Bài giảng Đột biến gen Beta-globin ở bệnh nhi Beta-thalassemia miền bắc Việt Nam

Bài giảng Đột biến gen Beta-globin ở bệnh nhi Beta-thalassemia miền bắc Việt Nam trình bày về nghiên cứu tiến cứu, mô tả, phân tích, cắt ngang, bằng các kỹ thuật lâm sàng và xét nghiệm; phát hiện đột biến gen tại Khoa Sinh học phân tử, bệnh nhi Beta-thalassemia.

ĐỘT BIẾN GEN BETA-GLOBIN

Ở BỆNH NHI BETA-THALASSEMIA

MIỀN BẮC VIỆT NAM

Nguyễn Hoàng Nam, Dương Bá Trực

Bệnh viện Nhi trung ương

HNNKTQ TpHCM 30/11-1/12-18

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

2

• Beta-thalassemia là bệnh di truyền phổ biến ở Việt Nam,

do giảm hay không tổng hợp được mạch beta globin của

Hb, do đột biến gen beta-globin.

• Nghiên cứu về đột biến gen globin gây

beta-thalassemia giúp ích cho việc tư vấn di truyền, chẩn đoán trước sinh

• Mục tiêu nghiên cứu:

“ Nghiên cứu một số đặc điểm đột biến gen beta-globin ở bệnh nhân beta-thalassemia phía bắc Việt Nam ”

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

Đối tượng nghiên cứu

• 104 bệnh nhân đủ tiêu chuẩn chẩn đoán : 55 là

beta-thalassemia,

49 là beta-thalassemia / HbE vào Bệnh viện Nhi trung ương

• Tuổi - Dưới 5 tuổi : 89 (85,6%), trong đó < 1 tuổi 50 (44,4%)

- Từ 5-10 tuổi : 12 (11,5%)

- Từ 10-15 tuổi : 3 ( 2,9%)

• Giới : Nam / Nữ : 59/45 (1,3/1)

• Dân tộc - Kinh : 71 (68,3%), - Ít người gồm Thái, Tày,

Mường, Nùng, Sán Dìu, Dao, Bố Y : 33 (31,7%)

• Địa phương : Hà Nội và 28 tỉnh thành miền bắc. 3

Phương pháp nghiên cứu

4

• Nghiên cứu tiến cứu, mô tả, phân tích, cắt ngang bằng các kỹ thuật

lâm sàng và xét nghiệm, tại BVNTƯ

• Phát hiện đột biến gen tại Khoa Sinh học phân tử, BVNTƯ :

- Tách DNA từ máu ngoại biên với bộ kít QIA gen DNA của Đức.

- Sử dụng kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR phát hiện 9 đột biến điểm thường gặp ở Châu Á là CD41/42, CD17, IVS1-1, -28,

IVS2-654, CD71/72, IVS1-5, CD95, CD26 (HbE).

- Giải trình tự gen khi không thấy đột biến với Multiplex ARMS-PCR

- Sử dụng kỹ thuật GAP-PCR để phát hiện đột biến xóa đoạn nếu cần

Sơ đồ quy trình phát hiện đột biến gen β-globin

Bệnh nhân β-thalassemia Thu thập mẫu máu và tách DNA

Phát hiện đột biến gen bằng Multiplex PCR

và ARMS-PCR

Có đột biến gen Không thấy đột biến gen

Xác định kiểu gen đột biến:

Dị hợp tử, đồng hợp tử

Giải trình tự gen

Có đột biến gen Phát hiện đột biến

xóa đoạn bằng GAP- PCR

Một số đột biến gen -globin phát hiện bằng kỹ thuật ARMS

1 2 3 4 5 6 7 8

Panel 1: 1-6 1: Dị hợp tử -28 2: Dị hợp tử kép -28/71-72 3: Dị hợp tử Codon 17 4: Dị hợp tử Codon 43 5: Thang DNA 100 bp 6: Mẫu nội kiểm không DNA

Panel 2: 7-8 7: Di hợp tử IVS 2-654 8: Mẫu nội kiểm không DNA

Phân tích đột biến gen theo chức năng và vị trí

ĐỘT BIẾN SAO MÃ (Kiểu hình β + - thalassemia)

- Vùng khởi động (promotor)

- Vị trị 5’UTR (5’ - Vùng không phiên mã)

ĐỘT BIẾN HOÀN THIỆN RNA (Kiểu hình β + hay β 0 -thalassemia)

- Vị trí nối (splice junction)

- Vị trí nối đòng thuận (consensus splice site)

- Exon

- Intron

- Vị trí 3’UTR.

ĐỘT BIẾN DỊCH MÃ RNA (Kiểu hình β 0 -thalassemia)

- Codon khởi đầu (Initiation Codon)

- Codon vô nghĩa (Nonsense Codon)

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

ĐỘT BIẾN GEN β-GLOBIN GÂY BETA-THALASSEMIA

Đã phát hiện 208 alen đột biến gen ở 104 bệnh nhân β-thalasemia

Đột biến gen β – globin ở

β – thalassemia Kiểu hình Số alen đột biến Tỷ lệ %

Các đột biến gen β -globin phát hiện ở 104 bệnh nhân

Đột biến gen

Khác(Mường, Nùng, Sán Dìu, Dao, Bổ

Tần số các đột biến gen beta-globin ở β-thalassemia tại Việt Nam

Đột biến

Miền Bắc

(Nghiên cứu này)

Miền Bắc 2.000 [Filon, Trực, cs.]

