Luận văn thạc sĩ nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh phục vụ cho tạo giống mía saccharum SSP chuyển gen

Từ những năm 70, với sự ra ñời và ứng dụng mạnh mẽ của sinh học phân tử ñã ñem lại nhiều thành công trong công cuộc cải tạo giống cây trồng như: nuôi cấy tế bào trần, biến dị dòng soma,

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
 -

BÙI NGỌC TRANG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH PHỤC VỤ

CHO TẠO GIỐNG MÍA (SACCHARUM SSP.) CHUYỂN GEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Lời cam ñoan

Tôi xin cam ñoan rằng số liệu kết quả nghiên cứu trong luận văn này là

trung th ực và chưa sử dụng ñể bảo vệ trong một học vị nào

Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ trong luận văn này ñã ñược cảm

ơn, mọi thông tin trích trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà N ội, tháng 09 năm 2008

Tác giả

Bùi Ngọc Trang

Lời cảm ơn

ðể hoàn thành luận văn, tôi nhận ñược rất nhiều sự quan tâm giúp ñỡ của

m ọi người

Tr ước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành ñến các Thầy giáo, Cô giáo

khoa Nông h ọc, khoa Sau ðại học,bộ môn Công nghệ Sinh học, trường ðại

H ọc Nông Nghiệp Hà Nội ñã giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm

lu ận văn

Tôi xin bày t ỏ lòng biết ơn, sự kính trọng sâu sắc nhất tới Thầy giáo -

PGS.TS Lê Huy Hàm, ng ười ñã tận tình chỉ bảo, trực tiếp hướng dẫn giúp ñỡ

tôi th ực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành c ảm ơn TS Phạm Thị Lý Thu cùng tập thể cán bộ công

nhân viên Vi ện Di truyền Nông nghiệp ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi

trong quá trình th ực hiện luận văn

Tôi xin chân thành c ảm ơn các bạn bè ñồng nghiệp ñã ñộng viên giúp ñỡ

tôi hoàn thành khoá h ọc!

Hà N ội, tháng 09 năm 2008

Tác giả

Bùi Ngọc Trang

2.2.2 Vai trß cña hÖ thèng t¸i sinh vµ mét sè hÖ thèng nu«i cÊy sö dông cho

2.3.2 C¸c ph−¬ng ph¸p chuyÓn gen 112.3.3 Vai trß cña gen chØ thÞ trong kü thuËt chuyÓn gen 142.4 C¸c nghiªn cøu x©y dùng hÖ thèng t¸i sinh vµ chuyÓn gen vµo c©y mÝa 15

4.1 §¸nh gi¸ kh¶ n¨ng t¸i sinh c©y th«ng qua m« sÑo cña 4 gièng mÝa nhËp néi 354.1.1 ThÝ nghiÖm 1: §¸nh gi¸ kh¶ n¨ng t¹o m« sÑo tõ l¸ non cña 4 gièng mÝa 354.1.2 ThÝ nghiÖm 2: §¸nh gi¸ kh¶ n¨ng t¸i sinh cña 4 gièng mÝa 38

4.3 Thö nghiÖm chuyÓn gen chØ thÞ GUS vµo m« sÑo cña c©y mÝa th«ng qua

4.3.1 ThÝ nghiÖm 13 Lùa chän chñng vi khuÈn thÝch hîp cho thÝ nghiÖm

4.3.2 Thí nghiệm 14 Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến mức độ

4.3.3 Thí nghiệm 15 Nghiên cứu ảnh hưởng của AS tới khả năng biểu hiện

4.3.4 Thí nghiệm 16 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm tới khả

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo mô sẹo từ lá non mía 27

Bảng 2 ảnh hưởng phối hợp của auxin và cytokinin tới khả năng tạo mô

Bảng 3 ảnh hưởng của cytokinin tới khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo 28

Bảng 4 ảnh hưởng của cytokinin ñến khả năng nhân nhanh chồi mía 29

Bảng 5 Khả năng tạo mô sẹo từ lá non của 4 giống mía nhập nội 36

Bảng 6 Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo của 4 giống giống mía nhập nội 38

Bảng 7 ảnh hưởng của auxin lên khả năng khởi tạo mô sẹo 41

Bảng 8 ảnh hưởng của cytokinin trong tổ hợp với 2,4-D tới khả năng

Bảng 9 ảnh hưởng của 2,4-D tới khả năng nhân mô sẹo trên

Bảng 10 ảnh hưởng của hàm lượng 2,4-D tới khả năng nhân mô sẹo trên

Bảng 11 ảnh hưởng của Ki và BAP tới khả năng tái sinh cây từ mô sẹo 50

Bảng 12 ảnh hưởng của α-NAA phối hợp Ki tới khả năng tái sinh cây từ mô

Bảng 13 ảnh hưởng của Ki ñến khả năng nhân nhanh chồi mía 56

Bảng 14 ảnh hưởng phối hợp của auxin và Ki lên khả năng

Bảng 15 ảnh hưởng của α-NAA lên khả năng phát sinh rễ của chồi mía 60

Bảng 16 ảnh hưởng giá thể ñến Tỉ lệ sống của cây mía ngoài vườn ươm 62

Bảng 17 Lựa chọn chủng vi khuẩn A tumerfaciens thích hợp cho chuyển

Bảng 18 ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn tới tỉ lệ biểu hiện tạm thời của

Bảng 19 ảnh hưởng của hàm lượng AS tới tỉ lệ biểu hiện tạm thời

68

Bảng 20 ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm tới tỉ lệ biểu hiện

69

DANH MỤC BIỂU ðỒ

Biểu ñồ 2 Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo của 4 giống mía 40Biểu ñồ 3 ảnh hưởng của auxin tới khả năng khởi tạo mô sẹo của cây mía 42Biểu ñồ 4 ảnh hưởng của cytokinin trong tổ hợp với 2,4-D 44

Biểu ñồ 5 Tương quan giữa nồng ñộ 2,4D và khả năng nhân mô sẹo trên

Biểu ñồ 6 Tương quan giữa nồng ñộ 2,4-D và hệ số nhân mô sẹo của cây mía

49Biểu ñồ 7 ảnh hưởng của cytokinin tới khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo 51Biểu ñồ 8 Tương quan giữa nồng ñộ α-NAA trong tác ñộng tổ hợp với Ki

Biểu ñồ 9 Tương quan giữa nồng ñộ Ki và khả năng nhân nhanh chồi mía 57Biểu ñồ 10 Tương quan giữa nồng ñộ auxin trong tác ñộng tổ hợp với Ki tới

Biểu ñồ 11 Tương quan giữa nồng α-NAAvà khả năng phát sinh rễ 61

DANH MỤC HÌNH

Hình 2 Sơ ñồ thể hiện quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào thực vật 8

Hình 4 Kết quả tạo mô sẹo từ lá non của 4 giống mía nhập nội 37

Hình 6 ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo mô sẹo của cây mía 43Hình 7 Mô sẹo khởi tạo trên môi trường: (a) (b) 2 mg/l 2,4-D; 45

Hình 15 Biểu hiện tạm thời của gen gus trên mô sẹo mía sau khi lây nhiễm

Hình 16 Biểu hiện tạm thời của gen gus ở các mật ñộ vi khuẩn khác nhau 67 Hình 17 ảnh hưởng của hàm lượng AS tới biểu hiện tạm thời của gen gus 69 Hình 18 ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm tới biểu hiện tạm thời của gen gus 70

