Nhóm nghiên cứu đã thiết lập thành công quy trình định lượng DNA EBV trong máu ngoại vi của những bệnh nhân ung thư vòm mũi họng với độ nhạy 96,9%. Đối chiếu với kết quả xét nghiệm trên nhóm chứng là những người khỏe mạnh cho thấy độ đặc hiệu là 98%.
Trang 1THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG DNA EBV TRONG MÁU NGOẠI VI VỚI ĐỘ NHẠY CAO GÓP PHẦN SÀNG LỌC
PHÁT HIỆN SỚM
HỒ HỮU THỌ1, TRIỆU THỊ NGUYỆT1, ĐỖ TRÂM ANH2, NGUYỄN ĐÌNH ỨNG, ĐINH THỊ THU HẰNG3, BÙI TIẾN SỸ4, HOÀNG ĐÀO CHINH5, LÊ MINH KỲ6, VŨ TRƯỜNG PHONG, NGÔ THANH TÙNG7, NGUYỄN KIM LƯU8, NGUYỄN VĂN BA, HỒ ANH SƠN3, HOÀNG VĂN LƯƠNG3, NGHIÊM ĐỨC THUẬN2
TÓM TẮT
Nhóm nghiên cứu đã thiết lập thành công quy trình định lượng DNA EBV trong máu ngoại vi của những bệnh nhân ung thư vòm mũi họng với độ nhạy 96,9% Đối chiếu với kết quả xét nghiệm trên nhóm chứng là những người khỏe mạnh cho thấy độ đặc hiệu là 98% Quy trình kỹ thuật định lượng cf-DNA EBV đã được kiểm định với bộ mẫu chuẩn quốc tế được cung cấp bởi Đại học Hồng Kông Quy trình được thiết lập trong nghiê n cứu góp phần sàng lọc phát hiện sớm bệnh ung thư vòm mũi họng
SUMMARY
Development of ultrasensitive q-pcr assay based on circulating EBV DNA for early detection of
nasopharyngeal carcinoma
In our study, we have establihed successfully an ultrasensitive qPCR assay for detection cf-EBV DNA Evaluation on clinical samples has proven a remarkably high sensitivity of 96.9% and high specificity of 98% Moreover, we have also validated the performance of the optimal qPCR assay using the international standard panel that was provided by Chinese University of Hong Kong
1 Labo Nghiên cứu Gen, Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự - Học viện Quân Y
2 Khoa Tai-Mũi-Họng - Bệnh viện Quân Y 103 - Học viện Quân Y
3 Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự - Học viện Quân Y
4Khoa Sinh học Phân tử - Bệnh viện Trung Ương Quân Đội 108
5 Khoa Xạ phẫu và Xạ trị - Bệnh viện Trung Ương Quân Đội 108
6Trung tâm Ung Bướu và phẫu thuật Đầu cổ - Viện Tai-Mũi-Họng Trung Ương
7Khoa Ung thư Đầu cổ và xạ trị - Bệnh viện K
Trung tâm Ung Bướu và Y học Hạt nhân - Bệnh viện Quân Y 103 - Học viện Quân Y
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư vòm mũi họng (UTVMH) là loại ung thư
rất phổ biến ở một số nước Châu Á, trong đó có Việt
đoán ở giai đoạn muộn, đồng thời các triệu chứng
của bệnh thường không đặc hiệu và khó phân biệt
với các bệnh lý khác ở vùng lân cận Bên cạnh đó,
UTVMH thường có di căn hạch sớm[3] Hậu quả là
nhiều bệnh nhân UTVMH được chẩn đoán ở giai
đoạn tiến triển kèm theo di căn, điều trị khó khăn mà
hiệu quả không cao
UTVMH liên quan mật thiết với nhiễm virus
Epstein Barr (EBV), hệ gen của virus này đã được
xác định trong hầu hết các tế bào của khối UTVMH Triển vọng to lớn của DNA-EBV lưu hành trong máu ngoại vi đối với sàng lọc phát hiện sớm, tiên lượng
và đánh giá mức độ đáp ứng điều trị UTVMH đã được khẳng định qua hàng loạt các nghiên cứu trên thế giới trong hơn 15 năm qua Tuy nhiên, hiện vẫn chưa có xét nghiệm DNA-EBV chuẩn hóa nào được
