Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch ép một số loại thảo dược trị bệnh lở loét do vi khuẩn aeromonas hydrophila gây ra trên cá lóc đen (channa striata bloch, 1793) trong điều kiện thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH ---&--- ĐẶNG THỊ PHƯỢNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH ÉP MỘT SỐ LOẠI THẢO DƯỢC TRỊ BỆNH LỞ LOÉT DO VI KHUẨN Aeromonas hydrophila

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH -& -

ĐẶNG THỊ PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH

ÉP MỘT SỐ LOẠI THẢO DƯỢC TRỊ BỆNH LỞ LOÉT DO VI

KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY RA TRÊN CÁ LÓC ĐEN (Channa striata Bloch, 1793) TRONG ĐIỀU KIỆN THỰC

NGHIỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KỸ SƯ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

Nghệ An - 5/2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH -& -

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH

ÉP MỘT SỐ LOẠI THẢO DƯỢC TRỊ BỆNH LỞ LOÉT DO VI

KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY RA TRÊN CÁ LÓC ĐEN (Channa striata Bloch, 1793) TRONG ĐIỀU KIỆN THỰC

NGHIỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KỸ SƯ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

Người thực hiện: Đặng Thị Phượng Lớp : 53K - NTTS

Người hướng dẫn: ThS Trương Thị Thành Vinh

Nghệ An - 5/2016

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi được sự giúp

đỡ của nhiều thầy cô giáo Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Trường Đại Học Vinh, Ban chủ nhiệm khoa, Phòng thí nghiệm khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành chương trình thực tập

Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn cô giáo Trương Thị Thành Vinh, đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy trong suốt quá trình thực tập cuối khóa và hoàn thành bài khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp 53K_NTTS cùng toàn thể bạn bè, gia đình đã động viên, bên cạnh, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp, mặc dù đã có rất nhiều cố gắng, tuy nhiên

do thời gian có hạn và kiến thức còn hạn chế nên không thể tránh được những sai sót Rất mong được sự quan tâm, góp ý của thầy cô để khóa luận hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Nghệ An, tháng 5 năm 2016

Sinh Viên

Đặng Thị Phƣợng

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU

Thủy sản đang dần trở thành một ngành kinh tế quan trọng trong chiến lược đảm bảo

an ninh lương thực thực phẩm ở phạm vi toàn cầu Năm 2013, tổng sản lượng thủy sản toàn thế giới đạt khoảng 161 triệu tấn (FAO, 2014) Trong cơ cấu phát triển thủy sản trên thế giới thì cá nước ngọt hiện là nhóm đối tượng thủy sản chiếm tỷ trọng chủ yếu (58%) Riêng ở Việt Nam, cá nước ngọt hiện chiếm trên 50% tổng sản lượng nuôi trồng hàng năm của cả nước, tức là khoảng 1,5 triệu tấn/năm

Tuy nhiên, dịch bệnh hiện đang là thách thức lớn nhất đối với phát triển của nuôi trồng thủy sản nước ngọt không chỉ riêng với Việt Nam mà còn là vấn đề của nuôi trồng thủy sản thế giới, đặc biệt là các bệnh do vi khuẩn Ở Mỹ, năm 2006, 45% cá giống thuộc giống cá da trơn chết vì bệnh, trong đó, 60% là do các tác nhân bệnh là vi khuẩn Hàng năm, thiệt hại trên cá da trơn do các bệnh vi khuẩn ở Mỹ ước tính khoảng 80 triệu USD Bệnh do vi khuẩn cũng thường xuyên gây thiệt hại nặng nề cho nghề nuôi cá nước ngọt tại Ấn Độ, Đài Loan, Trung Quốc, Ở Việt Nam, mặc dù chưa có số liệu thống kê chính thức nhưng bệnh do vi khuẩn vẫn được xem là tác nhân gây hại chủ yếu của nghề nuôi cá nước ngọt

Cá lóc đen (Channa striata Bloch, 1793) là một trong những đối tượng nuôi tiềm

năng mới có giá trị kinh tế cao hiện đang được nuôi khá phổ biến ở nước ta Tuy nhiên,

hiện nay tỷ lệ cá nhiễm bệnh lở loét do vi khuẩn Aeromonas hydrophila đã và đang là

một trong những thách thức ảnh hưởng không nhỏ đến tỷ lệ sống, tốc độ tăng trưởng Khi

cá nuôi bị bệnh nhiễm khuẩn, thuốc kháng sinh dường như là lựa chọn đầu tiên của người nuôi và nó đã góp phần quan trọng đến việc điều trị bệnh có hiệu quả Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc kháng sinh quá nhiều, không đúng chỉ định và không đúng cách cũng đã dẫn đến vấn đề kháng thuốc trong NTTS, làm giảm giá trị thương mại của sản phẩm từ đó dẫn đến nguy cơ mất thị trường do các rào cản chất lượng từ các quốc gia và sự tẩy chay của người tiêu dùng (Aoki & ctv, 1990) Vì vậy để góp phần hạn chế rủi ro phòng trị bệnh đúng tác nhân gây bệnh là rất cần thiết

Ngoài ra việc sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh động vật thủy sản có thể để lại dư lượng trong sản phẩm sẽ gây hại cho người tiêu dùng và khả năng tiêu thụ sản phẩm Do đó việc nghiên cứu sử dụng các loại thảo dược trong phòng và trị bệnh nhiễm khuẩn cho các đối tượng động vật thủy sản vừa đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm vừa thân thiện với môi trường sinh thái

