Nghiên cứu ứng dụng phương pháp trung hoà vi rut trên môi trường tế bào BHK 21 trong giám sát huyết thanh sau tiêm phòng vacxin LMLM vô hoạt type o chủng myanma 98 BY 2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN QUANG ANH “NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP TRUNG HÒA VI RÚT TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO BHK-21 TRONG GIÁM SÁT HUYẾT THANH SAU

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

NGUYỄN QUANG ANH

“NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP TRUNG HÒA VI RÚT TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO BHK-21 TRONG GIÁM SÁT HUYẾT THANH SAU TIÊM PHÒNG VACXIN LMLM VÔ HOẠT TYPE O CHỦNG MYANMA 98/BY/2010”

LUẬN VĂN THẠC SỸ NÔNG NGHIỆP

Hà Nội, 2012

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

NGUYỄN QUANG ANH

“NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP TRUNG HÒA VI RÚT TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO BHK-21 TRONG GIÁM SÁT HUYẾT THANH SAU TIÊM PHÒNG VACXIN LMLM VÔ HOẠT TYPE O CHỦNG MYANMA 98/BY/2010”

LUẬN VĂN THẠC SỸ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: Thú y Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Hữu Nam

Hà Nội, 2012

Lời cam ñoan

Tôi xin cam ñoan luận văn là kết quả nghiên cứu của riêng tôi, không sao chép của ai Nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin ñược ñăng tải trên các tác phẩm, tạp chí và các trang web theo danh mục tài liệu của luận văn

Tác giả luận văn

Nguyễn Quang Anh

Lời cảm ơn

Luận văn này là kết quả của quá trình học tập tại Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội và quá trình cơng tác của bản thân tại Cục Thú y trong các năm qua Với tình cảm chân thành, tác giả xin bày tỏ lịng biết ơn đến quý thầy cơ giáo đã tham gia giảng dạy lớp cao học khố 19 chuyên ngành Thú y, đến Viện đào tạo sau ðại học của Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội, đến lãnh đạo cùng tồn thể cán bộ cơng nhân viên của Trung tâm Chẩn đốn thú y trung ương

đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tác giả trong quá trình học tập và hồn thành đề tài luận văn này

ðặc biệt tác giả xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS – TS Nguyễn Hữu Nam đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tác giả nghiên cứu đề tài và hồn chỉnh luận văn

Mặc dù bản thân đã rất cố gắng nhưng chắc chắn luận văn khơng tránh khỏi những thiếu sĩt, rất mong được nhận những ý kiến đĩng gĩp bổ sung của quý thầy cơ cùng các đồng nghiệp

Hà Nội, tháng 10 năm 2012 Tác giả luận văn

Nguyễn Quang Anh

Mục lục

PHẦN 1 ðẶT VẤN ðỀ 1

1.1 Tính cấp thiết của ñề tài 1

1.2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 2

1.3 Mục tiêu của ñề tài 2

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Những hiểu biết về bệnh Lở mồm long móng 3

2.1.1 Khái niệm bệnh Lở mồm long móng 3

2.1.2 Lịch sử bệnh Lở mồm long móng 3

2.1.3 Loài vật mắc bệnh 8

2.1.4 Lứa tuổi 8

2.1.5 Khả năng lây lan 9

2.1.6 Tỷ lệ ốm và chết 9

2.1.7 Triệu chứng - bệnh tích 10

2.1.8 Phòng bệnh 14

2.2 Những hiểu biết về vi rút gây bệnh Lở mồm long móng 16

2.2.1 Hình thái, kích thước của vi rút 16

2.2.2 Cấu tạo của vi rút 16

2.2.3 Phân loại vi rút 17

2.2.4 ðặc tính nuôi cấy của vi rút 18

2.2.5 Sức ñề kháng của vi rút 19

2.2.6 Chất chứa vi rút 19

2.2.7 Cách sinh bệnh 20

2.3 Các phương pháp chẩn đốn bệnh 22

2.3.1 Chẩn đốn lâm sàng 22

2.3.2 Chẩn đốn vi rút học 22

2.3.3 Chẩn đốn huyết thanh học 23

2.3.4 Chẩn đốn bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 26

PHẦN 3 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

3.1 ðối tượng, máy mĩc, dụng cụ, hĩa chất nghiên cứu 27

3.1.1 ðối tượng, địa điểm nghiên cứu 27

3.1.2 Máy mĩc, dụng cụ, hĩa chất và nguyên liệu 27

3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 29

3.2.1 Nội dung nghiên cứu 29

3.3 Phương pháp xử lý số liệu 37

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

4.1 Thiết lập phương pháp trung hịa kháng thể LMLM trên mơi trường tế bào BHK-21……… 38

4.1.1 Nhân giống vi rút type O chủng Myanma 98-like 38

4.1.2 Chuẩn độ 2 giống vi rút type O chủng Myanma 98- like 40

4.1.3 Kết quả thiết lập thực hiện phản ứng trung hịa trên tế bào BHK-21 43

4.2 Kết quả kiểm tra tỷ lệ kháng thể bảo hộ của tỉnh Nam ðịnh bằng 2 phương pháp ELISA và trung hịa trên tế bào 47

4.2.1 Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM trước khi tiêm phịng vacxin 47

4.2.2 Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM sau khi tiêm phịng vacxin 49

ELISA và trung hòa trên tế bào 51

4.3.1 Kết quả kiểm tra trước khi tiêm phòng vacxin 51

4.3.2 Kết quả kiểm tra sau khi tiêm phòng vacxin 53

4.4.1 Kết quả kiểm tra trước khi tiêm phòng vacxin 55

4.4.2 Kết quả kiểm tra sau khi tiêm phòng vacxin 56

4.5 So sánh phương pháp trung hòa vi rút với phương pháp ELISA 59

4.5.1 Kiểm tra ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu của phương pháp trung hòa vi rút LMLM trên tế bào… 59

4.5.2 So sánh kết quả kiểm tra kháng thể của 2 phương pháp trung hòa và ELISA 60

4.5.3 So sánh thời gian xét nghiệm của 2 phương pháp trung hòa và ELISA 63

4.5.4 So sánh hiệu quả kinh tế của 2 phương pháp trung hòa và ELISA 65

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 67

5.1 Kết luận 67

5.2 ðề nghị 68

PHỤ LỤC 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

Danh mục các chữ viết tắt

EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid

MHC-II Major Histocompatibility Complex class II

OIE International Office des Epizootics

(nay là World Organisation for Animal Health)

RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction TTCðTYTƯ Trung tâm Chẩn đốn Thú y TƯ

Vero Verda Reno - tế bào thận khỉ xanh châu Phi

WTO World Trade Organization

UI ðơn vị quốc tế (International Unit)

Danh mục các bảng

Bảng 4.1: Kết quả ñánh giá hai giống vi rút 39

Bảng 4.2: Kết quả sau 3 lần chuẩn ñộ trên tế bào BHK-21 41

Bảng 4.3: Kết quả kiểm tra ñối chứng chuẩn và huyết thanh bằng phương pháp trung hòa 45

Bảng 4.4: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM trước tiêm phòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa tại Nam ðịnh 48

Bảng 4.5: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM sau tiêm phòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào 50

Bảng 4.6: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM trước tiêm phòng bằng 52

Bảng 4.7: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM sau tiêm phòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào tại Lào Cai 53

Bảng 4.8: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM trước tiêm phòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào tại Nghệ An 55

Bảng 4.9: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM sau tiêm phòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào tại Nghệ An 57

Bảng 4.10: ðộ nhạy và ñộ ñặc hiệu của phương pháp trung hòa tế bào 59

Bảng 4.11: Kết quả so sánh tại 3 tỉnh bằng 2 phương pháp trung hòa trên tế bào

và ELISA 60

Bảng 4.12: Thời gian xét nghiệm mẫu của phương pháp trung hòa 63

Bảng 4.13: Chi phí xét nghiệm 1 mẫu huyết thanh của phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào 65

