PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ A. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNGKHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN DUNG MÔI LÊN THỜI GIAN LƯU I. Nguyên tắc: • Là phương pháp phân tách ,phân li,phân tích các chất dựa trên tương tác khác nhau của nó với pha động và pha tĩnh. • Tùy theo độ phân cực của pha động và pha tĩnh mà ta có 2 phương pháp khác nhau: Sắc kí pha thuận dùng để tách các hợp chất có độ phân cực cao :pha tĩnh phân cực và pha động kém hoặc không phân cực Sắc kí pha đảo dùng để tách các hợp chất kém hoặc không phân cực: có pha tĩnh kém hoặc không phân cực còn pha động phân cực cao. • Mẫu phân tích được đưa vào phần trên của cột,cho dung dịch rửa chảy qua cột,sẽ xảy ra sự phân li tách cấu tử.Thu thập dung dịch chạy ra khỏi cột trong từng khoảng thời gian xác định khác nhau,phân tích nồng độ các cấu tử bằng các phương pháp thích hợp xây dựng đồ thị→có thể dùng để phân tích định tính hoặc định lượng. II. Nội dung thực tập: • Nghiên cứu hiệu năng cột tách và độ chọn lọc trong sắc kí lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) có pha tĩnh là pha đảo.Hệ thống HPLC cơ bản gồm : bơm,van tiêm mẫu, cột, đầu dò, thiết bị ghi nhận và hiển thị tín hiệu. • Sắc kí lỏng hiệu năng cao ,pha tĩnh kém phân cực vốn giữ rất chặt các hợp chất kém hoặc không phân cực.Trong bài này cột sắc kí được nhồi pha tĩnh là những hạt silica hình cầu xốp.Hidrogen trên nhóm silanol SiOH được thay thế bằng nhóm octodecyl ( C18 ) làm cho bề mặt hạt silica trở nên không phân cực.Mức độ không phân cực của bề mặt hạt silica tùy thuộc vào tương quan giữa mật độ C18 và nhóm silanol còn lại,mức độ che phủ C18 và độ xốp của hạt silica. • Thực hiện tối ưu hóa khả năng tách hỗn hợp chứa metyl parahydroxybenzoate, etyl parahydroxybenzoate ,propyl parahydroxybenzoate ,và butyl parahydroxybenzoate bằng cách tiêm hỗn hợp 4 chất vào cột,rửa thành phần pha động thay đổi để tìm pha động tách tốt nhất→đánh giá hiệu năng cột tách. III. Thực nghiệm : 1. Khảo sát ảnh hưởng của pha động lên khả năng phân tách hỗn hợp: Tiến hành chạy máy đo HPLC với chất mẫu là hỗn hợp các ester trên và thay đổi thành phần pha động : • Dung dịch MeOH 100% • Dung dịch MeOHnước = 8020 • Dung dịch MeOHnước = 6535 ( Lưu ý là các pha động phải được đuổi khí hoà tan trước ) Một số chú ý thao tác: • Khi tiêm mẫu: Bơm thừa 1 ít mẫu để đẩy mẫu cũ ra đường thải. Tráng rửa bơm tim trước bằng mẫu đo • Khi thay đổi pha động :nhấn Stand By ,thế dung pha động mới,chờ khoảng 10 phút để đẩy hết pha động cũ ra ngoài. Kết quả chạy HPLC : a. Pha động 100% MeOH: Nhận xét: sắc kí đồ thu được chỉ có 1 peak→pha động MeOH 100% không có khả năng phân tách hỗn hợp. b. Pha động MeOHH2O =8020 : Nhận xét: sắc kí đồ thu được 4 peak ứng với 4 chất trong hỗn hợp