Xuất phát từ những yêu cầu, điều kiện thực tế, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên

cứu khả năng kháng khuẩn của dịch ép một số loại thảo dƣợc trị bệnh lở loét do vi

khuẩn Aeromonas hydrophila gây ra trên cá lóc đen (Channa striata Bloch, 1793)

trong điều kiện thực nghiệm”

Với mục tiêu đánh giá hiệu quả dịch ép một số loại thảo dược để trị bệnh lở loét

do vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây ra trên cá Lóc đen (Channa striata Bloch, 1793)

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vài nét về đối tượng nghiên cứu

Hình 1.1 Tỏi (Allium sativum)

Tỏi (danh pháp hai phần: Allium sativum) là một loài thực vật thuộc họ Hành, nghĩa là

có họ hàng với hành tây, hành ta, hành tím, tỏi tây, v.v và cũng được con người sử dụng làm gia vị, thuốc, rau như những loài họ hàng của nó

- Đặc điểm:

Thuộc dạng cây thảo dược sống nhiều năm Thân thực hình trụ, phía dưới mang nhiều rễ phụ, phía trên mang nhiều lá Lá cứng, hình dải, thẳng dài 15 – 50cm, rộng 1-

2,5cm có rãnh khía, mép lá hơi ráp Ở mỗi nách lá phía gốc có một chồi nhỏ sau này phát triển thành một tép tỏi; các tép này nằm chung trong một cái bao (do các bẹ lá trước tạo ra) thành một củ tỏi tức là thân hành(giò) của tỏi Hoa xếp thành tán ở ngọn thân trên một cánh hoa dài 55cm hay hơn Bao hoa màu trắng hay hồng bao bởi một cái mo dễ rụng tận cùng thành mũi nhọn dài Hoa tháng 5-7, quả tháng 9-10

- Bộ phận dùng: củ tỏi là giò của cây tỏi- Bulbus Allii thường có tên là Đại toán

- Nơi sống và thu hái: Cây của miền trung châu Á, được gây trồng nhiều nước ở nhiều nước ôn đới Ở nước ta, cũng trồng nhiều, có những vùng trồng tỏi có tiếng ở Quảng Ngãi, Hà Bắc, Hải Hưng, Ninh Thuận… Tỏi là một món ăn gia vị phổ biến Người ta thường dùng tỏi để pha chế các loại nước chấm, xào nấu, muối dưa hoặc ăn sống để chữa bệnh

-Thành phần hóa học: Các chất chính trong củ tỏi là tinh dầu, với các sulfur và polysulfur devinyle, các vitamin A, B1, B2 và C, các chất kháng khuẩn, trong đó có allycin, allycetoin I và II, men allynin và acid nicotinic

- Tác dụng dược lí: tỏi có vị cay, tính ẩm, có tác dụng hành khí tiêu tích sát trùng giải độc Alixin là hoạt chất có tác dụng nhiều chất của tỏi, có tác dụng ức chế các loại vi khuẩn, các nấm gây bệnh Alixin không hiện diện trong tỏi, nó chỉ sinh ra khi tỏi bị đập dập Alixin là một chất kháng sinh tự nhiên rất mạnh, mạnh hơn cả penicillin Cơ chế tác động của Alixin là gây ức chế quá trình tổng hợp protein, DNA, RNA làm chậm quá trình sinh trưởng của vi sinh vật Nước tỏi pha loãng 125.000 lần vẫn có dấu hiệu ức chế

nhiều loại vi khuẩn gram âm và gram dương như Staphylococcus, Streptococcus, Samonella, V.cholerae, B.dysenteriae, Mycobacterium tuberculosis

Tỏi là chất kháng khuẩn và sát khuẩn Tỏi điều hòa sinh vật của ruột Tỏi là thuốc trị giun đặc biệt là giun kim Tỏi là chất kích thích cơ thể và điều hòa các chức năng chủ yếu như rối loạn gan và các tuyến nội tiết…Ở Việt Nam, một số chế phẩm từ thảo dược

đã được nghiên cứu, sản xuất và áp dụng từ một số địa phương, sản phẩm có tên

VTS1-C và VTS2-T là sản phẩm thảo dược phối chế từ các hoạt chất tách chiết từ tỏi, sị bệnh cho sài đất, nhọ nồi…Tỏi cũng có trong thành phần của thuốc KN-04-12

Hiện nay, ở Trung quốc sản phẩm có nguồn gốc từ tỏi dạng bột mịn trắng đã được người dân sử dụng rộng sãi, được xem như là một loại kháng sinh phổ rộng để phòng trị bệnh các bệnh nhiễm khuẩn cho ĐVTS nuôi

1.1.2 Gừng (Zinggiber officinale Rose)

Gừng có tên khác là can khương, sinh khương

Tên khoa học: Zingiber officinale Rose

Thuộc họ gừng:Zingiberace

Hình 1.2 Củ gừng

Gừng là loại cây sống lâu năm với các thân rễ bò ngang hay tạo thành củ, bao gồm

47 chi và hơn 1000 loài Là một loại cây nhỏ 5cm- 1cm, thân rễ phình to thành củ Lá mọc so le, không cuống , có bẹ hình mác dài khoảng 15cm- 20cm, rộng 2cm, bẹ nhẵn, lưỡi bẹ nhỏ dạng màng

Bộ phận dùng là củ Nhiều loài là các loại cây cảnh, hay cây gia vị, cây thuốc quan trọng Gừng thích hợp với điều kiện nhiệt đới và được trồng khắp nước ta, là loài thực vật sinh trưởng ở châu Á, có nguồn gốc từ Ấn Độ Gừng có vị cay, mùi thơm, tính ấm Từ

lâu, loại thực phẩm này đã đựoc dùng trong ẩm thực và là vị thuốc hữu hiệu

chống nôn Thế nhưng, củ gừng còn có nhiều tác dụng kỳ diệu khác nữa Những năm gần đây, các nghiên cứu về dược lý đã phát hiện ra một số tác dụng đặc biệt khác của củ gừng mà trước đây ít ai nghĩ đến