Danh mục các hình

(gồm sơ ñồ, ñồ thị, biểu ñồ, hình vẽ, ảnh)

Hình 2.1 Phân bố các type LMLM tại các huyện có dịch năm 2009 7

Hình 2.2: Triệu chứng và bệnh tích ở miệng lưỡi bò bị bệnh LMLM 11

Hình 2.3: Triệu chứng long móng ở lợn 13

Hình 2.4: Một số hình ảnh của vi rút LMLM 16

Hình 2.5: Sơ ñồ cấu trúc gien vi rút LMLM 17

Hình 2.6: Sự phận bổ các type huyết thanh vi rút LMLM trên thế giới 21

Hình 4.1 Chai tế bào ñể nhân giống virút 40

Hình 4.2: Tế bào BHK-21 bình thường 40

Hình 4.3: Tế bào BHK-21 bị vi rút LMLM phá hủy 40

Hình 4.4: ðĩa tế bào trung hòa trước khi cố ñịnh xanh methylene 47

Hình 4.5: ðĩa tế bào trung hòa sau khi cố ñịnh xanh methylene 47

Hình 4.6: Phản ứng ELISA xác ñịnh hiệu giá kháng thể kháng vi rút LMLM 58

Biểu ñồ 4.1: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM trước tiêm phòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào tại Nam ðịnh 49

Biểu ñồ 4.2: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM sau tiêm phòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào tại Nam ðịnh 50

Biểu ñồ 4.3: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM trước tiêm phòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào tại Lào Cai 52

Biểu ñồ 4.4: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM sau tiêm phòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào tại Lào Cai 54

Biểu ñồ 4.5: Kết quả kiểm tra kháng thể LMLM trước tiêm phòng bằng phương pháp ELISA và trung hòa trên tế bào tại Nghệ An 55

pháp ELISA và trung hòa trên tế bào tại Nghệ An 57

Biểu ñồ 4.7: Kết quả so sánh tại 3 tỉnh bằng 2 phương pháp trung hòa trên tế bào

và ELISA 62

PHẦN 1 ðẶT VẤN ðỀ 1.1 Tính cấp thiết của ñề tài

Việt Nam là một nước có ngành nông nghiệp chiếm trên 60% tỷ trọng của nền kinh tế Trong ñó chăn nuôi ñặc biệt là chăn nuôi gia súc ñóng góp một lượng thực phẩm lớn cho nhu cầu thịt của toàn dân Theo Tổng Cục Thống kê (GSO), năm 2007, tổng ñàn trâu 2,99 triệu con, ñàn bò 6,72 triệu con, ñàn lợn 26,56 triệu con, ñàn gia cầm 226 triệu con, và dê cừu 1,77 triệu con Trong những năm gần ñây, ñược sự quan tâm và chỉ ñạo sát sao của ðảng và Nhà nước, ngành Nông nghiệp nói chung và ngành Chăn nuôi Thú y nói riêng ñã có những bước chuyển biến rõ rệt Tuy nhiên tình hình dịch bệnh vẫn diễn ra hết sức phức tạp, ñặc biệt là dịch bệnh Lở Mồm Long Móng (LMLM) ðây là bệnh ñược tổ chức Thú y Thế giới (OIE) ñưa vào vị trí ñầu tiên trong danh mục các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của gia súc Bệnh gây thiệt hại lớn về kinh tế và ảnh hưởng ñến thương mại, ñặc biệt là việc buôn bán gia súc và sản phẩm từ gia súc Ngoài những thiệt hại do việc triển khai chống dịch, bệnh LMLM trực tiếp gây sảy thai khoảng 25% cái chửa, làm giảm 25% sản phẩm thịt, 50% sản lượng sữa và 25% sản lượng lông cừu(Nguyễn Vĩnh Phước,1987), (Blancou

J và Yoshiro O., 1995) Phòng chống dịch bệnh LMLM luôn là chính sách của mỗi Quốc gia trên Thế giới

Vi rút gây bệnh LMLM thuộc loại ARNvi rút, họ Picornaviridae, có hướng thượng bì và ñược chia thành 7 type huyết thanh là: O; A; C; SAT 1; SAT 2; SAT 3 và Asia 1, trong ñó có hơn 70 subtype khác nhau (Tô Long Thành, 2000), (Aftosa F., 2000).Các type huyết thanh này gây bệnh có triệu chứng lâm sàng giống nhau nhưng lại không tạo ñáp ứng miễn dịch chéo cho nhau Chính vì

vậy việc phịng bệnh bằng vacxin gặp nhiều khĩ khăn do cấu trúc kháng nguyên khác nhau

Xác định mức độ tương đồng giữa chủng vi rút gây bệnh cho gia súc và chủng vi rút được sử dụng làm vacxin là điều kiện tiên quyết trong chương trình phịng chống dịch bệnh(Doel T R., 2003) ðiều này khơng chỉ gĩp phần làm tăng tính hiệu quả của việc tiêm phịng mà cịn gĩp phần làm giảm chi phí trong cơng tác phịng chống dịch bệnh ðặc biệt, trong điều kiện Việt Nam vẫn cịn gặp nhiều khĩ khăn về kinh tế Xuất phát từ vấn đề trên chúng tơi tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu ứng dụng phương pháp trung hịa vi rút trên mơi trường tế bào BHK 21 trong cơng tác giám sát sau tiêm phịng vaccine LMLM vơ hoạt type

O chủng Myanma 98/BY/2010”

1.2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Kết quả đề tài sẽ đĩng gĩp hiểu sâu thêm về bệnh Lở mồm long mĩng, là tài liệu tham khảo cho cơng tác nghiên cứu và giảng dạy, đặc biệt là cán bộ làm cơng tác chẩn đốn trong phịng thí nghiệm

Giúp cho cơng tác phịng chống dịch bệnh Lở mồm long mĩng tại Việt Nam đạt hiểu quả cao hơn

1.3 Mục tiêu của đề tài

Ứng dụng phương pháp trung hịa vi rút vào cơng tác giám sát sau tiêm phịng bệnh Lở mồm long mĩng

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Những hiểu biết về bệnh Lở mồm long móng

2.1.1 Khái niệm bệnh Lở mồm long móng

Foot and Mouth Disase hay còn gọi là bệnh lở mồm long móng, là bệnh truyền nhiễm cấp tắnh của các loài ựộng vật có móng guốc chẵn bao gồm cả gia súc và ựộng vật hoang dã như trâu, bò, lợn, dê, cừu, loài linh dương, hươu, nai Bệnh do một loài vi rút thuộc họ Picornaviridae gây ra đây là loài vi rút có tắnh hướng thượng bì, thường làm thủy hóa các tế bào thượng bì.đặc trưng của bệnh

là làm xuất hiện những mụn nước với các kắch cỡkhông ựồng ựều ở niêm mạc miệng, kẽ móng, gờ móng, trên bầu vú, ựầu vúcon cái và cuống của dạ cỏ Khi mụn nước vỡ sẽ tạo ra các vết loét BệnhLMLM khi xuất hiện thường lây lan rất nhanh, rất mạnh và thường trên phạmvi rộng, có thể lây lan trong phạm vi một hoặc nhiều nước, gây ra các ổ dịchlớn trong thời gian ngắn, tỷ lệ mắc bệnh cao,

có thể tới 100%

2.1.2 Lịch sử bệnh Lở mồm long móng

2.1.2.1.Tình hình bệnh Lở mồm long móng trên thế giới

Lần ựầu tiên, bệnh LMLM ựược Frascastorius phát hiện và mô tả vàonăm

1514 ở Ý, sau ựó bệnh ựược phát hiện ở Bắc Ý, Pháp, Anh và nhiềunước châu

Âu khác đến năm 1897, tác nhângây bệnh ựược hai nhà khoa học người đức có tên là Loeffler và Frosch tìmra, tác nhân này ựược chứng minh là có thể qua ựược màng lọc (đào Trọng đạt, 2000) đến những năm ựầu thế kỷ 20, nhiều công trình nghiêncứu chi tiết về bệnh này mới ựược thực hiện (Andersen, 1980) Năm1922, Valée và Carré phát hiện ra tắnh ựa dạng của huyết thanh miễn dịch

chống vi rút (type O và A), năm 1926 Waldman và Trautwein tìm ra vi rút typeC, Lawrence cũng phát hiện ra type SAT1, SAT2, SAT3 từ các mẫu bệnhphẩm gửi ựến từ châu Phi, type Asia1 từ Ấn độ, Miến điện và Hồng Kông