1 MỞ ðẦU 1.1 ðẶT VẤN ðỀ

Cây mía (Saccharum ssp.) là một trong những cây công nghiệp có giá

trị kinh tế cao, quan trọng ở các nước nhiệt ñới và á nhiệt ñới, ñược trồng ở hơn 70 nước trên thế giới 70% lượng ñường trên thế giới ñược sản xuất từ cây mía [52] Tầm quan trọng của mía ngày càng tăng bởi cây mía là nguồn nguyên liệu thô cho ngành công nghiệp ñường và các ngành công nghiệp sản xuất rượu, acid acetic, butanol, giấy, gỗ dán, công nghệ enzyme và thức ăn chăn nuôi Những năm gần ñây, mía trở thành một trong những ñối tượng ñặc biệt ñược quan tâm trong chương trình sản xuất nhiên liệu sinh học

Ở Việt Nam, mía là nguồn nguyên liệu duy nhất cho ngành công nghiệp chế biến ñường Triển vọng phát triển ngành trồng mía ở nước ta là rất lớn vì chúng ta có những ñiều kiện thuận lợi ñể nâng cao năng suất và sản lượng mía, ñáp ứng nhu cầu ñường trong nước cũng như xuất khẩu [4] Hiện nay, ngành mía ñường nước ta ñã có những bước phát triển vượt bậc kể từ khi thực hiện chương trình 1 triệu tấn ñường do nghị quyết ðại hội ðảng lần thứ

8 ñề ra Tuy nhiên, bình quân trên cả nước năng suất mía trong suốt giai ñoạn

1996 - 2005 chỉ tăng 1,5%/năm Giai ñoạn 2005-2006 năng suất bình quân ñạt 55,3 tấn mía/ha, bằng 67% năng suất bình quân của toàn thế giới và thấp hơn nhiều các nước trong khu vực Một số dự báo cho biết, với quy mô sản xuất như hiện nay thì năm 2010 Việt Nam phải nhập khẩu khoảng 500000- 600000 tấn ñường [54] Tất cả các kết quả trên là hệ quả tất yếu của việc thiếu nguyên liệu mía Thực tiễn sản xuất cho thấy, các vùng trồng mía trong nước còn thiếu giống năng suất tốt, chất lượng cao, hầu hết các giống mía ñang sản xuất là giống nhập nội ðể khắc phục tình trạng ñó và ñạt chỉ tiêu ñịnh hướng tới 2020 mức sản xuất ñường sẽ là 2,1 triệu tấn, ðảng và nhà nước ta ñã và ñang triển khai nhiều biện pháp nhằm cải tạo giống mía

Trải qua hàng ngàn năm, bằng phương pháp chọn giống cổ truyền, người ta ñã ñưa ra hàng vạn giống cây trồng mới có ñặc ñiểm quí giá, phẩm chất tốt, song vẫn còn nhiều hạn chế như năng suất thấp, khả năng chống chịu sâu bệnh, ñiều kiện ngoại cảnh kém Từ những năm 70, với sự ra ñời và ứng dụng mạnh mẽ của sinh học phân tử ñã ñem lại nhiều thành công trong công cuộc cải tạo giống cây trồng như: nuôi cấy tế bào trần, biến dị dòng soma, chuyển gen Trong ñó, phương pháp chuyển gen là phương pháp hết sức mới

mẻ, hữu hiệu, là một kỹ thuật thông dụng trong tạo giống cây trồng [5], ñặc biệt với cây mía- cây có mức bội thể cao (2n=36-170), hay có những biến ñổi

về mặt di truyền mà các chương trình nhân giống thông thường khó có thể thực hiện ñược [55] Ở Việt Nam, việc phát triển mía chủ yếu ở các vùng có ñiều kiện tự nhiên khó khăn không tưới (khô hạn), cây thường bị bệnh (nấm, virus, ñen ngọn ) làm giảm giá trị Vì vậy, nghiên cứu chuyển gen mang ñặc tính có giá trị vào cây mía là một hướng ñi mới cần ñược quan tâm Mía là cây tái sinh tốt, ñây là tiền ñề quan trọng cho việc xây dựng hệ thống tái sinh cây hoàn chỉnh làm cở sở cho các nghiên cứu chọn tạo giống mía chuyển gen Tuy nhiên, ở nước ta chưa có tác giả nào nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh phục

vụ cho tạo giống mía bằng phương pháp chuyển gen

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện ñề tài:

“Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh phục vụ cho tạo giống mía

(Saccharum ssp.) chuyển gen"

1.2 MỤC đÍCH VÀ YÊU CẦU CỦA đỀ TÀI

1.2.1 Mục ựắch

Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh cây mắa (Saccharum ssp.) phục

vụ cho tạo giống mắa chuyển gen- làm cơ sở cho chọn tạo giống mắa năng suất cao, chất lượng tốt,chống chịu những ựiều kiện bất thuận

1.2.2 Yêu cầu của ựề tài

- đánh giá khả năng tạo mô sẹo từ lá non và tái sinh cây của 4 giống mắa nhập nội

- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ựiều tiết sinh trưởng tới khả năng

hình thành, duy trì và nhân mô sẹo tạo nguyên liệu cho chuyển gen ở cây mắa

- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ựiều tiết sinh trưởng tới khả năng tái

sinh, nhân nhanh, ra rễ của chồi mắa in vitro

- Xác ựịnh loại giá thể thắch hợp cho tỉ lệ sống cao của cây mắa in vitro

ở giai ựoạn vườn ươm

- Thử nghiệm chuyển gen chỉ thị gus vào mô sẹo của cây mắa thông qua

vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA đỀ TÀI

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 MỘT SỐ NÉT VỀ CÂY MÍA (SACCHARUM SSP.)

2.1.1 Phân loại và ñặc ñiểm thực vật học

Theo phân loại thực vật, cây mía thuộc:

Bộ: Hoà thảo (Poales)

Họ: Hòa thảo (Poaceae)

Chi: Saccharum L

Hình 1 Cây mía (Saccharum ssp.)

Trong chi Saccharum có 13 loài trong ñó có 5 loài ñặc biệt quan trọng

trong sản xuất và lai tạo giống:

- Loài Nhiệt ñới (Saccharum officinarum L.)

- Loài Trung Quốc (Saccharum sinensis Roxb Emend Jesw)

- Loài Ấn ðộ (Saccharum barberi Jesw)

- Loài hoang dại thân nhỏ (Saccharum spontaneum L.)

- Loài hoang dại thân to (Saccharum robustum Bround and Jesw)

Cây mía thuộc nhóm thực vật quang hợp C4 Do vậy, nó ñược coi là một trong những cỗ máy chuyển hóa năng lượng mặt trời hiệu quả và có tiềm năng sản sinh ra một lượng lớn sinh khối [19]

Cây mía thuộc họ hoà thảo, hoa lưỡng tính, mỗi hoa có 3 nhị ñực, 1 bầu noãn và 2 ñầu nhị cái Hạt mía rất bé, kích thước khoảng 1-1,25 mm và nặng khoảng 0,15-0,25 g

Lá mía mọc thành 2 hàng so le, ñối nhau hoặc theo ñường vòng trên thân cây mía

Thân mía là ñối tượng thu hoạch, nguyên liệu ñể chế biến và là bộ phận làm giống cho các vụ sau, gồm nhiều lóng và ñốt hợp thành

Rễ mía thuộc loại rễ chùm So với những cây hoà thảo ngắn ngày khác, cây mía có bộ rễ phát triển ñặc biệt mạnh (1 khóm có 500-2000 rễ; Tổng chiều dài rễ tới 100-500 m) [9]

2.1.2 Phân bố và yêu cầu sinh thái

Về ñộ cao, cây mía phân bố từ vùng ñất thấp duyên hải ñến vùng ñồi, cao nguyên và giới hạn ñộ cao 1000-2000 m ở vùng xích ñạo, giới hạn 700 m

ñộ cao ở vùng chí tuyến

2.1.2.2 Yêu cầu sinh thái

- Nhiệt ñộ: Mía sinh trưởng ñạt ñến mức ñộ tối ña khi nhiệt ñộ khoảng 30o-34o C Nhìn chung, nhiệt ñộ thích hợp cho cả quá trình sinh trưởng là từ 24o – 30o C