Gừng là chất kích thích tiêu hóa, điều trị cảm, nôn mửa, trị ho, đau bụng, tiêu chảy, nhức đầu, gừng chống lão hóa Gừng là thứ thuốc tốt với bệnh sỏi mật, gừng có trong vị thuốc nam, gừng có tác dụng cải thiện thành phần máu, gừng vị khô vị cay, có tác dụng thông mạch, giảm đau tim và đột quỵ Chất gingerol trong củ gừng có tác dụng làm giảm đau, hạ sốt

- Nơi sống và thu hái: Cây của vùng Đông Á ôn đới, được trồng rộng rãi làm rau ăn ở miền núi, trung du và đồng bằng Thường trồng bằng củ tách ở cây đã tàn lụi Có thể trồng vào mùa xuân, hoặc thu đông là tốt nhất Ta thường thu hái rau hẹ quanh năm, thường dùng tươi Còn quả chín, phải chờ mùa thu đông, lấy về phơi khô, đập lấy hạt

- Thành phần hóa học: Trong cây hẹ có hợp chất sulfur, saponin, chất đắng và hoạt chất adorin có tác dụng kháng khuẩn và vitamin C.Thân chứa aliin, methylaliin, lá chứa hợp chất sulfit, linalol

bò, cao 30- 40cm Thân màu lục hoặc đỏ tía, phình lên ở những mấu, có lông cứng Lá mọc đối hình xoan dài, gần như không cuống , mép khía răng rất nhỏ, hai mặt lá có lông.Hoa hình đầu, màu trắng ,mọc ở kẽ lá hoặc ngọn thân Quả bế dài 3mm, có 3 cạnh, hơi dẹt

Các nghiên cứu trong y học hiện đại đã phát hiện thấy cỏ mực có saponin, tannin, chất đắng, carotene, ancaloit, tinh dầu, vitamin E, vitamin A

Cỏ mực tính lạnh, vị ngọt chua, không độc, có tác dụng lương huyết (mát huyết), cầm máu, thanh can nhiệt, dưỡng thận âm, làm đen râu tóc Chủ trị: xuất huyết nội tạng (chảy máu dạ dày, tiêu tiện ra máu, thổ huyết do lao, rong kinh), kiết lỵ, viêm gan mạn, chấn thương sưng tấy lở loét, mẫn ngứa, (uống trong, rửa ngoài)

1.1.5 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila

Có rất nhiều hệ thống phân loại vi khuẩn Aeromonas hydrophila khác nhau Theo Bùi

Quang Tề (2006) Aeromonas hydrophila được phân loại như sau:

Hình 1.5 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila khi nhuộm gram

- Đặc tính sinh học: Là vi khuẩn gram âm, được phân lập từ năm 1950 Cấu trúc vi

khuẩn hình que giống hình thái của vi khuẩn Bacillus Kích thước chiều rộng từ 0,3-1µm, chiều dài từ 1-3µm Chúng có khả năng di động nhờ tiêm mao ở đầu tế bào vi khuẩn Vi khuẩn này có thích nghi trong môi trường nước ngọt, nước lợ thậm chí là nước mặn Đây

là vi khuẩn yếm khí tùy tiện, có sức đề kháng tốt đối với các điều kiện bất lợi Chất sát trùng clorin không tiêu diệt được vi khuẩn này , ở nhiệt độ 40C vi khuẩn vẫn phát triển tốt

- Đặc tính gây bệnh: Đây là loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh cực mạnh Khi vào cơ thể chúng di chuyển theo đường máu để tới các cơ quan và gây bệnh Vi khuẩn này có một gene sản sinh độc tố đó là gen Aerolysin Cytotoxin(ACT) độc tố này là yếu tố gây nên tổn thương các mô bệnh Một số nhà khoa học cho rằng đây là loài vi khuẩn cơ hội, chúng chỉ có bệnh khi ghép với một số yếu tố nhiễm trùng khác hoặc khi có các stress nhiệt độ, môi trường ô nhiễm…

- Loài vật cảm nhiễm: Aeromonas hydrophila được phát hiện ở động vật lưỡng cư Ở ếch

vi khuẩn gây bệnh đỏ chân , gây các tổn thất nội tạng và đôi khi gây xuất huyết Ở cá, Aeromonas hydrophila gây bệnh lở loét , thối đuôi, thối vây , xuất huyết nhiễm trùng

máu, tuột vảy, xuất huyết mang , hậu môn ,mắt lồi , bụng chướng

Vi khuẩn này có thể sản sinh ra 2 loại roi: roi ở cực để bơi trong các dung dịch và roi ở bên để di chuyển trên các bề mặt (Altarriba et al., 2003) Vi khuẩn này được phân lập trên môi trường không chọn lọc như Nutrient Agar (NA) hay Tryptone Soy Agar (TSA) Cũng có thể phân lập trên môi trường đặc trưng như Rimler-Shotts (Zimmermanm, 1980), peptone beef-extract glycogen agar (Sanarelli, 1891) bằng cách ủ

ở 20 – 300C trong 18 – 36 giờ Những khuẩn lạc của Aeromonas hydrophila phát triển

trên môi trường TSA ở 280

C trong 18 – 24 giờ luôn xuất hiện dạng tròn, màu vàng kem hay vàng sáng, nổi, và đường kính 2 – 3 mm Cepahlothin đã được báo cáo như là tác

nhân làm giàu hóa tốt nhất trong APW để phân lập được A hydrophila đạt hiệu quả tốt

hơn (Sachan và Agarwal, 2000)