Ở châu Âu: Cuối thế kỷ 19, bệnh xuất hiện ở Nga, sau ựó lây lan

nhanhsang nhiều nước châu Âu khác như đức, Hà Lan, Thụy Sĩ, Bỉ, Hung-ga-ri, Áo,đan Mạch, Pháp, Ý làm cho hàng chục triệu trâu bò mắc bệnh (Nguyễn Vĩnh Phước, 1987) Từ 1951 ựến 1954, dịch LMLM phát sinh ở Tây đức, sauựó lây sang nhiều nước như Hà Lan, Bỉ, Luých-xăm-bua, Pháp, Anh, Ý, Áo,đan Mạch, Thụy điển, Na Uy, Ba Lan Năm 2000, Hy Lạp xảy ra 14 ổ dịchLMLM type Asia1, theo kết quả ựiều tra của Hy Lạp, nguyên nhân gây ra ựợtbùng phát dịch này là do nhập lậu gia súc từ Thổ Nhĩ Kỳ (Văn đăng Kỳ,2002) Năm 2001 dịch

nổ ra ở vùng đông Nam nước Anh, sau ựó dịchlây lan ra khắp nước Anh, len, xứ Uên, Bắc Ai-len, Cộng hoà Ai-len, HàLan và Pháp

Scốt-Ở châu Mỹ: Từ 1870 ựến 1929, xuất hiện 9 ổ dịch tại các bang của Mỹnhư

New England, Porland, Maine (1880), Boston, New England (1884), chủyếu là

do nhập khẩu gia súc mang trùng từ nước khác Năm 1870, bệnh cũngphát ra ở Canada Tại Mexico, dịch phát ra trong các năm 1946-1954, tạiCanada năm 1951-1952 và Argentina năm 1953 (Phan đình đỗ và Trịnh Văn Thịnh, 1958) Năm 2000 dịch LMLM xảy ra ở Nam Bra-xin (type O), Áchen-ti-na (type A), U-ru-guay (type O), Bo-li-via (type O và A), Co-lum-bia (typeO và A), Peru (type A), Ecuado (type O)

Ở châu Phi: Dịch LMLM xảy ra tại nhiều nước, cả ở Bắc Phi và NamPhi

(Nguyễn Vĩnh Phước, 1970) Năm 2001 dịch LMLM type O xảy ra ởUganda, tại Malawi type SAT1, tại Zimbawe type SAT2

Ở châu Á: Dịch LMLM xảy ra khá trầm trọng Bệnh phát sinh ở Ấn

độ(1929, 1952 ), In-ựô-nê-xia (1952), Phi-lip-pin (1902), My-an-ma (1936,1948), Ma-lay-xia (1939), Thái Lan (1952), Cam-pu-chia (1931, 1946, 1952),Trung Quốc (1951) (Nguyễn Vĩnh Phước, 1970) Nhìn chung có 3 typethường xuyên gây bệnh LMLM ở khu vực các nước đông Nam Á ựó là type O,A và Asia1 (Văn đăng Kỳ và Nguyễn Văn Thông, 2001)

2.1.2.2 Tình hình bệnh Lở mồm long móng ở Việt Nam

Ở Việt Nam, bệnh LMLM ựược phát hiện lần ựầu tiên vào năm 1898tại Nha Trang và sau ựó là vào năm 1920 ở Nam Bộ Tiếp theo ựó, các năm1937-

1940 bệnh ựược phát hiện ở Quảng Ngãi và năm 1952 bệnh phát ra tạitỉnh Thừa Thiên Huế, ựến năm 1953-1954 bệnh lây lan vào các tỉnh NamTrung bộ, Bắc Trung bộ (Khu 4), Khu 3, khu tả ngạn, trung và thượng du Bắcbộ, Tây Bắc (điện Biên) và Việt Bắc Tháng 4-1955, bệnh tái phát ở Khu 3 vàlan vào Khu 4 và Khu

tả ngạn Việt Bắc (Phan đình đỗ và Trịnh Văn Thịnh, 1958) Năm 1960-70, ở miền Nam dịch xảy ra lại nghiêm trọng hơn trênựàn trâu khu vực Sài Gòn-Chợ Lớn, từ ựó lây ra các tỉnh lân cận và tấn công 5trại lợn công nghiệp ở Nam bộ (Hồ đình Chúc và cộng sự, 1978)

Trong những năm 1954-1975, bệnh LMLM xảy ra tại các tỉnh thànhphố khu vực phắa Nam Bệnh phát ra nhiều tại các tỉnh giáp biên giới Campu-chia

Từ năm 1980-1988, dịch phát ra chủ yếu ở vùng đông Nam bộ và cáctỉnh miền Trung Năm 1993, dịch LMLM xảy ra ở 122 xã của 18 huyện thuộc các tỉnhgồm Quảng Ninh, Hải Phòng, Hà Tĩnh, Quảng Bình và Thừa Thiên Huế làm32.260 trâu, bò và 1612 lợn bị bệnh (Trần Hữu Cổn, 1996) Năm 1995dịch

LMLM xảy ra ở 107 huyện của 26 tỉnh làm 236.000 trâu, bò và 11.000lợn mắc bệnh (Lê Minh Chí, 1996)

Theo Trần Hữu Cổn (1996) trong vòng 20 năm từ 1975-1995 dịch liên tục phát ra trên ñàn trâu bò Năm 1995 là giai ñoạn ñỉnh ñiểm của dịch với 26 tỉnh thành có dịch làm nhiều gia súc mắc bệnh, tại khu vực phía Nam ñã có 10.293 con lợn mắc bệnh Tính ñến cuối năm 1999 có 55 tỉnh thành có gia súc mắc bệnh, số trâu bò mắc bệnh lên tới 120.989 con và số lợn mắc bệnh là 31.801 con

Tính ñến ngày 10/03/2000, ñã có 58 tỉnh có dịch, làm 297.808 trâu, bò và 36.530 lợn bị bệnh Từ năm 2000 ñến năm 2005 liên tục có dịch LMLM

Năm 2007, Chương trình quốc gia khống chế và thanh toán bệnh LMLM, các tỉnh vùng khống chế và vùng ñệm ñã triển khai tiêm phòng vacxin ñúng chủng loại vacxin, kết quả ñạt tỷ lệ cao, nên từ cuối tháng 08/2007 - ñầu tháng 11/2007, cả nước không có dịch LMLM xảy ra

Năm 2008:Dịch LMLM ñã xảy ra tại 122 xã, phường của 43 huyện, quận của 14 tỉnh thành làm 2.408 con trâu, bò và 67 con lợn mắc bệnh Tổng số gia súc chết và tiêu hủy là 218 trâu, bò và 39 lợn