sử dụng trên lâm sàng Tại Việt Nam, quy trình định lượng DNA-EBV hiện nay có độ nhạy còn thấp với ngưỡng phát hiện là 300 copy/ml huyết tương, nên chỉ phát hiện được DNA-EBV trong máu ngoại vi ở 64%-68% số bệnh nhân UTVMH[4-6] Thực tế này đặt
ra yêu cầu cần thiết lập quy trình phát hiện định lượng DNA-EBV trong máu ngoại vi với độ nhạy cao
Trang 2TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 75
ở nước ta, góp phần sàng lọc phát hiện các trường
hợp mắc ung thư vòm mũi họng ở giai đoạn sớm
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
Mẫu bệnh phẩm lâm sàng: Mẫu máu ngoại vi
được chống đông bằng EDTA của 32 bệnh nhân
được chẩn đoán xác định UTVMH dựa vào kết quả
giải phẫu bệnh của sinh thiết vòm mũi họng (nhóm
bệnh) Mẫu máu ngoại vi được chống đông bằng
EDTA của 105 người khỏe mạnh (nhóm chứng)
Các hóa chất dùng trong tách chiết DNA từ
huyết tương bao gồm bộ Kit tách chiết Anapure
DNA/RNA Viral Mini Kit, Isopropanol, Ethanol 100%
Hóa chất dùng trong phản ứng Realtime PCR như:
Quantitect Probe master mix, Quantitect SYBR
master mix, Primer, Probe, DMSO
Panel mẫu chuẩn định lượng DNA của EBV với
giải nồng độ xác định và mẫu huyết tương chuẩn
dương tính với DNA-EBV của Đại học Hồng Kông,
được GS Allen Chan chuyển cho nhóm nghiên cứu
Máy Roto-Gene Q, Tủ hút thao tác di truyền,
máy li tâm, khối ổn nhiệt có lắc, máy vortex,
NanoDrop
Phương pháp nghiên cứu
Thu thập và bảo quản mẫu
Mẫu máu tĩnh mạch ngoại vi với thể tích 5ml/lần
được lấy vào ống chứa chất chống đông K2 EDTA
Trong vòng 6h sau khi lấy, mẫu máu được vận
chuyển đến labo, tách huyết tương
Tách chiết DNA từ huyết tương
DNA huyết tương được tách chiết bằng bộ kit
Anapure DNA/RNA Viral Mini Kit với quy trình được
cải tiến góp phần làm tăng độ nhạy phát hiện
DNA-EBV trong máu ngoại vi
Thiết kế trình tự primer/probe cho phản ứng
realtime PCR
Trình tự mồi và probe được thiết kế và đánh giá
bằng phần mềm Oligo Primer Analysis Software
Thiết kế 3 bộ primer/probe cho phản ứng Realtime
PCR định lượng DNA-EBV nhắm vào các vùng DNA
khác nhau trên bộ gen của EBV: EBNA1, LMP1 và
BamH1-W Các bộ primer/probe được đánh giá sơ
bộ sử dụng chứng dương DNA được tách chiết từ
mẫu huyết tương chuẩn của Đại học Hồng Kông Bộ
primer/probe có tín hiệu khuếch đại sớm và độ đặc
hiệu cao nhất được lựa chọn để tiếp tục tối ưu thành
phần phản ứng và chu trình nhiệt
Realtime PCR định lượng
Phản ứng PCR được tiến hành trên hệ thống máy Rotor-Gene Q với thể tích phản ứng là 20µl và 8,6µl dịch chiết DNA được sử dụng làm khuôn Dữ liệu realtime PCR được thu thập bởi hệ thống Rotor-Gene Q và lưu trong máy tính sau đó sẽ được phân tích bằng phần mềm Rotor-Gene Q Mỗi mẫu được chạy 02 lần lặp lại, mỗi lần chạy luôn kèm theo các chứng âm không chứa khuôn DNA Đường chuẩn được thiết lập sử dụng mẫu chuẩn DNA quốc tế của Đại học Hồng Kông với dãy nồng độ xác định Giá trị trung bình kết quả định lượng của 02 lần lặp lại được sử dụng để tính toán nồng độ
Phương pháp xử lý số liệu
