ung dung cong nghe vi sinh vat trong san xuat ruou vang

Khi phản ứng với các nhóm amin tự do trongdịch ép nước quả sẽ tạo nên hương vị và mùi thơm đặc trưng cho sản phẩm lên men.Ngoài ra, glucose là loại đường có tốc độ sản xuất năng lượng lớ

CHỦ ĐỀ:

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ VI SINH VẬT

TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên bộ môn: PGS.TS Phan Thị Phượng Trang

Môn học: Công nghệ vi sinh vật Lớp: Cao học vi sinh K30

Học viên thực hiện:

1 Phạm Thanh Truyền 20C64008

2 Nguyễn Huỳnh Thanh Nhi 20C64013

Tp Hồ Chí Minh, 7/2021

MỤC LỤC

1 Giới thiệu 4

1.1 Vài nét về rượu vang 4

1.2 Thành phần dinh dưỡng trong dịch ép nho 4

1.3 Các thời kì trong lên men rượu vang 6

1.4 Phân loại rượu vang 6

1.5 Thành phần và giá trị dinh dưỡng trong rượu vang 7

1.6 Một số lợi ích của rượu vang 8

2 Chủng vi sinh vật, phân lập và sàng lập 8

2.1 Nấm men Saccharomyces cerevisiae 8

2.1.1 Nguồn phân lập 8

2.1.2 Phân lập và làm thuần 9

2.1.3 Sàng lọc chủng nấm men có tiềm năng trong sản xuất rượu vang 9

2.1.4 Bảo quản giống 10

2.1.5 Hoạt hóa chủng 10

2.2 Vi khuẩn lactic 11

2.2.1 Phân lập vi khuẩn lactic 12

2.2.2 Sàng lọc vi khuẩn lactic trong lên men malolactic 12

3 Tối ưu hoá quá trình lên men 13

3.1 Tối ưu hóa quá trình lên men rượu 13

3.2 Tối ưu hóa quá trình lên men malolactic 13

4 Quy trình sản xuất rượu vang 14

4.1 Thu hoạch nho 14

4.2 Sơ chế nho 14

4.3 Chuẩn bị men 15

4.4 Lên men rượu 16

4.5 Ép rượu 16

4.6 Lên men malolactic 16

4.7 Ủ rượu 17

4.8 Lọc rượu 17

4.9 Chiết rót, đóng chai, dán nhãn 17

5 Kiểm soát chất lượng trong sản xuất rượu vang 17

5.1 pH và độ acid 17

5.2 Hàm lượng đường 17

5.3 Hàm lượng Nitrogen 18

5.4 Chất rắn lơ lửng 18

5.5 Lượng Oxy hòa tan 18

5.6 Các chỉ tiêu đánh giá rượu thành phẩm 18

5.6.1 Chỉ tiêu cảm quan 18

5.6.2 Chỉ tiêu hóa học 19

5.6.3 Giới hạn kim loại nặng 19

5.6.4 Các chỉ tiêu vi sinh 20

6 Tài liệu tham khảo 20

1 Giới thiệu

1.1 Vài nét về rượu vang

Rượu vang là một loại rượu nhẹ được lên men từ dịch ép trái cây, thu được không quachưng cất, có hương vị thơm ngon của trái cây tự nhiên, độ cồn nhẹ (10 – 15%), là loạinước giải khát thơm ngon có giá trị dinh dưỡng cao, rất thích hợp cho phụ nữ và ngườicao tuổi Quá trình lên men được thực hiện chủ yếu nhờ nấm men sử dụng hệ enzyme sẵn

có chuyển hóa glucose và một số đường khác thành cồn ethanol và các sản phẩm phụ nhưester, axit hữu cơ,…Ngoài ra, còn có sự hỗ trợ một phần bởi vi khuẩn lactic tạo nênhương vị đặc trưng cho rượu vang

Trên thế giới, rượu vang đã ra đời cách đây khá lâu và ngành công nghiệp rượu vang

