Báo cáo thực tập tốt nghiệp tại đơn vị Di truyền và sinh học phân tử thuộc khoa Xét nghiệm – Truyền máu, bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng

Khoa Xét nghiệm Truyền máu được thành lập từ ngày 28082015 theo quyết định thành lập bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng của UBND TP.Đà Nẵng.Đơn vị Di truyền và Sinh học phân tử chuyên xét nghiệm về miễn dịch ung thư, di truyền và SHPT ung thư cho bệnh nhân đến khám tại Bệnh viện ung bướu Đà Nẵng. Virus viêm gan B thuộc họ Hepadnaviridae, chi Orthohepadnavirus, loài Hepatitis B virus . Có khả năng tồn tại cao, HBV bền vững với nhiệt độ: 1000C virus sống được 30 phút, 200C sống được tới 20 năm Định lƣợng virus viêm gan B bằng NKHBV TQPCR kit

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành tốt đợt thực tập tốt nghiệp, từ ngày 18/01/2016 đến ngày 17/03/2016, em xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo Bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng đã tạo điều kiện tốt nhất để em được học hỏi, tiếp cận và trao dồi các kỹ năng, tích lũy kinh nghiệm thực tế tại môi trường làm việc trong đơn vị Di truyền

và Sinh học phân tử thuộc Khoa xét nghiệm - Truyền máu

Xin chân thành cảm ơn ThS.BS Lê Văn Hùng – Trưởng khoa Xét nghiệm truyền máu, Kỹ thuật viên Hồ Ngọc Dương – Kỹ thuật viên trưởng, ThS Lê Thị Trân Nhi – Cán bộ hướng dẫn, cùng các nhân viên trong đơn vị đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm thực tế trong suốt quá trình thực tập tại Bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng

Em cũng xin gửi lời cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng, Ban chủ nhiệm khoa Sinh học - Môi trường đã tạo điều kiện cho em có được chuyến đi thực tập này Đồng thời, em cũng cảm ơn thầy ThS Trần Quang Dần – Giáo viên hướng dẫn đã tận tình hướng dẫn trang bị cho em những kiến thức quý báu để em hoàn thành tốt công việc trong suốt quá trình thực tập

Em hứa sẽ vận dụng tốt những kiến thức đã tiếp thu được vào công việc sau này!

Đà Nẵng, ngày 17 tháng 3 năm 2016

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ ĐƠN VỊ THỰC TẬP

1.1 Giới thiệu chung về khoa Xét nghiệm – Truyền máu

Khoa Xét nghiệm - Truyền máu được thành lập từ ngày 28/08/2015 theo quyết định thành lập bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng của UBND TP.Đà Nẵng Trên cơ sở sáp nhập nguyên trạng giữa Khoa xét nghiệm tổng hợp, Khu truyền máu và Trung tâm nghiên cứu ung thư thuộc Bệnh viện Ung thư Đà Nẵng

Khoa Xét nghiệm – Truyền máu gồm có ba đơn vị chính:

 Đơn vị Xét nghiệm tổng hợp

 Đơn vị Truyền máu

 Đơn vị Di truyền và Sinh học phân tử

1.2 Đơn vị Di truyền và sinh học phân tử

Đơn vị Di truyền và Sinh học phân tử chuyên xét nghiệm về miễn dịch ung thư, di truyền và SHPT ung thư cho bệnh nhân đến khám tại Bệnh viện ung bướu Đà Nẵng

1.2.1 Các kỹ thuật xét nghiệm tại đơn vị

Bảng 1: Các kỹ thuật xét nghiệm STT Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch

Xét nghiệm gen bệnh máu ác tính

3 Đếm số lượng tế bào Lympho T

CD4/CD8-CD3

Xét nghiệm công thức NST (Karyotype)

4 Phân tích CD Xét nghiệm sắc thể: kỹ thuật DNA

6 Phân loại Lymphoma Định lượng vvirus viêm gan B

(HBV)

7 Xét nghiệm định type HLA (bằng

kỹ thuật sinh học phân tử)

10 Xét nghiệm Đường – Ham Xác định DNA trong viêm gan B

11 Chuẩn đoán bệnh tiểu huyết sắc tố

về đêm (PNH)(5CD)