- Môi trường nuôi cấy có vai trò rất quan trọng trong sự phát triển và khả năng gây độc (độc lực) của vi khuẩn, đặc biệt là dinh dưỡng có sẵn, nhiệt độ và pH Sautour et al (2003), chỉ có nhiệt độ và độ hoạt động của nước ảnh hưởng chính đến sự phát triển của

A hydrophila, còn pH ảnh hưởng không đáng kể Mặc dù A hydrophila phát triển trong

khoảng nhiệt độ rộng, nhưng thông qua nhiều nhà nghiên cứu cho thấy nhiệt độ thích hợp

cho sự phát triển của A hydrophila từ 25 – 35 0C, trong khi có một số nhà nghiên cứu đã tìm thấy khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn ở 200C (Popoff, 1984) Tuy nhiên, Uddin et al (1997) đã tìm thấy khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển

của A hydrophila là 34,5 ± 1,0°C Sự phát triển của A hydrophila ở các khoảng nhiệt độ

khác nhau: từ 4 – 420C (Palumbo et al., 1985), từ 5 – 350C (Callister và Agger, 1987) [27]

- Có một vài nghiên cứu mô tả về khả năng gây bệnh của A hydrophila ở những loài cá

khác nhau thì khác nhau, điều này chủ yếu là do tính không đồng dạng giữa các chủng, sự khác nhau về cơ chế tấn công và gây độc đối với nhũng cơ thể cá bị nhiễm bệnh (Fang et al., 2004)

- Phân bố

Cá lóc sống phổ biến ở đồng ruộng, kênh rạch, ao hồ, đầm, sông, thích nghi được cả với môi trường nước đục, tù, nươc lợ, có thể chịu đựng được ở nhiệt độ trên 30 0C Cá thích ở nơi có rong đuôi chó, cỏ, đám bèo, vì ở nơi đây cá dể ẩn mình rình mồi Vào mùa

hè cá thường hoạt động và bắt mồi ở tầng nước mặt Mùa đông cá hoạt động ở tầng nước sâu hơn

-Tập tính sinh học

Thích sống ở vùng nước đục có nhiều rong cỏ, thường nằm phục ở dưới đáy vùng nước nông có nhiều cỏ Tính thích nghi với môi trường xung quanh rất mạnh, nhờ có cơ quan hô hấp phụ nên nó có thể hít thở được O2 trong không khí Ở vùng nước hàm lượng

O2 thấp cũng vẫn sống được, có khi không cần nước chỉ cần da và mang cá có độ ẩm nhất định vẫn có thể sống được thời gian khá lâu

- Tính ăn

Cá quả thuộc loại cá dữ Thức ăn là chân chèo và râu ngành; thân dài 3 - 8cm ăn côn trùng, cá con và tôm con; thân dài trên 8cm ăn cá con Khi trọng lượng nặng 0,5 kg cá có thể ăn 100 g thức ăn Trong điều kiện nuôi nó cũng ăn thức ăn chế biến Mùa đông không bắt mồi

- Sinh trưởng

Tương đối nhanh Con lớn nhất đến 5 kg, nhìn chung cá 1 tuổi thân dài 19 - 39cm nặng 95 - 760g; Cá 2 tuổi thân dài 38,5-40cm, nặng 625 - 1.395g; cá 3 tuổi thân dài 45-59cm, nặng 1.467 - 2.031g (con đực và cái chênh lệch lớn); khi nhiệt độ trên 200C sinh trưởng nhanh, dưới 150C sinh trưởng chậm

- Sinh sản

Cá lóc 1 - 2 tuổi bắt đầu đẻ trứng, mùa vụ sinh sản từ tháng 4 - 8, tập trung vào tháng 4 - 5 Cá thường đẻ vào sáng sớm sau những trận mưa rào một hai ngày nơi yên tỉnh có nhiều thực vật thủy sinh

1.2.Tình hình nghiên cứu bệnh do vi khuẩn Aeromonas.hydrophila gây ra cho động

vật thủy sản:

Bệnh do vi khuẩn Aermonas spp được nghiên cứu đầu tiên bởi Scaperclous (1930)

và nhóm vi khuẩn này được biết đến là nguyên nhân gây bệnh xuất huyết trên cá chình

và cá chép ở nhiều nước trên thế giới (Inglis et al., 1993; Aoki , 1999; Cipriano, 2001.) Theo báo cáo của Tanasomwang anh Saitanu (1979) đã tìm thấy vi khuẩn

A.hydrophila gây bệnh xuất huyết do nhiễm trùng máu trên cá basa nuôi trong bè gỗ Ngoài ra một số tác giả cũng đã nhận định chính A.hydrophila là tác nhân gây bệnh xuất

huyết trên cá chép và cá trê trắng giống

Bên cạnh đó, nghiên cứu gần đây của Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv (2012) đã xác định loài vi khuẩn này cũng gây xuất huyết trên lươn đồng và cũng chính là tác nhân gây bệnh trên cá rô ( Đặng Thụy Mai Thy 2012) Ngoài những nghiên cứu trên,theo Lư Trí

