Nghiên cứu tuyển chọn và thử nghiệm các chủng nấm isaria phòng trừ sâu tơ hại rau họ hoa thập tự trong điều kiện phòng thí nghiệm

Ảnh hưởng của nồng độ bào tử đối với hiệu lực phòng trừ sâu tơ của chủng nấm Isaria javanica VN1487 .... Ảnh hưởng của nồng độ bào tử đối với hiệu lực phòng trừ sâu tơ của chủng nấm Isar

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

- -

NGUYỄN THỊ TÖ

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN NẤM KÝ SINH

CÔN TRÙNG Isaria CÓ KHẢ NĂNG PHÕNG TRỪ SÂU TƠ (Plutella xylostella L.) HẠI RAU HỌ HOA THẬP TỰ

TRONG ĐIỀU KIỆN PHÕNG THÍ NGHIỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KĨ SƯ NGÀNH NÔNG HỌC

NGHỆ AN - 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

- -

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN NẤM KÝ SINH

CÔN TRÙNG Isaria CÓ KHẢ NĂNG PHÕNG TRỪ SÂU TƠ (Plutella xylostella L.) HẠI RAU HỌ HOA THẬP TỰ

TRONG ĐIỀU KIỆN PHÕNG THÍ NGHIỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KĨ SƯ NGÀNH NÔNG HỌC

Người thực hiện : Nguyễn Thị Tú Lớp : 53K - Nông học Người hướng dẫn : Ths Thái Thị Ngọc Lam

NGHỆ AN - 2016

i

LỜI CAM ĐOAN

Đề tài tốt nghiệp là sản phẩm của quá trình lao động khoa học không mệt mỏi

của chúng tôi Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu tuyển chọn và thử nghiệm các

chủng nấm Isaria phòng trừ sâu tơ hại rau họ hoa thập tự trong điều kiện phòng thí

nghiệm” là công trình do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của ThS Thái Thị Ngọc

Lam Những kết quả đạt được đảm bảo tính chính xác và trung thực về khoa học

Nếu sai tôi xin chịu trách nhiệm trước Tổ bộ môn, Khoa và Nhà trường

Nghệ An, tháng 4 năm 2016

Tác giả

Nguyễn Thị Tú

ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, ngoài sự nỗ lực của bản thân tôi còn nhận được

sự giúp đỡ, động viên, khích lệ của thầy cô, người thân, bạn bè trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô giáo, cán bộ Khoa Nông Lâm Ngư, Trường Đại học Vinh đã giảng dạy và hướng dẫn tôi hoàn thành chương trình học tập và nghiên cứu thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Thái Thị Ngọc Lam là người dẫn dắt, định hướng cho tôi những từ những bước đầu làm nghiên cứu khoa học, tận tâm và nhiệt tình hướng dẫngóp ý, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới cán bộ kĩ thuật viên phòng thí nghiệm đã hướng dẫn, giúp đỡ về chuyên môn và tạo điều kiện về cơ sở vật chất cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Và tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành những người thân trong gia đình, bạn

bè đã luôn động viên, khích lệ tôi trong suốt những năm tháng học tập rèn luyện tại Trường cũng như thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Nghệ An, tháng 5 năm 2016

Tác giả

Nguyễn Thị Tú

iv

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

1 Tầm quan trọng của việc nghiên cứu đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Phạm vi nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cơ sở khoa học 3

1.1.1 Khái niệm nấm ký sinh côn trùng 3

1.1.2 Chu trình sống và lây nhiễm của nấm ký sinh côn trùng 3

1.3 Tình hình nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng trên thế giới 7

1.3.1 Nghiên cứu về nhân nuôi các loài Isaria 7

1.3.3 Nghiên cứu sử dụng các loài Isaria trong phòng trừ sinh học 8

1.4 Tình hình nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng ở Việt Nam 10

1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước của sâu tơ (Plutella xylostella L.) 12

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nội dung nghiên cứu 15

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 15

2.3 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 15

2.4 Phương pháp nghiên cứu 15

2.4.1 phương pháp nhân nuôi nấm và vật chủ sâu tơ sạch 15

2.4.1.1 Phương pháp phân lập và nhân nuôi nấm trên môi trường PDA 15

2.4.1.2 Phương pháp đếm nồng độ bào tử 17

2.4.1.3 Phương pháp nhân nuôi vật chủ sâu tơ sạch 18

2.4.2 Phương pháp tuyển chọn các chủng nấm Isaria (Isaria javanica; Isaria tenuipes; Isaria sp.) có khả năng phòng trừ sâu tơ trong điều kiện phòng thí nghiệm 18 2.4.3 Phương pháp tuyển chọn các chủng nấm Isaria javanica (VN1487, VN1802, VN1472) có khả năng phòng trừ sâu tơ trong điều kiện phòng thí nghiệm 19

2.4.4 Phương pháp theo dõi chu trình xâm nhiễm của các chủng nấm Isaria tenuipes; Isaria sp và Isaria javanica đối với sâu tơ 19

2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 19

v

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 21

3.1 Tuyển chọn các chủng nấm Isaria (Isaria javanica; Isaria tenuipes; Isaria sp.) có

khả năng phòng trừ sâu tơ 21

3.1.1 Đánh giá khả năng phòng trừ của chủng nấm Isaria javanica VN1487 đối với

sâu tơ 21 3.1.1.1 Ảnh hưởng của liều lượng phun đối với hiệu lực phòng trừ sâu tơ của chủng

nấm Isaria javanica VN1487 21

3.1.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ bào tử đối với hiệu lực phòng trừ sâu tơ của chủng

nấm Isaria javanica VN1487 22 3.1.2 Đánh giá khả năng phòng trừ của chủng nấm Isaria tenuipes B2015-5 đối với

sâu tơ 24 3.1.2.1 Ảnh hưởng của liều lượng phun đối với hiệu lực phòng trừ sâu tơ của chủng

3.2.1 Khả năng phòng trừ sâu tơ của chủng nấm Isaria javanica VN1802 30

3.2.1.1 Ảnh hưởng của liều lượng phun đối với hiệu lực phòng trừ sâu tơ của chủng nấm Isaria javanica VN1802 30 3.2.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ bào tử đối với hiệu lực phòng trừ sâu tơ của chủng nấm Isaria javanica VN1802 32

3.2.2 Khả năng phòng trừ sâu tơ của chủng nấm Isaria javanica VN1472 33

3.2.2.1 Ảnh hưởng của liều lượng phun đối với hiệu lực phòng trừ sâu tơ của chủng nấm Isaria javanica VN1472 33

vi

3.2.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ bào tử đối với hiệu lực phòng trừ sâu tơ của chủng

nấm Isaria javanica VN1472 35

3.3 Chu trình xâm nhiễm của các chủng nấm Isaria (Isaria javanica; Isaria tenuipes; Isaria sp.) trên sâu tơ 36

3.3.1 Chu trình xâm nhiễm của chủng nấm Isaria javanica VN1487 trên sâu tơ 36

3.3.2 Chu trình xâm nhiễm của chủng nấm Isaria tenuipes trên sâu tơ 38

3.3.3 Chu trình xâm nhiễm của chủng nấm Isaria sp trên sâu tơ 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

1 Kết luận 43

2 Kiến nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC 1: MỘT SỐ HÌNH ẢNH 49

vii

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Hiệu lực phòng trừ của chủng nấm I Javanica VN1487 đối với sâu tơ ở các

liều lƣợng khác nhau 21

Bảng 3.2 Hiệu lực phòng trừ chủng nấm I Javanica VN1487 đối với sâu tơ ở các nồng độ khác nhau 23

Bảng 3.3 Hiệu lực phòng trừ của chủng nấm I tenuipes B 2015-5đối với sâu tơ ở các liều lƣợng khác nhau 25

Bảng 3.4 Hiệu lực phòng trừ của chủng nấm I Tenuipes B 2015-5 đối với sâu tơ ở các nồng độ khác nhau 26

Bảng 3.5 Hiệu lực phòng trừ của chủng nấm I tenuipes B2015-18 đối với sâu tơ ở các liều lƣợng khác nhau 27

Bảng 3.6 Hiệu lực phòng trừ của chủng nấm I.sp B 2015- 18 đối với sâu tơ ở các nồng độ khác nhau 29

Bảng 3.9 Hiệu lực phòng trừ của chủng nấm I Javanica VN1802 đối với sâu tơ ở các liều lƣợng khác nhau 30

Bảng 3.10 Hiệu lực phòng trừ của chủng phẩm nấm I Javanica VN1802 đối với sâu tơ ở các nồng độ khác nhau 32