Định lượng virus viêm gan B (HBV) cho các bệnh viêm gan C mãn tính

12 Xét nghiệm CD64, CD11b trong

SEPSIS

Định lượng virus viêm gan C (HCV) cho các bệnh viêm gan C mãn tính

Cobas TaqMan48

1.2.2 Trang thiết bị tại đơn vị Di truyền và sinh học phân tử

1.2.2.1 Labo Miễn dịch ung thư và nuôi cấy tế bào

Hình 1: Máy Flowcytometry Hình 2: Tủ ấm có trao đổi khí

Hình 3: Tủ an toàn sinh học cấp 2 Hình 4: Máy ly tâm lạnh ống nghiệm

1.2.2.2 Labo Di truyền và sinh học phân tử

Hình 6: Kính hiển vi gắn camera Hình 5: Tủ hút khí độc

Hình 7: Máy ly tâm lạnh Eppendorf Hình 8: Máy Vortex

Hình 10: Máy đo nồng độ Acid

nucleid Hình 9: Máy Spindown

Hình 11: Máy PCR

Hình 13: Máy điện di Hình 14: Máy đọc gel

Hình 16: Tủ lạnh -800C Hình 12: Máy Realtime PCR

Hình 18: Máy ủ nhiệt có lắc

Hình 15: Tủ lạnh 40C Hình 17: Tủ lạnh -200C

Hình 19 : Máy ly tâm Eppendorrf

Hình 20 : Đầu tuýp micropipette

CHƯƠNG II: KẾT QUẢ THỰC TẬP 2.1 Tổng quan về virus viêm gan B (Hepatitis B virus - HBV)

2.1.1 Lịch sử phát triển của virus viêm gan B [1,2]

Trước công nguyên bệnh vàng da nhiễm trùng ở người đã được Hyppocrate mô tả giống như một số bệnh khác ở thời kỳ này Bệnh viêm gan là bạn đồng hành của các cuộc chiến tranh đã được ghi nhận trong lịch sử y học và

y học quân sự, thời kỳ này người ta thừa nhận có sự lây nhiễm giữa người với người nhưng không biết được các tác nhân gây bệnh như hiện nay

Luerman (1883) mô tả một trận dịch tại xưởng đóng tàu Bremen ở những người được chủng ngừa vaccine đậu mùa có bạch cầu người Cùng năm này, một trận vàng da sau chủng ngừa khác xảy ra ở Merzig Do vậy, sự hiện diện của một thể viêm gan virus lây nhiễm trực tiếp từ máu người hoặc các dẫn xuất từ máu đã được nghĩ đến

Lindstedl (Thụy Điển, 1919) đã tiên phong trong việc đặt ra thuật ngữ Viêm gan cho bệnh vàng da xuất tiết và chuẩn đoán phân biệt hai dạng viêm gan dịch tễ (viêm gan A) và viêm gan huyết thanh (viêm gan B)

Đến năm 1965 Blumberg và các cộng sự của ông lần đầu tiên tìm thấy được thành phần quan trọng của virus viêm gan B trong khi nghiên cứu về các loại protein trong huyết thanh người Thành phần này là một loại kháng nguyên

có nguồn gốc từ huyết thanh của một người Úc kết tủa với huyết thanh của bệnh nhân bị bệnh máu do được truyền máu nhiều lần và ông đặt tên cho kháng nguyên này là kháng nguyên Australia (Au)

Đến năm 1968, Prince, Okochi và Murakami đã xác định được mối tương quan giữa kháng nguyên Au với bệnh nhân viêm gan cấp tính và cho rằng đây là một kháng nguyên của virus viêm gan, cho đến 11 năm sau điều giả định này mới được xác định đây là kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B

Năm 1970, Dane phát hiện ra các hạt virus trong huyết thanh bệnh nhân bị nhiễm virus viêm gan B và ông đã mô tả hình dạng hoàn chỉnh của hạt virus viêm gan B mà sau này người ta gọi là virion Dane

Kaplan (1973) phát hiện DNA polymerase nội sinh bên trong vỏ ngoài của các hạt Dane Chính DNA polymerase này giúp Robinson (1979) nhân dòng HBV và xác định chuỗi mã nucleotide DNA toàn phần, cho rằng HBV là một tác nhân gây bệnh theo đường máu nhưng không sao chép trong môi trường nuôi cấy

mô Từ đó, bộ gen HBV là bộ gen độc đáo trong thế giới virus do bản chất đậm đặc của chúng, các khung đọc gối lên nhau và do phụ thuộc vào bước phiên mã ngược, dù rằng virion chứa chủ yếu DNA Do phát hiện này, virus viêm gan B

trở thành kiểu nguyên sinh của họ hepadnavirus, Hepadnaviridae

2.1.2 Phân loại, cấu trúc virus viêm gan B

2.1.2.1 Phân loại

Virus viêm gan B thuộc họ Hepadnaviridae, chi Orthohepadnavirus, loài Hepatitis B virus Có khả năng tồn tại cao, HBV bền vững với nhiệt độ: 1000C virus sống được 30 phút, -200C sống được tới 20 năm [3]