Tài (2010) vi khuẩn A.hydrophila chiếm cao nhất 38,3% gây bệnh trên cá lóc

Tương tự đến năm 2012 tác giả Phạm Minh Đức và ctv xác định được 4 loài vi

khuẩn gây bệnh trên cá lóc.Trong đó vi khuẩn A.hydrophila cũng có tần số xuất hiện cao nhất chiếm 54,3% Từ những ghi nhận trên cho thấy loài vi khuẩn A.hydrophila đã có sự

mở rộng phổ loài cảm nhiễm trên các đối tượng cá nước ngọt hiện nay

A.hyrophila thuộc nhóm Aeromonas di động và là tác nhân chủ yếu gây bệnh nhiễm

trùng huyết (MAS), cũng là tác nhân cơ hội (thứ cấp) gây bệnh EUS (Robert, 1993)

Bệnh do A.hydrophila gây ra được gọi là bệnh "Đốm đỏ" (Huizinga et al., 1979)

Trong điều kiện bình thường, A.hydrophila không gây bệnh đối với các sinh vật

sống, nhưng khi môi trường ô nhiễm, cá bị stress, thay đổi sinh lý đột ngột hay bị nhiễm

những mầm bệnh khác thì A.hydrophila là tác nhân gây bệnh tiềm tàng (Plumb et al., 1976; Fang et al., 2000) A.hydrophila trở thành một tác nhân gây bệnh trầm trọng trong

nghề nuôi cá thâm canh do tăng sức tải môi trường, sinh lý cá nuôi bị rối loạn (Shaw và

Squires, 1984) Khi điều kiện môi trường thuận lợi A.hydrophila tăng sinh rất nhanh và

sản sinh ra độc tố ECP rất nhiều, đây là nguyên nhân gây bệnh đột ngột cho cá và thậm chí làm cá chết ngay (Allan và Stevenson,1981; Yadav et al., 1992; Vivas et al., 2004a)

1.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng thảo dƣợc trong phòng và trị bệnh nhiễm

khuẩn ở động vật thủy sản

1.3.1 Tình hình nghiên cứu sử dụng thảo dược trên thế giới

Nghiên cứu và ứng dụng các loại thảo dược có hiệu quả tốt trong việc phòng trị bệnh cho con người đã được nghiên cứu từ rất lâu và hiện đang rất phát triển (Nguyễn Thị Vân Thái và ctv, 2003)[20] Tuy nhiên việc nghiên cứu và cho ra đời các loaị sản phẩm thuốc từ thảo dược có tác dụng phòng và trị bệnh cho động vật thuỷ sản nói riêng thì còn rất hạn chế Nghiên cứu và sử dụng kháng sinh thảo dược đã thực sự có những lợi ích thiết thực ví như chi phí thấp, dễ sử dụng, không gây hại đến môi trường tạo ra sản phẩm đạt tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm Ngoài ra, một ưu điểm nữa của thảo dược là dễ tìm kiếm ngoài tự nhiên hoặc người dân có thể tự trồng được Chính vì vậy hiện đã có rất nhiều nước trên thế giới quan tâm nghiên cứu ứng dụng thảo dược vào trong lĩnh vực nuôi trồng thuỷ sản, trong số đó phải kể đến Ấn Độ và Trung Quốc

Hiện nay ở Trung Quốc sản phẩm được sử dụng phổ biến và nhiều người biết đến

có nguồn gốc từ tỏi (Allium sativum), đóng gói dạng bột mịn trắng với trọng lượng

1kg/gói (trong gói 1kg có 10 gói nhỏ mỗi gói có trọng lượng 100gram) đã được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả cao trong việc phòng và trị bệnh nhiễm khuẩn trên cá trắm cỏ nói riêng và cá nuôi nước ngọt nói chung

Cũng ở Trung Quốc đã có báo cáo nghiên cứu cho biết hẹ (Allium tuberosum) có tính kháng nấm rất tốt, cụ thể với các nấm có tên sau Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Coprinus comatus, Mycosphaerella arachidicola, và Botrytis cinerea Một

thí nghiệm chi tiết đã được tiến hành xác định, liều gây chết LC50 có hiệu quả chống lại

nấm Botrytis cinerea ở nồng độ 2µM, sau 1h ngâm trong khoảng pH giao động lớn từ 1,6

đến 12,3 Đồng thời cũng đã xác định được tác dụng một loại protein có tác dụng ức chế

quá trình hình thành Cysteine trong tế bào loài nấm Fusarium oxysporum, Fusarium solani của Chồi Hẹ (Biochemical and Biophysical Research Communications 279, 74 –

80 (2000) Tuy nhiên hiệu quả của Allium tuberosum giảm mạnh và có thể không còn tính kháng nấm khi có mặt của trypsin (Lam.Y W, & ctv , 2000)

Một hợp tác nghiên cứu giữa các nhà nghiên cứu người Trung Quốc và Ấn Độ về hiệu quả của 1 số thảo dược đối với khả năng kháng lại virut đốm trắng trên tôm

(Penaeus monodon) Thí nghiệm được tiến hành như sau: Năm loại thảo mộc lần lượt có tên Cyanodon dactylon, Aegle marmelos, Tinospora cordifolia, Picrorhiza kurooa và

Eclipta alba được tách chiết bằng phương pháp methanol, tiến hành dùng thảo dược đã

được tách chiết trộn vào thức ăn lần lượt với các nồng độ sau 100mg/kg thức ăn, 200mg/kg thức ăn, 400mg/kg thức ăn; 800mg/kg thức ăn Sau 7 ngày thí nghiệm lô đối chứng (lô không có tác động của thảo mộc), tôm đã chết Sau 25 ngày lô thí nghiệm có ăn thảo mộc ở nồng đô 800mg/kg thức ăn có tỷ lệ sống đạt trên 74% (P<0.0001) (Thavasimuthu C, & ctv, 2006)[43].Tại Ai Cập, một nghiên cứu còn mang tính chất sơ

khai trên cá rô phi (Oreochromis niloticus) giống trong khẩu phần ăn có bổ sung gừng

với lượng 200 mg/kg TA trong khoảng thời gian 17 tuần đã có hiệu quả làm nâng cao tỷ

lệ sống (Ashraf M & ctv, 2008) Tuy nhiên các nhà nghiên cứu không đưa thêm giải thích nào cho đề xuất trên