Bảng 3.11 Hiệu lực phòng trừ của chủng nấm I javanica VN1472 đối với sâu tơ ở các liều lƣợng khác nhau 33

Bảng 3.12 Hiệu lực phòng trừ của chủng nấm I javanica VN1472 đối với sâu tơ ở các nồng độ khác nhau 35

Bảng 3.15 Chu trình xâm nhiễm của loài Isaria javanica trên sâu tơ (ngày) 37

Bảng 3.16 Chu trình xâm nhiễm của loài Isaria tenuipes trên sâu tơ (ngày) 39

Bảng 3.17 Chu trình xâm nhiễm của loài Isaria sp trên sâu tơ (ngày) 41

viii

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Chu trình xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng 4

Hình 3.1 Hiệu lực phòng trừ của chủng nấm I Javanica VN1487 đối với sâu tơ ở các liều lƣợng khác nhau 21

Hình 3.2 Hiệu lực phòng trừ của chủng nấm I Javanica VN1487 đối với sâu tơ ở các nồng độ khác nhau 23

Hình 3.3 Hiệu lực phòng trừ của chủng nấm I Tenuipes B 2015-5 đối với sâu tơ ở các liều lƣợng khác nhau 25

Hình 3.4 Hiệu lực phòng trừ của chủng nấm I Tenuipes B 2015-5 đối với sâu tơ ở các nồng độ khác nhau 26

28

Hình 3.5 Hiệu lực phòng trừ của chủng nấm I tenuipes B2015-18 đối với sâu tơ ở các liều lƣợng khác nhau 28

Hình 3.6 Hiệu lực phòng trừ của chủng nấm I.sp B 2015- 18 đối với sâu tơ ở các nồng độ khác nhau 29

Hình 3.9.Hiệu lực phòng trừ của chủng nấm I Javanica VN1802 đối với sâu tơ ở các liều lƣợng khác nhau 31

Hình 3.10.Hiệu lực phòng trừ của chủng nấm I Javanica VN1802 đối với sâu tơ ở các nồng độ khác nhau 32

Hình 3.11 Hiệu lực phòng trừ của chủng nấm I.javanica VN1472 đối với sâu tơ ở các liều lƣợng khác nhau 34

Hình 3.12.Hiệu lực phòng trừ của chủng nấm I Javanica VN1472 đối với sâu tơ ở các nồng độ khác nhau 35

Hình 3.15 Vòng đời phát triển của chủng nấm Isaria javanica trên sâu tơ 38

Hình 3.16 Vòng đời phát triển của chủng nấm Isaria tenuipes trên sâu tơ 40

Hình 3.15 Vòng đời phát triển của chủng nấm Isaria sp trên sâu tơ (ngày) 42

1

MỞ ĐẦU

1 Tầm quan trọng của việc nghiên cứu đề tài

Raulà thực phẩm quan trọng không thể thiếu đổi với bữa ăn hàng ngày, nó còn

là thực phẩm cung cấp nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể con người như là protein, axit hữu cơ, vitamin và các chất khoáng, bên cạnh đó rau còn là nguồn thức ăn phục vụ cho chăn nuôi và góp phần tăng thu nhập cho người lao động, giải quyết việc làm cho người nông dân

Trong số các loại rau trồng ở Việt Nam thì hơn 50% sản lượng là rau thuộc họ hoa thập tự Rau họ hoa thập tự bao gồm: rau cải, xà lách, xúp lơ, bắp cải, củ cải.Với

sự phong phú về chủng loại, đa dạng về sinh thái thì rau họ hoa thập tự chịu sự phá hại của rất nhiều loại sâu như sâu tơ, sâu xanh bướm trắng, rệp, bọ nhảy gây ảnh hưởng rất lớn đến năng suất và chất lượng của cây trồng Một trong những khó khăn lớn nhất của nghề sản xuất rau họ hoa thập tự là sự phá hại nghiêm trọng của sâu tơ ở tất cả các vùng trồng rau trên cả nước

Vì thế để phòng trừ sâu hại nói chung và sâu tơ nói riêng trên cây trồng người dân chủ yếu sử dụng biện pháp phun thuốc hóa học không hợp lí Biện pháp này tuy

có tác dụng nhanh có thể nhìn thấy sâu hại chếtngay nhưng nó đã và đang gây ra những hậu quả cho môi trường và sức khỏe cộng đồng

Để bảo vệ cây rau sạch, an toàn và tăng năng suất, hiện nay ở nước ta với chiến lược phát triển nền nông nghiệp bền vững và an toàn, ứng dụng các biện pháp sinh học vào trong sản xuất nông nghiệp đã và đang đóng vai trò rất quan trọng làm tăng tính đa dạng sinh học đ c biệt làm đa dạng quần thể thiên địch trên đồng ruộng và bảo

vệ sức khỏe con người và môi trường

Nấm ký sinh côn trùng Isaria là loại nấm phát triển nhanh, có số lượng bào tử

nhiều, dễ phân lập và nhân nuôi Là loại nấm ký sinh côn trùng có hoạt chất sinh học

có giá trị dược lý rất lớn, được ứng dụng trong y- dược để chữa bệnh và làm thực phẩm chức năng nhằm nâng cao sức khỏe cho con người Đ c biệt, các bệnh về ung thư- một trong những căn bệnh nan y của con người hiện nay Do đó, nhu cầu về sử

dụng nấm Isaria trên thị trường là rất lớn Các sản phẩm sản xuất từ Isaria rất đa dạng

về chủng loại, từ dạng thực phẩm chức năng cho đến thuốc viên nang Ngoài ra, nấm

Isaria còn được coi là tác nhân kiểm soát sinh học Trong tự nhiên, từ các mẫu nấm Isaria thu thập được cho thấy chúng thườngký sinh trên giai đoạn nhộng của nhiều loại

Chính vì vậy tôi đề xuất thực hiện đề tài“Nghiên cứu tuyển chọn chi nấm

Isaria có khả năng phòng trừ sâu tơ (Plutella xylostella L.)hại rau họ hoa thập tự trong điều kiệnphòng thí nghiệm” Kết quả nghiên cứu của đề tài làứng dụng một số

loài nấm thuộc giống Isaria trong phòng trừ sâu tơ hại rau họ hoa thập tự (HTT) ở Việt

Nam

2 Mục tiêu nghiên cứu

Trên cơ sở nghiên cứu tuyển chọn và xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm

nấm Isaria phòng trừ một số loài sâutơ trong phòng thí nghiệm nhằm cung cấp dẫn

liệu khoa học làm cơ sở để ứng dụng các chế phẩm nấm phòng trừ sâu tơ rau họ hoa thập tự ở ngoài đồng ruộng và tạo ra được sản phẩm rau an toàn, hiệu quả kinh tế cao đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng và sản xuất hiện nay đồng thời bảo vệ được đa dạng sinh học và giảm thiểu ô nhiễm môi trường

3 Phạm vi nghiên cứu

Đề tài tập trung nghiên cứu đánh giá các loài nấm ký sinh côn trùng Isaria đến

khả năng gây bệnh của chúng trên vật chủ sâu tơ (nồng độ, liều lượng nấm)

Nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bảo vệ thực vật và phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Nông nghiệp, Trung tâm THTN, Trường Đại học Vinh trong thời gian từ tháng 9 năm 2015 đến tháng 4 năm 2016

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Kết quả của đề tài sẽ bổ sung và cung cấp thêm một số dẫn liệu khoa học cho

nghiên cứu tuyển chọn các loài nấm Isaria có hoạt tính sinh học cao

Đề tài cũng cung cấp thêm một số chủng nấm có hiệu lực cao trong kiểm soát

sinh học sâu tơ (Plutella xylostella L) hại rau họ HTT trong điều kiện phòng thí

nghiệm để từ đó có dẫn liệu cung cấp cho ứng dụng ngoài đồng ruộng

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cơ sở khoa học

1.1.1 Khái niệm nấm ký sinh côn trùng

“Nấm ký sinh công trùng (Entomology pathogenic fungi (EPF) hay nấm côn

trùng, Insect - fungi” là thuật ngữ đề cập về nhóm nấm ký sinh gây bệnh cho côn

trùng Theo Evans (1988), nấm ký sinh côn trùng được chia thành 4 nhóm:

(1) Ký sinh trong tức là nấm ký sinh trong các nội quan, xoang cơ thể của côn trùng ký chủ

(2) Ký sinh ngoài tức là nấm phát triển trên lớp cuticun vỏ cơ thể của côn trùng

và gây nên bệnh hại cho ký chủ

(3) Nấm mọc trên côn trùng tức là những nấm đã được trực tiếp ho c gián tiếp chứng minh chúng ký sinh trên côn trùng