- Ánh sáng: Mía là cây rất nhạy cảm với ánh sáng, cần cường ñộ ánh sáng mạnh và rất sợ bóng râm Trong suốt cuộc ñời mình, cây mía cần khoảng

2000 ñến 3000h chiếu sáng, tối thiểu phải có từ 1200h chiếu sáng trở lên

- Nước: Mía là cây cần nhiều nước nhưng lại sợ úng thuỷ ðể ñạt năng suất cao, mía cần một lượng mưa hữu hiệu tối thiểu là 1500mm cho cả chu kỳ sinh trưởng Lượng mưa hữu hiệu ñó tương ñương với lượng mưa thực

tế là 2000-2500mm

- ðất: ðất thích hợp với cây mía là loại ñất có khả năng giữ nước, hút nước tốt, ñất xốp, thoáng, có khoảng 40% chất rắn, 30% nước và 30% không khí ðất ñạt các yêu cầu trên là ñất cát pha, ñất thịt nhẹ, ñất thịt trung bình và trong ñất còn chất hữu cơ, nhiều mùn Thành phần cơ giới có 10-15% sét, 25-35% limông, 40-50% cát ðộ pH=5,5-7,5

2.1.3 Giá trị cây mía

Hiện nay, mía là nguyên liệu chủ yếu ñể chế biến ra ñường (chiếm 70%) trên thế giới Một cân ñường cung cấp năng lượng tương ñương 0,5kg mỡ; 50-60kg rau quả ðường cung cấp 10% nhu cầu năng lượng của cộng ñồng [9] Bên cạnh ñó, mía còn là cây xoá ñói giảm nghèo cho nông dân trung du, miền núi, là cây có hiệu quả kinh tế cao nhờ vào ñặc tính thực vật học, cho nên mía có khả năng chịu hạn khá, có thể trồng trên các vùng ñồi núi Nếu ñược chăm bón tốt, nó có thể cho 200-250 tấn sinh khối/ha/năm Theo thống kê năm 2006 ở Việt Nam, giá bán 1 tấn mía cây trung bình là 700.000ñ, cao hơn nhiều lần các cây trồng khác Do ñó, mía ñã trở thành cây làm giàu cho nhiều gia ñình, nhiều khu vực rộng lớn, nhất là vùng trung du

và nhiều ñồi thấp

Theo dự báo của một số nhà khoa học về kinh tế, cuối thế kỷ XXI và các thể kỷ sau, năng lượng hoá thạch sẽ ngày càng cạn kiệt Và ñể khắc phục tình trạng này, người ta ñã nghĩ ñến việc sử dụng năng lượng mới từ thực vật Trong các cây có thể khai thác, chế biến ra nhiên liệu lỏng, cây mía ñược nhiều người quan tâm nhất và ñược xếp là cây năng lượng hàng ñầu trong số các loài thực vật Từ 1 tấn mía tốt, người ta có thể sản xuất ra 35-50 lit cồn

96o – loại cồn thay xăng ñể chạy máy ñốt trong 1 ha mía có thể sản xuất

7000-8000 lit cồn làm nhiên liệu [9] Gần ñây, ở Mỹ ñã cố gắng sản xuất cồn nhiên liệu ñạt 5,67 tỷ lit/năm [6]

Ngày nay, khi khoa học kỹ thuật phát triển thì giá trị cây mía ngày càng ñược nâng cao Ngoài các giá trị ñã ñược biết ñến ở trên, xenllulozo trong bã mía ñược ngành giấy và công nghiệp gỗ ép, công nghiệp dệt khai thác Công nghiệp hoá chất thông qua các phản ứng khử, oxy hoá, ester hoá ñể sản xuất sobitol, glixerin, nannitol, axit gluconic Từ bùn lọc có thể sản xuất sáp, chất béo và phân bón

2.2 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH 2.2.1 Cơ sở khoa học

Việc xây dựng 1 hệ thống tái sinh ở thực vật nói chung và cây mía nói riêng có thể thực hiện ñược nhờ vào tính toàn năng của tế bào thực vật

Tính toàn năng của tế bào thực vật là khả năng của các tế bào ñã ñược biệt hoá (trừ một số loại tế bào ñã biệt hoá sâu như ống mạch, mao dẫn ) có khả năng thể hiện toàn bộ hệ thống di truyền và có thể trong ñiều kiện phù hợp sẽ phát triển phôi dẫn ñến việc hình thành cây hoàn chỉnh mới

Trong một cơ thể thực vật bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong ñó có nhiều loại tế bào khác nhau thực hiện các chức năng khác nhau Các mô có cấu trúc chuyên môn nhất ñịnh là nhờ sự phân hoá Phân hoá

tế bào là sự chuyển hoá các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên hoá, ñảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể Trong ñiều kiện thích hợp, các tế bào ñã phân hoá có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và lại phân chia mạnh mẽ Qúa trình này gọi là quá trình phản phân hoá

Sự phân hoá tế bào

Sự phản phân hoá tế bào

Hình 2 Sơ ñồ thể hiện quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào

thực vật [11]

Sự phân hoá cơ quan cũng như tái sinh cơ thể nguyên vẹn là kết quả của quá trình tái phân hoá các tế bào và mô nuôi cấy Về mặt bản chất, các quá trình trên là sự hoạt hoá của các gen trong tế bào Trong ñiều kiện tự nhiên, ở những giai ñoạn phát triển cá thể nhất ñịnh một số gen sẽ ñược hoạt hoá, một số gen khác sẽ bị ức chế theo ñúng chương trình ñã ñược mã hoá trong phân tử ADN

Trong nuôi cấy thực vật in vitro, con người có thể ñiều khiển ñược sự

phân hoá và phản phân hoá ñể tái sinh một cây hoàn chỉnh từ mô, tế bào nhờ việc tạo ra những môi trường thích hợp cho mỗi loại ñối tượng thực vật

2.2.2 Vai trò của hệ thống tái sinh và một số hệ thống nuôi cấy sử dụng cho biến nạp gen

Trong quá trình chuyển gen thực vật, việc xây dựng ñược dạng tế bào

ñích có khả năng tiếp nhận gen mới và tái sinh thành cây hoàn chỉnh là hết sức quan trọng Vì vậy, hệ thống tái sinh là ñiều kiện tiên quyết ñể thực hiện thành công biến nạp gen

Xây dựng một hệ thống nuôi cấy và tái sinh cây hoàn chỉnh là tiền ñề quan trọng cho các nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng nói chung và cây mía nói riêng

Một số hệ thống nuôi cấy thường ñược sử dụng:

2.2.2.1 Nuôi cấy phân hoá

ðây là phương pháp dựa trên cơ sở nuôi cấy mô, từ các cơ quan xác ñịnh có sự phân hoá hình thành nên các cơ quan mới Bao gồm 1 số phương pháp như: Nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng và chồi bên; Nuôi cấy tạo chồi bất ñịnh

;Nuôi cấy tạo phôi vô tính

• Nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng và chồi bên:

Nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng là một phương pháp cấy mô ñược ứng dụng rộng rãi nhất trong nông nghiệp và nghề làm vườn với các ưu ñiểm:

- Nhân nhanh hàng loạt, ñồng nhất với số lượng lớn cây giống từ một cây mẹ ban ñầu

- Loại trừ bệnh virus

- Bảo quản quỹ gen in vitro

- Sử dụng trong chuyển gen

Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng là các mô phân sinh của ñỉnh sinh trưởng nằm ở chóp ñỉnh chồi Kích thước mẫu nuôi cấy phụ thuộc vào loài thực vật và mục ñích nghiên cứu