đã có nhiều bước tiến đáng kể, hoàn thiện quy trình cũng như chất lượng sản lượng ngàycàng đáp ứng thị hiếu người tiêu dùng Các quốc gia sản xuất rượu vang và tiệu thụ rượuvang mạnh phải kể đến là Pháp, Ý, Đức, Mỹ, Tây Ban Nha…Việc sản xuất rượu vangtrong nước cũng đã phát triển nhưng chủ yếu tiêu thụ ở vùng nông thôn bởi chất lượngchưa cao, giá thành vừa phải Chưa có một quy trình sản xuất yêu cầu kĩ thuật và côngnghệ như của nước ngoài Hầu hết vang được chiết xuất từ nhiều nguồn dịch quả khácnhau nên chất lượng chưa đảm bảo Hiện nay có hai công ty sản xuất rượu vang lớn ởViệt Nam là vang Đà Lạt và vang Biên Hòa Nguồn nguyên liệu nho thì chỉ có NinhThuận được đánh giá là vùng trồng nho tiềm năng cho sản xuất nho Tuy nhiên các nhàsản xuất vang ở Việt Nam trong quá trình sản xuất vẫn cho thu mua một số lượng lớn quả

mà không quan tâm tới chất lượng và nguồn gốc dẫn tới chất lượng thành phẩm khôngcao, không đáp ứng nhu cầu thị trường ngày một khắt khe

1.2 Thành phần dinh dưỡng trong dịch ép nho

Trong quả nho và nhiều loại quả khác, hầu như chỉ có đường khử glucose, fructose lànhững hợp chất có chứa nhóm aldehyde Khi phản ứng với các nhóm amin tự do trongdịch ép nước quả sẽ tạo nên hương vị và mùi thơm đặc trưng cho sản phẩm lên men.Ngoài ra, glucose là loại đường có tốc độ sản xuất năng lượng lớn nhất thích hợp cho sựphát triển sinh khối của nấm men Do đó, nếu sử dụng dịch lên men hoàn toàn từ dịch épquả thì quá trình lên men sẽ rất thuận lợi

Các loại quả như nho, táo, xoài,… thâm chí cả cóc, bưởi, mận đều có thể dùng làmnguyên liệu để chế biến lên men rượu vang Nhưng nho vẫn là nguyên liệu lí tưởng nhấtvì:

 Nho cho chất lượng rượu tốt nhất, hương vị đậm đà

 Vị ngọt, nồng của cồn ethanol cân đối với vị chua, chát của axit và tannin trongquả nho

 Thành phần nước quả thích hợp cho việc lên men

 Nho cho sản lượng nước quả cao trên diện tích thâm canh tốt (1ha đạt 2- 3 vạnlít nước quả)

Nước ép nho tươi chứa 70 - 80% nước và nhiều chất rắn hòa tan (vô cơ và hữu cơ).Trong sản xuất rượu vang, các nhóm hợp chất quan trọng trong dịch ép nho bao gồm:đường, axit hữu cơ, hợp chất phenolic, hợp chất nitơ, hợp chất thơm, khoáng chất, nhómchất pectic

+ Đường: Glucose và fructose được xem là loại đường chính trong nho Hàm lượngđường trong nước ép nho chín dao động trong khoảng 150 - 250 g /L Trong quả chưachín, glucose là đường chủ yếu Ở giai đoạn chín, glucose và fructose thường có mặt vớilượng bằng nhau (tỷ lệ 1: 1) Trong nho chín quá, hàm lượng fructose vượt quá glucose + Axit hữu cơ: Axit tartaric, malic, citric,…là chất rắn có nhiều nhất trong nước épnho, là nguyên nhân tạo nên vị chua, có ảnh hưởng đến màu sắc; pH của rượu So vớinhững loại trái cây khác, nho là loại trái cây hiếm hoi có chứa axit tartaric và hiện diệndưới dạng axit tự do và muối, chẳng hạn như kali bitartrate Bitartrate là một thành phầnquan trọng vì nó ảnh hưởng đến độ pH và độ ổn định lạnh của rượu

+ Hợp chất phenolic: Hai chất chính có trong nhóm hợp chất này là anthocyanins vàtannin Anthocyanins là sắc tố chịu trách nhiệm tạo ra màu đỏ và tím cho nho và rượuvang Khi vang đỏ chín, anthocyanin sẽ kết hợp với các hợp chất phenol khác góp phần

ổn định màu sắc trong vang đỏ Tannin là những hợp chất rất phức tạp, trọng lượng phân

tử lớn có vai trò làm tăng vị chát và đắng trong rượu Trong quá trình tăng trưởng củanho, tannin bắt đầu trùng hợp dẫn đến tăng kích thước phân tử, khi đó vị chát được cảmnhận nhiều hơn vị đắng Sự gia tăng kích thước phân tử làm cho các hợp chất này khônghòa tan và do đó, chúng kết tủa, và vị chát của rượu vang sẽ giảm

