Luận văn thạc sĩ nghiên cứu sản xuất kháng thể bại liệt trên thỏ và đánh giá an toàn của vacxin bại liệt trong phòng thí nghiệm

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DNA: Deroxyribonucleic acid axit deroxyribo nucleic RNA: Ribonucleic acid axit ribonucleic CCID50: Cell culture infective dose 50 Liều gây nhiễm CGI: Cell G

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

-

NGUYỄN THỊ NGA

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG THỂ BẠI LIỆT TRÊN THỎ

VÀ ðÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN CỦA VẮC XIN BẠI LIỆT

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược công bố trong bất

LờI CảM ƠNờI CảM ƠNờI CảM ƠN Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn, với sự nỗ lực của cá nhân, tôi còn nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của nhiều cá nhân

và tập thể Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn và cảm ơn chân thành tới:

Ban Giám hiệu, các thầy cô giáo Khoa Sau Đại học, Khoa chăn nuôi Thú y – Trường Đại học Nông nghiệp, cán bộ Trung Tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế và đặc biệt là các cán bộ phòng Kiểm định chất lượng Vắc xin (QC), những người đã giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi học tập, tiếp thu kiến thức trong chương trình học

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Thị Luân – Phó Giám đốc Trung Tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế - Bộ

Y tế, đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài, cũng như trong quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp

Cảm ơn TS Nguyễn Hữu Nam - Trưởng khoa thú y Trường Đại Học Nông nghiệp I Hà Nội đã hướng dẫn khoa học và giúp đỡ tôi hoàn chỉnh luận văn

Xin cảm ơn PGS TS Nguyễn Đăng Hiền – Giám Đốc Trung Tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm y tế đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá học và thực hiện các nghiên cứu thí nghiệm

Cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và các bạn bè, đồng nghiệp

đã động viên, chia sẻ, giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Một lần nữa tôi xin trân trọng cảm ơn !

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Nga

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DNA: Deroxyribonucleic acid (axit deroxyribo nucleic)

RNA: Ribonucleic acid (axit ribonucleic)

CCID50: Cell culture infective dose 50 (Liều gây nhiễm)

CGI: Cell Goowth Index (Mẫu B tăng trưởng phát triển)

CPE: Cytopathic Effect (Huỷ hoại tế bào)

CFU: Clonial Forming Unit (đám hoại tử)

CT TCMR: Chương trình tiêm chủng mở rộng

DMSO: Dymethyl Sulphoxide (Môi trường cất giữ tế bào)

GLP: Good Laboratory Practive (Tiêu chuẩn thực hành tốt kiểm nghiệm) GM: Grow medium (Môi trường tăng trưởng)

GMP: Good Manufacturing Practices (Tiêu chuẩn thực hành tốt sản xuất) HEP2C: Human Laryngocacynoma cincinnati (Tế bào ung thư thanh

quản người) HIV: Human immunodeficiency virus (Virus suy giảm miễn dịch ở người) HTK: Huyết thanh khỉ

IPV: Inactivated Polio vaccine (Vắc xin bại liệt bất hoạt)

IgG: Immunoglobulin G (Globulin miễn dịch lớp G)

IgM: Immunoglobulin M (Globulin miễn dịch lớp M)

IgA: Immunoglobulin A (Globulin miễn dịch lớp A)

LH: Lactabumin Hydrolysate trong ựệm Hanks

LHE: Lactabumin Hydrolysate Ờ Hanks - Eagle

JVKT: Tế bào thận khỉ sơ sinh Xanh Châu phi

PFU: Plasque forming unit (đơn vị tạo ựám hoại tử)

FBS: Fetal Bovine Serum (huyết thanh bê )

TCID50: Tissue culture infective dose 50 (liều gây nhiễm 50% tế bào)

WHO: World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)

MA104: Tế bào thận khỉ bào thai Rhesus

MM: Maintenance medium (Môi trường duy trì)

MEM: Eagles Minimum Essential Medium (Môi trường Eagle tối thiểu) OPV: Oral Polio vaccine (Vắc xin bại liệt sống uống giảm ñộc lực)

QA: Quality Assurance (Bảo ñảm chất lượng.)