Dịch xảy ra chủ yếu trên ñàn trâu, bò, tuy nhiên mức ñộ dịch ñã giảm rõ rệt về phạm vi (số tỉnh, huyện, xã) cũng như số lượng gia súc mắc bệnh và giết hủy so với năm 2007

Type vi-rút gây bệnh: hầu hết các ổ dịch LMLM năm 2008 xảy ra là do type O Tháng 12/2008 vi rút type A ñã xuất hiện tại Nghệ An

Năm 2009:Dịch ñã xảy ra ở 229 xã, phường thuộc 87 huyện, quận của 27 tỉnh, thành phố với tổng số 7.861 con trâu, bò mắc bệnh, 432 con phải tiêu hủy;

trên lợn, dịch xảy ra ở 35 xã, phường thuộc 23 huyện, quận của 16 tỉnh, thành phố làm 499 con lợn mắc bệnh LMLM, 429 con phải tiêu hủy

Tháng 09/2009, dịch xảy ra trên quy mô rộng, trong tháng xuất hiện trên

90 ổ dịch, sau ñó số ổ dịch giảm dần

Hình 2.1 Phân bố các type LMLM tại các huyện có dịch năm 2009

(Nguồn: Cục Thú y)

Về type virút gây bệnh: hầu hết các ổ dịch LMLM xảy ra trong năm 2009

là do type O; type A xuất hiện ở các tỉnh Hà Giang, Sơn La, Bắc Giang, Kon Tum và Long An

Năm 2010: trong 6 tháng ñầu năm 2010, dịch xảy ra ở 85 xã, phường thuộc 32 huyện của 12 tỉnh thành phố làm 4.290 con trâu, 1.171 con bò và 684 lợn mắc bệnh trong ñó 67 con trâu bò và 52 con lợn tiêu hủy Các ổ dịch LMLM

phân bố chủ yếu ở khu vực miền núi phía Bắc và toàn bộ các ổ dịch ñều là type

O (nguồn Cục Thú y)

Năm 2011, dịch xảy ra ở 1.809 xã, phường thuộc 239 huyện của 35 tỉnh Tổng số gia súc mắc bệnh 140.979 con trâu bò lợn, dê Tổng số gia chết và tiêu hủy là 39.228 con trong ñó 6.217 con trâu, 805 con bò, 31.993 con lợn và 213 con dê(Cục Thú y, 2011) Khu vực xảy ra dịch bệnh chủ yếu ở các tỉnh Bắc Trung bộ, duyên hải miền Trung, Tây Nguyên và các tỉnh miền núi phía Bắc, ñặc biệt xảy ra nặng ở các tỉnh miền núi phía Bắc

ðến 10/05/2011 cả nước vẫn còn 7 tỉnh có ổ dịch LMLM

2.1.3 Loài vật mắc bệnh

Trong tự nhiên, tất cả các ñộng vật móng guốc chẵn ñều mắc, trong ñó loài trâu, bò mắc nhiều nhất rồi ñến lợn, dê, cừu ðộng vật non mẫn cảm hơn ñộng vật trưởng thành Loài vật một móng như ngựa, gia cầm và chim không cảm nhiễm với bệnh [5]

Trong thí nghiệm: Tiêm vi rút cho bê mới ñẻ chưa bú sữa mẹ sẽ gây bệnh

và có thể làm chết bê trong vòng 38 giờ, phủ tạng bê chứa nhiều vi rút Ngoài ra trong phòng thí nghiệm người ta có thể dùng chuột nhắt trắng, chuột xám, thỏ, chuột lang (Nguyễn Vĩnh Phước, 1970)

2.1.4 Lứa tuổi

ðộng vật ở các lứa tuổi ñều có thể bị bệnh, súc vật non bị mắc bệnh nặng hơn súc vật trưởng thành (Nguyễn Như Thanh, 2001)

Vi rút LMLM gây bệnh nhẹ ở ñộng vật trưởng thành với tỉ lệ chết trên 5% Tuy nhiên ở ñộng vật non gây bệnh rất nặng, tỷ lệ chết lên ñến 90% (Riemann H., 2008)

2.1.5 Khả năng lây lan

Bệnh LMLM là bệnh lây lan rất mạnh rất nhanh, rất rộng trong một thời gian ngắn Sự di chuyển vi rút LMLM trong ñiều kiện thích hợp có thể là 250 km trong không khí

Vi rút gây bệnh LMLM có thể lây truyền trực tiếp giữa con mắc bệnh và con khoẻ khi nhốt chung hoặc chăn thả chung trên ñồng cỏ

Chó, mèo, gà, chim muông, hoang thú, côn trùng không mắc bệnh nhưng

có thể truyền bệnh theo con ñường cơ học từ nơi này ñến nơi khác Gió cũng là một yếu tố quan trọng trong việc làm lây lan bệnh qua không khí

2.1.6 Tỷ lệ ốm và chết

Tỷ lệ tử vong ở ñộng vật trưởng thành thấp nhưng tỷ lệ tử vong ở ñộng vật non có thể lên tới 100%, ñộng vật non chết chủ yếu do viêm cơ tim nặng dẫn ñến suy tim và chết (Alexandersen S., 2008), nguyên nhân khác là do gia súc non, sức ñề kháng kém nên dễ bị nhiễm kế phát các bệnh khác khi mắc bệnh LMLM

- Ở miệng: Lúc sốt thì miệng nóng, niêm mạc miệng, môi, lợi, chân răng nóng, khô, ñỏ ửng lưỡi dày lên và khó cử ñộng, có con không liếm mũi ñược Mụn nước bắt ñầu mọc ở mép, ở môi, lợi, lưỡi, phía trong má và chân răng Ở những nơi có mụn nước xuất hiện, tổ chức liên kết phồng lên, có màng bọc mỏng, bên trong có nước, lúc ñầu nước trong vàng, về sau nước vẩn ñục dần, sờ vào mụn có cảm giác mềm Mụn có màu trắng hoặc hơi hồng Sau một hai ngày thì mụn vỡ, lớp bọc mụn rách ra xơ xác, ñể lộ mặt dưới có màu ñỏ hoặc mụn thủng một giếng nhỏ có viền bị rách Mụn nước vỡ, các màng niêm mạc mất ñi

ñể lại vết lét sâu, rộng, màu hồng trắng, có phủ một lớp chất màu vàng, sau vài ngày thì bắt ñầu hình thành sẹo Mụn nước vỡ thì lưỡi bị loét ñỏ, màng lưỡi tróc theo mụn nước, lớp niêm mạc có gai tróc ra

Nước bọt lúc ñầu chảy ra ít và trong, khi mụn vỡ thì nước bọt chảy ra nhiều, mồm hôi, tiếng chép miệng ñặc trưng

Hình 2.2: Triệu chứng và bệnh tích ở miệng lưỡi bò bị bệnh LMLM

- Ở chân: Khi con vật có biểu hiện kém ăn, móng chân bắt ñầu nóng, ñau, vành móng hơi sưng, da mỏng có màu trắng hồng, tụ máu phồng lên Con vật ñứng không yên, bước ñi khó khăn, dò dẫm, không dám bước mạnh Có khi què nặng, con vật nằm một chỗ, vành móng mưng mủ, phồng lên Sau 1-2 hôm thì mụn nước bắt ñầu thấy rõ ở kẽ chân, mụn trắng dài lấp cả kẽ chân Mụn nước vỡ, làm rách lớp da kẽ chân, phần da sau gót cũng bị loét làm hở móng, có khi long móng ở những con bị nặng Mụn vỡ chảy nước mùi hôi thối và ñể lộ lớp bì bên trong màu ñỏ