Cũng tại Ai Cập khi nghiên cứu, tiến hành bổ sung tỏi vào thức ăn, thí nghiệm trong 3 tháng mùa hè và 6 tháng mùa đông để kiểm tra hiệu quả tăng trưởng của cá rô phi Kết quả trong 3 tháng mùa hè không có sự khác biệt giữa lô đối chứng và lô thí nghiệm, nhưng qua 6 tháng mùa đông cá ở lô thí nghiệm được bổ sung 1% tỏi vào thức

ăn, rô phi có khả năng tăng trọng tốt, các lô đối chứng trọng lượng cá nuôi có giảm (Ahmed.S.D & ctv, 2007)[35]

Theo kết quả nghiên cứu của Mohan Thakare, 2004[35] Khi ông tiến hành nghiên

cứu tính kháng khuẩn của cây nghệ (Curcuma longa ), gừng (Zingiber officinale), hạt tiêu đen (Piper nigrum), cây quế (Cinnamomum cassia), cây húng tây (Thymus vulgaris), Laurus nobilis (Bay leaf), và cây đinh hương (Syzgium aromaticum) với một số loài vi khuẩn cụ thể như E coli, S.typhimurium, E faecium, và E faecalis bằng phương pháp kháng sinh đồ Kết quả chỉ rõ dịch tách chiết từ nghệ có tính kháng E coli, S typhimurium, và E faecalis với nồng độ 130 mg/khoanh, cũng phương pháp tương tự

húng tây có tính kháng khuẩn tại nồng độ đạt 30 mg/khoanh, nhưng cả 2 loại thảo mộc

này lại không có hiệu quả đối với E.faecium, các thảo mộc còn lại chỉ rõ không có hoạt

tính kháng 4 loài vi khuẩn được chọn đưa vào nghiên cứu Tuy nhiên khi tiến hành nghiên cứu các bước tiếp theo về thử tác dụng độc trên nhiều loài động vật thuỷ sản thì đinh hương có ảnh hưởng đến sự tăng trọng

Nhật Bản, một hợp tác nghiên cứu giữa các nhà khoa học thuộc Bộ Môn Ngư Y- Khoa Thuỷ sản, Đại học Nông- Lâm - Huế và Bộ môn bệnh cá - Trường Đại học Nippon, Tokyo - Nhật Bản cho thấy, 2500 ppm là nồng độ ức chế tối thiểu của dịch chiết lá Trầu

với dung môi là nước cất và ethanol lên tất cả các nấm thuộc họ Saprolegniaceae và Achlya sp Trong khi đó với nồng độ 1250 ppm có khả năng ức chế nấm Aphanomycespiscida Tuy nhiên nghiên cứu mới chỉ triển khai trong phòng thí nghiệm

Nhìn chung trong nuôi trồng thuỷ sản đã có những quan tâm, chú trọng đến hiệu quả của thảo mộc trong khía cạnh về tính kháng khuẩn hay nâng cao sức đề kháng, tính miễn dịch của vật nuôi, tuy nhiên các kết quả nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở trong quy mô phòng thí nghiệm Các sản phẩm có mặt trên thị trường được ra đời từ kết quả nghiên cứu là còn hạn hữu

1.3.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng thảo dược ở Việt Nam

Theo kinh nghiệm dân gian, có khá nhiều loại cây thuốc nam, thảo mộc đã và đang được sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản như lá xoan, tỏi, cây chó đẻ răng cưa, hạt cau, hạt

bí ngô… Mỗi một loại có tác dụng khác nhau trong việc phòng và trị bệnh, một số cây

có ưu thế trong việc phòng trị bệnh do tác nhân gây bệnh là ký sinh trùng và một số cây

có ưu thế phòng trị bệnh nhiễm khuẩn Hợp chất có trong thảo dược rất phong phú, chúng được chia thành các nhóm trong đó bao gồm kháng sinh thực vật (phytocide) có tác dụng diệt khuẩn cũng như hạn chế sự sinh trưởng của các loại vi khuẩn

Trong báo cáo ” Sử dụng kháng sinh thảo mộc phòng và chữa trị một số bệnh nhiễm khuẩn trong nuôi động vật thuỷ sản ”, Nguyễn Thị Vân Thái và ctv đã trình bày về khả năng sử dụng y dược y học cổ truyền trong phòng và chữa trị một số bệnh nhiễm khuẩn cho tôm cá, động vật thân mềm… thay thế các thuốc kháng sinh hiện đang phổ biến trên thị trường[25] Các tác giả đã đưa ra phương pháp phòngbệnh bằng thức ăn bổ trợ có tác dụng tăng cường sức đề kháng của động vật thuỷ sản Trong một nghiên cứu vào năm 2006, Nguyễn Viết Khuê và ctv cho thấy trong số những người được phỏng vấn

có 41,33% người nuôi sử dụng thảo dược, phổ biến là tỏi và lá xoan, 15% dùng không hiệu quả, 85% đạt hiệu quả từ ít đến nhiều Việc nghiên cứu thành phần các hợp chất có

trong thảo mộc là cơ sở nghiên cứu cho ra các sản phẩm thuốc ứng dụng phòng trị bệnh động vật thuỷ sản nói riêng