Miền Trung 2013

[Triết LPM.]

Miền Nam 2002

[Saovaros,

và cs.]

Miền Nam 1988

[Hảo LT và cs.]

-13,8%

- - - -

-+ + + - - - + - - - - -

35,7%

25%

7,3%

-7,3%

7,3 - - 6,0%

- - - 11,8%

-43.5% 13.0% - 8.7% 13.0% - - - 4.4% - - - - 17.4%

Phân bố đột biến gen β– thalassemia phổ biến ở Châu Á

*Việt Nam [Nghiên cứu này] *Các nước khác [Southat F.2011] Nhận xét: Các đột biến phổ biến ở Việt Nam khá giống với Trung Quốc,Thái Lan: giống một phần với Myanma, Indonesia,

Malaysia.

Tần xuất đột biến Beta Thalassemia phổ biến ở các

nước châu âu và địa trung hải

Pháp

CD39 C – T 41,90%

Italia

CD39 C – T 41,00% IVS 1-110 G – A 25,70% IVS 1-110 G – A 23,50% IVS 1-1 G – A 10,50% IVS 1-6 T – C 10,10% IVS 1-6 T – C 8,60% IVS 1-1 G – A 10,10%

Tây Ban Nha

CD39 C – T 50,00%

Hy Lạp

IVS 1-110 G – A 43,10% IVS 1-110 G – A 16,50% CD39 C – T 20,90% IVS 1-6 T – G 12,60% IVS 1-1 G – A 13,50% IVS 1-1 G – A 11,50% IVS 1-6 T – C 8,60%

Bồ Đào Nha

CD39 C – T 37,30%

Cyprus

IVS 1-110 G – A 78,40% IVS 1-1 G – A 21,00% IVS 1-6 T – C 6,40%

Exon 1 (30%) Exon 2(59,6%) Intron 1 (1,9%) Intron 2 (2,9%) Vùng khởi động (4,3%) Đột biến khác (1,4%)

Phân bố đột biến gen β -globin theo vị trí

Chức năng gen Số lượng Tỷ lệ % ĐỘT BIẾN SAO MÃ (Kiểu hình β + thalassemia) 9 4,3

- Yếu tố điều hòa khởi động

ĐỘT BIẾN DỊCH MÃ RNA (Kiểu hình β 0

thalassemia) 186 89,4

- Codon vô nghĩa CD17 (AAG – TAG)

CD26 (GAG – AAG) CD95 (TAC – TAA)

Phân bố đột biến theo kiểu gen

Kiểu

gen

Kiểu phối hợp đột biến

Số bệnh nhân

40

17

9 8

38,46

8,7 7,7

Dị hợp tử kép CD41/42 - CD17 CD17 - CD71/72 CD41/42 - CD71/72 CD41/42 - CD95 CD41/42 - IVS1.5

23

15 3 3 1 1

14,4 2,9 2,9 0,96 0,96

Phân bố đột biến theo kiểu gen (tiếp)

Kiểu

gen

Kiểu phối hợp đột biến

Số bệnh nhân

Tỷ lệ

%

β0β+ Đị hợp tử kép

-28 - CD17 -28 - CD41/42 -88-CD41/42 CD17 - IVS2.654 CD41/42 - IVS2.654 CD71/72 - IVS2.654 IVS1.1 - IVS2.654 -140 - CD17 CD17- c441.c442 ins A

14

3

2

2 2 1 1 1 1

1

13,46

2,9 1,9 1,9 1,9

0,96 0,96 0,96 0,96 0,96

‘

Phân bố đột biến theo kiểu gen (tiếp)

Kiểu

gen

Kiểu phối hợp đột biến

Số bệnh nhân

Tỷ lệ

%

β0βE Dị hợp tử phối hợp HbE

CD17 -CD26 CD41/42 - CD26 CD71/72 - CD26 IVS1.1 - CD26 IVS1.5 - CD26 CD95 - CD26

47

21 20 3 1 1 1

45,20

21,2 19,2 2,9 0,96 0,96 0,96

β+βE Dị hợp tử phốihợp HbE

-28 - CD26 -88 - CD26

2

1 1

1,92

0,96 0,96

• Không khác biệt nhiều về đột biến giữa các dân tộc, chỉ thấy CD26 gặp

nhiều ở người Thái hơn Kinh và Tày CD41/42 gặp nhiều ở Tày hơn Kinh

19

Các đột biến gen beta-globin đã phát hiện :

Đặc điểm đột biến gen beta-globin ở Việt Nam :

• Đột biến ở quá trình dịch mã RNA (80,4%) nhiều hơn hoàn thiện RNA

và sao mã; nhiều ở exon (89,6%), ít hơn ở intron và vùng khởi động.

• Đa số đột biến có kiểu hình β 0 (68%), β E (23,5%), đột biến β + ít

• Đã phát hiện 25 kiểu phối hợp đột biến, 5 kiểu phối hợp phổ biến :

CD17-CD26, CD41/42-CD26, CD41/42-CD17, CD41/42-CD41/42, CD17-CD17 Kiểu gen β 0 β E phổ biến nhất (45,3%), tiếp theo β 0 β 0

(38,4%), β 0 β + (13,4%), β + β E (1,92%), cuối cùng là β + β + (0,96%).

Từ đó có thể kết luận :

Phần lớn β-thalassemia ở Việt Nam là β0-thalassemia

20

Trân trọng cảm ơn