nhưng các peak rất gần nhau, còn có phần chung không rõ ràng→ tách được nhưng không tốt. c. Pha động MeOHH2O = 6535 : Thời gian lưu ứng với các peak : • Peak 1 : tR = 2.422 (s) • Peak 2 : tR =3.126 (s) • Peak 3 : tR = 4.543 (s) • Peak 4 : tR = 7.255 (s) Nhận xét: sắc kí đồ thu được có 4 peak rõ ràng→tách tốt.Như vậy ta có thể dự đoán được pha động MeOHH2O = 5545 cũng có khả năng tách hỗn hợp, tuy nhiên thời gian lưu hơi lâu nên ta chọn pha động MeOHH2O=6535 là dung môi tách hỗn hợp tốt nhất. Giải thích: Các chất mẫu dùng trong bài có mạch C phức tạp ( chứa nhân benzene)→kém phân cực,tính kị nước cao.Chính vì vậy mà khi thay đổi pha động theo chiều hướng tăng dần %H2O thời gian lưu bị kéo dài ra và phân biệt rõ ràng hơn→khả năng tách tốt hơn. 2. Định danh các peak : Dùng pha động MeOHH2O=6535 chạy với các mẫu là từng dung dịch chứa từng phidroxibenzoate ester vào cột.Kết quả như sau: • Mẫu 1: dung dịch metyl phidroxibenzoate
Trang 1Họ và tên: Nguyễn Quốc Thọ
MSSV : 0614188
Nhóm : E2 –T7
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ
A PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG-KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN
DUNG MÔI LÊN THỜI GIAN LƯU
I Nguyên tắc:
• Là phương pháp phân tách ,phân li,phân tích các chất dựa trên tương tác khác nhau của nó với pha động và pha tĩnh
• Tùy theo độ phân cực của pha động và pha tĩnh mà ta có 2 phương pháp khác nhau:
Sắc kí pha thuận dùng để tách các hợp chất có độ phân cực cao :pha tĩnh phân cực và pha động kém hoặc không phân cực
Sắc kí pha đảo dùng để tách các hợp chất kém hoặc không phân cực:
có pha tĩnh kém hoặc không phân cực còn pha động phân cực cao
• Mẫu phân tích được đưa vào phần trên của cột,cho dung dịch rửa chảy qua cột,sẽ xảy ra sự phân li tách cấu tử.Thu thập dung dịch chạy ra khỏi cột trong từng khoảng thời gian xác định khác nhau,phân tích nồng độ các cấu tử bằng các phương pháp thích hợp xây dựng đồ thị→có thể dùng để phân tích định tính hoặc định lượng
II Nội dung thực tập:
• Nghiên cứu hiệu năng cột tách và độ chọn lọc trong sắc kí lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) có pha tĩnh là pha đảo.Hệ thống HPLC cơ bản gồm : bơm,van tiêm mẫu, cột, đầu dò, thiết bị ghi nhận và hiển thị tín hiệu
• Sắc kí lỏng hiệu năng cao ,pha tĩnh kém phân cực vốn giữ rất chặt các hợp chất kém hoặc không phân cực.Trong bài này cột sắc kí được nhồi pha tĩnh là những hạt silica hình cầu xốp.Hidrogen trên nhóm silanol Si-OH được thay thế bằng nhóm octodecyl ( C18 ) làm cho bề mặt hạt silica trở nên không phân cực.Mức độ không phân cực của bề mặt hạt silica tùy thuộc vào tương quan giữa mật độ C18 và nhóm silanol còn lại,mức độ che phủ C18 và độ xốp của hạt silica