- Ở vú: Bầu vú bị sưng, mụn nước mọc ở ñầu núm vú, mụn có thể to bằng quả mận, da xung quanh mụn màu ñỏ và ñau, sau 2-6 ngày thì vỡ ñể lại vết xước bằng phẳng dưới dạng vảy Bầu vú bị tổn thương, việc vắt sữa khó khăn, sữa thay ñổi tính chất: lỏng, màu vàng, mùi hôi và sản lượng sữa giảm nhiều

- Các triệu chứng khác: Ngoài những triệu chứng như mô tả ở trên, có trường hợp sau khi mụn nước ở miệng, móng vỡ thì con vật ñi tháo trong 2-3

ngày, trong phân có chất nhầy và có khi lẫn máu Có trường hợp thấy mụn mọc ở những vùng da mỏng như ở âm hộ, nách, ngực, bụng, trong ñùi Có trường hợp mầm bệnh nhiễm vào bộ máy tuần hoàn, vào tim gây suy tim hay bộ máy tiêu hóa, hô hấp gây viêm ruột, viêm phổi

b) Triệu chứng ở lợn:

Thời gian nung bệnh trung bình từ 2-12 ngày Lợn sốt cao 40-410C, ủ rũ, kém ăn, chảy nhiều nước bọt màu trắng Mụn mọc ở quanh mũi, sống mũi niêm mạc miệng, lưỡi, ñầu vú hay quanh bầu vú, kẽ móng, vành móng Lợn ñi lại khó khăn, khập khiễng, hoặc không muốn di chuyển, di chuyển bằng ñầu gối, hay nằm Sau vài ngày mụn vỡ tạo thành các vết loét, kẽ móng nứt, có khi long mất móng, da ñỏ loét Ở ñầu vú lợn nái ñang nuôi con cũng có mụn nước Lợn con ñang bú và lợn con cai sữa có hiện tượng ỉa chảy gầy yếu hoặc chết ñột ngột, lợn choai một số ít có mụn nước còn hiện tượng loét kẽ móng thường xuyên xẩy ra(Baillree Tindall, 1985)

Triệu chứng lâm sàng bệnh LMLM trên lợn khó phân biệt với các bệnh mụn nước khác như: viêm miệng mụn nước (VS), ngoại ban có mụn nước (VES)

và bệnh mụn nước ở lợn (SVD)

- Ở tim: Màng bao tim xuất huyết từng ñiểm có khi từng ñám, vùng tổn thương nhỏ, từng ổ xám, kích thước không ñều, nó làm cơ tim có sọc vằn (gọi là tim rằn ri, da hổ) do mắc bệnh nhiều lần Xét nghiệm vi thể cơ tim bị thoái hoá

và hoại tử cùng với sự xâm nhập lan tràn limphô bào và ñôi khi cả bạchcầu trung tính

Các bệnh tích cơ tim tương tự ở chuột con ñang bú ñược gây nhiễm thực nghiệm với vi rút LMLM, nhưng trầm trọng hơn(Andersen, 1980)

- Ở ñường hô hấp: Viêm khí quản, phế quản, màng phổi và phổi

- Ở lách: Sưng ñen

- Ở cơ vân: Các biến ñổi ở cơ vân giống như biến ñổi ở cơ tim Những vùng bị hoại tử có ranh giới rõ Về ñại thể có các ổ màu xám có kích thước khác nhau Về vi thể có các bó cơ bị hoại tử và có sự xâm nhập bạch cầu

2.1.8 Phòng bệnh

2.1.8.1 Khi chưa có dịch xảy ra

a) Chăm sóc và vệ sinh phòng bệnh

- Cho gia súc ăn uống ñầy ñủ về chất lượng và số lượng

- ðịnh kỳ tẩy uế chuồng trại, bãi chăn thu gom phân rác ñốt hay ủ phân theo phương pháp sinh vật học

- Khi nhập gia súc từ nơi này sang nơi khác phải thực hiện kiểm dịch chặt chẽ, nhất là qua biên giới (Tô Long Thành, 2000)

vi rút gây bệnh trên thực ñịa thì việc tiêm phòng mới có hiệu quả

Sau khi tiêm vacxin mức ñộ bảo hộ tốt nhất thường ñược ghi nhận ở bò là từ 21-28 ngày sau khi tiêm, nhưng có một số trường hợp ñỉnh cao này lại quan sát thấy ở ngày 14 sau khi tiêm(Cunliffe H.R., 1962), (Eble P.L., 2006, 2007)

Mỗi lần tiêm bảo hộ ñược 3 tháng do vậy chúng ta cần phải tiêm nhắc lại

- Các loại vacxin ñang dùng hiện nay:

+ Vacxin formol keo phèn

+ Vacxin vô hoạt nuôi cấy trên môi trường tế bào

Các loại vacxin LMLM hiện dùng ở Việt Nam

Tại Việt Nam hiện ñang sử dụng 2 loại vacxin ñơn giá và ña giá nhập từ các nước là Merial (Pháp) và Intervet (Hà Lan), Trung Quốc (vacxin vô hoạt type O), Nga, Ấn ðộ (Posi-FMD)

Intervet giới thiệu ở Việt Nam hai loại vacxin LMLM có tên thương mại

là DECIVAC- FMD- ALSA (dùng cho thú nhai lại) và DECIVAC- FMD- DOE (dùng chung cho lợn và thú nhai lại)

Merial có vacxin Aftovax (dùng cho thú nhai lại) và Aftopor (dùng cho lợn và thú nhai lại) (Brown C., 2001)

Viện Thú y Lan Châu, Trung Quốc có vacxin nhị giá Foot and Mouth Disease (type O, Asia1) Bivalent Vaccine, vô hoạt cũng ñang ñược sử dụng ở nước ta

Vacxin ña giá ở Việt Nam chứa các type O, A và Asia1 (Brown C.,2001)

2.1.8.2 Khi dịch xảy ra

Khi dịch bệnh LMLM xảy ra, phải thực hiện các biện pháp chống dịch, khai báo có dịch và công bố dịch, khoanh vùng ổ dịch

2.2 Những hiểu biết về vi rút gây bệnh Lở mồm long móng

2.2.1 Hình thái, kích thước của vi rút

Vi rút gây bệnh LMLM thuộc họ Picornaviridae, giống Aphthovirus, có cấu trúc hình ña diện gồm 30 mặt ñều Vi rút LMLM thuộc loại vi rút nhỏ nhất, kích thước từ 20-30 nm và có thể qua ñược các máy lọc Berkefeld, Chamberland, màng lọc Seizt (Nguyễn Như Thanh, 2001) Trọng lượng phân tử của một vi rút hoàn chỉnh khoảng 6,9 kda, 69% là prô-tê-in và 31% là ARN

Hình ảnh vi rút LMLM dưới

kính hiển vi ñiện tử

Mô hình cấu trúc của hạt virion LMLM

Cấu tạo kháng nguyên

Hình ảnh cấu trúc không gian 3 chiều của vi rút LMLM

Hình 2.4: Một số hình ảnh của vi rút LMLM

2.2.2 Cấu tạo của vi rút

Hạt vi rút chứa 30% a-xít nu-clê-ic, ñó là một ñoạn ARN chuỗi ñơn, hợp thành bởi 8450 ba-zơ và có hệ số sa lắng là 35S, không có tính sinh kháng thể và

