thái khác nhau Tuy nhiên mối liên hệ của việc này với các điều kiện môi trường, tình trạng sức khỏe hay thông tin di truyền vẫn chưa được làm rõ