Nồng độ của DNA-EBV huyết tương được tính theo đơn vị số copy/ml huyết tương
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết quả tối ưu quy trình realtime PCR phát hiện DNA-EBV
Tiến hành thiết kế các bộ primer/probe như mô
tả trong phần phương pháp nghiên cứu, bộ primer/probe (III) được tiếp tục sử dụng để tối ưu thành phần phản ứng và chu trình nhiệt
Tối ưu nồng độ mồi
Hình 1 Tối ưu nồng độ mồi cho phản ứng qPCR Các phản ứng realtime PCR (0.1Q), (0.2Q), (0.3Q), (0.4Q), (0.5Q) có cùng lượng Khuôn DNA và nồng
độ primer lần lượt là 0,1µM, 0,2µM, 0,3µM, 0,4µM và 0,5µM Phản ứng (am Q) là chứng âm không có Khuôn DNA và nồng độ primer 0,2µM
Tối ưu nồng độ Probe
Trang 3Hình 2 Tối ưu nồng độ probe cho phản ứng
Realtime PCR Các phản ứng realtime PCR (35 0.2-1+), (35 0.1-1),
(35 0.05- 1) có cùng lượng Khuôn DNA và nồng độ
probe lần lượt là 0,2µM, 0,1µM, 0,05µM Phản ứng
(35 0.2-1- ) là chứng âm không có Khuôn DNA và
nồng độ probe là 0,2µM
Tối ưu nồng độ DMSO
Hình 3 Tối ưu nồng độ DMSO cho phản ứng
Realtime PCR Các phản ứng realtime PCR (10%-Q), (7.5%-Q), (5%-Q), (2.5%- Q) có cùng lượng Khuôn DNA và nồng độ DMSO lần lượt là 10%, 7,5%, 5% và 2,5% Phản ứng (SS-Q) là chứng dương không bổ sung
DMSO
Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime PCR
Số chu kỳ:
45
Nồng độ các thành phần phản ứng Realtime PCR đã tối ưu:
Kết quả đánh giá quy trình trên bộ panel mẫu
chuẩn quốc tế
Trang 4TẠP CHÍ UNG THƯ HỌC VIỆT NAM 77
Hình 4 Độ nhạy của quy trình trên bộ panel mẫu
chuẩn quốc tế Toàn bộ số mẫu (9/9) trong bộ panel mẫu chuẩn
quốc tế với đều cho tín hiệu khuếch đại, mẫu chuẩn
có nồng độ thấp nhất là 25copy/ml Chứng âm
không có khuôn DNA không cho tín hiệu khuếch đại
Kết quả thí nghiệm trên cho thấy, quy trình
realtime PCR tối ưu có độ đặc hiệu cao (chứng âm
không cho tín hiệu khuếch đại) và có khả năng phát
hiện được mẫu DNA của EBV có nồng độ thấp nhất
trong bộ panel mẫu chuẩn quốc tế Kết quả thí
nghiệm với 10 lần lặp lại cho thấy ngưỡng phát hiện
của quy trình realtime PCR tối ưu là 25 copy/ml
huyết tương, tốt hơn rất nhiều so với các nghiên cứu
khác trong nước đã công bố cho đến nay với
ngưỡng phát hiện là 300 copy/ml[4-6]
Đồng thời, khả năng định lượng của quy trình realtime PCR tối ưu cũng được đánh giá trên panel
bộ mẫu chuẩn quốc tế và thu được đường chuẩn với
hệ số tương quan tuyến tính là R2=0.99613 (Hình 5)
Như vậy, quy trình realtime PCR tối ưu có tương quan tuyến tính rất tốt và có khả năng định lượng DNA-EBV với độ tin cậy cao
Hình 5 Đường chuẩn của quy trình tối ưu trên bộ
panel mẫu chuẩn quốc tế Tương quan tuyến tính giữa giá trị Ct với log của nồng độ DNA-EBV có trong các mẫu khác nhau của
bộ panel mẫu chuẩn quốc tế từ 25 - 150.000copy/ml
Đánh giá hiệu quả của quy trình tối ưu trên các mẫu lâm sàng, góp phần sàng lọc phát hiện sớm UTVMH
Hình 5 Độ nhạy, độ đặc hiệu của xét nghiệm định lượng DNA-EBV trong máu ngoại vi
của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng
Kết quả xác định được DNA-EBV trong máu
ngoại vi của 96,9% số bệnh nhân UTVMH (31/32),