• Nuôi cấy tạo chồi bất ñịnh

Sự tái sinh chồi bất ñịnh chính là sự phát sinh, phân hoá các cơ quan

nhằm tạo mới các chồi bất ñịnh trên mẫu từ nhiều nguồn khác nhau thông qua

giai ñoạn callus ðây là dạng nhân giống in vitro có thể sử dụng ñể tái sinh

dòng hoặc nhân nhanh với lượng lớn

• Nuôi cấy tạo phôi vô tính

Phôi vô tính là các thể nhân giống có cực tính, bắt nguồn từ các tế bào dinh dưỡng (tế bào soma) Khả năng tạo phôi vô tính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, ngoài các ñiều kiện vật lý, hoá học thuận lợi cho sự tạo phôi, còn phụ thuộc rất lớn vào loài, giống, chủng trong cùng một loài Việc tạo ra phôi vô tính ở thực vật ñem lại tiềm năng ứng dụng với mục ñích nhân dòng

số lượng lớn, nuôi cấy tế bào trần, tạo các biến dị soma có lợi

Từ các mô, cơ quan nuôi cấy sẽ tạo nên các khối tế bào vô tổ chức, không có hình dạng nhất ñịnh gọi là mô sẹo (callus) và ở những môi trường thích hợp, mô sẹo ñược nuôi cấy ñể nhân khối

• Nuôi cấy mô sẹo (callus)

Mô sẹo là khối các tế bào mô mềm có mức ñộ cấu trúc di truyền thấp, chưa phân hoá, phân chia một cách hỗn loạn và có tính biến ñộng di truyền

cao Mô sẹo thu ñược bằng nuôi cấy in vitro các cơ quan của thực vật như

thân, rễ, lá, hoa trong môi trường chứa chất ñiều tiết sinh trưởng nhóm auxin với ñiều kiện nuôi cấy thích hợp Mô sẹo có thể ñược duy trì liên tục trên môi trường nuôi cấy bằng cách cấy chuyển ñịnh kì

• Nuôi cấy tế bào huyền phù

Nuôi cấy tế bào huyền phù là kỹ thuật nuôi cấy tế bào ñơn hoặc cụm nhỏ tế bào trong môi trường lỏng Các tế bào này cũng ñược tạo từ mô sẹo

có nguồn gốc từ thân, rễ, lá, hoa, phôi Tuy nhiên, nhược ñiểm của phương pháp này là thời gian nuôi cấy dài và ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng tái sinh cây

• Nuôi cấy tế bào trần

Tế bào thực vật bị phá bỏ toàn bộ lớp vỏ bao bọc chỉ còn lại khối nguyên sinh chất ñược bao bọc bởi màng nguyên sinh khi ñược nuôi cấy trên môi trường thích hợp thì tái tạo thành tế bào, phát triển thành khối mô sẹo và tái sinh thành cây hoàn chỉnh Ứng dụng có ý nghĩa nhất của phương pháp này là tạo cây soma, tạo cây lai tế bào chất thông qua dung hợp tế bào trần và biến nạp gen

Tuy nhiên, nh ằm mục ñích xây dựng một hệ thống nuôi cấy tái sinh cây

ph ục vụ chuyển gen, cần nghiên cứu ñến khả năng sống sót của tế bào sau khi

chuy ển gen trên môi trường chọn lọc Do vậy, hệ thống nuôi cấy qua mô sẹo

thích h ợp hơn cả với ưu ñiểm : Tỉ lệ tái sinh cây cao; Thời gian nuôi cấy

không quá dài

Tái sinh cây qua con ñường mô sẹo có thể hình thành phôi hay tái sinh tạo chồi trực tiếp Tuy nhiên, cây tái sinh từ phôi soma xuất phát từ một tế bào ñơn, riêng lẻ và phát triển thành một cây hoàn chỉnh nên duy trì ñược tính ñồng nhất của hệ gen và do vậy hạn chế hiện tượng khảm ở cây chuyển gen [1]

2.3 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀO THỰC VẬT

2.3.1 Khái niệm về chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật ñưa một hay nhiều gen lạ ñã ñược thiết

kế ở dạng ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung (vi sinh vật, ñộng vật ) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ Trong tế bào chủ, các gen này hoạt ñộng tổng hợp nên các protein ñặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các ñặc tính mới của cơ thể chuyển gen

2.3.2 Các phương pháp chuyển gen

Chuyển gen hữu ích vào cây trồng là một trong những bước tiến nhảy vọt của công nghệ sinh học hiện nay Hiệu quả chuyển gen phụ thuộc rất lớn vào bản chất cây trồng, ñặc tính di truyền cũng như phương pháp biến nạp Mục ñích chính của kỹ thuật chuyển gen là phải ñạt hiệu quả cao, áp dụng ñược với nhiều ñối tượng cây trồng, từ ñó các nhà nghiên cứu công nghệ gen

ñã xây dựng nhiều giải pháp kỹ thuật chuyển gen khác nhau

Chuyển gen vào thực vật có thể chia làm 2 nhóm phương pháp chính:

phương pháp chuyển gen gián tiếp và phương pháp chuyển gen trực tiếp

2.3.2.1 Phương pháp chuyển gen gián tiếp

• Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium:

ADN ñược chuyển vào tế bào thực vật nhờ cơ chế truyền ñặc trưng của

loài vi khuẩn Agrobacterium làm môi giới Phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium thường ñược áp dụng thành công ở các loại cây 2 lá mầm

Nhờ áp dụng các kỹ thuật di truyền mà Ti-plasmid của vi khuẩn

Agrobacterium ñã trở thành một vectơ chuyển gen hữu hiệu Người ta ñã có thể cắt bỏ những ñoạn gen cần thiết, lắp ráp, bổ sung các cấu trúc và các gen quan tâm vào các vị trí nằm giữa hai ñoạn biên của T-DNA

Phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium là phương pháp chuyển

gen ñược sử dụng rộng rãi nhất, có nhiều ưu ñiểm hơn hẳn các phương pháp chyển gen khác như:

- Số bản sao ñược chuyển vào tế bào thực vật rất thấp dẫn tới giảm sự không biểu hiện của các gen ñã chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững, hiệu quả chuyển gen cao [37]

- Tránh ñược sự hình thành các cây chuyển gen khảm (hiện tượng thường gặp ở các phương pháp chuyển gen trực tiếp) [30]

Phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn này ñã ñược áp dụng thành công trên nhiều ñối tượng cây trồng, ñặc biệt trên cây hai lá mầm Người ta

cũng ñã tìm ra các chủng Agrobacterium mẫn cảm với cây 1 lá mầm, trong ñó

có ngô, lúa và ñã nhận ñược các cây chuyển gen hữu thụ bằng phương pháp này [35][36][42]

• Chuyển gen nhờ virus

Ngoài vi khuẩn, người ta còn dùng virus làm vectơ chuyển gen cho cây trồng do virus dễ xâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật Bên cạnh ñó, trong cấu tạo của virus cũng có mặt axit nucleic làm cơ sở cho việc gắn các gen cần chuyển vào

Tuy nhiên, việc chuyển gen nhờ virus ít ñược sử dụng do vius không truyền qua hạt nên việc nhân giống các cây chuyển gen nhờ virus phải tiến

hành bằng phương pháp vô tính- phương pháp không thể thực hiện ñược cho tất cả các loại cây ðây chính là nhược ñiểm lớn nhất của phương pháp chuyển gen này