2.1.2.2 Cấu trúc

Virus viêm gan B có một cấu trúc hai lần vỏ protein đồng tâm gồm ba lớp Lớp ngoài cùng của virus được cấu tạo bởi ba chuỗi polypeptid, chuỗi có kích thước ngắn nhất có trọng lượng phân tử là 25kDa được gọi là polypeptid chính,

do có nhiều nhất trong thành phần bao ngoài Lớp ngoài cùng chứa các kháng nguyên bề mặt HbsAg

Hình 21: Cấu trúc cắt ngang của virus HBV

Vỏ capsid được cấu tạo bởi hai chuỗi polypeptid được gọi là polypeptid lõi và tiền lõi, chuỗi polypeptid lõi ngắn có trọng lượng phân tử 22 kDa chính là kháng nguyên lõi của virus, ký hiệu HbcAg Chuỗi polypeptid tiền lõi dài hơn có trọng lượng phân tử 25kDa, có cấu trúc gồm toàn bộ chuỗi ngắn cộng thêm một peptid đợn có 29 acid amin Kháng nguyên e của HBV (HbeAg) chính là một sản phẩm chuyển hóa của lớp vỏ capsid

Bộ gen của HBV là một sợi vòng DNA chiều dài 3200 cặp base có cấu trúc mạch kép không hoàn toàn Mạch dài là mạch mã hóa còn gọi là mạch thông tin và RNA tiền gen của virus được mã hóa từ vạch này, mạch dương có chiều dài bằng 50-80% chiều dài mạch âm

2.1.3 Quá trình sao chép và nhân lên của virus viêm gan B

Tất cả các virus đều là vật ký sinh tế bào cấu tạo bởi một thể nhiễm sắc là RNA hay DNA chứa đựng trong một vỏ bọc protein Muốn nhân lên virus phải đi vào trong tế bào và sử dụng bộ máy của tế bào để tổng hợp các protein của vỏ bọc và bộ gen virus, khi bộ gen đã được bao bọc trong vỏ bọc thì các hạt virus mới được giải phóng ra khỏi tế bào và tiếp tục một chu trình nhân lên mới

Hình 22: Quá trình nhân lên của virus trong tế bào gan

Các virion HBV liên kết với một thụ thể trên bề mặt tế bào gan [6] Một

số thụ thể đã được xác định, bao gồm thụ thể transferrin, các phân tử thụ thể asialoglycoprotein và thụ thể endoxin Vỏ capsid nhập vào tế bào và DNA virus

đi vào đến nhân tế bào gan Trong nhân tế bào DNA của virus được đóng lại thành DNA mạch vòng gọi là cccDNA [5,6]

Sau khi bị nhiễm, phần sợi đơn của trình tự được khôi phục, tạo thành một DNA siêu xoắn kép nhờ DNA polymerase nằm ở đầu 3’ của sợi dương Đầu tiên, RNA tiền genom được phiên mã dựa trên khuôn mẫu là sợi âm DNA nhờ RNA polymerase của tế bào chủ, sau đó sợi âm DNA được phiên mã ngược dựa trên khuôn mẫu RNA tiền genom nhờ enzyme phiên mã ngược phụ thuộc DNA polymerase của virus, cuối cùng sợi dương DNA được tổng hợp từ sợi âm DNA

và chuỗi xoắn kép DNA được hoàn thành [6]

Khi DNA của virus được tổng hợp, genom RNA bị giáng hóa trừ một đoạn nhỏ khoảng 20 cặp base từ đầu 5, sẽ hoạt động như một đoạn mồi để tổng hợp DNA sợi dương từ sợi âm khuôn mẫu mới được tổng hợp, các hạt virus mới tổng hợp chứa một phần sợi kép DNA của virus và sẽ nhận các vỏ bọc có chứa HbsAg bằng cách đâm chồi từ màng bào tương và sẽ trở thành các hạt virus gây nhiễm các hạt virion hoàn chỉnh này được giải phóng vào máu tuần hoàn và tiếp tục gây các tế bào chủ tiếp theo[7]

2.1.4 Các dấu ấn miễn dịch của virus viêm gan B

2.1.4.1 Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HbsAg)