+ Hợp chất Nitơ: Nho chứa nhiều hợp chất nitơ khác nhau, gồm các cation amoni vàcác hợp chất nitơ hữu cơ như axit amin, peptite và protein Tổng nồng độ nitơ của quả sẽtăng lên trong thời kỳ chín Các hợp chất chứa nitơ rất quan trọng vì chúng đóng vai trò

là chất dinh dưỡng cho nấm men và vi khuẩn lactic Nitơ ảnh hưởng đến sự hình thànhsinh khối, tốc độ lên men và sản xuất các sản phẩm phụ khác, do đó ảnh hưởng đến cácthuộc tính cảm quan của rượu vang

+ Hợp chất thơm: Ở rượu vang, nhiều hợp chất thơm dễ bay hơi cũng đã được tìmthấy như 4-vinylguaiacol, 4-vinylphenol, Terpenes, tạo ra mùi cay giống như đinhhương và mùi thuốc đối với một số loại vang Các hợp chất thơm này có nguồn gốc từ banguồn chính đó là nho, quá trình tăng trưởng của nho và trong quá trình lên men

+ Khoáng chất: Khoáng chất trong nho sẽ được cây hấp thụ có nguồn gốc từ đất,chiếm 0,2 - 0,6% trọng lượng tươi của quả, gồm các hợp chất khoáng quan trọng như:kali, natri, sắt, phosphate, sunfat và clorua Trong đó, kali là khoáng chất quan trọng nhất,

chiếm 50 - 70% các cation trong nước trái cây Trong quá trình chín, hàm lượng kalitrong nho tăng lên Sự di chuyển của nó vào trái cây dẫn đến sự hình thành kali bitartrate,làm giảm độ chua và tăng độ pH của nước trái cây

+ Nhóm chất Pectic: Là chất kết dính có trong thành tế bào quả nho Về mặt hóa học,chúng là những polysaccharid phức tạp được tạo thành từ các phân tử axit galacturonicliên kết với nhau Trong quá trình chín, pectic bị thủy phân bởi các enzym pectolytic cótrong tự nhiên, làm cho quả mọng mềm hơn khi chín

1.3 Các thời kì trong lên men rượu vang

Quá trình lên men rượu chia làm hai thời kì chính:

- Thời kì phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của O2, tế bào nấm men pháttriển sinh khối

- Thời kì lên men chuyển đường thành rượu và CO2 : giai đoạn này nấm men hấp thụ cácchất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học trongquá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và CO2

Sau thời kì này là hoạt động của các vi khuẩn lactic (LAB) giúp chuyển hóa đườngcòn sót lại trong rượu vang non, đặc biệt là quá trình lên men axit malic thành axit lactic,citric, axetic,… góp phần hình thành hương vị đặc trưng của rượu vang (còn gọi là Quátrình lên men malolactic)

1.4 Phân loại rượu vang

Rượu vang có thể được phân loại theo nhiều cách như sau:

+ Rượu vang đỏ (Red wine): được lên men từ nước ép và vỏ quả nho

+ Rượu vang trắng (White wine): chỉ được lên men từ nước ép nho

+ Rượu vang hồng (Rose wine): gần giống vang đỏ, tuy nhiên khi lên men, thời gian để

vỏ nho tiếp xúc với nước ép nho ngắn hơn so với vang đỏ

+ Rượu vang khô (dry- wine): chọn những quả nho thường, trong quá trình lên men,lượng đường trong nho sẽ được chuyển gần hết thành rượu (độ cồn cao), có vị chát

+ Rượu vang ngọt (sweet wine): chọn những quả nho chín kĩ (có lượng đường cao),lượng đường vẫn được giữ lại một phần trong quá trình lên men, có vị hơi ngọt

Ngoài ra, rượu còn được phân loại theo nơi sản xuất: theo quốc gia thì sẽ có các loạirượu vang như vang Pháp, Úc, Tây Ban Nha,…Theo vùng thì sẽ có các loại rượu thuộcvùng Bordeaux (Pháp), Burgandy (Pháp), California (Hoa Kỳ), Chablis (Pháp),…

1.5 Thành phần và giá trị dinh dưỡng trong rượu vang

Rượu vang có thành phần rất phức tạp, đến nay ở các nước có công nghệ sản xuấtrượu vang lâu đời cũng chưa biết hết được các chất cấu thành của rượu Theo một sốnghiên cứu, thành phần chủ yếu của rượu là: cồn ethanol, đường, các axit hữu cơ; vô cơ

tỷ lệ tannin nhiều hơn so với vang trắng do sử dụng cả phần vỏ nho để chế biến

Một giá trị dinh dưỡng đáng kể khác của rượu vang là giàu vitamin Do một số biếnđổi sinh hóa trong lên men, một số vitamin sẽ được giữ lại trong nước quả, một số sẽđược bổ sung thêm và một số sẽ mất đi