(4) Cộng sinh có nghĩa là cả nấm và côn trùng cùng mang lại lợi ích cho nhau trong mối quan hệ cùng chung sống

Nấm còn được chia ra thành ký sinh sơ cấp (primery pathogen) và ký sinh thứ cấp (secondary pathogen) (Pu và Li, 1996) Nấm ký sinh sơ cấp thường nhiễm vào ký chủ côn trùng khoẻ mạnh, gây bệnh và sau đó giết chết côn trùng Trong khi đó, nấm

ký sinh thứ cấp chỉ có thể ký sinh trên những côn trùng yếu ho c bị thương Các mầm bệnh ký sinh trên côn trùng trưởng thành ho c côn trùng bị bệnh được gọi là ký sinh

cơ hội ho c ký sinh không chuyên tính, loại ký sinh này có thể nhiễm vào ký chủ thông qua sự xâm nhập qua lớp cuticun vỏ cơ thể côn trùng (dẫn theo Trần Ngọc Lân

và cs, 2007) [12]

1.1.2 Chu trình sống và lây nhiễm của nấm ký sinh côn trùng

Nấm ký sinh côn trùng có thể xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng qua con đường

hô hấp, tiêu hóa ho c qua cơ quan sinh dục, nhưng phần lớn là qua lớp vỏ cuticun của chúng Tức là phải có sự tiếp xúc của bào tử nấm và bề m t cơ thể vật chủ Bào tử nấm bám vào bề m t cơ thể vật chủ, khi đủ điều kiện ẩm độ bào tử mọc mầm và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp vỏ cuticun Khi nấm xâm nhiễm vào bên trong, nấm mọc khắp cơ thể của côn trùng và sản xuất các độc tố trong đó để tăng tốc độ giết

chết côn trùng ho c ngăn ch n sự cạnh tranh của các loài vi sinh vật khác

4

Hình 1.1 Chu trình xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng

Nấm xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng gồm 3 giai đoạn chính:

(i) Giai đoạn xâm nhập

Giai đoạn xâm nhập được tính từ khi bào tử nấm mọc mầm đến lúc hoàn thành việc xâm nhập vào trong xoang cơ thể côn trùng Bào tử nấm sau khi mọc mầm phát sinh mầm bệnh, nó giải phóng các enzyme ngoại bào tương ứng với các thành phần chính của lớp vỏ cuticun của côn trùng để phân hủy lớp vỏ này như Protease,chitinase, aminopept, carboxypeptidase A, esterase, N - axetylglucosaminidase, cenlulase Các enzyme này được tạo ra một cách nhanh chóng, liên tục và với mức độ khác nhau giữa các loài và thậm chí ngay cả trong một loài

Enzyme protease và chitinase hình thành trên cơ thể côn trùng, tham gia phân hủy lớp da côn trùng (cuticula) và lớp biểu bì (thành phần chính là protein) Lipase, cenlulase và các enzyme khác cũng là những enzyme có vai trò không kém phần quan trọng Nhưng quan trọng nhất là enzyme phân hủy protein (protease) và enzyme phân huỷ kitin (chitinase) của côn trùng Hai enzyme này có liên quan trực tiếp đến hiệu lực diệt côn trùng của nấm ký sinh côn trùng (Tạ Kim Chỉnh, 1994) [2]

(ii) Giai đoạn phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng

Giai đoạn này được tính từ khi nấm hoàn thành quá trình xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng cho đến khi côn trùng chết Đây là giai đoạn sống ký sinh của nấm Trong xoang cơ thể côn trùng nấm tiếp tục phát triển, hình thành rất nhiều sợi nấm ngắn Khi hệ sợi nấm được hình thành trong cơ thể, nó phân tán khắp cơ thể theo dịch máu, phá hủy các tế bào máu và làm giảm tốc độ lưu thông máu Toàn bộ các

5

bộ phận nội quan bị xâm nhập Nấm thường xâm nhập vào khí quản làm suy yếu hô hấp Hoạt động của côn trùng trở nên chậm chạp và phản ứng kém với các tác nhân kích thích bên ngoài Kết quả là vật chủ mất khả năng kiểm soát hoạt động sống và dẫn đến chết (Phạm Văn Lầm, 2000)[8]

(iii) Giai đoạn sinh trưởng của nấm sau khi vật chủ chết

Đây là giai đoạn sống hoại sinh của nấm ký sinh Xác côn trùng chết là nguồn dinh dưỡng có giá trị cho các vi sinh vật Thông thường, các bộ phận bên trong cơ thể côn trùng sẽ bị phân hủy bởi vi khuẩn hoại sinh Trên bề m t ngoài của cơ thể côn

trùng, các nấm hoại sinh như Aspergillus spp., Penicillium spp và Fusarium spp định

cư ở lớp biểu bì và cạnh tranh với vi khuẩn ở bên trong cơ thể côn trùng Do nấm côn trùng có khả năng sản xuất ra các chất có hoạt tính như thuốc kháng sinh ức chế hoạt động của vi khuẩn và nấm hoại sinh khác nên chúng có thể cạnh tranh với các sinh vật này để tồn tại và phát triển, làm cho xác vật chủ không bị phân hủy

Sau khi nấm côn trùng đã sử dụng cạn kiệt nguồn dinh dưỡng bên trong cơ thể côn trùng, nó chuyển sang giai đoạn hình thành bào tử

Ở giai đoạn xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng, nấm sử dụng các enzyme ngoại bào để phân hủy lớp vỏ cuticun Khác với giai đoạn này, ở giai đoạn nấm đâm xuyên, mọc thành sợi ra bên ngoài nó sử dụng toàn bộ tác động cơ học Sau

đó các bào tử được hình thành trên lớp sợi nấm ở bề m t cơ thể vật chủ Nhiều côn trùng bị bao bọc toàn bộ bên ngoài bởi hệ sợi nấm và các bào tử, vì vậy mà rất khó

ho c không thể xác định các vật chủ

Đ c điểm cơ thể côn trùng bị chết do nấm côn trùng không bao giờ bị thối, nhũn mà thường vẫn giữ nguyên hình dạng như khi còn sống Toàn bộ bên trong cơ thể sâu chết chứa đầy sợi nấm Sau đó, các sợi nấm này mọc ra ngoài qua vỏ cơ thể và bao phủ toàn bộ bề m t ngoài của cơ thể sâu Đây là đ c điểm rất đ c trưng để phân biệt sâu chết do nấm côn trùng với sâu chết do virus, vi khuẩn gây bệnh (Trần Ngọc Lân và cộng sự, 2008) [10]

Thomas M B., Read A F., (2007)[53] đã đưa ra sơ đồ xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng vào cơ thể vật chủ (hình 1.2)

6

Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng

Theo Thomas M B., Read A F., (2007) chu kỳ phát triển của nấm ký sinh côn

trùng, như nấm Beaueria bassiana và Metarhizium anisopliae gồm các giai đoạn: Bào

tử đính tiếp xúc với tầng cuticun của lớp vỏ vật chủ Bào tử nảy mầm và sinh sản hình thành vòi và giác bám (cấu trúc cơ quan xâm nhập) [53]

Sự xâm nhập của bào tử đính là sự tổ hợp của sức ép cơ học và sự tác động của enzyme phân giải tầng cuticun Quá trình sinh trưởng bên trong xoang máu cơ thể vật chủ và sự sinh sản của bào tử đính làm vật chủ chết Tầng cuticun của vỏ cơ thể vật chủ là tầng chống chịu đầu tiên trong việc bảo vệ chống lại sự xâm nhiễm của nấm và

nó có vai trò quyết định tính chuyên hóa đ c hiệu của nấm Nếu nấm phá vỡ được tầng cuticun thì sự xâm nhiễm thành công, sau đó phụ thuộc vào khả năng chiến thắng được phản ứng miễn dịch bẩm sinh ở côn trùng của nấm

Các loài côn trùng có thể phản ứng lại sự xâm nhiễm này của nấm bằng cả hai phương thức là tế bào và thể dịch Sự hình thành hoạt động miễn dịch càng sớm ở điểm phân giải bào tử đính trong suốt quá trình xâm nhập Các loài nấm nói chung đều có hai phương thức để chiến thắng các phản ứng tự vệ của vật chủ: Sự phát triển của các dạng sinh trưởng giai đoạn tiềm ẩn là sự ngụy trang hữu hiệu từ các phản ứng tự vệ của côn trùng và sự sản xuất ra các chất miễn dịch phân hóa thuận nghịch của bộ phận ức chế hệ thống bảo vệ