Xuất hiện rất sớm trước khi có triệu chứng lâm sàng, tăng cao dần và biến mất sau 4-8 tuần kể từ khi có triệu chứng Nếu sau 6 tháng mà vẫn còn HbsAg thì

có nguy cơ chuyển thành người mang HbsAg mạn

2.1.4.2 Kháng nguyên e (HbeAg)

Là kháng nguyên hòa tan có mặt trong huyết tương thường liên quan đến HbsAg, phản ảnh mức độ lây nhiễm của viêm gan B Ở tế bào gan HbeAg hiện diện trong tế bào chất sẽ được giải phóng khỏi phần lõi của virus khi xử lý với

các chất tẩy mạnh Kháng nguyên HBeAg xuất hiện sớm trong giai đoạn tiền vàng da

2.1.4.3 Kháng nguyên lõi (HBcAg)

Kháng nguyên lõi HBcAg được lớp vỏ HbsAg bao bọc nên không tồn tại trong máu ở dạng tự do, cho nên các kỹ thuật miễn dịch học thông thường không phát hiện được, HBcAg chỉ xuất hiện trong tế bào gan và chỉ có thể phát hiện được khi làm sinh thiết gan

2.1.4.4 Kháng thể anti-HBs

Là kháng thể kháng lại HbsAg, xuất hiện muộn 2-16 tuần sau sự thoái lui của HbsAg IgM anti-HBs xuất hiện trong giai đoạn cấp còn IgG anti-HBs xuất hiện muộn và tồn tại lâu dài hơn Nồng độ kháng thể anti-HBs cao hay thấp còn phụ thuộc vào một số các yếu tố như: công hiệu vaccine, liều lượng và thời gian 2.1.4.5 Kháng thể anti-HBe

Là kháng thể kháng lại HBeAg, thường có ở huyết thanh người mang HBsAg hiệu giá thấp, chỉ nên xét HBeAg và anti-HBe ở những người có HbsAg (+) Khi xuất hiện anti-HBe là bệnh nhân đang được hồi phục

2.1.4.6 Kháng thể anti- HBc

Là kháng thể kháng lại HBcAg, biểu hiện đã từng mắc HBV Anti-HBc IgM xuất hiện sớm ngay thời kỳ ủ bệnh, còn anti-HBc IgG xuất hiện muộn nhưng tồn tại lâu hơn

2.1.4.7 HBV-DNA

HBV-DNA chỉ thấy trong huyết thanh chứ các hạt virus hoàn chỉnh, phát hiện thấy HBV-DNA là bằng chứng trực tiếp về sự hiện diện HBV trong máu Định lượng HBV-DNA cho phép đánh giá mức độ nhiễm virus viêm gan B 2.1.5 Các triệu chứng lâm sàng [4]

2.1.5.1 Giai đoạn cấp tính

Quá trình lây nhiễm cấp tính gây ra các triệu chứng khác nhau Thời gian

ủ bệnh từ 6 tuần đến 6 tháng Bệnh có thể khởi phát nhẹ hoặc bùng phát đột ngột, các triệu chứng nhiễm cấp bao gồm sốt, biếng ăn, buồn nôn, khó chịu, nôn mửa, vàng da, nước tiểu có màu đen, đau bụng,… Trong viêm gan cấp, số người bệnh

có dấu hiệu viêm gan bộc phát là 1-2% và tỷ lệ chết 63-93%

2.1.5.2 Giai đoạn mạn tính

Giai đoạn này xác định thông qua thời gian tồn tại của HbsAg trong huyết thanh người bệnh tối thiểu 6 tháng hoặc sự hiện diện của HbsAg đi kèm với sự vắng mặt của kháng thể immunoglobulin M (IgM) kháng HBc Người mang viêm gan mạn tính đều có khả năng tiến triển thành bệnh mạn tính về gan bao gồm xơ gan và ung thư gan