2.3.2.2 Phương pháp chuyển gen trực tiếp

• Phương pháp xung ñiện

Phương pháp này dựa vào hiện tượng phóng ñiện ñể tạo lỗ trên màng tế bào, ñưa ADN vào tế bào dễ hơn, nhất là khi ADN ñã tiếp giáp với màng tế bào trong nuôi cấy tế bào trần hoặc mô sẹo Tuy nhiên phương pháp này chưa

có những kết quả chứng minh chắc chắn cho sự biến nạp Hơn nữa, việc nuôi cấy tế bào trần ở một số loài cây trồng vẫn còn gặp nhiều khó khăn Phương pháp này chủ yếu dùng trong nghiên cứu biểu hiện tạm thời của các gen

• Phương pháp vi tiêm

Phương pháp sử dụng loại kim siêu nhỏ và kính hiển vi ñể tiêm ADN vào những tế bào nhất ñịnh Kỹ thuật này tạo ñược dòng biến nạp từ tế bào trần và cây biến nạp khảm từ nuôi cấy hạt phấn của cây cải dầu Tuy nhiên, mỗi lần tiêm chỉ ñược một tế bào và thao tác ñòi hỏi rất khéo léo, chính xác

• Phương pháp vĩ tiêm

Phương pháp này sử dụng kim tiêm có ñường kính lớn hơn ñường kính

tế bào ñể ñưa ADN ngoại lai vào tế bào, các tế bào bị phá vỡ và ADN xâm nhập vào tế bào bị thương và sau ñó ñược chuyển vào tế bào bên cạnh

• Phương pháp chuyển gen thông qua ống phấn

ðây là phương pháp chuyển gen dựa trên nguyên tắc là ADN có thể xâm nhập vào hạt phấn ở giai ñoạn nảy mầm, nhờ ñó ADN có ñiều kiện di chuyển vào nhân của tế bào hạt phấn hoặc hợp tử qua ống phấn Kỹ thuật chuyển gen này ñơn giản nhưng hiệu quả chuyển gen thấp

• Phương pháp sử dụng súng bắn gen

Chuyển gen bằng súng bắn gen là một trong những kỹ thuật ñua các gen ngoại lai và tế bào Kỹ thuật biến nạp này dựa trên nguyên tắc sử dụng các viên ñạn kim loại (thương dùng hạt vàng hoặc volfram) có kích thước hiển vi, tỷ trọng cao ñể ñạt gia tốc lớn xuyên qua vỏ và màng tế bào, ñưa lớp ADN bọc ngoài tiếp cận với bộ mày di truyền của tế bào

Phương pháp này thường áp dụng với những giống cây trồng mà việc

chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium khó thực hiện ñược hoặc khả

năng tái sinh kém do nó có những ưu ñiểm nổi bật như: Dễ sử dụng; Các vectơ ñược thiết kế ñơn giản; Cần lượng nhỏ plasmid ADN; Biểu hiện gen tạm thời có thể quan sát sau vài ngày; Chuyển ADN ngoại lai vào tế bào nhanh Tuy nhiên, phương pháp chuyển gen này ñòi hỏi thiết bị ñắt tiền, hiệu quả chuyển gen chưa cao, biểu hiện gen không bền vững

2.3.3 Vai trò của gen chỉ thị trong kỹ thuật chuyển gen

Gen chỉ thị là gen có trách nhiệm thông báo kết quả của quá trình chuyển AND ngoại lai vào hệ gen của thực vật

Thực tế cho thấy, chỉ một Tỉ lệ ít tế bào thực vật ñược biến nạp thành công nhờ các phương pháp chuyển gen Do ñó, rất cần có phương pháp nhận biết những tế bào ñã ñược biến nạp gen ñể tạo cây con mang gen mong muốn

từ các tế bào chưa biến ñổi di truyền [8] Sử dụng gen chỉ thị ñể nhận biết những tế bào ñã ñược biến nạp là một trong những phương pháp phổ biến hiện nay Các gen như: Chloramphenicol-acetyl transferaza (CAT),β-glucuronidaza (GUS) ñược dùng làm gen chỉ thị những tế bào ñã biến ñổi chứa gen ngoại lai ổn ñịnh Ngoài ra còn có gen LUX của ñom ñóm, gen vibrio harveyi mã hoá enzym uciferase phát tia sáng, dễ phát hiện nên ñược

sử dụng làm gen chỉ thị

Ở nước ta, ñã có những thành công nhất ñịnh trong nghiên cứu chuyển gen vào thực vật Ví dụ như việc chuyển gen kháng hgromycin, gen GUS và gen

kháng bệnh bạc lá Xa-21 vào lúa bằng phương pháp bắn gen [13]; Tác giả Lã Tuấn Nghĩa và cộng sự ñã chuyển gen GUS và gen kháng kanamycin vào cà chua [51]…

2.4 CÁC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN VÀO CÂY MÍA

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

• Các nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh

Ngày nay, nghiên cứu về cây mía ñã ñược nhiều quốc gia quan tâm, nhất là ở các nước nhiệt ñới và á nhiệt ñới- nơi khởi nguồn của cây mía

Những nghiên cứu thành công bước ñầu về cây mía in vitro ñã, ñang tạo ñà

phát triển cho các nghiên cứu về cây trồng tiếp theo

Sự thành công của các nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh phụ thuộc chủ yếu vào ñiều kiện phát triển của nguồn nguyên liệu [25], thành phần cấu tạo của môi trường, ñiều kiện nuôi cấy [46] và các kiểu gen của cây thí nghiệm

Cây mía lần ñầu tiên ñược nghiên cứu nuôi cấy in vitro từ năm 1961 tại

Hawai [44] ñể làm vật liệu khởi ñầu cho các nghiên cứu về nhân giống, gây ñột biến [37], chọn tạo giống, làm sạch virus [48] và bảo quản nguồn tài nguyên cây trồng [50]

Những nghiên cứu về nguồn vật liệu ban ñầu cho tái sinh cây mía từ

nuôi cấy in vitro của các tác giả: Ho & Vasil (1983) [40], Chen và cộng sự

(1988) [26] cho rằng có thể nhân nhanh cây mía bằng tái sinh trực tiếp từ chồi nách Taylor (1994) (1997) ñã áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào ñể trồng ñược hơn 200 giống mía từ nuôi cấy chồi ñỉnh [50] [48]

Từ năm 1986, việc tách và nuôi cấy tế bào trần của cây mía cũng ñược các nhà khoa học chú ý nghiên cứu Sreenivason & Vasil ñã tái sinh ñược cây mía từ nuôi cấy tế bào trần của giống mía B4362 Chen & cộng sự (1988)

cũng ựã tái sinh cây con hoàn chỉnh từ huyền phù tế bào của giống mắa đài Loan F164 [26]

Tiếp ựó, một loạt phương pháp tạo phôi soma và phát sinh cơ quan ựược xây dựng thông qua giai ựoạn mô sẹo từ các mảnh lá non [16] [31] Trong hầu hết các nghiên cứu này, mô sẹo ựược tạo ta trong môi trường có 2,4D hoặc picloram để tăng khả năng tái tạo, mô sẹo ựược chuyển vào môi trường giảm nồng ựộ auxin hoặc không có auxin Gần ựây, ựể tái sinh chồi từ

mô sẹo nhanh, người ta sử dụng môi trường MS cải tiến có TDZ [33] Tất cả các kết quả ựạt ựược từ việc sử dụng TDZ ựể tạo chồi nhanh hơn sử dụng Ki/NAA

Các nghiên cứu của Larkin & Scocroft (1981), Dix (1993), Ashraf (1994) ựã lựa chọn ựược các dòng tế bào soma thắch hợp khác nhau từ nuôi cấy callus có bổ sung thêm công cụ sản xuất cây kháng stress [43] [28] [21]

Nghiên cứu của Anblagan và cộng sự (2000) ựã chia callus mắa thành 2 dạng (i) dạng nhớt lỏng, không phôi hóa (ii) dạng cục xốp màu vàng trắng, phôi hóa và xác ựịnh ựược nồng ựộ tối ưu của các chất ựiều hòa sinh trưởng

bổ sung vào môi trường MS nhằm mục ựắch tái sinh cây Nồng ựộ NAA cao hoặc NAA kết hợp với IAA, IBA sẽ kắch thắch quá trình tạo rễ [21]