ñặc tính kháng nguyên nhưng có vai trò trong quá trình gây nhiễm Vỏ cap-xit của vi rút có hơn 60 ñơn vị (capxôm) Mỗi cap-xôm có 4 loại prô-tê-in cấu trúc giống nhau là VP1, VP2, VP3 và VP4 VP1, VP2 và VP3 tạo nên một bề mặt của khối 20 mặt ñối xứng với ñường kính khoảng 23nm còn VP4 là prô-tê-in ở bên trong capxit, kết dính ARN vi rút với mặt trong của capxit (Bachrach H.L., 1968) VP1 ở ngoài cùng tham gia vào việc cố ñịnh vi rút trên những tế bào, ñóng vai trò quan trọng nhất trong việc gây bệnh, ñồng thời là loại kháng nguyên chính tạo ra kháng thể chống lại bệnh LMLM Vi rút LMLM thuộc loại không có

vỏ bọc

Hình 2.5: Sơ ñồ cấu trúc gien vi rút LMLM

2.2.3 Phân loại vi rút

Cho ñến nay vi rút LMLM ñược phát hiện gồm 7 type khác nhau ñó là: O,

A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 và Asia1 Các type này có tính kháng nguyên không giống nhau và giữa các type không gây miễn dịch chéo nhưng chúng gây các triệu chứng, bệnh tích ở ñộng vật rất giống nhau Trong mỗi type lại có các sub-type ðến nay ñã phát hiện ñược trên 70 sub-type vi rút Các sub-type ñược

ký hiệu gồm tên của type mẹ và ñánh dấu theo thứ tự ngày tháng phát hiện ra chúng, ví dụ: A22, O11

2.2.4 ðặc tính nuôi cấy của vi rút

Vi-rút LMLM có tính hướng thượng bì, do ñó thường nuôi cấy vi-rút trên:

- Tổ chức da sống (thượng bì), như tổ chức da của thai lợn, bò, chuột con còn sống (giữ thai sống bằng phương pháp nhân tạo)

- Trên các ñộng vật thí nghiệm như thỏ, chuột lang, chuột nhắt ñã trưởng thành (tuy nhiên vi-rút thường bị biên ñổi và mất ñặc tính gây bệnh); trên màng niệu nang của phôi trứng (không ổn ñịnh, có khi ñược có khi không)

- Trên tổ chức thượng bì lưỡi bò trưởng thành ðây là tổ chức thích hợp nhất ñể nuôi cấy vi-rút LMLM Lưỡi bò phải ñược lấy ngay sau khi mổ bò, giữ lạnh ở nhiệt ñộ 2 -30C và chỉ sử dụng ñược trong vòng 8 ngày.Phương pháp này cho kết quả tốt nhất, ñộc lực của vi-rút vẫn cao ñối với bò và ñộng vật thí nghiệm sau nhiều lần tiếp ñời Do ñó phương pháp này thường ñược dùng ñể chế vắc-xin vô hoạt

- Ngoài các phương pháp trên, có thể nuôi cấy trên môi trường tế bào.Tốt nhất là tế bào thận bê hoặc cừu non, tuyến yên của bò hoặc của lợn, hoặccác dòng tế bào mẫn cảm như tế bào BHK (Baby Hamster Kidney) Sau khicấy vi rút LMLM vào các môi trường tế bào nói trên, ñể tủ ấm 370C trongkhoảng 24-72 giờ, vi rút sẽ làm huỷ hoại tế bào nuôi Phòng thí nghiệm thamchiếu LMLM Pirbright năm 1973 ñã nuôi cấy 140 chủng vi rút LMLM,khoảng 120 chủng ñã sinh trưởng trong môi trường BHK21 Hiện nay môitrường này thường ñược sử dụng ñể phân lập vi rút (Geoffrey W., 1989)

2.2.5 Sức ñề kháng của vi rút

- Theo A.I.Donaldson (2000) , vi-rút LMLM khá bền vững trong ñiều kiện

tự nhiên Vi-rút LMLM thích nghi nhất với pH trong khoảng 7,2 – 7,6 pH < 5 hay pH > 11 vi-rút bị vô hoạt rất nhanh Khi vi-rút ở trong các dịch tự nhiên ñang khô ñi như ở trong phân, nước tiểu hay rơm rạ, chất ñộn chuồng thì tính gây bệnh của vi-rút tương ñối bền vững với tác ñộng vô hoạt

Ở nhiệt ñộ 600C – 700C vi-rút sẽ bị chết sau 5 - 15 phút, ñun sôi 1000C rút chết ngay Ngược lại ở nhiệt ñộ thấp như trong tủ lạnh, vi-rút có thể ñược bảo tồn 425 ngày

vi ðối với hoá chất, vivi rút LMLM có sức ñề kháng mạnh với những chất

sát trùng thông thường: Crezon 3% sau 6 giờ vi-rút vẫn còn ñộc lực, clorofoc 1% sau 20 ngày vi-rút vẫn còn ñộc lực Vì thế phải dùng những chất sát trùng mạnh, xút 1% diệt vi-rút trong 1 - 10 phút, tốt nhất là dùng nước vôi tôi 5 - 10%, for-môn 2% diệt trong 6 giờ

2.2.6 Chất chứa vi rút

Trong cơ thể của ñộng vật mắc bệnh, vi rút ñược phân bố trong các bệnh tích ñặc hiệu, các mụn nước, trong dịch lâm ba không màu hoặc màu vàng nhạt của mụn nước và trong các màng bọc mụn nước Vi rút có nhiều nhất trong dịch của mụn nước sơ phát và mới (tối ña 2 ngày) Trong máu, nội tạng, các bệnh tích

ở bắp thịt, trong các chất bài tiết và bài xuất: nước bọt, nước tiểu, phân, sữa, nước mũi, nước mắt ñều có chứa vi rút

2.2.7 Cách sinh bệnh

Thời kỳ nung bệnh phụ thuộc vào loài ñộng vật, liều vi rút, ñường truyền

và type vi rút, trong một số trường hợp có thể kéo dài 2- 10 ngày

Vi rút LMLM có tính hướng thượng bì, sinh sản chủ yếu trong các tế bào thượng bì, ñặc biệt là ở những tế bào thượng bì non Khi vi rút xâm nhập vào cơ thể, trước tiên nó nhân lên ở trong lớp thượng bì của nơi xâm nhập (lớp thượng

bì của ống tiêu hóa, của da, ), gây thuỷ thũng các tế bào thượng bì này và hình thành mụn nước sơ phát (thường không trông thấy vì con vật vẫn còn khỏe mạnh) Sau ñó, vi rút sẽ ñi vào máu và các cơ quan phủ tạng Khi vi rút vào máu

sẽ gây sốt và tới các tế bào thượng bì, cuối giai ñoạn sốt, vi rút gây ra các mụn nước thứ phát ở nơi những tế bào thượng bì ñang phân chia mạnh như niêm mạc xoang miệng, vành móng, kẽ móng, núm vú bò sữa, mõm lợn Dưới áp lực của nước chứa bên trong, mụn nước phát triển to dần ra, nhô lên, kèm theo là phản ứng viêm của da vùng lân cận, bạch cầu xâm nhiễm làm cho dịch lâm ba trong của mụn nước trở nên hơi ñục, nhưng không bao giờ sinh mủ Sau khi mụn vỡ, những tổn thương trên thượng bì ñược lấp ñầy, không ñể lại sẹo Mụn nước chỉ loét khi có sự xâm nhiễm của vi khuẩn kế phát (vi khuẩn sinh mủ, gây hoại tử, ) gây bệnh lý cục bộ ăn sâu vào trong, có khi gây bại huyết, con vật có thể suy yếu hoặc chết

Vi rút có thể thông qua ñường tuần hoàn con mẹ xâm nhập vào phôi thai,

do ñó gia súc có chửa khi mắc bệnh LMLM thường hay sẩy thai

2.2.8 Phân bố serotypevi rút LMLM trên thế giới

Nhìn chung, sự phân bố của các typevi rút LMLM thường có tính ñặc trưng vùng lãnh thổ: Vi rút LMLM type O, A, C có mặt trên khắp thế giới; type Asia 1

có nguồn gốc châu Á Các type SAT 1, SAT 2, SAT 3 chỉ có ở châu Phi, hiếm khi thoát ra ngoài (ngoại trừ trường hợp dịch do SAT1 ở Trung đông năm 1962) Diễn biến của type O cũng trở nên phức tạp trong những năm gần ựây: Type