Viêm gan mạn tính có thể chia thành ba tình trạng bệnh lý khác nhau: Viêm gan mạn tính kéo dài, viêm gan mạn tính hoạt động và xơ gan Những người bị viêm gan mạn tính kéo dài thường không biểu hiện các triệu chứng lâm sàng cho tới cuối gian đoạn phát triển của bệnh lý Những bệnh nhân ở gia đoạn viêm gan mạn tính hoạt động sẽ phát triển thành xơ gan Xơ gan là một dạng của quá trình thương tổn gan và chính quá trình này có thể dẫn đến tình trạng ung thư

tế bào gan

2.2 Định lƣợng virus viêm gan B bằng NK HBV TQPCR kit

2.2.1 NKHBV TQPCR kit

Mức phát hiện 50 copies/ml mẫu thử

Hình 23: Protocol NKHBV TQPCR Kit

300µl x 2

NK

HBVDNA S1

Plasmid chèn HBVDNA, được cung cấp ở nồng độ

105/5µl để làm chuẩn 1

300µl x 2

NKHBVDNA S2

Plasmid chèn HBVDNA, được cung cấp ở nồng độ

104/5µl để làm chuẩn 2

300µl x 2

NKHBVDNA S3

Plasmid chèn HBVDNA, được cung cấp ở nồng độ

2.2.2 Quy trình xét nghiệm định lượng virus HBV

Bước 1: Lấy mẫu bệnh phẩm

- Huyết thanh hay huyết tương được tách từ máu toàn phần hay máu kháng đông bằng EDTA

Bước 2: Chuẩn bị mẫu thử và các dụng cụ cần thiết

- Phải kèm 1 chứng âm với mỗi lần làm xét nghiệm các mẫu thử

- Sử dụng 1 tube Eppendorf tinh sạch, ghi trên tube ký hiệu C(-) và cho vào

đó 100µl mẫu chứng âm

- Đếm số lượng mẫu thử phải làm xét nghiệm để lấy đủ số tube Eppendorf tinh sạch, mỗi tube cho 1 mẫu thử, ghi trên tube ký hiệu của các mẫu thử Cho 100µl mẫu thử vào Eppendorf tương ứng

- Vortex mạnh 3 lần mỗi lần 10 giây ống HBVDNA-IC Dùng micropipette cho vào các tube C(-) và các tube mẫu thử đã chuẩn bị ở trên, mỗi tube 5µl HBVDNA-IC Sau đó vortex các tube để trộn đều

Bước 3: Tách chiết DNA các mẫu thử ( theo bộ tách chiết DNAPREP-BOOM Nam Khoa, Việt Nam)

Hình 24: DNAPREP BOOM

- Trong 1 tube Eppendorf 1.5ml, cho vào 900µl L6 (phá vỡ màng phospholipid, ức chế các enzyme) 30µl silica (DNA sẽ liên kết với silica)

và 100µl mẫu thử Vortex hỗn dịch này và lắc tay úp ngửa trong 10 phút Vortex lần nữa trong 5 giây và ly tâm 13000rpm trong 15 giây Hút bỏ phần nước nổi,

- Rửa 2 lần với mỗi lần 1ml L2 ( tiếp tục phá vỡ các protein) cho vào cặn silica rồi vortex vài giây để hòa tan silica vào dung dịch, sau đó ly tâm 13000rpm trong 15 giây Hút bỏ phần dịch nổi, chừa lại cặn silica

- Tiếp theo rửa 2 lần nữa, mỗi lần với 1ml Ethanol 70% (kết tủa DNA, tăng cường khả năng liên kết giữa DNA và silica) cho vào cặn silica rồi vortex vài giây để hòa tan silica vào dung dịch, sau đó ly tâm 13000rpm trong 15 giây Hút bỏ phần nổi chừa lại cặn silica

- Sau đó rửa lại 1 lần nữa với 1ml Acetone (Loại bỏ ethanol và các tạp chất) Ly tâm 13000rpm trong 15 giây, hút bỏ phần dịch nổi chừa lại cặn silica

- Làm khô silica ở 560C trong 10 phút trong máy ủ nhiệt

- Thêm 50µl đệm TE 1x (bảo quản DNA) Vortex cho đến khi silica rã hoàn toàn Ủ 560C trong 10 phút.Ly tâm 13000rpm trong 2 phút Thu lấy dịch nổi có chứa DNA

- Dịch chứa DNA có thể sử dụng ngay hoặc dự trữ ở -200C

Bước 4: Cho vào TQPCR mix để chuẩn bị chạy realtime PCR

- Dùng pipette phân phối TQPCR master mix vào các tube PCR, mỗi tube nhận 15µl TQPCR master mix

- Đối với tách chiết DNA chứng (-) và từ các mẫu thử: Cho 5µl mẫu tách chiết DNA vào tube TQPCR mix

- Đối với NKHBVDNA chuẩn: Vortex mạnh 3 lần, mỗi lần 10 giây các tube chứa NKHBVDNA chuẩn Dùng pipette lấy 5µl cho vào tube TQPCR mix