do đó độ nhạy của xét nghiệm là 96,9% Nồng độ
DNA-EBV trong các mẫu dương tính ở nhóm bệnh nhân UTVMH dao động trong khoảng từ 53copy/ml-3,8x105copy/ml
Trang 5Trên nhóm chứng khỏe mạnh, kết quả
DNA-EBV dương tính ở 2/105 trường hợp, tương ứng với
độ đặc hiệu là 98% (103/105) Với 2 trường hợp
nhóm chứng khoẻ mạnh dương tính với DNA-EBV,
nồng độ DNA-EBV xác định đều dưới 40copies/ml
và xét nghiệm lại sau 2 tuần đều cho kết quả âm
tính, giúp phân biệt với những trường hợp dương
tính thật
Như vậy, quy trình định lượng nồng độ
DNA-EBV trong máu ngoại vi đã được thiết lập và đánh
giá trên panel mẫu chuẩn quốc tế của Đại học Hồng
Kông với ngưỡng phát hiện là 25copy/ml Đồng thời,
đánh giá trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng thu được độ
nhạy 97% và độ đặc hiệu 98% Kết quả đạt được
tương đương với các công bố trên thế giới[7,8,9]
KẾT LUẬN
Quy trình realtime PCR định lượng DNA EBV
với độ nhạy cao (25copy/ml) đã được thiết lập thành
công trong nghiên cứu này và quy trình đã được
đánh giá chất lượng trên bộ mẫu chuẩn quốc tế
đảm bảo độ tin cậy cao
Hiệu quả sàng lọc chẩn đoán sớm UTVMH trên
nhóm đối tượng nghiên cứu của quy trình tối ưu định
lượng DNA EBV tự do lưu hành trong máu ngoại vi
đạt được độ nhạy là 96,9% và và độ đặc hiệu 98%
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Yu, W.M and S.S Hussain, Incidence of
nasopharyngeal carcinoma in Chinese
immigrants, compared with Chinese in China
and South East Asia: review J Laryngol Otol,
2009 123 (10): p 1067-74
2 Vokes, E.E., D.N Liebowitz, and R.R
Weichselbaum, Nasopharyngeal carcinoma
Lancet, 1997 350(9084): p 1087-91
3 Stacey EM, F.R., "The nose, paranasal sinuses, and nasopharynx”, in: Sternberg SS, editor, Diagnostic Surgical Pathology, vol1, 3nd edition Lippincott William & Wilkins, Philadelphia, 1999 1: p 885-917
4 Phạm Huy Tần, T.H.T., Trần Thị Thuý Hằng, Nguyễn Đình Phúc, Trần Vân Khánh, Nồng độ EBV-DNA huyết tương của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng và mối tương quan với chẩn đoán giai đoạn TNM (Tumor Nodes Metastasis) Tạp chí nghiên cứu Y học, 2015 95(3): p 24-31
5 Tú, Đ.V., Đánh giá nồng độ EBV-DNA trong huyết tương bệnh nhân ung thư vòm mũi họng giai đoạn II-III trước và sau điều trị Luận văn tốt nghiệp bác sỹ nội trú, Trường Đại học Y Hà Nội,
2012
6 Nguyễn Tuyết Mai, Đ.V.T., Mối tương quan giữa
nồng độ EBV-DNA huyết tương với kết quả điều
trị trong ung thư vòm họng giai đoạn II, III tại
bệnh viện K Y học Việt Nam, 2012 1: p 43-46
7 Lo, Y.M., et al., Quantitative analysis of cell-free Epstein-Barr virus DNA in plasma of patients with nasopharyngeal carcinoma Cancer Res,
1999 59(6): p 1188-91
8 Shao, J.Y., et al., Comparison of plasma Epstein-Barr virus (EBV) DNA levels and serum EBV immunoglobulin A/virus capsid antigen antibody titers in patients with nasopharyngeal carcinoma Cancer, 2004 100(6): p 1162-70
9 Kondo, S., et al., Diagnostic value of serum EBV-DNA quantification and antibody to viral capsid antigen in nasopharyngeal carcinoma patients Cancer Sci, 2004 95(6): p 508-13