Nghiên cứu của Alam và cộng sự cho thấy callus khởi tạo trên môi trường MS bổ sung 2,4-D cho tỉ lệ tái sinh chồi cao hơn callus khởi tạo trên môi trường bổ sung NAA Và hầu hết các nghiên cứu ựều cho thấy chồi mắa ựược tái sinh với tỉ lệ cao trên các môi trường MS bổ sung cytokinin ở nồng

ựộ cao (BAP, kinetin 1-3 mg/l) và auxin ở nồng ựộ thấp hơn (NAA, IAA 0,5 mg/l) [13]

Năm 2002, 2004, Gill và cộng sự ựã nghiên cứu trên hai giống Co.J.83, Co.J.86 và thấy rằng việc bổ sung 30 mg/l maltose, 560 mg/l prolin, 2 mg/l ABA hoặc 3 mg/l 2,4-D có tác dụng kắch thắch quá trình tạo callus phôi hóa

Chồi tái sinh thu ñược trên môi trường chứa 0,5 mg/l BAP và môi trường tạo rễ

là môi trường có chứa 5 mg/l NAA (kích thích tạo rễ tốt hơn môi trường bổ sung 2 mg/l IBA và 3 mg/l NAA) Các môi trường ñều ñược bổ sung 7% sucrose [34]

Hiện nay, một số báo cáo ñã ñưa ra phương pháp mới tái sinh cây mía

mà không thông qua giai ñoạn tạo mô sẹo Kết quả của nghiên cứu mơí này

ñã tạo ra một khối lượng cây lớn từ những cụm hoa chưa trưởng thành [27] và các chồi [50]

• Các nghiên cứu chuyển gen

Mía là cây có bộ nhiễm sắc thể ña bội (2n= 36-170), tính di truyền không ổn ñịnh, cho nên, việc nhân giống truyền thống ñòi hỏi phải mất nhiều thời gian mới tạo ra ñược môt giống mới Công nghệ sinh học sử dụng kỹ thuật di truyền ñể cải tạo giống cây trồng bằng cách ñưa trực tiếp những gen

có giá trị vào hệ gen của thực vật, cho phép tạo ra hàng loạt cây trồng mang gen hữu ích là một hướng ñi hữu hiệu Vì vậy, sau khi ñã có hệ thống tái sinh hoàn chỉnh, cần xây dựng một phương pháp chuyển gen hiệu quả cao ñể cài các gen mong muốn vào bộ nhiễm sắc thể mía [21]

Từ năm 1987, Chen và cộng sự ñã tiến hành các thí nghiệm chuyển gen vào tế bào trần của mía sử dụng kĩ thuật PEG (polyethylene glycol) Các tế bào trần sau khi chuyển gen (tần số 8/107) ñã mang plasmid pABD1 và hình thành các cụm tế bào kháng kanamycin Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, họ

ñã không thu ñược callus và cây chuyển gen tái sinh [26]

Nghiên cứu ñầu tiên về cây mía chuyển gen thành công ñược Bower & Bich báo cáo vào năm 1992 sử dụng súng bắn gen [23] Năm 1997, Arencibia và cộng sự cũng ñã xây dựng quy trình chuyển gen vào ñỉnh sinh trưởng của cây bằng phương pháp xung ñiện [21]

Năm 2002, Gallo-Meagher và CS ñã tiến hành chuyển gen vào mô sẹo mía thông qua kĩ thuật bắn gen Gen ñược ñưa vào là gen cấu trúc vỏ virus

dòng E và gen manA (gen mã hóa enzym phosphomannose isomerase) Trong

quá trình chọn lọc, callus chuyển gen ñược tái sinh trên môi trường MS bổ sung 2,5 µM TDZ và 3 g/l mannose Khoảng 100 chồi chuyển gen ñược tái sinh và cây con ñược chuyển ra vườm ươm sau khi ñược tạo rễ trên môi trường chứa 5 mg/l IBA [32]

Tiếp theo, những báo cáo tương tự về vấn ñề này cũng ñược ñưa ra như: chuyển gen chỉ thị [21][24][29], gen kháng virus khảm [41], kháng côn trùng [20]… vào mía

Thực tế cho thấy hầu hết các cây ngũ cốc và thân cỏ không phải là vật

chủ của Agrobacterium tumefaciens, do vậy việc chuyển gen vào cây một lá mầm thông qua Agrobacterium tumefaciens gặp nhiều khó khăn hơn so với

cây hai lá mầm Tuy nhiên, gần ñây, nhiều nghiên cứu ñã xây dựng quy trình chuyển gen vào ngũ cốc nói chung và mía ñường nói riêng thông qua

Agrobacterium tumefaciens

Báo cáo ñầu tiên về chuyển gen mang ñặc tính quan tâm vào mía

thông qua A tumefaciens ñược công bố bởi Arencibia và cộng sự (1998)

Trong những thí nghiệm này, chủng LBA4404 (pTOK233) và EHA101 (pMTCA31G) mang vectơ nhị phân chứa gen kháng côn trùng ñã ñược chuyển thành công vào mía thông qua callus Trong 395 cây tái sinh có 341 cây sống sót và ñược ñem trồng trong nhà kính Phân tích Southern ñã khẳng ñịnh T-DNA ñã ñược chuyển vào hệ gen mía với số bản sao là từ 1 – 3 bản [23]

Năm 2003, Manickavasagam và cộng sự ñã tiến hành chuyển gen vào

chồi mắt của giống mía Co92061 và Co671 thông qua Agrobacterium chủng

LBA4404 và EHA105 mang vectơ nhị phân pGA492 Gen ñược chuyển gồm

có nptII, bar và gus-intron (β-glucuronidase) Hiệu quả chuyển gen ñược khẳng ñịnh bởi biểu hiện gen gus và phân tích PCR ñối với gen bar Phân tích

Southern cho thấy gen bar ñược chuyển vào hai vị trí của genom trong hầu

hết mẫu chuyển gen Chủng EHA105 cho hiệu quả chuyển gen cao hơn, lượng chồi tạo ra nhiều gấp ñôi so với chủng LBA4404 Kết quả cho thấy với quy trình này, chồi chuyển gen ñược tái sinh và nhân lên sau 5 tháng với hiệu quả chuyển gen khoảng 50% [45]

Theo công bố mới nhất, các nhà khoa học ðức và Indonesia ñã tạo ra một loại mía chyển gen cho thu hoạch cao hơn, trong khi ñó lại cần ít phân bón hơn Bên cạnh ñó, các nghiên cứu thuộc trường ðH Nông nghiệp Bogor

và Trung tâm sinh học phân tử ở Karlsruhe, ðức ñã tạo ra một loại mía

chuyển gen có chứa gen phytase làm tăng khả năng hấp thu các khoáng chất

quan trọng trong ñất (canxi, magie ), tăng sản lượng mía mà không cần phải bón phân Hiện nay, 70 dòng mía chuyển gen ñang ñược trồng thử và dòng ñược chọn sẽ cho người nông dân tự do sử dụng [53]

Nh ư vậy, các nghiên cứu về chuyển gen vào cây mía ñã và ñang mở

h ướng ñi mới cho công tác chọn tạo giống mía năng suất, chất lượng cao phù

h ợp với các vùng sinh thái

2.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Cây mía là một trong những cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao Ở nước ta, mía là nguồn nguyên liệu duy nhất cho ngành công nghiệp chế biến ñường [4] Do ñó, những nghiên cứu về cây mía, ñặc biệt là nghiên cứu cây

mía in vitro với mục ñích nâng cao năng suất, sản lượng mía nhằm ñáp ứng

lượng ñường tiêu dùng trong nước và xuất khẩu ngày càng ñược quan tâm

Quy trình nhân giống mía in vitro ñầu tiên của nước ta ñược xây dựng

tại viện Di truyền Nông nghiệp Quy trình này ñã ñược công nhận là tiến bộ kĩ thuật và ñược khuyến nghị sử dụng rộng rãi trong sản xuất [3]