Thuốc KN-04-12 là sản phẩm phối chế của đề tài cấp nhà nước mã số KN-04-12 năm 1990-1995 Thành phần thuốc bao gồm các cây thuốc có kháng sinh thực vật (tỏi, sài đất, nhọ nồi, cỏ sữa, chó đẻ răng cưa…), vitamin và một số vi lượng khác Thuốc được nghiền thành bột, có mùi đặc trưng của tỏi Thuốc có tác dụng phòng và trị bệnh nhiễm khuẩn như đốm đỏ, thối mang, viêm ruột của cá nuôi lồng hoặc nuôi ao Bên cạnh đó một

số tác giả cho rằng khi cá có dấu hiệu ban đầu của bệnh nhiễm khuẩn có thể trị bằng cách cho tỏi (0.5kg tỏi/ 100kg cá) và bổ sung 0.3% muối ăn trong thức ăn viên cho cá ăn, hiệu quả đạt được rất tốt (Võ Thị Cúc Hoa và Thái Bá Hồ (1980) Một sản phẩm khác có tên VTS1- C và VTS1- T là sản phẩm thảo dươc phối chế từ các hoạt chất tách chiết từ tỏi, sài đất, nhọ nồi để phòng trị bệnh cho Tôm sú và cá Tra nuôi ao và nuôi lồng để phòng trị môt số bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophyla, Edwardsiella tarda, Hafnia alvei, Vibrio harveyi, V alginolyticus Thuốc BecaNor 1 và BecaNor 2 là 2 sản phẩm với thành phân chính là tỏi và gừng bước đầu đã có hiệu quả rất tốt trong việc phòng và trị bệnh đốm đỏ ở qui mô phòng thí nghiệm, sản phẩm được ra đời do sự nỗ lực trong việc nghiên cứu biện pháp phòng và trị bệnh lở loét trên cá trắm cỏ của CEDMA đồng thời với sự tài trợ của dự án NORAD Năm 2006 đã tiến hành thử nghiệm ngoài thực địa 2 loại dược thảo BecaNor TD1 và BecaNor TD 2 tại 3 tỉnh Quảng Ninh, Nam Định, Hà Giang phòng bệnh cho cá trắm cỏ, hàng tháng cho cá ăn dược thảo với liều lượng 7g/ kg thức ăn Kết quả thu được cho thấy tại 2 tỉnh Quảng Ninh và Nam Định, cá trắm cỏ cho ăn thuốc phòng đã không nhiễm bệnh trong khi đó ở các lô đối chứng vẫn có hiện tượng cá chết do nhiễm bệnh vi khuẩn

Tại tỉnh Hà Giang, tỷ lệ chết giảm từ 100% xuống còn 40% khi cho cá ăn thuốc phòng ( Nguyễn Thị Hà và ctv, 2006 ) Tuy nhiên, việc thử nghiệm chưa được thực hiện trên diện rộng nên chưa khẳng định được hiệu quả của các dược thảo này đồng thời chưa được áp dụng rộng rãi (Phạm Văn Thư, 2006) [24]

Năm 2007, Nguyễn Ngọc Phước và ctv đã tiến hành nghiên cứu sử dụng lá trầu không để trị bệnh do nấm, vi khuẩn gây ra trên đối tượng nuôi động vật thuỷ sản Bước đầu đã có kết quả tốt ở quy mô phòng thí nghiệm [22]

Năm (2008), Trương Thị Mỹ Hạnh và ctv đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch triết lá trầu và cũng đạt được những kết quả nhất định.Tuy nhiên đó mới chỉ là những nghiên cứu trong phòng thí nghiệm [6]

Năm 2011, Huỳnh Kim Diệu nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của cỏ mực thu tại khu vực đồng bằng sông Cửu Long , kết quả cho thấy chúng có khả năng kháng khuẩn tương đối tốt đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản [7]

Nguyễn Thị Thanh(2011) đã thử nghiệm khả năng phòng và trị bệnh lở loét do vi

khuẩn Streptococcus spp trên cá trê lai bằng hỗn hợp dịch ép củ tỏi và lá hung[8]

Trần Ngọc Hùng, Trương Thị Thành Vinh 2012 đã nghiên cứu tính kháng khuẩn

của một số loại thảo mộc với vi khuẩn Streptococcus spp gây bệnh lỡ loét trên rô phi

vằn[9]

Như vậy, ở Việt Nam cũng tồn tại những vấn đề cần giải quyết mà tình hình chung của thế giới đang yêu cầu, ngoài các vấn đề đã giải quyết được thì các nghiên cứu vẫn còn bộc lộ một số hạn chế như: động vật thủy sản được thử nghiệm chưa nhiều, các nghiên cứu trên thực địa còn ít , sản phẩm thuốc có nguồn gốc thảo dược còn khiêm tốn,

ít có nghiên cứu đề cập đến tác động của nhiệt độ, các chất hóa học…đến tính kháng khuẩn của dịch chiết thảo dược

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Vi khuẩn Aeromonas hydrophyla được cung cấp từ trung tâm quan trắc cảnh báo

môi trường và Bệnh Thủy Sản- Viện nghiên cứu NTTS1 lưu giữ tại phòng thí nghiệm vi

sinh bệnh học thủy sản khoa Nông – Lâm - Ngư trường Đại học Vinh

- Dịch ép thảo dược: Tỏi (Allium sativum L), Gừng (Zingiber officinale), lá Hẹ

(Allium sativum), Cỏ Mực (Eclipta alba)