Nấm ký sinh thường để lại những dấu hiệu trên cơ thể vật chủ hay làm cho tập tính sống của chúng bị thay đổi Những cá thể sâu hại bị nhiễm nấm thường có các vệt chấm đen xuất hiện trên bề m t, có thể tại nơi bào tử nấm bám vào và mọc mầm xâm

nhiễm vào bên trong cơ thể vật chủ Nơi xâm nhập của nấm Beauveria bassiana

7

thường có vệt chấm đen hình dạng bất định Khi bị bệnh do nấm, sâu hại ngừng hoạt động khoảng 2 đến 3 ngày trước thời điểm phát triển hoàn toàn của nấm ở trong cơ thể

vật chủ Nếu bị bệnh do nấm Beauveria thì sâu hại sẽ ngừng hoạt động khoảng 7 ngày

trước khi chết Những cá thể sâu hại bị nhiễm bệnh nấm côn trùng thường có màu hồng nhạt Một số loài nấm có thể làm cho sâu bệnh trở nên có màu vàng nhạt, xanh lá

cây ho c nâu Cơ thể sâu bị bệnh trở nên hóa cứng Một số loài Cordyceps ký sinh có thể ảnh hưởng đến hành vi của vật chủ sâu bọ Cordyceps unilateralis gây bệnh trên

kiến và khiến chúng leo lên cây rồi bám ở đó trước khi chết, đảm bảo phân phối tối đa bào tử từ quả thể mọc ra ngoài cơ thể côn trùng đã chết (Phạm Văn Lầm, 2000) [8]

1.3 Tình hình nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng trên thế giới

Nấm ký sinh côn trùng – Entomology pathogennic fungi (EPF) không chỉ là nhóm có tính đa dạng sinh học cao, nguồn lợi tài nguyên quý giá mà còn có vai trò rất quan trọng trong phòng trừ sâu hại cây trồng

Nấm ký sinh côn trùng đã được phát hiện cách đây 150 năm và cho đến nay trên thế giới có khoảng 700 loài đã được xác định, mô tả trong đó ở Thái Lan đã phát hiện được hơn 400 loài ( Trần Ngọc Lân và cộng sự, 2008) [9] Hiện nay có nhiều

nước trên thế giới đã nghiên cứu và ứng dụng nấm ký sinh côn trùng giống Beauveria,

Metarhizium, Isaria, Aschersonia,… vào trong sản xuất để tiêu diệt sâu hại cho kết quả

rất tốt như Mỹ, Brazil, Thái Lan, Malaysia,… Trong đó Isaria là một trong giống nấm

đạt hiệu quả phòng trừ sâu hại cây trồng rất cao

1.3.1 Nghiên cứu về nhân nuôi các loài Isaria

Khả năng nhân sinh khối của Isaria tenuipes trên các môi trường khác nhau đã được quan tâm nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới Chun-Ping Xu et al (2003) khi nhân sinh khối I tenuipes các điều kiện nuôi như nguồn dinh dưỡng cacbon, khoáng,

ni tơ và độ pH ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng phát triển của nấm Nguồn dinh dưỡng

Ali et al., (2009) đã nghiên cứu cải tiến thành phần môi trường lỏng nuôi cấy

Isaria fumosorosea để tạo ra sinh khối chủ yếu là các bào tử đính dạng chìm Kết quả

cho thấy, với các môi trường nuôi cấy bình thường sinh khối thu được thường có màu trắng và chủ yếu là sợi nấm (80 - 97%), tuy nhiên với một số môi trường chúng tạo ra sắc tố nâu Với môi trường có chứa 20-30 mg /l FeSO4·7H2O và 6-12 mg/l

8

CuSO4·5H2O tạo ra sắc tố nâu lớn nhất Khi bổ sung 25ml/l Polyethylene glycol (200 MW) - chất xúc tác quá trình sinh bào tử, giảm sự hình thành sợi nấm sinh dưỡng

cấy Sinh khối thu được chủ yếu là bào tử đính chìm chiếm hơn 60% [40]

Gabriel et al (2010) đã nghiên cứu lựa chọn môi trường nhân nuôi Isaria

fumosorosea và Isaria farinosa để sản xuất sinh khối Kết quả cho thấy, ở giai đoạn 1,

môi trường lỏng tốt nhất là mật mía (30g/l) + nước gạo ninh nhừ (200g/l); nước gạo ninh nhừ (200g/l) + nấm men (5g/l) và mật mía (30g/l) + nước gạo ninh nhừ (200g/l)

+ nấm men (5g/l) Giai đoạn nhân nuôi trên môi trường rắn, Isaria farinosa phát triển

tốt nhất với môi trường bột đậu nành + ngô vỡ (ngâm nước 60 phút) và gạo nguyên

kích thước dài 7 mm × dày 2 mm (ninh 8-10 phút với nước); đối với Isaria

fumosorosea cả gạo vỡ 3 mm dài × 2 mm dày (ngâm nước 40 phút) và gạo nguyên

(ninh 8-10 phút với nước) đều cho kết quả tốt nhất về khả năng phát sinh bào tử [31]

1.3.3 Nghiên cứu sử dụng các loài Isaria trong phòng trừ sinh học

Trên thế giới nấm Isaria đã từng được sử dụng để phòng trừ sâu hại cây trồng như các loài Isaria javanica, Isaria fariosa, Isaria fumosorosea Ở Thái Lan loại nấm

Isaria fariosa đã phòng trừ sâu hại cây trồng rất thành công Nấm ký sinh côn trùng

thuộc giống Isaria là một loại nấm phát triển nhanh, có số lượng bào tử nhiều, dễ phân lập Loài nấm Isaria javanica được đánh giá là rất có triển vọng trong việc ứng dụng

để phòng trừ sâu hại cây trồng Loài nấm này đã được nghiên cứu và ứng dụng vào phòng trừ một số đối tượng sâu hại (thuộc bộ Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hymenoptera,…) ở một số nước trên thế giới như Trung Quốc, Hoa Kỳ, Brazin, và cho kết quả rất tốt

Kết quả nghiên cứu tại Lower Rio Grande Valley bang Texas, Mỹ cho thấy,

Isaria sp là tác nhân gây bệnh loài rệp phấn trắng Bemisia tabaci G (biotype B) hại

với rệp non tuổi 2, 3 và 4 đã thu được kết quả như sau: nồng độ gây chết trung bình

CFU/ml đối với nhộng của ruồi sừng hút máu bò chăn thả Haematobia irritans đạt

Pasco et al (2011) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nấm Isaria fumosorosea đến

tỷ lệ chết và sức ăn của rầy chổng cánh Diaphorina citri trong điều kiện phòng thí

nghiệm Sức ăn của rầy giảm khi xử lý bằng blastospore của nấm với số giọt mật tiết

ra không vượt quá 2,4 giọt so với 4 và 8 khi xử lý bằng bào tử bột và đối chứng Tỷ lệ chết đạt 100% sau 7 ngày tiếp xúc nguồn bệnh [35][36][37]

Kết quả sử dụng nấm Isaria fumosorosea kiểm soát rầy chổng cánh ở South

Texas cho thấy, ở 27°C phòng thí nghiệm, 70% rầy chết trong vòng một tuần khi tiếp xúc với thẻ vàng đã được phun blastospore Trong nhà kính, 25 - 37°C sử dụng thẻ

vàng cho tỷ lệ chết thấp < 40% (Patrick et al., 2011) [38]

Thử nghiệm trong điều kiện phòng thí nghiệm sử dụng nấm Isaria fumosorosea Wize đối với rầy chổng cánh Diaphorina citri Tỷ lệ chết đạt 100% rầy trưởng thành ở

fumosorosea trong vòng hai tuần đầu tỷ lệ chết của rầy không sai khác so với đối

chứng Tuy nhiên, sau đó rệp có hiện tượng nhiễm bệnh Hai tác nhân này có khả năng tương thích với nhau vì vậy có thể kết hợp trong kiểm soát rệp nâu hại cam quýt

Kết quả nghiên cứu của Pasco et al (2013) xác định khả năng tương thích của nấm Isaria fumosorosea với các hóa chất nông nghiệp được sử dụng để kiếm soát rầy chổng cánh Diaphorina citri Sự tăng trưởng của I fumosorosea trong phòng giảm ít

nhất với các loại hóa chất có nguồn gốc từ dầu mỏ và lớn nhất với cấc hóa chất từ dầu

thực vật và borax Do đó không nên trộn I fumosorosea với các sản phẩm trên [42]