Bảng 1 Thành phần vitamin của nước nho tươi và của rượu vang nho

Cholin 19 – 39 (mg/l) 19 – 27 20 - 43

1.6 Một số lợi ích của rượu vang

Khi được tiêu thụ một cách vừa phải và có kiểm soát, rượu vang có một số tác dụngsau:

 Tăng cường trí não

 Giảm cân, chống béo phì

 Ngăn ngừa sự tấn công của các bệnh ung thư

 Làm chậm quá trình lão hóa

Các chất chống oxy hóa polyphenol, resveratrol và quercetin có trong rượu vang đỏngăn ngừa sự tích tụ của các gốc tự do làm chậm quá trình xơ vữa động mạch, cải thiệnmức cholesterol HDL tốt và giảm mức cholesterol LDL xấu Hợp chất piceatannol cótrong nho đỏ có cấu trúc hóa học tương tự resveratrol Piceatannol giúp chống béo phì vàtăng cân bằng cách ngăn chặn sự phát triển và tăng trưởng của các tế bào mỡ

2 Chủng vi sinh vật, phân lập và sàng lập

2.1 Nấm men Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae là một loài nấm men được biết đến nhiều nhất có trong

bánh mì nên thường gọi là men bánh mì, là một loại vi sinh vật thuộc chi Saccharomyces,lớp Ascomycetes, ngành nấm Loài này có thể xem là loài nấm hữu dụng nhất trong đờisống con người từ hàng ngàn năm trước đến nay Nó được dùng rộng rãi trong quá trìnhlên men làm bánh mì, rượu và bia

Saccharomyces cerevisiae

Chủng nấm men phân lập dùng trong sản xuất rượu vang cần mang một số đặc tínhnhư: có thể sinh trưởng và phát triển trong điều kiện pH thấp (3,5 – 5,5), nồng độ đườngcao, chống chịu được với các stress sinh học như độ axit, nhiệt đô, ethanol cao, hạn chếđược lượng khí CO2 sinh ra

2.1.1 Nguồn phân lập

Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có dạng

hình cầu hay hình trứng, có kích thuớc nhỏ, từ 5-6 đến

10-14 µm, sinh sản bằng cách tạo chồi và tạo bào tử Nguồn

dinh dưỡng chủ yếu của chúng là sử dụng đường glucose,

galactose, saccharose, maltose như nguồn cacbon, chúng

sử dụng amino axit và muối amon như nguồn nitơ

Hình 1.Saccharomyces cerevisiae

Mẫu nho không có chất kích thích và chất phòng trừ sâu bệnh được thu nhận tại vườn

ở các tỉnh Ninh Thuận, Khánh Hòa, Lâm Đồng Sau khi thu nhận sẽ được làm dập trongtúi nilon vô trùng, ủ lên men tự nhiên và giữ làm nguồn phân lập nấm men Mẫu sau mộttuần lên men được bảo quản ở 4oC để tiến hành phân lập

2.1.2 Phân lập và làm thuần

Chủng nấm men được phân lập trên môi trường YPG (yeast extract- glucose) có bổ sung 6 g/L tartaric axit, 30 mg/mL chloramphenicol

peptone-Quy trình phân lập:

- Lấy 1 (g) mẫu nho lên men pha loãng, cấy sang môi trường YPG, ủ 30oC trong 24- 48h

- Chọn các khuẩn lạc điển hình cấy ria sang môi trường YPG có bổ sung chloramphenicol

30 mg/l, ủ ở cùng điều kiện

- Cấy chuyền nhiều lần để làm thuần, sau đó chuyển sang ống thạch nghiêng YPG và bảoquản ở 4oC chuẩn bị cho nghiên cứu tiếp theo

2.1.3 Sàng lọc chủng nấm men có tiềm năng trong sản xuất rượu vang

Dựa trên các thí nghiệm kiểm tra các khả năng:

 Khả năng chịu áp suất thẩm thấu với glucose và fructose

 Khả năng chịu ethanol

 Khả năng chịu nhiệt, pH

 Khả năng sinh H2S

 Khả năng sinh ethanol

Khả năng lên men đường: các dòng nấm men phân lập được nuôi cấy trên môi trườngYEPD lỏng (15g peptone, 10g yeast extract, 20g saccharose), trong ống nghiệm có chứaống Durham ở 30oC trong 48h Nếu có sinh hơi sẽ làm cho ống Durham bị đẩy lên, chứng

tỏ có khả năng lên men đường

Khả năng chịu áp suất thẩm thấu với glucose và fructose: các dòng phân lập đượcnuôi cấy trong môi trường YPG có bổ sung glucose hoặc saccharose ở các mức nồng độkhác nhau (0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% và 30%), 30˚C trong vòng 48h Sau 48h nuôicấy tiến hành đo OD 600 nm

Khả năng chịu ethanol: các dòng phân lập được nuôi cấy trong 10 ml môi trườngYPG lỏng (bổ sung 5, 10, 15% ethanol), ở 30˚C trong 72h, đo OD

Khả năng chịu nhiệt: các dòng phân lập được nuôi cấy trong môi trường YPG và ủ ởcác mức nhiệt độ khác nhau từ 25, 30, 37 và 45˚C , đo OD

Khả năng chịu pH: các dòng phân lập nấm men được nuôi cấy trường môi trườngYPG với các mức pH khác nhau 2, 3, 4, 5 và 6 và ủ ở 30˚C trong 72h, đo OD

Khả năng sinh H2S: trong quá trình sinh trưởng và phát triển nấm men có thể sinhnhiều hidrogen sunfit, đây là sản phẩm không mong muốn trong quá trình lên men rượu

vì có thể ảnh hưởng đến mùi vị và chất lượng rượu vang thu được nên các chủng nấmmen được kiểm tra khả năng sinh H2S bằng cách nuôi cấy trên môi trường LA (Peptone yeast extract, NaCl) ở 30˚C trong 10 ngày và kiểm tra sự thay đổi về màu sắc của môi

trường nuôi cấy Nếu môi trường chuyển sang màu đen thì chủng nấm mem đó có khảnăng sinh H2S và là chủng không phù hợp dùng để lên men rượu vang

Khả năng sinh ethanol:

Bước 1: Xác định trọng lượng riêng (môi trường nuôi cấy ban đầu)

Cân trọng lượng của bình tam giác vô trùng (W1), làm đầy bình bằng nước vô trùngkhử ion và cân trọng lượng (W2) Sau đó làm đầy bình tam giác bằng môi trường nuôicấy và cân trọng lượng (W3)

Trọng lượng riêng = S/W

Trong đó: S khối lượng thể tích của môi trường (W3-W1)

W khối lượng của thể tích nước (W2-W1)

Bước 2: Xác định hàm lượng ethanol

Mỗi dòng phân lập được nuôi cấy trong môi trường YPG có bổ sung saccharose Saukhi nuôi cấy tiến hành xác đinh trọng lượng riêng của canh trường nuôi cấy Hàm lượngethanol trong canh trường nuôi cấy được xác định bằng công thức:

%Ethanol = (Trọng lượng riêng của môi trường ban đầu – Trọng lượng riêng của canhtrường sau khi nuôi cấy) x 131,25

2.1.4 Bảo quản giống

Tế bào nấm men được nuôi cấy trên môi trường YPG có thể được bảo quản lạnh sâutrong glycerol ở -70°C

Nguyên tắc phương pháp làm lạnh sâu: dựa trên cơ sở sự phát triển của vi sinh vật bị

ức chế ở nhiệt độ lạnh sâu bằng cách trộn dịch tế bào với chất bảo vệ với nồng độ thíchhợp, sau đó đưa vào lạnh sâu ở nhiệt độ tối ưu để bất hoạt chủng

Quy trình thực hiện:

- Chuẩn bị 1mL dung dịch glycerol 30% vô trùng vào lọ có nắp vặn vô trùng 4mL

- Bổ sung 1mL dịch nuôi cấy men được lấy ở pha log muộn vào dung dịch glycerol

- Trộn, làm đông trên đá khô và bảo quản ở –70°C

2.1.5 Hoạt hóa chủng

Mẫu sau một thời gian bảo quản sẽ bị bất hoạt, để thu nhận lại đặc điểm vốn có củachủng gốc phục vụ cho các nghiên cứu, ta sẽ tiến hành hoạt hóa chúng Sau thời gian bảoquản lạnh sâu và được hoạt hóa, khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch có đặc điểm hình tháigiống hệt hình thái của chủng nấm men trước khi bảo quản