Từ năm 1980, Phân viện Công nghệ sinh học thuộc Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia ñã tiến hành triển khai nhân giống mía

bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật Vật liệu nuôi cấy ban ñầu là chồi ñỉnh [7] Kết quả ñã ñưa ñược giống F156 ra phục vụ cho sản xuất Tiếp ñó, tác giả ñã xây dựng ñược quy trình nhân giống cho một số giống mía từ khi ñưa chồi ñỉnh vào nuôi cấy ñến khi tạo ra giống cấp I, II phục vụ cho sản xuất

Viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam ñã nghiên cứu sử dụng

kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào ñể nhân nhanh một số giống mới, có triển vọng trong sản xuất: CP 5243, VN 72234, ROC1, ROC10 Vật liệu tạo cụm chồi mía là lá non thông qua giai ñoạn callus tái sinh thành cây [12]

Tiếp sau ñó, Trung tâm ứng dụng tiến bộ khoa hoc kỹ thuật Bình ðịnh, Viện Nghiên cứu Ngô, Viện Di truyền nông nghiệp cũng tiến hành nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào ñể nhân một số giống mía: ROC 1, ROC 10 phục vụ cho nhu cầu sản xuất [14] Viện Di truyền nông nghiệp sử dụng mô phân sinh ñỉnh tách từ ngọn mía ñể tạo chồi trực tiếp, không qua giai ñoạn tạo mô sẹo thay cho nguồn vật liệu lá non, tránh sự hình thành các biến

dị soma và hiện tượng hoá ñen của mẫu nuôi cấy

Viện nghiên cứu Dầu thực vật, tinh dầu, hương liệu, mỹ phẩm Việt Nam ñã xây dựng thành công quy trình công nghệ sản xuất các giống mía năng suất cao bằng phương pháp nuôi cấy mô Quy trình này ñã ñược chuyển giao công nghệ từ phòng thí nghiệm ñến ngoài ñồng ruộng với giá chào bán là 30 triệu ñồng

Tác giả Nguyễn Thị Nhẫn ñã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro trong

công tác nhân giống mía lai: Quế ñường 15 (Hoa Nam 52-12x Nội Giang 782) và F134 (CO 290 x POJ28/78) Nguyên liệu sử dụng trong các thí nghiệm là các mắt mía và ñỉnh sinh trưởng ngọn

59-Như vậy, các nghiên cứu về cây mía ở Việt Nam mới chỉ tập trung vào việc nhân giống in vitro ñã góp phần không nhỏ trong việc nhân nhanh tạo lượng cây lớn, duy trì tính trạng tốt, cây sạch bệnh nhằm thu ñược giống

cây trồng với năng suất, sản lượng, chất lượng ñáp ứng yêu cầu của nhà trồng trọt Tuy nhiên, công tác chọn tạo giống mía mới, ñặc biệt chọn tạo giống mía nhờ phương pháp biến nạp di truyền còn hết sức mới mẻ và chưa ñược quan tâm nghiên cứu Do ñó, ñể tạo tiền ñề cho những thành công tiếp theo trong các nghiên cứu về cây mía, việc xây dựng một hệ thống tái sinh hoàn chỉnh tạo nguồn vật liệu khởi ñầu cho các nghiên cứu chuyển gen ở cây mía

3 NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

để ựạt ựược mục tiêu ựã ựề ra, chúng tôi tiến hành nghiên cứu với các nội dung chủ yếu sau:

1 đánh giá khả năng tạo mô sẹo và tái sinh của 4 giống mắa nhập nội

2 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ựiều tiết sinh trưởng thực vật tới khả năng hình thành, duy trì và nhân mô sẹo làm nguyên liệu phục vụ cho chuyển gen ở cây mắa

3 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất diều tiết sinh trưởng thực vật tới

khả năng tái sinh, nhân nhanh, ra rễ của chồi mắa in vitro

4 Xác ựịnh loại giá thể thắch hợp cho tỉ lệ sống cao của cây mắa in

vitro trong giai ựoạn vườn ươm

5 Thử nghiệm chuyển gen chỉ thị gus vào mô sẹo của cây mắa thông qua Agrobacterium tumefaciens

Nội dung 2,3,4,5: Tiến hành thắ nghiệm trên giống mắa ựã lựa chọn ựược từ nội dung 1

3.2VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.2.1 Vật liệu thực vật: Các giống mắa nhập nội: Qđ 94-119, Qđ 93-159,

ROC 23, ROC 26 ựược trồng tại nhà lưới của Viện Di truyền Nông nghiệp, nguồn gốc và lý lịch giống như sau:

Giống mắa Qđ 94-119

- Tổ hợp cây bố mẹ: Cây mắa trương 76-65 x nhại 71-374

- Nguồn gốc giống mắa: Sở nghiên cứu cây mắa ựường Quảng Tây

- đặc ựiểm: + Thân cây dài, từ vừa cho tới lớn

+ Dóng mắa dạng ống + Thân cây có màu tắm nhạt

+ Lá mắa có màu xanh lục nhạt, dày, cứng và ngắn Lá non mọc thẳng vút, lá già vươn ra ngoài, bẹ lá màu tắm nhạt + Tỉ lệ nảy mầm cao, mầm nảy ựều, mập, khoẻ, mọc nhanh và sinh trưởng khoẻ

+ Hàm lượng ựường có thể ựạt tối ựa 17,8%

Giống mắa Qđ 93-159

- Tổ hợp cây bố mẹ: Quế nông 73.204 x CP 72-1210

- Nguồn gốc giống mắa: Trạm thắ nghiệm Trạm Giang- Viện Nghiên cứu công nghiệp ựường- Tổng hội công nghiệp nhẹ Trung quốc

- đặc ựiểm: + Mầm mọc nhanh, ựều, hiệu suất nảy mầm cao, phân nhánh tốt

+ Rễ mắa phát triển sớm, nhiều, mạnh + Thân to trung bình ựến lớn, số cây hữu hiệu nhiều, dễ bóc

lá, không rễ phụ, ựường kắnh thân bình quan của mắa trồng mới là 2,96 cm

+ Chống hạn, chống ựổ tốt + đề kháng tốt với bệnh ựốm vòng, chống bọ hung, chống bệnh than

+ Chắn sớm, ựường cao (15-17%), ựộ tinh khiết cao (90-95%)

Giống mắa ROC 23

- Tổ hợp cây bố mẹ: F 166 x 74-575

- Nguồn gốc giống mắa: Viện Nghiên cứu mắa ựường đàI Loan

- đặc ựiểm: + Mầm có hình tam giác cân, lồi lộ, có cách mầm dài, phân

+ Năng suất ổn ựịnh (> 80 tấn/ha), hàm lượng ựường 15%)

(14-+ Kháng bệnh nấm, bệnh ựen ngọn tốt, kháng bệnh rỉ vàng, nâu và khô lá ở mức ựộ trung bình Dễ nhiễm bệnh khảm virus, bệnh cháy lá, bệnh rệp xơ bông trắng

+ Chống hạn, úng, chống ựổ tốt

Giống mắa ROC 26

- Nguồn gốc giống mắa: Viện Nghiên cứu mắa ựường đài Loan

- đặc ựiểm: + Thân mầm trung bình, hình tròn, phân nhánh khoẻ Lóng

gen chỉ thị gus, gen chọn lọc

hptII (gen kháng hygromycin)

Cả hai gen này ựều ựược ựiều

khiển bởi ựoạn gen khởi ựộng CaMV35S

Hình 3 Vectơ nhị thể pCAMBIA1301 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Môi trường nuôi cấy

Các thắ nghiệm ựược tiến hành trên môi trường khoáng MS (Murashige

và Skoog, 1962) có bổ sung agar, ựường sucrose, than hoạt tắnh

điều kiện thắ nghiệm:

3.3.2 Chuẩn bị mẫu thắ nghiệm

Lát cắt lá non (2x2mm) ựỉnh sinh trưởng của cây mắa 6 tháng tuổi

(Saccharum ssp.)