10

Theo Manana et al (2013) sử dụng nấm Isaria fumosorosea kiểm soát thử nghiệm trong phòng với hai loài sâu hại cây lá kim là Lymantria monacha và L dispar tại Thổ Nhĩ Kỳ Kết quả cho thấy, hiệu lực gây chết của I fumosorosea với L dispar

CFU/ml) [33]

1.4 Tình hình nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng ở Việt Nam

Sử dụng nấm ký sinh côn trùng để phòng trừ sâu hại đã đƣợc quan tâm nghiên cứu ở Việt Nam Tuy nhiên, các nghiên cứu chỉ tập trung vào hai loài nấm là

Beauveria bassiana, Metarhizium anisoplae Từ những năm 1990 cho đến nay có các

công trình nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng trong phòng trừ sâu hại cây trồng ở Việt Nam của Tạ Kim Chỉnh (1992, 1994) [3, 4]; Phạm Thị Thuỳ (1993) [22]; Nguyễn Văn Cảm (1994) [1]; Võ Thị Thu Oanh (2003, 2008) [15, 16]; Nguyễn Xuân Niệm (2004) [14]; Nguyễn Xuân Thanh và cộng sự (2005) [19]; Trịnh Văn Hạnh và cộng sự (2005) [10]; Phạm Thị Thuỳ và cộng sự (2005 a, b, c, d) [20, 21, 22, 23]; Đàm Ngọc Hân và cộng sự (2007) [5]; Trần Ngọc Lân và cộng sự (2008) [25, 15]; Nguyễn Thị Thanh và cộng sự (2011) [17, 18]

Các công trình nghiên cứu chỉ tập trung vào nấm Beauveria, Metarhizium

phòng trừ sâu hại rau để sản xuất rau an toàn ở Hà Nội và vùng phụ cận Nghiên cứu

sử dụng nấm Metarhizium anisopliae phòng trừ bọ cánh cứng hại dừa ở các tỉnh phía

Nam (Nguyễn Thị Lộc và cộng sự, 2004) Nghiên cứu và hoàn thiện công nghệ sản

xuất thuốc trừ sâu vi nấm Beauveria và Metarhizium để phòng trừ sâu hại đậu xanh ở

Hà Tĩnh năm 2003 (Phạm Thị Thùy và cộng sự, 2005); Sử dụng chế phẩm nấm

Metarhizium anisopliae để phòng trừ bọ cánh cứng hại dừa Brontispa sp [23,24]

Nghiên cứu đ c tính sinh học và hiệu lực diệt côn trùng có hại của nấm

Metarhizium anisopliae, sử dụng nấm Metarhizium anisopliae để phòng trừ rệp

sáp Pseudococcus citri Risso hại rễ cây cà phê tại tỉnh Đắk lắk năm 2002 - 2003

(Nguyễn Xuân Thanh, Phạm Thị Thùy, 2005) [23]; Ứng dụng chế phẩm nấm

Metarhizium anisopliae để phòng trừ bọ xít hại cây trồng (Đàm Ngọc Hân, Phạm

Thị Thùy, 2007) [11] Nghiên cứu hiệu lực diệt mối cánh Coptotermes formosanus Shiraki của chế phẩm Metarhizium anisopliae (Trịnh Văn Hạnh và cộng sự, 2005) [10]

11

Kết quả nghiên cứu của Trần Ngọc Lân và cộng sự (2008) cho thấy loài

Paecilomyces sp1 có khả năng phòng trừ sâu xanh (Heliothis armigera Fabr.) hại lạc và

sâu tơ (Plutella xylostella L.) hại rau cải một cách có hiệu quả [11, 12]

Kết quả nghiên cứu của Trần Ngọc Lân và cộng sự (2008) về sử dụng nấm B

bassiana (BbGc), B bassiana (BbPs) và M anisopliae (MaPs) phòng trừ sâu mọt hại

kho, cho thấy ảnh hưởng của các công thức khác nhau của nấm B bassiana lên mọt ngô

Sitophilus zeamais Motsch gây hại ở kho ngô [11] Dạng nhũ tương với B bassiana ở

dạng bột của nấm B bassiana đạt hiệu quả phòng trừ mọt ngô tới 90% sau 15 ngày, ở

CFU/kg ngô) và đạt 77% với liều

Nghiên cứu về Isaria đã có những kết quả bước đầu ở Việt Nam Theo Trần

Ngọc Lân và cộng sự (2008) [11] đã nghiên cứu về đa dạng sinh học về nấm ký sinh côn

trùng tại vườn quốc gia Pù Mát (Nghệ An) ghi nhận có 13 loài Isaria trong đó Isaria

tenuipes phổ biến nhất, tiếp theo là Isaria javanica

Nghiên cứu về đ c điểm sinh học của nấm Isaria tenuipes, kết quả cho thấy loài

nấm này chỉ ký sinh trên nhộng của sâu cánh vảy, quả thể có 4 dạng hình thái (hoa cúc trắng, lục bình trắng, bông tuyết, dạng vô tính kết hợp hữu tính), sinh trưởng nhanh trên PDA, bào tử dạng bột và rất triển vọng trong phòng trừ sâu hại (Trần Ngọc Lân và cộng

sự, 2011) [13]

Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thúy và cộng sự (2011) cho thấy, nấm

Isaria javanica VN1487 sinh trưởng và phát triển nhanh trên môi trường lên men rắn,

với hàm lượng cơ chất gạo lứt là 150 gam và lượng nhộng tằm bổ sung là 3 gam trong bình 500ml Nấm bao phủ toàn bộ môi trường sau 10 ngày và đạt nồng độ bào tử cao

Theo Trần Ngọc Lân và cộng sự (2011) [14] chỉ ra rằng, khối lượng cơ chất khác

nhau ảnh hưởng đến khả năng hình thành synnema của I tenuipes Lượng cơ chất 40g

phù hợp nhất cho hộp nhựa 700ml với thời gian thu hoạch synnema là 45,67 ± 1,53 ngày và sản lượng synnema thu được 19,52 ± 0,61(g/hộp).Chất dinh dưỡng trong nhộng

tằm thích hợp cho sự hình thành synnema của I tenuipes, với thời gian thu hoạch

synnema là 43,33 ± 0,58 ngày và sản lượng synnema thu được 17,82 ± 1,66 (g/hộp) Chu

kỳ sinh trưởng synnema trong nhân nuôi tạo synnema nấm của I tenuipe gồm 4 giai

12

đoạn là (1) bao phủ hệ sợi nấm, (2) chuyển màu, (3) mọc mầm và (4) tăng trưởng của

synnema

Theo Nguyễn Thị Thanh và cộng sự (2011), nấm Isaria javanica với nồng độ

107 CFU/ml sau 10 ngày xử lý ở điều kiện ô lưới, hiệu lực phòng trừ đối với sâu khoang hại lạc đạt 93,18%, rệp xám hại cải đạt 99,29% và rệp muội hại lạc đạt 100% [17, 18]

Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thúy và cộng sự (2014) [26], cho thấy trong

18 chủng nấm Isaria javanica thu thập tại Vườn quốc gia Pù Mát dựa vào các chỉ tiêu:

Thời gian vòng đời của nấm, (5) Nồng độ bào tử hình thành trên sâu; đã tuyển chọn được các chủng nấm tiềm năng để kiểm soát sâu khoang, có 4/18 chủng nấm nghiên cứu được đánh giá là có tiềm năng gồm: VN1472, VN1487, VN1801 và VN1802

1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước của sâu tơ (Plutella

xylostella L.)