O có mặt ở nhiều quốc gia ở khắp 4 châu lục: châu Phi (Sudan, Mali và Togo), châu Á (Iran, Pakistan, Arập Xê Út, Nepan, Bhutan, Philippin, Việt Nam, Myanmar và Thái Lan), Nam Mỹ (Brazil, Southern Cone, Ecuador và Venezuela)Ầ

(Nguồn FAO: http://www.fao.org/corp/google_result/en/?cx=018170620143701104933%3Aqq82jsfba7w&q=FMD+stituation+map+2008&cof=FORID%3A9&x=12&y=7#1247)

Hình 2.6: Sự phận bổ các type huyết thanh vi rút LMLM trên thế giới

Vi rút LMLM type O xuất hiện nhiều nhất ở khu vực đông Nam Á: Malaysia, Lào, Việt Nam, Philippin, Hồng Kông, Myanmar và Thái Lan Ổ dịch

do vi rút LMLM type Asia1 cũng ựược báo cáo ở Iran, Afganistan, Georgia, Azerbezan, Mông Cổ

Chưa có những hiểu biết rõ ràng về dịch tễ học type C vi rút LMLM Vi rút LMLM type C xảy ra ắt nhất so với các type khác trong khu vực trên thế giới, vi

rút LMLM type này là nguyên nhân gây 8% các vụ dịch xảy ra vào năm

1977-1990 và 1,6% các vụ dịch trong năm 1991-1994

Từ năm 1995 có ắt nhất là 10 vụ dịch nghi ngờ do vi rút LMLM type C gây

ra trên thế giới; châu Á (1967-2004) tiêu biểu ở Angola, 1973 châu Âu 1989), Bắc Mỹ (1944 và 1996, 1971-1993), Trung đông (1967-1970)

(1953-2.3 Các phương pháp chẩn ựoán bệnh

2.3.1 Chẩn ựoán lâm sàng

Chẩn ựoán lâm sàng bệnh LMLM có thể thực hiện khi bệnh xẩy ra tạikhu vực ựã ựược xác ựịnh là có dịch LMLM.Hoặc căn cứ các ựặc ựiểm dịch tễ như: Bệnh ựại lưu hành, tốc ựộ lây lannhanh, tỷ lệ mắc cao, tỷ lệ chết thấp, ựộng vật móng guốc chẵn ựều mắc bệnh

Khi trâu bò mắc bệnh, chẩn ựoán thôngqua triệu chứng lâm sàng là tương ựối chắnh xác, ở lợn thì cần phải chẩn ựoánphân biệt với các bệnh mụn nước

2.3.2 Chẩn ựoán vi rút học

Huyễn dịch bệnh phẩm cần chẩn ựoán phải ựược ly tâm trước khi cấyvào

tế bào nuôi hoặc tiêm cho ựộng vật thắ nghiệm Phương pháp thường sửdụng hiện nay là nuôi cấy vi rút trên môi trường tế bào Các tế bào nhạy cảmvới vi rút LMLM bao gồm tế bào tuyến giáp trạng sơ cấp của bò, tế bào thậnsơ cấp của cừu, bê hoặc lợn, các tế bào dòng, như tế bào thận chuột Hamsternon (Baby Hamster Kidney- BHK) Nếu bệnh phẩm có vi rút LMLM, sau khigây nhiễm 24 giờ sẽ thấy bệnh tắch tế bào

Ngoài ra, có thể tiêm huyễn dịch bệnh phẩm cần chẩn ựoán vào nội bìlưỡi

dịch bệnh phẩm vào Nếu bệnh phẩm cĩ chứa vi rút LMLM thì sau12-48 giờ, xuất hiện mụn nước hoặc mụn nhỏ màu đỏ ở chỗ tiêm hoặc bơibệnh phẩm

2.3.3 Chẩn đốn huyết thanh học

2.3.3.1 Phản ứng trung hồ vi rút

Phản ứng này dùng chẩn đốn các trường hợp bị bệnh nhẹ, khơng điển hình, phải lấy máu chắt huyết thanh để tìm kháng thể Phản ứng này rất đặc hiệu, nhạy và nhanh chĩng Việc tìm ra kháng thể đặc hiệu ở gia súc chưa được tiêm phịng vắc-xin LMLM đủ cơ sở kết luân là con vật cĩ bệnh

Kháng nguyên là vi-rút LMLM chuẩn nuơi cấy trên mơi trường IB-RS-2, BHK-21, tế bào thận lợn hoặc thận cừu và gây bệnh tích tế bào Kháng thể nghi

là huyết thanh của gia súc nghi mắc bệnh được xử lý ở nhiệt độ 560C trong 30 phút

Phản ứng trung hịa vi-rút được thực hiện trên mơi trường tế bào IB-RS-2, BHK-21, tế bào thận lợn hoặc thận cừu được nuơi trong các đĩa nhựa giếng nhỏ đáy bằng ðể xác định type gây bệnh, cho huyết thanh của gia súc nghi mắc bệnh vào 7 ống nghiệm, sau đĩ cho vào ống nghiệm từng type vi-rút LMLM đã biết với hiệu giá vi-rút đã được xác định là 100 TCID50 (50% Tissue Culture Infectious Dose) một lượng tương đương với huyết thanh nghi, rồi cho vào tủ ấm

370C trong khoảng 1 giờ để kháng nguyên và kháng thể tác động vào nhau Sau

đĩ dùng hỗn dịch của từng ống nghiệm cấy vào các dãy giếng nhựa đã nuơi cấy

tế bào, đồng thời các giếng đối chứng âm khơng cấy hỗn dịch mà để tế bào tiếp tục phát triển và các giếng đối chứng dương cấy các type vi-rút LMLM tiếp tục

để tủ ấm 370C trong vịng 2-3 ngày

ðọc kết quả, nếu giếng đĩa nhựa nào khơng cĩ hiện tượng hủy hoại tế bào, giống như giếng đối chứng âm, chứng tỏ giếng đĩ cĩ kháng thể tương ứng với type vi-rút LMLM nên vi-rút bị kháng thể trung hịa và khơng cĩ khả năng hủy hoại tế bào Ngược lại, nếu giếng đĩa nào cĩ hiện tượng hủy hoại tế bào, tức là ở

đĩ vi-rút vẫn cịn khả năng gây bệnh, giống giếng đối chứng dương, chứng tỏ kháng thể khơng tương ứng với type vi-rút đĩ hoặc trong huyết thanh khơng cĩ kháng thể

2.3.3.2 Phản ứng kết hợp bổ thể (CFT- Complement Fixation Test)

Phản ứng kết hợp bổ thể là phản ứng thơng thường được dùng để phát hiện bệnh LMLM, vì đơn giản, cho kết quả nhanh, chính xác và ít tổn kém

Nguyên lý: Dùng các type huyết thanh đã biết để phát hiện type vi-rút gây bệnh Phản ứng kết hợp bổ thể được thực hiện nhờ hai hệ thống: hệ thống dung huyết và hệ thống dung trùng với sự tham gia của bổ thể

Huyết thanh miễn dịch (huyết thanh chuẩn) của từng type được chế trên chuột lang bằng phương pháp gây tối miễn dịch Kháng nguyên nghi là huyết thanh gia súc nghi mắc bệnh LMLM hoặc dùng bệnh phẩm cấy vào mơi trường phù hợp, sau đĩ lấy dịch để làm phản ứng