2.2 Vật liệu, dụng cụ, hóa chất

- Kháng sinh: Doxycycline 30µg, Tetracyclin 30µg, Oxacillin 1µg, Erythromycin

15µg

- Cá lóc đen kích cỡ cá thương phẩm

- Môi trường dinh dưỡng cơ bản NA (Nutrient Agar)

- Ống nghiệm vô trùng các loại, bình tam giác, đĩa peptri, que cấy vô trùng, đèn cồn, lamen, lam, pipet, kẹp gắp, dầu soi kính, tủ lạnh, tủ sấy, cân điện tử, kính hiển vi, nước muối sinh lý, nước cất, kim tiêm, bút ghi kính, máy ảnh

- Hoá chất, thuốc: Cồn, giấy tẩm kháng sinh

- Dụng cụ thu dịch ép thảo dược: Máy xay, máy ép, chai, lọ

- Đĩa giấy tẩm nước ép thảo dược đường kính 6mm

- Dao, kéo tiểu phẫu, panh, khay Inox, găng tay…

2.3 Nội dung nghiên cứu

- ND1: Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của dịch ép một số loại thảo dược: Tỏi

(Allium sativum), Gừng (Zingiber officinale ), Hẹ (Allium sativum), Cỏ Mực (Eclipta alba), đối với vi khuẩn A hydrophila gây bệnh lở loét trên cá lóc đen

- ND2: Thử nghiệm ảnh hưởng của dịch chiết thảo dược với các loại dung môi: Rượu, Cồn 950, Chloroform, Nước cất đến khả năng kháng vi khuẩn A hydrophila

- ND3: Thử nghiệm ảnh hưởng của nồng độ pha loãng dịch ép thảo dược tới khả

năng kháng vi khuẩn A hydrophila

- ND4: Thử nghiệm khả năng trị bệnh lở loét cho cá lóc đen do vi khuẩn A hydrophila gây ra của dịch ép thảo dược trong điều kiện thực nghiệm

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp thu dịch ép thảo dược

- Đối với tỏi và gừng sử dụng bộ phận thường gọi là củ, ta lấy những củ chắc, đều, đẹp Sau đó bỏ vỏ và rửa sạch, để ráo nước tự nhiên ở nhiệt độ phòng Tiến hành cân khối lượng củ rồi cho vào máy ép thu lấy dịch ép Dịch ép được bảo quản ở nơi khô thoáng và

ở nhiệt độ phòng

- Đối với các loại thảo mộc: lá hẹ và lá cỏ mực (sử dụng bộ phận lá, lấy những lá bánh tẻ); chọn thảo mộc tươi, rửa sạch, để ráo nước tự nhiên ở nhiệt độ phòng, thái nhỏ, cân khối lượng rồi cho vào máy xay thật nhuyễn thu lấy dịch ép Dịch ép được bảo quản

ở nhiệt độ phòng

Hình 2.1 Quy trình thu dịch ép thảo dược

2.4.2 Phương pháp pha loãng nồng độ thảo dược

Pha loãng nồng độ theo phương pháp đường chéo trong hóa học:

Chuẩn bị một số ống nghiệm vô trùng, mỗi ống chứa 9ml nước muối sinh lý

Lấy 1ml mẫu nước cần nghiên cứu, đưa sang ống nghiêm thứ nhất làm đồng đều ta được độ pha loãng 10 lần (10-1)

Lấy 1ml nước ở ống nghiệm 10-1 cho vào ống nghiệm thứ 2, ta được độ pha loãng

100 lần (10-2

)

Cứ làm như vậy ta được độ pha loãng tiếp theo: 10-3, 10-4, …,10-n

Lấy 0,1ml nước nghiên cứu ở 2 – 3 độ pha loãng khác nhau, nuôi cấy trên đĩa thạch chứa môi trường cần thiết bằng que gạt Mỗi độ pha loãng nuôi cấy từ 2 – 3 đĩa lồng

Nuôi cấy ở nhiệt độ 300C, sau 24 giờ, đem ra đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch, lấy giá trị trung bình của các đĩa lồng có cùng nồng độ pha loãng

Hình 2.2 Các bước pha loãng nồng độ vi khuẩn

NA(-) NA(-) NA(-)

Nước muối sinh lý

Vi khuẩn gốc 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

Mật độ vi khuẩn tính theo công thức: X =

K V

A

.

Trong đó:

X: mật độ vi khuẩn

A: Số lượng khuẩn lạc trung bình trong 1 độ pha loãng

V: Thể nước đưa vào nuôi cấy

K: Hệ số pha loãng

2.4.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch ép một số loại thảo

dược đối với vi khuẩn A hydrophila gây bệnh lở loét trên cá lóc đen

Xác định khả năng kháng vi khuấn Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá lóc đen của dịch ép nguyên chất các loại thảo dược: củ Tỏi (Allium sativum), củ Gừng (Zingiber officinale ), lá Hẹ (Allium tuberosum) và lá Cỏ Mực (Eclipta alba Hassk) Bố

trí thí nghiệm theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn Thực hiện trên 4 công thức nghiệm, mỗi công thức nghiệm được lặp lại 3 lần

- Thu lấy dịch ép các loại thảo dược

- Vi khuẩn được lưu giữ lấy ra nuôi cấy tăng sinh, sau đó xác định mật độ vi khuẩn, tiến hành thí nghiệm với mật độ vi khuẩn 106

- Từ thí nghiệm này, ta so sánh được hiệu quả kháng khuẩn giữa dịch ép các loại

thảo dược Chọn loại thảo dược có tính kháng khuẩn tốt đối với vi khuẩn Aeromonas hydrophyla để tiến hành thí nghiệm tiếp theo

Các loại thảo dược