Sâu tơ (Plutella xylostella L.) là một trong số loại sâu hại gây hại nghiêm trọng

nhất trên cây rau họ hoa thập tự ở hiện nay ở Việt Nam cũng như các nước trên thê giới.Chúng phân bố rộng ở các nước nhiệt đới và ôn đới , kí chủ là các loại rau và cây dại trong họ thập tự Chúng gây hại trong suốt quá trình sinh trưởng của cây rau

Đ c điểm sinh học của loài sâu này được nhiều nhà khoa học nghiên cứu và cho thấy (tùy thuộc vào điều kiện môi trường ở từng nước khác nhau và vòng đời sâu cũng khác nhau: ở Canada vòng đời sâu từ 14- 21 ngày, Hồng Koong 22- 37 ngày, Malaysia 10,8 -27 ngày Ở nhiệt độ 20°C vòng đời sâu là 23 ngày nhưng 25°C thì vòng đời rút ngắn 16 ngày (Koshihara, 1985) (dẫn theo Đinh Thị Hiền, 2007)[6]

Thời gian sống của trưởng thành thay đổi rất nhiều tùy địa phương và tùy điều kiện ngoại cảnh nghiên cứu Ở Canada bướm đực sống từ 3 -58 ngày, bướm cái sống

từ 7- 47 ngày, nếu không có cây chủ bướm sống từ 11– 27 ngày (Harcourt,1957) Trong điều kiện nhiệt độ trung bình 18°C ở Venezuela, bướm đực có thể sống trung bình 39,3 ngày, bướm cái sống trung bình 30,6 ngày

Khả năng sinh sản của sâu tơ có sự sai khác rất lớn giữa các tác giả, tại Mỹ một

số trứng đẻ trung bình mỗi bướm cái ở điều kiện 26°C khoảng 139 trứng (Biever và Boldt, 1971) Salinas và Pena (1976) nuôi tại Venezuela ở điều kiện 18°C trung bình mỗi bướm cái đẻ 162,6 trứng Ở Anh, điều kiện nuôi 20°C, số trứng đẻ thay đổi từ 95–

Ở nước ta mối quan tâm đến sâu tơ trên rau họ hoa thập tự được đ t ra từ những năm 60 Theo Nguyễn Đình Đạt và cộng tác viên (1980), vòng đời sâu tơ trung bình 23,6 ngày, trong đó thời kì sâu non khoảng 8- 9 ngày, khả năng sinh sản của sâu tơ cao, một bướm cái đẻ bình quân khoảng 150 trứng, biến động từ 80- 250 trứng[6]

Các tài liệu công bố đều chỉ rõ ở Việt Nam, sâu tơ phát sinh gây hại liên tục trong năm với mức độ khác nhau giữa các vụ gieo trồng Kết quả theo dõi của Nguyễn Đình Đạt và cộng tác viên trên cải bắp vùng Hà Nội từ tháng 8 năm trước đến tháng 8 năm sau có khoảng 9 lứa sâu tơ phát sinh Trong đó từ lứa thứ 6 đến lứa thứ 9 hình thành vào thời gian từ tháng 11 năm trước đến tháng 3 năm sau và thường có mật độ cao 463,3 – 486,9 con/ cây (Nguyễn Đình Đạt và nnk, 1980) (dẫn theo Đinh Thị Hiền, 2007)[6]

Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Quý Hùng và cộng tác viên ở thành phố

Hồ Chí Minh, trong tháng 9– 10 vòng đời sâu tơ là 15– 17 ngày, nhưng thời gian sâu non vẫn tới 8,4 – 8,8 ngày Số trứng đẻ của mỗi bướm cái là 100- 150 trứng Nếu trứng hình thành từ sâu non ăn lá cải non 30 ngày tuổi cho số trứng đẻ 169,7 trứng/ bướm, nhiều hơn số trứng đẻ từ sâu non ăn lá già 45 ngày tuổi (98,8 trứng / bướm) Sâu tơ gây hại làm giảm 30- 40% năng suất , chi phí cho việc phòng trừ sâu hại chiếm 46,7 % vốn đầu tư, từ tháng 10– tháng 3 năm sau có 7- 8 lứa sâu rộ Thời điểm đỉnh cao về mật độ tháng 12 và tháng 3, ở cải vụ muộn sâu tơ hại n ng hơn vụ sớm (dẫn theo Đinh Thị Hiền, 2007) [6]

Ở vùng ven thành phố Hồ Chí Minh, ước tính khoảng hơn 20 lứa sâu tơ gây hại Bất kì thời gian naog trong năm nếu có cây họ hoa thập tự đều thấy sâu tơ hiện diện Tuy nhiên trong mùa khô mật độ thường cao hơn trong mùa mưa (Dương Thanh Tài

và nnk, 1995)[7] Kết quả nghiên cứu 3 năm tại Hooc Môn, Bình Chánh (tp Hồ Chí Minh) trên vụ bắp cải chính ở mùa khô cho kết quả từ tháng 10– tháng 3 có 7 – 8 lứa sâu non rộ trung bình 14- 16 ngày có 1 đỉnh cao Hai thời điểm sâu nhiều nhất trong năm gồm:

Đứng trước sự bất lực của thuốc hóa học để trừ sâu tơ trong một số trường hợp

và hiệu quả của chúng khi sử dụng nên biện pháp sinh học ngày càng được chú ý Vì vậy các biện pháp bảo vệ thực vật và thúc đẩy sự gia tăng số lượng thiên địch tự nhiên

là 1 phần quan trọng của hệ thống phòng trừ tổng hợp sâu hại( Lim và Ooi, 1984), (dẫn theo Đinh Thị Hiền) [6]

Vòng đời của sâu tơ

(2) Tuyển chọn các chủng nấm Isaria javanica (VN1487, VN1802, VN1472)

có khả năng phòng trừ sâu tơ

(3) Vòng đời xâm nhiễm của các chủng nấm Isaria (Isaria javanica; Isaria

tenuipes; Isaria sp.) trên vật chủ sâu tơ

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: Từ tháng 8 năm 2015 đến tháng 3 năm 2016

- Địa điểm: Nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm công nghệ nấm ký sinh côn trùng, khoa Nông Lâm Ngư, Trường Đại học Vinh

2.3 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu

- Nấm ký sinh côn trùng I tenuipes (B2015-5); I javanica (gồm các chủng VN

1802, VN1472, VN1487; I.sp (B2015-18) đã được thu thập tại Vườn Quốc Gia Pù Mát

- Sâu non sâu tơ (Plutella xylostella L.)

- Vật liệu nghiên cứu

- Nguyên liệu, hóa chất: Khoai tây, Agar, Glucose, cồn,

- Các thiết bị và dụng cụ thí nghiệm: Đĩa Petri, ống nghiệm, bình tam giác, kính hiển vi, tủ sấy, tủ hấp tiệt trùng, buồng nuôi cấy, dụng cụ nuôi cấy,

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp nhân nuôi nấm và vật chủ sâu tơ sạch

2.4.1.1 Phương pháp phân lập và nhân nuôi nấm trên môi trường PDA

Sau khi thu thập nấm trong môi trường tự nhiên thì tiến hành phân loại sơ bộ loài Các loài được định loại dựa vào đ c điểm hình thái bên ngoài, màu sắc, cấu trúc của dạng sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính Tiến hành quan sát bào tử để định dạng chính xác hơn Dựa vào cấu trúc bào tử (kích thước và hình dạng), quả thể, sợi nấm và màu sắc ở bên ngoài

16

Phân lập nấm ký sinh côn trùng theo phương pháp của Goettel và Inghis (1997),

nhân nuôi sơ cấp chủng nấm Isaria trên môi trường PDA theo phương pháp của

Brown and Smith và Samson (1974) [60]

* Phân loại sơ bộ mẫu nấm ngay sau khi thu thập

Từ mẫu nấm gốc sau khi thu thập phải tiến hành phân loại ngay trên thực địa và phải chú ý quan sát hình thái bên ngoài, màu sắc, hành dạng, dạng sinh sản hữu tính hay vô tính để xác định cách phân loại (có thể dựa vào vật chủ để phân loại nếu chưa

xác định mẫu rõ ràng)

Đánh ký hiệu số thứ tự cho các mẫu nấm gốc và định loại chúng theo giống (genus); vẽ và ghi thông tin về mẫu vào sổ (chiều dài và chiều rộng quả thể, số quả thể, màu sắc quả thể, chiều dài và chiều rộng synnema, số synnema và màu sắc); ký chủ (chiều dài và chiều rộng vật chủ…), cây cỏ nơi thu thập, người thu thập, địa điểm

thu thập, tọa độ địa lý (GIS)

* Chuẩn bị môi trường PDA

Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) bao gồm các thành phần sau:

Khoai tây (Potato) 200 gam

Đường Glucozo 20 gam

Agar 20 gam

Nước cất 1000 ml

Bước 1 Khoai tây được rửa sạch và gọt vỏ, để ráo nước

Bước 2 Cân 200g và cắt nhỏ theo kích thước 1,0 cm x 1,0 cm rồi cho vào nồi cùng 1000ml nước cất, nấu mềm trong khoảng 45 phút đến 1 giờ

Bước 3 Lọc lấy dịch chiết và thêm vào 20g glucose + 15g agar + lượng nước sao cho đủ 1000ml, cho lên bếp từ, vừa đun nóng vừa cho đũa khuấy đánh tan đều

Bước 4 Cho vào bình tam giác loại 1000ml có nắp kín, đem hấp tiệt trùng ở

buồng cấy

* Phân lập và nuôi cấy nấm trên môi trường PDA

Bước 1 Chuẩn bị môi trường (PDA có thêm chất kháng sinh), các dụng cụ để phân lập và nuôi cấy