• Thực hiện tối ưu hóa khả năng tách hỗn hợp chứa metyl parahydroxybenzoate, etyl parahydroxybenzoate ,propyl parahydroxybenzoate ,và butyl parahydroxybenzoate bằng cách tiêm hỗn hợp 4 chất vào cột,rửa thành phần pha động thay đổi để tìm pha động tách tốt nhất→đánh giá hiệu năng cột tách
III Thực nghiệm :
1 Khảo sát ảnh hưởng của pha động lên khả năng phân tách hỗn hợp:
Tiến hành chạy máy đo HPLC với chất mẫu là hỗn hợp các ester trên và thay đổi thành phần pha động :
Trang 2• Dung dịch MeOH/nước = 65/35
( Lưu ý là các pha động phải được đuổi khí hoà tan trước )
Một số chú ý thao tác:
Bơm thừa 1 ít mẫu để đẩy mẫu cũ ra đường thải
• Khi thay đổi pha động :nhấn Stand By ,thế dung pha động mới,chờ khoảng 10 phút để đẩy hết pha động cũ ra ngoài
peak→pha động MeOH 100% không có khả năng phân tách hỗn hợp
Trang 3
4 chất trong hỗn hợp nhưng các peak rất gần nhau, còn có phần chung không rõ ràng→ tách được nhưng không tốt
• Peak 1 : tR = 2.422 (s)
Trang 4• Peak 2 : tR =3.126 (s)
• Peak 3 : tR = 4.543 (s)
• Peak 4 : tR = 7.255 (s)
ràng→tách tốt.Như vậy ta có thể dự đoán được pha động MeOH/H2O = 55/45 cũng có khả năng tách hỗn hợp, tuy nhiên thời gian lưu hơi lâu nên
ta chọn pha động MeOH/H2O=65/35 là dung môi tách hỗn hợp tốt nhất
mạch C phức tạp ( chứa nhân benzene)→kém phân cực,tính kị nước cao.Chính vì vậy mà khi thay đổi pha động theo chiều hướng tăng dần
%H2O thời gian lưu bị kéo dài ra và phân biệt rõ ràng hơn→khả năng tách tốt hơn
chạy với các mẫu là từng dung dịch chứa từng p-hidroxibenzoate ester vào cột.Kết quả như sau:
p-hidroxibenzoate
tR = 2.322
Trang 5• Mẫu 2: dung dịch etyl p- hidroxibenzoate :
tR = 2.965 (s)
hidroxibenzoate :
Trang 6
Nhận xét:
tR = 4.318 (s)
So sánh thời gian lưu của 3 mẫu chất thì ta thấy rằng thời gian lưu
tăng theo chiều tăng của số C.Thực tế chỉ cần chạy 2 mẫu ta cũng có thể suy được ra quy luật này
Như vậy ta có thể định danh các peak trong sắc kí đồ thu được khi
chạy hỗn hợp các p-hidroxibenzoate ester với pha động MeOH/H2O=65/35:
Peak 1 có thời gian lưu 2.422 (s) là peak của metyl
p-hidroxibenzoate
Peak 2 có thời gian lưu 3.126 (s) là peak của etyl p-
hidroxibenzoate
Peak 3 có thời gian lưu 4.543 (s) là peak của propyl
p-hidroxibenzoate
Peak 4 có thời gian lưu 7.255 (s) là peak của butyl
p-hidroxibenzoate
Giải thích kết quả rửa giải :
• Trong bài này ta dùng pha tĩnh là hệ C18 kém phân cực, có ái lực mạnh với các hợp chất kém phân cực nên giữ chúng chặt chẽ hơn.Trong khi đó pha động là dung dịch metanol (với thành phần khác nhau) tương đối phân cực,có ái
Trang 7lực với các hợp chất phân cực.Do vậy các hợp chất phân cực hơn sẽ bị pha động kéo tốt hơn→ra nhanh hơn→thời gian lưu ngắn hơn
• Khi đi từ metyl→butyl p-hidroxibenzoate ,số lượng C tăng dần, độ phân cực giảm dần, tương tác của chúng với pha động và pha tĩnh cũng sẽ khác nhau→thứ tự rửa giải khác nhau:
Metyl p-hidroxibenzoate phân cực nhất, tương tác với pha động lớn nhất,nên được kéo ra sớm nhất→thời gian lưu ngắn nhất
Butyl p-hidroxibenzoate kém phân cực nhất,tương tác với pha tĩnh nhiều nhất,bị giữ lại chặt nhất→thời gian lưu lâu nhất
• Khi thay đổi thành phần pha động thứ tự tách các chất không thay đổi do tương tác giữa từng chất mẫu với pha tĩnh thì không thay đổi, còn tương tác giữa từng chất mẫu với pha động thì có thay đổi nhưng thay đổi giống nhau
Đánh giá hiệu năng cột tách: chọn pha động tách tốt
nhất,chọn các thông số của integrator sao cho chiều cao của peak cao nhất bằng bề rộng của khổ giấy in, vận tốc chạy giấy khoảng 60 mm/phút nhằm phóng to sắc kí
đồ của từng peak trong hỗn hợp
Trang 9• Peak 1: dung dịch metyl p-hidroxibenzoate
2.278
0.133
R b
t n
W
Độ bất đối xứng:
7
1.4 5
B k
A
= = =
• Peak 2: dung dịch etyl p-hidroxibenzoate
Thời gian lưu : tR = 2.940 (s)
Bề rộng đáy : Wb = 0.133 (s)
Trang 10 Số đĩa lí thuyết :
2.94
0.133
R b
t n
W
= ÷ = ÷ =
Độ bất đối xứng :
1.17 6
B k
A
= = =
• Peak 3: dung dịch propyl p-hidroxibenzoate
Thời gian lưu : tR = 4.271(s)
Bề rộng đáy : Wb = 0.158
Số đĩa lí thuyết :
4.271
0.158
R b
t n
W
= ÷ = ÷ =
Độ bất đối xứng:
9 0.9
10
B k A
1.14 7
B k A
= = =
• Peak 4 : dung dịch butyl p-hidroxibenzoate
Thời gian lưu : tR = 6.789 (s)
6.789
0.219
R b
t n
W
9
0.9 10
B k A
= = =
Giá trị này bất thường
• Trên lí thuyết peak thu được trên sắc kí đồ phải đối xứng tức là các phân tử chất tách ra đều nhau theo thời gian Điều này chỉ có thể đạt được nếu như:
Trang 11 Điều kiện áp suất ổn định.
Pha tĩnh chứa các hạt có kích thướt giống nhau,sắp xếp đều đặn
Tương tác giữa mỗi chất mẫu với pha tĩnh và pha động là như nhau tại mọi điểm và mọi thời điểm
• Trên thực tế thì không thể đạt được những điều kiện này,các phân tử chất ra sau còn bị giữ lâu hơn do hiện tượng thẩm thấu→gây ra hiện tượng kéo đuôi ( B/A > 1)
phân tích với các ưu điểm:
phức tạp như GC hay AAS
tinh khiết cao nếu gắn bộ thu hồi phân đoạn
phân tích các hợp chất kém bền nhiệt
là các đồng phân thì phương pháp này không thể sử dụng vì các đồng phân có độ phân cực giống nhau
B PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ KHÍ
I Đại cương sắc kí khí:
Là phương pháp dùng để phân tích các hợp chất dễ bay hơi và bền nhiệt
Về nguyên tắc thì tương tự sắc kí lỏng, chỉ khác về phương thức tiến hành
Cũng dựa trên tương tác giữa chất cần phân tích các pha, tuy nhiên trong sắc
kí khí thì:
• Pha tĩnh : chất bền nhiệt,không bốc hơi ở nhiệt độ cột sắc kí,tác động lên chất phân tích
• Pha động : giữ vai trò là khí mang,hoàn toàn không có tác động lên chất phân tích, thường là những khí trơ :He,H2,N2,Ar…
• Bình khí mang : cung cấp khí mang-đóng vai trò là pha động
• Lò nung : đuợc cách nhiệt,giữ hoặc thay đổi nhiệt độ theo yêu cầu
Trang 12• Detectơ : ghi nhận nồng độ đi qua và chuyển thành tín
