Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật – Kĩ thuật và ứng dụng: Bài 3 – TS. Vũ Bích Ngọc

Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật – Kĩ thuật và ứng dụng: Bài 3 – TS. Vũ Bích Ngọc tìm hiểu về kỹ thuật nuôi cấy sơ cấp tế bào động vật; một số khái niệm dòng tế bào, quy trình nuôi cấy sơ cấp, thu nhận - bảo quản mẫu...

Câu hỏi

Tại sao?

Bạn là chuyên gia và tế bào gốc, bạn tư vấn cho bệnh nhân nên thu mô nào nào trong các mô sau để phân lập

được tế bào gốc?

Ông Đại bị bệnh thoái hoá khớp gối cấp độ nặng, các thuốc truyền thống không thể điều trị được Ông Đại tìm

hiểu và thấy ghép tế bào gốc có thể điều trị được căn bệnh này

Nuôi cấy tế bào là gì?

Lấy tế bào khỏi cơ thể

động vật và giúp tế bào

tăng trưởng trong môi

trường nhân tạo

Nuôi cấy sơ cấp

Nuôi cấy thứ cấp

• TRONG NUÔI CẤY SƠ CẤP, CÁC

TẾ BÀO BAN ĐẦU THƯỜNG LÀ MỘT HỖN HỢP CÁC DÒNG TẾ BÀO KHÁC NHAU, HOẶC CHỨA MỘT KIỂU KẾ BÀO TRỘI NHẤT, TRONG

ĐÓ CÓ NHỮNG TẾ BÀO QUAN TÂM VÀ NHỮNG TẾ BÀO KHÁC (ĐƯỢC COI LÀ TẾ BÀO TẠP NHIỄM

• SAU ĐÓ, VIỆC NUÔI CẤY ĐƯỢC GỌI LÀ THỨ CẤP (SECONDARY CULTURE)

Thu nhận

cơ quan

Tế bào thứ cấp Cấy chuyền

Cấy chuyền

Nuôi mô

Cắt nhỏ Thành

tế bào đơn

Tế bào sơ cấp

– Thường chứa kiểu tế bào đơn – Có thể tăng sinh liên tục trong nhiều thế hệ

– Có hai kiểu dòng tế bào khi nuôi cấy:

• Dòng tế bào

• Dòng tế bào liên tục

Nuôi cấy sơ cấp-Tế bào

sơ cấp Nuôi cấy thứ cấp-Tế bào thứ cấp

Tăng sinh

– Có đời sống hạn định, lão hóa

sau một số lần cấy chuyền nhất

(Master bank) và ngân hàng TB

làm việc (working bank) để duy

trì những dòng này trong thời

gian dài

Dòng tế bào

Dòng tế bào liên tục

(CHO, COS1, hela, Vero…: khả năng phân bào vĩnh viễn/dài; không thay đổi đặc tính

Chúng thường là những tế bào chuyển dạng (transformation)

Tế bào từ khối u

Nhiễm với các viral oncogenes

Xử lí hóa chất (chemical treatments)

Bất lợi của những dòng này là giữ lại rất ít các đặc tính in vivo.

Chuyển dạng (Transformation) Và

Chuyển nhiễm (Transfection)

• Chuyển dạng

– Cảm ứng thay đổi kiểu hình ban đầu thông

qua sự thay đổi DNA và sự biểu hiện gen

Các nuôi cấy sơ cấp thường tốn công sức

Có thể duy trì in vitro trong thời gian giới hạn

Hai kiểu nuôi cấy sơ cấp

KIỂU 1: NUÔI CẤY MẢNH

MÔ SƠ CẤP

Là việc nuôi cấy các mảnh mô

in vitro Trong quá trình nuôi

cấy, các tế bào từ mảnh mô sẽ

phát triển lan ra từ vùng mô

sẽ phát triển tăng sinh thành nhiều tế bào mới.

THU NHẬN MẪU MÔ

CẮT NHỎ (chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô chết)

NUÔI SƠ CẤP

Cấy chuyền

DÒNG TẾ BÀO

Tách tế bào bằng enzym (ủ…)

Trypsin lạnh Trypsin ấm

Ly tâm

Collagenase

Tái huyền phù

Quy trình nuôi cấy sơ cấp

Nuôi cấy

Xử lí mẫu

Nuôi cấy tế bào đơn:

Tách mô thành tế bào đơn

Nuôi cấy mảnh mô:

Cố định mảnh mô

Thu nhận –bảo quản mẫu

• Tùy loại mẫu mô cũng như thời gian cần thiết vận chuyển về phòng thí nghiệm: có kế hoạch vận chuyển chúng trong điều kiện thích hợp.