Bước 2 Mẫu đã hình thành bào tử phải phân lập ngay, mẫu non có thể để sau vài ngày và quan sát sự hình thành bào tử

17

Bước 3 Dùng dụng cụ phân lập đã vô trùng để lấy bào tử rồi rải đều trên đĩa môi trường ho c đ t nghiêng trên đĩa Petri để cho phóng bào tử và đánh dấu vị trí đó

trong hộp nhựa có lót giấy ẩm

Hàng ngày quan sát sự nảy mầm của bào tử dưới kính hiển vi soi nổi

* Cấy chuyển bào tử nấm nảy mầm sang PDA trên đĩa Petri

Sau khi phân lập trên PDA, tiến hành quan sát dưới kính hiển vi soi nổi để tìm

ra bào tử nảy mầm Dùng dụng cụ nuôi cấy đã vô trùng cắt nhanh phần môi trường có chứa bào tử và chuyển sang đĩa PDA sạch khác (cấy chuyển tiếp sang đĩa khác nếu đĩa vẫn bị tạp nhiễm)

Sau đó, dùng lưới lọc mịn (tấm lưới lọc của Nhật Bản) lọc hỗn hợp dung dịch vừa pha chế để đảm bảo chỉ có bào tử được lọt qua Nhỏ vào dịch lọc 1-2 giọt hỗn hợp

định các bào tử trong dịch lọc để dễ dáng cho việc đếm hơn

Nhỏ 1 giọt bào tử đã pha loãng lên buồng đếm, đậy lamen lên, dùng giấy thấm

để thấm những dịch thừa xung quanh

Đ t buồng đếm lên kính hiển vi điều chỉnh kính hiển vi ở vật kính 40x Đếm số lượng bào tử trong 5 ô lớn, mỗi ô lớn có 16 ô nhỏ Chọn 4 ô, ở 4 góc và 1 ô chính giữa buồng đếm (phương pháp 5 điểm chéo góc) Đếm 3 lần lấy giá trị trung bình

* Công thức tính bào tử

- Cách tính bào tử trung bình: X = (a+ b+c)/3

Trong đó: X: là giá trị trung bình của 5 ô vuông

- a, b, c : là tổng số bào tử đếm được ở 3 lần ở 5 ô vuông lớn

- Sử dụng 1 chất lỏng bào tử cho 5 ô vuông, số bào tử tập trung trong 1ml:

c = X x 5 x 104 (đơn vị tính bào tử)

18

- Cho n là số lần pha loãng, C là số bào tử tập trung trong nguồn gốc dung dịch:

C = c x 10n

2.4.1.3 Phương pháp nhân nuôi vật chủ sâu tơ sạch

Thu bắt sâu tơ “sạch” không nhiễm nấm, không nhiễm thuốc BVTV ở ngoài đồng ruộng, nuôi trong hộp nhựa có kích thước 25 cm x 20 cm x15 cm.Hộp nhựa có chứa cây rau làm thức ăn cho sâu Trưởng thành thu được cho ghép đôi và tiến hành thu sâu non

2.4.2 Phương pháp tuyển chọn các chủng nấm Isaria (Isaria javanica; Isaria tenuipes; Isaria sp.) có khả năng phòng trừ sâu tơ trong điều kiện phòng thí nghiệm

Sử dung dịch bào tử được lấy từ PDA của mỗi chủng nấm: Isaria javanica (VN1487, VN1802, VN1472); Isaria tenuipes (B2015-5); Isaria sp (B2015-18)phun

trên sâu tơ để đánh giá khả năng phòng trừ và tìm ra loài có khả năng phòng trừ tốt nhất

Thí nghiệm 1 Ảnh hưởng của liều lượng dung dịch bào tử của chúng nấm Isaria đến hiệu lực phòng trừ của sâu tơ

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sâu chết, thời gian sâu chết, tỷ lệ sâu mọc nấm

Thí nghiệm 2 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch bào tử của nấm Isaria

đến hiệu lực phòng trừ của sâu tơ

19

Thí nghiệm l p lại 3 lần trong hộp nhựa có kích thước 25 cm x 20 cm x15 cm Hộp nhựa có chứa cây rau làm thức ăn cho sâu Số lượng sâu: 10 con/hộp Dùng bơm

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sâu chết, thời gian sâu chết, tỷ lệ sâu mọc nấm

2.4.3 Phương pháp tuyển chọn các chủng nấm Isaria javanica (VN1487, VN1802, VN1472) có khả năng phòng trừ sâu tơ trong điều kiện phòng thí nghiệm

Sử dung dịch bào tử được lấy từ PDA của mỗi loài nấm: Isaria javanica

(VN1487, VN1802, VN1472) phun trên sâu tơ để đánh giá khả năng phòng trừ và tìm

ra chủng có khả năng phòng trừ tốt nhất

Thí nghiệm 3 Ảnh hưởng của liều lượng dung dịch bào tử các chủng nấm Isaria javanica đến hiệu lực phòng trừ của sâu tơ

Tiến hành tương tự thí nghiệm 1

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sâu chết, thời gian sâu chết, tỷ lệ sâu mọc nấm

Thí nghiệm 4 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch bào tử của các chủng

nấm Isaria javanica đến hiệu lực phòng trừ của sâu tơ

Tiến hành tương tự thí nghiệm 2

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sâu chết, thời gian sâu chết, tỷ lệ sâu mọc nấm

2.4.4 Phương pháp theo dõi chu trình xâm nhiễm của các chủng nấm Isaria tenuipes; Isaria sp và Isaria javanicađối với sâu tơ

- Chu trình xâm nhiễm của nấm Isaria javanica trên sâu tơ

- Chu trình xâm nhiễm của nấm Isaria tenuipes trên sâu tơ

- Chu trình xâm nhiễm của nấm Isaria sp.trên sâu tơ

Chỉ tiêu theo dõi:

- Thời gian lây nhiễm đến vật chủ chết (ngày/giờ)

- Vật chủ chết đến sợ nấm mọc ra (ngày/giờ)

- Sợi nấm mọc ra đến hình thành bào tử (ngày/giờ)

- Hình thành bào tử đến bao phủ cơ thể (ngày/giờ)

- Bao phủ có thể đến bào tử phát tán (ngày/giờ)

- Chụp ảnh và mô tả các đ c điểm

2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu sau khi được thu thập được xử lý trên Microsoft Office Excel 2003 và trên phần mềm Statistix 10.0

20

* Hiệu lực phòng trừ đƣợc tính theo công thức Abbott (1925)

H= Ca- Ta

Ca Trong đó:

H là hiệu lực phòng trừ của nấm

Ca là số lƣợng sâu sống sót ở công thức đối chứng

Ta là số lƣợng sâu sống sót ở công thức thí nghiệm

* Tỷ lệ nhiễm nấm trên sâu tơ đƣợc tính theo công thức

T=

Cb- Tb

Cb Trong đó:

T là hiệu lực phòng trừ của nấm

21

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tuyển chọn các chủng nấm Isaria (Isaria javanica; Isaria tenuipes; Isaria sp.) có khả năng phòng trừ sâu tơ

3.1.1 Đánh giá khả năng phòng trừ của chủng nấm Isaria javanica VN1487 đối với sâu tơ

3.1.1.1 Ảnh hưởng của liều lượng phun đối với hiệu lực phòng trừ sâu tơ của chủng nấm Isaria javanica VN1487

Tiến hành thử nghiệm hiệu lực phòng trừ sâu tơ hại rau họ HTT của chủng nấm

I javanica VN1487 ở 3 liều lượng khác nhau: 1ml, 3ml, 5mltrong điều kiện phòng thí

nghiệm kết quả được thể hiện qua bảng 3.1 và hình 3.1a

Bảng 3.1 Hiệu lực phòng trừ của chủng nấm I Javanica VN1487 đối với

sâu tơ ở các liều lượng khác nhau

Công thức Tỷ lệ chết của sâu tơ (%) Tỷ lệ sâu nhiễm nấm (%)

a Tỷ lệ chết của sâu tơ b Tỷ lệ nhiễm nấm của sâu tơ

Hình 3.1 Hiệu lực phòng trừ của chủng nấm I Javanica VN1487 đối với

sâu tơ ở các liều lượng khác nhau

2ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày

Thời gian sau phun nấm (ngày)

0 10 20 30 40 50 60 70

2ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày

Thời gian sau phun nấm (ngày)