2.3.3.3 Phản ứng ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Theo tác giả Tơ Long Thành, ELISA là một phản ứng dùng để chẩn đốn nhanh bệnh LMLM và để giám định type huyết thanh của vi-rút LMLM ðây là một phản ứng cĩ độ đặc hiệu cao khi dùng với một kháng thể đơn dịng, phản ứng này cĩ độ nhạy cao trong chẩn đốn và định type vi-rút Phản ứng ELISA cũng thường được sử dụng hơn so với phản ứng kết hợp bổ thể vì nĩ cĩ độ đặc

hiệu và độ nhạy cao hơn, khơng bị ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường hoặc ức chế bổ thể

Nguyên lý: Phản ứng ELISA dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn

en-zym cho kết hợp trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên, rồi cho cơ chất vào Nếu kháng thể tương ứng với kháng nguyên thì kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn en-zym khơng bị rửa trơi, en-zym sẽ phân giải cơ chất tạo lên màu, khi màu trong quang phổ kế sẽ định lượng được mức độ phản ứng

Trong đĩ cĩ:

- Phản ứng ELISA trực tiếp dùng để phát hiện kháng nguyên

- Phản ứng ELISA gián tiếp dùng để phát hiện kháng thể

Hiện nay, trong xét nghiệm chẩn đốn thường sử dụng kít FMD 3ABC – ELISA để chẩn đốn phân biệt huyết thanh dương tính là do nhiễm vi-rút tự nhiên hay do vắc-xin Cơ sở khoa học của phương pháp này là vi-rút LMLM nhiễm vào cơ thể gia súc mĩng guốc chẵn, quá trình nhân lên của virus sẽ diễn

ra Trong quá trình này, vi-rút vừa tạo ra các thành phần để tái tạo các hạt vi-rút mới (các vi-ri-ơn), vừa tạo ra các thành phần khơng tham gia tạo thành các hạt vi-ri-ơn mà chỉ đĩng vai trị là các men giúp cho quá trình nhân lên của vi-rút Các thành phần kết hợp thành bản thân vi-rút cĩ tính kháng nguyên gọi là prơ-tê-

in cấu trúc (structure protein) Các thành phần khơng tham gia kết hợp thành ri-ơn mới và cĩ tính kháng nguyên gọi là prơ-tê-in khơng cấu trúc (non – structure protein) Trong các hạt prơ-tê-in khơng cấu trúc của vi-rút LMLM thì kháng nguyên 3ABC cĩ tính kháng nguyên rất cao, nĩ kích thích cơ thể gia súc tạo ra kháng thể đặc hiệu với số lượng lớn và tổn tại nhiều tháng trong huyết

vi-thanh trâu bị bị nhiễm Do đĩ việc phát hiện kháng thể đặc hiệu 3ABC cho phép kết luận gia súc đã bị nhiễm vi-rút LMLM

Tuy nhiên, trong các loại vắc-xin vơ hoạt LMLM của các hãng Intervet (Hà Lan) và Merial (Pháp) những kháng nguyên khơng cấu trúc đã được loại bỏ (gọi là vắc-xin tinh khiết) Sau khi tiêm cho gia súc chỉ kích thích cơ thể sản sinh

ra kháng thể chống lại kháng nguyên cấu trúc (hạt vi-rút) chứ khơng cĩ kháng thể chống lại kháng nguyên khơng cấu trúc 3ABC

Một số loại vắc-xin khác (vắc-xin đơn type O và hai type O- Asia1 của Trung Quốc) là vắc-xin khơng tinh khiết Do đĩ dùng phản ứng 3ABC – ELISA

sẽ khơng xác định chắn chắn gia súc nhiễm vi-rút LMLM thực địa hay do tiêm vắc-xin khơng tinh khiết Việc kết luận gia súc mắc bệnh hay do tiêm vắc-xin Trung Quốc phải kết hợp với xét nghiệm bằng phản ứng trung hịa vi-rút và điều tra lịch sử tiêm phịng vắc-xin

2.3.4 Chẩn đốn bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

Kỹ thuật PCR được Kary Mullis và cộng sự phát minh ra vào năm 1985.ðây là phương pháp tạo dịng invitro cho phép khuyếch đại một vùng AND (Deoxyribonucleic) đặc hiệu trên hệ gien Phản ứng PCR chỉ cĩ khả năngkhuyếch đại ADN do đĩ với những trường hợp mà thơng tin di truyền là ARNnhư vi rút LMLM thì cần cĩ một quá trình chuyển từ ARN thành ADN trướckhi thực hiện phản ứng PCR, đĩ là phản ứng sao chép ngược (ReverseTransciption - RT) Do đĩ cĩ thể sử dụng phản ứng PCR để làm tăng số lượngcác đoạn gien của vi rút LMLM cĩ trong bệnh phẩm cần chẩn đốn, sau đĩ sosánh trình tự a-xít nu-clê-ic của đoạn ADN đĩ với trình tự a-xít nu-clê-ic củaADN của vi rút LMLM đã đăng ký trong ngân hàng dữ liệu gien để kết luận

PHẦN 3 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 ðối tượng, máy mĩc, dụng cụ, hĩa chất nghiên cứu

3.1.1 ðối tượng, địa điểm nghiên cứu

- ðối tượng nghiên cứu là mẫu huyết thanh của trâu, bị và lợn tại các tỉnh Nam ðịnh, Lào Cai và Nghệ An Mẫu được lấy trước tiêm phịng và sau khi tiêm phịng vacxinLMLM type O chủng O/Mya98/BY/201021 ngày Số lượng mẫu được thu thập tại mỗi tỉnh là 45 mẫu huyết thanh

- Nghiên cứu thực địa: thu thập mẫu huyết thanh trâu, bị và lợn tại 03 tỉnh Nam ðịnh, Lào Cai và Nghệ An

- Nghiên cứu trong phịng thí nghiệm: gồm xử lý và xét nghiệm mẫu huyết thanh được thực hiện tại Trung tâm Chẩn đốn thú y trung ương - Cục Thú y

- Thời gian nghiên cứu từ tháng 3 năm 2012 đến tháng 8 năm 2012

3.1.2 Máy mĩc, dụng cụ, hĩa chất và nguyên liệu

3.1.2.1 Máy mĩc

Máy mĩc trong phịng thí nghiệm bao gồm: Tủ lạnh âm sâu, tủ lạnh thường, buồng cấy vơ trùng, nối hấp vơ trùng (autoclave), tủ ấm 370C, máy lắc đĩa, tủ ấm 370C cĩ 5% CO2, tủ sấy, bồn nước ấm (water bath), máy li tâm lạnh, máy lọc, máy cất nước, cân phân tích, máy đo pH, máy rửa đĩa ELISA, máy đọc ELISA, kính hiển vi đảo chiều

3.1.2.3 Hố chất

Nước cất hoặc nước khử ion; Water free RNA; H2SO4 1,25M; Trysin EDTA; Na2HPO4.2H2O; KH2PO4; KCl; NaCl; Formol; Methylene blue; Dimethylsulfoxide (DMSO)

3.1.2.4 Nguyên liệu

- Bộ kit ELISA phát hiện kháng thể LMLM type O (Pirbright- Anh Quốc)

- Nguyên liệu cho phân lậpvi rút và trung hịa huyết thanh trên tế bào + Giống tế bào BHK21: do Phịng Vi rút, Trung tâm Chẩn đốn thú y trung ương cung cấp

- Mơi trường MEM (Minimum Essential Medium), Foetal Bovine (Cafl) Serum, L - Glutamine, Penicilline - Streptomycine, Amphotericin, Trypsin, Hepes free acid, NaHCO3, PBS Ca2+, Mg2+ free, HCl 1N, NaOH 1N…

- Giống vi rútLMLM type O được phân lập trên lợn và trên trâu bị ở Việt Nam và được xác định bởi phịng xét nghiệm tham chiếu Pirbright, thuộc chủng

vi rút LMLM Myanma 98