Thu nhận mảnh mô

Thu nhận- Bảo quản mẫu

Thu nhận - Bảo quản mẫu

Xử lý sơ bộ

mẫu mô

• rửa nhiều lần bằng dung dịch PBS có bổ sung kháng sinh (thường là gentamicin hay penicillin và

streptomicin), kháng nấm

• cắt bỏ các phần mô chết, phần thừa (như mỡ…)

• cắt nhỏ mô thành từng mảnh 2-3 mm2 Các mẫu này có thể được sử dụng để – nuôi (phát triển sơ cấp mảnh mô–primary

explant tissue culture), hoặc

– sử dụng để tách rời các tế bào sau đó

Thu nhận - Bảo quản mẫu

Cắt nhuyễn

Ép nhuyễn

Tách bằng

Biện pháp tách mô bằng cơ học

Xử lý mẫu

Phương pháp cắt nhuyễn

Sử dụng lực cơ học bẻ gãy các cầu nối liên bào: dùng kéo, dao cắt nhuyễn các mảnh mơ.

Huyền phù vào dịch PBS, để lắng, thu dịch trong

Phương pháp này cho hiệu quả không cao, số lượng tếbào đơn thu nhận ít, vì vậy, thường áp dụng cho nhữngmẫu mô có kích thước lớn và không khan hiếm Tuy

Phương pháp ép nhuyễn

Ép nhuyễn mô: dùng 2

phiến lame ép chặt mảnh

mô để thu tế bào đơn đối với

những mô có liên kết yếu.

Có thể dùng pittong của

syringe

Tách rời tế bào đơn

Tách bằng enzym Trypsin

Trypsin ấm

Trypsin

lạnh

Collagenase Papain Elastase

Các tế bào động vật trong khối mô liên kết chặt chẽ với nhau và với ECM nhờ các cấu nối protein hình thành giữa các tế bào

với nhau Để tách rời các tế bào trong khốimô, người ta thường dùng các enzymeprotease như trypsin, pronase…

Quy trình trypsin ấm

Ủ trong 4 0 C, 6- 18 giờ Loại bỏ trypsin

ủ ống chứa mẫu mô trong 36,5 0 C,

Thu dịch huyền phù

tế bào, xác định mật

độ, tiến hành nuôi

• Không đặc hiệu cho

loại protein: Cắt liên

• Cắt liên kết peptide tạo bởi – COOH acid amin thơm với –NH2

• Tính đặc hiệu kém hơn trypsin

• Bị ức chế bởi DFB

•

• Hoạt động tốt: pH7-8, <

45 0 C

• Cắt liên kết peptide dạng poly-L prolin; gồm

4 loại đặc trưng tắt từng loại mô chuyên

biệtè ít làm

hư hại tế bào

• pH 8,5

4,5-• Bị kìm hãm bởi chất oxy hoá

• Phân huỷ elastin

• Sử dụng kết hợp với enzyme khác

Hạn chế tối đa thời gian tiếp xúc của enzyme với tế bào

Chọn nồng độ tối thiểu enzyme phân tách tuỳ loại tế bào

Sử dụng các chất ức chế hoạt tính enzym ngay sau khi phân tách (FBS, protease inhibitor)

tỉ trọng

Phương pháp tách

tế bào dựa vào marker bề mặt

pháp ly

tâm theo gradient

tỉ trọng

Phương pháp tách tế bào dựa vào marker bề mặt:

-Bao phủ bề mặt mỗi tế bào trong cơ thể là nhữngprotein đặc biệt gọi là receptor

-Receptor có khả năng liên kết hay đính một cách đặchiệu với những phân tử tín hiệu

-Có rất nhiều receptor, chúng khác nhau ở cấu trúc và áilực với những phân tử tín hiệu

-Bình thường, tế bào sử dụng những receptor và nhữngphân tử tín hiệu như là cách để truyền đạt thông tin vớinhững tế bào khác, và tiến hành những chức năng riêngcủa chúng trong cơ thể

-Trong phương pháp này, những receptor bề mặt tế bào

Phương pháp tách tế bào dựa vào marker bề mặt tế bào

Nuôi cấy mảnh mô

Đặt mảnh mô vào dụng cụ nuôi

Mảnh mô nổi

Cố định mảnh mô Mảnh mô sống

NUÔI CẤY MẢNH MÔ SƠ CẤP

(mảnh mô ung thư vú)

Nuôi cấy

(1)ủ trong tủ nuôi cấy, 37 0 C

(2) Thay môi trường mới sau một thời gian tùy loại tế bào

(1) Ly tâm thu tế bào đơn

(2) Tái huyền phù trong

môi trường nuôi

(3) Cho vào bình nuôi cấy

Sau khi cố định mảnh

mô, bổ sung môi trường nuôi cấy

Thu nhận mô dạng lỏng – thu nhận tế bào đơn

nhân tủy xương chuột

TẾ BÀO ĐƠN NHÂN TUỶ XƯƠNG

TẾ BÀO ĐÃ QUA NUÔI CẤY

Thu nhận mô dạng lỏng – thu nhận tế bào đơn

nhân tủy xương chuột

NUÔI CẤY SƠ CẤP HUYỀN

PHÙ TẾ BÀO ĐƠN