hiệu điện
• Bộ phận xử lí tín hiệu,thường kết nối với máy tính có
phần mềm xử lí số liệu
II Thực hành :
1 Tách hỗn hợp heptan+octan:
Chất mẫu : hỗn hợp heptan+octan 1000ppm trong dung môi CS2
Thao tác thực nghiệm:
• Khởi động hệ thống,cài đặt các thông số kĩ thuật cần thiết ( nhiệt
độ, áp suất→ảnh hưởng rất lớn đến quá trình phân tích)
Nhiệt độ cột : 60o C (đẳng nhiệt)
Nhiệt độ injector va detector : 150o C
• Rửa bơm kim tiêm nhiều lần bằng dung môi ( CS2) và bằng dung dịch mẫu ( lưu ý là kim tiêm phải không chứa bọt khí)
• Tiêm khoảng 1μL mẫu vào buồng tiêm.Lưu ý thao tác tiêm mẫu rất quan trọng, ảnh hưởng đến kết quả phân tích
• Thực hiện 3 lần thực nghiêm,kết quả như sau:
Thời gian lưu Diện tích peak Thời gian lưu Diện tích peak Thời gian lưu Diện tích peak
Dung môi 5.995 3514439.6 6.038 3121818.6 5.981 3597403.8
Heptan 6.883 478478.6 6.744 404257.2 6.875 470928.6
Octan 8.025 541602.8 7.876 466005.4 7.999 532523.1
Nhận xét: thời gian lưu của octan dài hơn so với heptan→trong cùng dãy
đồng đẳng,khi tăng số C ( khối lượng phân tử tăng),thời gian lưu càng dài
Tính toán kết quả:
6.834( )
R tb
t t t
t − = + + = + + = s
, 0.95;2
0.078
* 4.30* 0.1936
3
R
n x t
S t
n
Trang 131 2 3
,
478478.6 404257.2 470928.6
451221.5 40847.06
tb
n x
S S
=
=
n x S
S
1 2 3 8.025 7.876 7.999
7.967( )
R tb
t t t
3
R t
541602.8 466005.4 532523.1
513377.1 3
tb
n x S
S
b Tính heptan với octan làm chuẩn:
Ta có bảng:
3 ,
0.8577 0.8563 0.8595
0.8578 3
1.6*10
R tb
n t
t S
−
−
=
3
1.6*10
3
R t
ε = − ≈
Trang 14,
0.8834 0.8675 0.8843
0.8784 3
0.0095
tb
n S
S S
=
3
S
2 Quan hệ giữa sự lưu giữ các chất thuộc dãy đồng đẳng hidrocacbon no mạch thẳng và chương trình nhiệt độ cột:
mẫu là hỗn hợp C6-C11 với điều kiện đẳng nhiệt (100oC),kết quả thu được như sau:
Tiến hành chạy hỗn hợp C6-C11 nhưng với điều kiện nhiệt độ thay đổi: đưa nhiệt độ lên 50oC, giữ 5 phút,sau đó cứ 1 phút tăng 15oC,khi nhiệt độ đạt 150oC thì giữ 10 phút.Kết quả thu được:
Cách định danh từng mũi sắc kí
Theo kết quả khảo sát ở trên và kết luận khẳng định ở phần đầu ta có:
• Khi chạy ở điều kiện đẳng nhiệt ta chỉ thu được 5 peak ứng với mẫu gồm 6 chất đồng đẳng Điều này cho thấy ở điều kiện nhiệt độ cố định ( 100oC), chúng ta không thể tách được hexan ra khỏi hỗn hợp ( peak của nó trùng với của dung môi)
• Nhưng ớ điều kiện nhiệt độ thay đổi và cao hơn ( 150oC) ta thu được 6 peak ứng với 6 chất trong hỗn hợp→tách tốt
3 Đánh giá,nhận xét về phương pháp sắc kí khí:
Trang 15• Khí có độ nhớt thấp nên có thể xây dựng các cột sắc kí dài→số đĩa lí thuyết lớn→khả năng phân tích tốt
• Không tốn dung môi→kinh tế,không ảnh hưởng môi trường
• Có thể tiến hành lại thí nghiệm mà không chờ cho cột ổn định→tiết kiệm thời gian
• Giới hạn mẫu phân tích :chỉ phân tích các chất
dễ bay hơi
tách các chất