để thu ựược mẫu tốt, không bị nhiễm khuẩn trong quá trình nuôi cấy, nguồn nguyên liệu ban ựầu phải ựược lấy từ những cây sinh trưởng tốt, không sâu bệnh Quá trình thu và vận chuyển mẫu không bị dập nát, dụng cụ lấy mẫu phải sạch ựể tránh lây lan nấm bệnh, nhiễm khuẩn sau này

Ngọn mắa 6 tháng tuổi sau khi thu từ vườn về ựược khử trùng bề mặt bằng ethanol 70o Sau ựó, chúng tôi tiến hành bóc các lớp lá ngoài của ngọn mắa và lấy phần lá non nhất bao quanh ựỉnh sinh trưởng

3.3.3 Bố trắ thắ nghiệm:

3.3.3.1 đánh giá khả năng tạo mô sẹo, tái sinh cây của 4 giống mắa nhập nội

Từ 4 giống mắa nhập nội: Qđ 94-119, Qđ 93-159, ROC 23, ROC 26, chúng tôi tiến hành ựánh giá Tỉ lệ tạo mô sẹo, tái sinh của các giống mắa phục

vụ cho các nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh và chuyển gen sau này Nền môi trường: MS + 30 g/l sucrose + 7,5 g/l agar, pH = 5,8

- Thắ nghiệm 1: Giai ựoạn tạo mô sẹo: môi trường bổ sung

2mg/l 2,4D [2]

Mẫu cấy: 10 mẫu lá non (2x2mm)/ựĩa

Mỗi công thức gồm 3 ựĩa petri Mỗi ựĩa chứa 10ml môi trường nuôi cấy, thắ nghiệm bố trắ ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại

Thời gian theo dõi: 10 ngày/ lần đánh giá kết quả sau 30 ngày

- Thắ nghiệm 2: Giai ựoạn tái sinh cây từ mô sẹo: môi trường bổ

sung 2 mg/l Ki + 0,5 mg/l NAA [2]

Mẫu cấy: 10 mẫu mô sẹo/ bình Mỗi công thức gồm 4 bình tam giác Mỗi bình chứa 50ml môi trường nuôi cấy, thắ nghiệm bố trắ ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại Thời gian theo dõi: 10 ngày/ lần đánh giá kết quả sau 30 ngày

3.3.3.2 Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh

Các thắ nghiệm trong giai ựoạn này sử dụng giống mắa có Tỉ lệ tạo mô sẹo, tái sinh cao từ thắ nghiệm 2.1

3.3.3.2.1 Giai ựoạn khởi tạo và nhân mô sẹo

Nền môi trường: MS + 30 g/l sucrose + 7,5 g/l agar, pH = 5,8

Bố trắ thắ nghiệm: mỗi công thức gồm 6 ựĩa petri Mỗi ựĩa chứa 10ml môi trường nuôi cấy với 5 mẫu kắch thước (2x2) mm

Thắ nghiệm bố trắ ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại

Thời gian theo dõi: 10 ngày/lần đánh giá kết quả sau 30 ngày

đĩa thắ nghiệm ựược ựặt ở nhiệt ựộ 27 ổ 10oC, không chiếu sáng, ựộ ẩm 90% trong tủ nuôi ựiều khiển nhiệt ựộ, ánh sáng của hãng SANYO

Ớ Giai ựoạn khởi tạo mô sẹo:

Thớ nghiệm 3: Ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo mụ sẹo từ lỏ non mớa Bảng 1 Ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo mụ sẹo từ lỏ non mớa

Nồng ủộ (mg/l) Auxin

Bảng 2 Ảnh hưởng phối hợp của auxin và cytokinin tới khả năng tạo mụ

sẹo từ lỏ non mớa

Nồng độ (mg/l) Cytokinin

• Giai ủoạn nhõn mụ sẹo:

Thớ nghiệm 5: Ảnh hưởng của 2,4-D tới khả năng nhõn mụ sẹo trờn hai nền mụi trường MS và N6

Thớ nghiệm sử dụng mụ sẹo ở giai ủoạn khởi tạo nuụi cấy trờn hai nền mụi trường MS và N6 ủược bổ sung chất ðTST 2,4D ở cỏc nồng ủộ sau:

Sau khi xác ựịnh ựược nền môi trường thắch hợp ở thắ nghiệm 5, bổ sung 2,4D với các nồng ựộ khác nhau nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4D tới khả năng nhân mô sẹo

Thắ nghiệm ựược tiến hành theo các công thức sau:

đối chứng (đ/C): 0 mg/l 2,4-D

Công thức 1: 0,5 mg/l 2,4-D Công thức 5: 2,5 mg/l 2,4-D Công thức 2: 1,0 mg/l 2,4-D Công thức 6: 3,0 mg/l 2,4-D Công thức 3: 1,5 mg/l 2,4-D Công thức 7: 3,5 mg/l 2,4-D Công thức 4: 2,0 mg/l 2,4-D Công thức 8: 4,0 mg/l 2,4-D

3.3.3.2.2 Giai ựoạn tái sinh, nhân chồi và ra rễ

Bố trắ thắ nghiệm: mỗi công thức gồm 3 bình tam giác dung tắch 250ml, mỗi bình chứa 50ml môi trường nuôi cấy

Thắ nghiệm bố trắ ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại

Thời gian theo dõi: 10 ngày/lần

điều kiện nuôi cấy: bình thắ nghiệm ựược ựặt trong tủ nuôi ổn nhiệt của hãng Rumed (CHLB đức), nhiệt ựộ 28 oC, cường ựộ ánh sáng 2000 lux, ựộ

ẩm 90%, chiếu sáng 10-14 giờ/ngày

Ớ Giai ựoạn tái sinh

Nền môi trường: MS + 30 g/l sucrose + 1 g/l than hoạt tắnh + 7,5 g/l agar; pH=5,8

Toàn bộ thắ nghiệm, mỗi bình cấy 9 mẫu mô sẹo (2x2mm)

đánh giá kết quả sau 40 ngày

Thắ nghiệm 7: Ảnh hưởng của cytokinin tới khả năng tái sinh chồi

Nồng ñộ (mg/l) Cytokinin

Công thức 2: 0,50 mg/l α-NAA

Công thức 3: 0,75 mg/l α-NAA

Công thức 4: 1,00 mg/l α-NAA

• Giai ñoạn nhân nhanh

Nền môi trường: MS + 30 g/l sucrose + 7,5 g/l agar, pH=5,8

Mẫu cấy: mỗi bình cấy 6 cụm, mỗi cụm 3 chồi ñược tạo thành từ giai ñoạn tái sinh Mỗi chồi có chiều cao khoảng 2 cm

Hệ số nhân chồi ñược ñánh giá sau 30 ngày nuôi cấy

Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của cytokinin ñến khả năng nhân nhanh chồi mía

Môi trường nuôi cấy có bổ sung cytokynin (Ki) ở các nồng ñộ khác nhau như sau:

Bảng 4 Ảnh hưởng của cytokinin ñến khả năng nhân nhanh chồi mía

Nồng ñộ (mg/l) Cytokinin