22

Kết quả ở bảng 3.1 và hình 3.1a cho thấy liều lƣợng khác nhau có sự chênh lệch về hiệu lực phòng trừ sâu tơ Ngày thứ 2 sau khi phun thì các công thức đã có sự sai khác, liều lƣợng 3ml (16,67%) có sự sai khác có ý nghĩa với liều lƣợng 1ml (3,33%) và liều lƣợng 5

ml (13,33%) trong tất cả các ngày theo dõi

Đến 4 ngày sau phun, liều lƣợng 3ml cho hiệu lực phòng trừ cao nhất đạt 30,00%,tiếp đến liều lƣợng 5ml là 23,33 % còn liều lƣợng 1ml cho hiệu lực phòng trừ thấp nhất là 20,00%

Đến ngày thứ 6 sau phun, hiệu lực giữa các liều lƣợng vẫn tiếp tục tăng lên Trong đó liều lƣợng 3 ml có hiệu lực phòng trừ vẫn ở mức cao nhất đạt 62,9 %, tiếp đến liều lƣợng 5 ml và liều lƣợng 1 ml đạt 44,40 %

Sau 8 ngày sau phun, các liều lƣợng khác nhau cho hiệu lực phòng trừ khác nhau, liều lƣợng 3ml cho hiệu lực cao nhất đạt 75,83% Hiệu lực 1ml hiệu lực thấp

nhất đạt 54,16% Vậy ở liều lƣợng 3ml thì chủng nấm I Javanica VN1487 đạt hiệu

lực phòng trừ sâu tơ là cao nhất

Đánh giá khả năng sâu nhiễm nấm thì cũng tăng theo thời gian xử lí (hình 3.1b)

Tỷ lệ nhiễm nấm tăng dần theo thời gian từ ngày thứ 4 cho đến ngày thứ 8, sau 2 ngày đầu theo dõi chƣa thấy sau mọc nấm Ở ngày thứ 4, liều lƣợng 3ml cho cho tỷ lệ mọc nấm cao nhất là 16,66% ở mức ý nghĩa thống kê 0,05% Ngày thứ 8 tỷ lệ mọc nấm của liều lƣợng 3ml đạt cao nhất là 63,33%, liều lƣợng 1 ml đạt 50,00%, liều lƣợng 5 ml thấp nhất đạt 43,33%

Nhƣ vậy: Ở liều lƣợng 3ml các chủng nấm I Javanica VN1487 cho hiệu lực

phòng trừ cao nhất và tỷ lệ mọc nấm cao nhất

3.1.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ bào tử đối với hiệu lực phòng trừ sâu tơ của chủng nấm Isaria javanica VN1487

Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.2a cho thấy các công thức đều có hiệu lực

phòng trừ tăng theo thời gian

23

Bảng 3.2 Hiệu lực phòng trừ chủng nấm I Javanica VN1487 đối với sâu tơ

ở các nồng độ khác nhau

Công thức

a.Tỷ lệ chết của sâu tơ b Tỷ lệ nhiễm nấm của sâu tơ

Hình 3.2 Hiệu lực phòng trừ của chủng nấm I Javanica VN1487 đối với

sâu tơ ở các nồng độ khác nhau

Sau 2 ngày phun nấm I Javanica VN1487 ở tất cả các công thức chƣa có hiệu

lực trên cơ thể sâu tơ

Sâu tơ bị chết sau 4 ngày phun, ở các nồng độ khác nhau thì hiệu lực phòng trừ

lần lƣợt là 20%, 30%, không có sự sai khác về m t thống kê

2ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày

Thời gian sau phun nấm (ngày)

0 10 20 30 40 50 60 70

2 ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày Thời gian sau phun nấm (ngày)

Sau 8 ngày phun, tỷ lệ sâu tơ bị nhiễm nấm I Javanica VN1487 ở các công

thức thí nghiệm đều đạt tỷ lệ cao nhất trong suốt quá trình theo dõi Tỷ lệ sâu tơ bị

lực phòng trừ thấp nhất trong tất cả các ngày theo dõi (37%) Vì vậy hiệu lực phòng

Đánh giá khả năng sâu nhiễm nấm thì cũng tăng theo thời gian xử lí (hình 3.2b)

Tỷ lệ nhiễm nấm tăng dần theo thời gian từ ngày thứ 2 cho đến ngày thứ 8, sau 2 ngày

mọc nấm cao nhất là 13,33% ở mức ý nghĩa thống kê 0,05% Ngày thứ 6 tỷ lệ mọc

Tiến hành thử nghiệm hiệu lực phòng trừ sâu tơ hại rau họ HTT củachủng

nấmI tenuipes B2015-5 ở 3 liều lƣợng khác nhau: 1ml, 3ml, 5ml trong điều kiện

phòng thí nghiệmkết quả đƣợc thể hiện qua bảng 3.3

Sau 2 ngày phun nấm I tenuipes B2015-5 ở tất cả các công thức chƣa có hiệu lực trên cơ thể sâu tơ

Ngày thứ4 sau khi phun, hiệu lực phòng trừ của chế phấm nấm I tenuipes B2015.5

của 3 công thức thí nghiệm ở trên sâu tơ đã tăng mạnh và có sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm Liều lƣợng 3ml cho hiệu quả phòng trừ cao nhất đạt 26,66 %

Từ ngày thứ 6 sau khi phun, hiệu lực phòng trừ của các công thức thí nghiệm đều tăng và có sự sai khác rõ rệt về m t thống kê Liều lƣợng 3ml cho hiệu quả phòng trừ cao nhất đạt 40,70 %, tiếp đến liều lƣợng 5 ml đạt 18,5% và liều lƣợng 1ml (29,6%)

25

Bảng 3.3 Hiệu lực phòng trừ của chủng nấm I tenuipes B 2015-5đối với

sâu tơ ở các liều lƣợng khác nhau

a Tỷ lệ chết của sâu tơ b.Tỷ lệ nhiễm nấm của sâu tơ

Hình 3.3 Hiệu lực phòng trừ của chủng nấm I Tenuipes B 2015-5 đối với

sâu tơ ở các liều lƣợng khác nhau

Đến ngày thứ 8 sau phun, hiệu lực phòng trừ sâu tơ của chủng nấm I tenuipes

B2015-5 ở liều lƣợng 3ml cao nhất và có khác biệt rất rõ so với liều lƣợng 1ml và liều lƣợng 5ml Trong đó liều lƣợng 3ml đạt hiệu lực cao nhất với 50,00 %, đến liều lƣợng

1 ml đạt 33,33%, thấp nhất là liều lƣợng 5ml đạt 29,16%

Liều lƣợng của nấm có liên quan đến số lƣợng bào tử nấm, tác nhân gây chết đối với sâu tơ Sử dụng liều lƣợng 3ml là liều lƣợng thích hợp nhất đối với sâu tơ Liều lƣợng lớn hơn thì số lƣợng bào tử nhiều hơn nên hiệu lực phòng trừ giảm do sự cạnh tranh sinh học của các bào tử trên cơ thể vật chủ

Đánh giá khả năng sâu nhiễm nấm thì các công thức liều lƣợng cũng tăng theo thời gian sau xử lý Trong 3 công thức thí nghiệm thì liều lƣợng 3ml cho tỷ lệ sâu chết

2 ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày

Thời gian sau phun nấm (ngày)

2 ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày Thời gian sau phun nấm (ngày)

26

cao nhất đạt 46,66% so với số sâu chết sau 8 ngày,thấp nhất là công thức liều lƣợng

5ml đạt 23,33% Nhƣ vậy nấm Isaria tenuipes B2015-5 ở công thức liều lƣợng 3 ml

cho tỷ lệ chết và khả năng gây nhiễm nấm cao nhất

Nhƣ vậy chủng nấm I tenuipes B2015-5 đạt hiệu quả phòng trừ sâu tơ cao nhất

và tỉ lệ sâu nhiễm nấm cao nhất ở liều lƣợng 3ml

3.1.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ bào tử đối với hiệu lực phòng trừ sâu tơ của chủng nấm Isaria tenuipes B2015-5

Sâu tơ bị chết sau 4 ngày phun, ở các nồng độ khác nhau thì hiệu lực phòng trừ

lần lƣợt là 17,03%, 24,06%, không có sự sai khác về m t thống kê

Bảng 3.4 Hiệu lực phòng trừ của chủng nấm I Tenuipes B 2015-5 đối với

sâu tơ ở các nồng độ khác nhau

a Tỷ lệ chết của sâu tơ b Tỷ lệ nhiễm nấm của sâu tơ

Hình 3.4 Hiệu lực phòng trừ của chủng nấm I Tenuipes B 2015-5 đối với

sâu tơ ở các nồng độ khác nhau

Thời gian sau phun nấm (ngày)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Thời gian sau phun nấm (ngày)