QC: Quality Control (Kiểm ñịnh chất lượng)

SFV: Simian Foamy virus (Virus nước bọt ở khỉ)

SIV: Simian immunodeficiency virus (Virus gây suy giảm miễn dịch ở khỉ) SV40: Siman Virus 40 (Virus 40 ở khỉ)

Vero: Tế bào thận khỉ xanh Châu phi

HGKT Hiệu giá kháng thể

FCA Adjuvant Complexte Freund (tá dược toàn phần)

FIA Adjuvant Incomplexte Freund (tá dược không toàn phần)

MỤC LỤC

2.6 Tiêu chuẩn Việt Nam về phương pháp kiểm tra tính an toàn của

4.1.2 Kết quả sản xuất kháng thể từ huyết thanh Thỏ lần thứ nhất 51 4.1.3 Kết quả sản xuất kháng thể từ huyết thanh Thỏ lần thứ hai 57 4.2 Kết quả kiểm tra tính an toàn văcxin bại liệt trong phòng thí

4.2.1 Kiểm tra nguyên liệu ñầu cho sản xuất văcxin bại liệt – khỉ sản

4.2.2 Kết quả kiểm tra tế bào sử dụng cho sản xuất văcxin bại liệt trong

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

BỞng 4.1 Các thông sỞ cho sỞn xuỞt kháng nguyên bỞi liỞt

BỞng 4.3 SỞ lỞỞng huyỞt thanh thu ñỞỞc cỞa lỞn thỞ

BỞng 4.7 SỞ lỞỞng huyỞt thanh thu ñỞỞc cỞa lỞn thỞ

BỞng 4.9 HiỞu giá kháng thỞ týp II lỞn 2 (Theo phỞỞng pháp

BỞng 4.11 KỞt quỞ kiỞm tra các test thỞ nghiỞm cho khỞ

BỞng 4.13 ChỞt lỞỞng tỞ bào sỞ dỞng cho sỞn xuỞt vỞc xin

BỞng 4.14 KỞt quỞ kiỞm tra tác nhân ngoỞi lai trên nỞỞc

nỞi nuôi tỞ bào sỞ dỞng cho sỞn xuỞt vỞc xin bỞi liỞt

BỞng 4.15 KỞt quỞ kiỞm tra tác nhân ngoỞi lai trên nỞỞc

nỞi nuôi tỞ bào sỞ dỞng cho sỞn xuỞt vỞc xin bỞi liỞt

(mỞu 2) 68 BỞng 4.16 ChỞt lỞỞng tỞ bào sỞ dỞng cho sỞn xuỞt văcxin

DANH MỤC BIỂU ðỒ

BiỞu ñỞ 4 HiỞu giá kháng thỞ týp II (theo phỞỞng pháp tiêm

BiỞu ñỞ 5 HiỞu giá kháng thỞ týp II (theo phỞỞng pháp tiêm

BiỞu ñỞ 8: SỞ thay ñỞi hiỞu giá giỞa 2 nhiỞt ñỞ cỞa văcxin bai

BiỞu ñỞ 9: thay ñỞi hiỞu giá giỞa 2 nhiỞt ñỞ cỞa văcxin bai liỞt

1 MỞ đẦU

1.1 Tắnh cấp thiết của ựề tài

Bệnh bại liệt do Polio virus gây ra là một bệnh nhiễm trùng toàn thân, có

biểu hiện lâm sàng với các mức ựộ nặng nhẹ khác nhau, gây tổn thương hệ thần kinh trung ương và ựôi khi gây biểu hiện liệt mềm cấp Bệnh thường ựược gọi dưới tên Poliomyelitis (Polios: Chất xám, myelos: tủy sống), ựể mô tả tổn thương bệnh lý tại các nơron của chất xám, ựặc biệt tại sừng trước của hệ thần kinh tủy sống gây biểu hiện liệt mềm cấp

Bệnh bại liệt do virrus gây ra bởi 3 týp Polio khác nhau (týp I-II-III ), dựa vào tắnh khác biệt về kiểm tra huyết thanh trung hòa Trước khi dùng văcxin ựại ựa

số các trường hợp liệt do virus Polio gây ra thuộc nhóm virus hoang dại [4], [5], [8], [12], [17], [19] và ựể lại di chứng liệt suốt ựời cho trẻ, ựặc biệt nghiêm trọng nếu như gây liệt hô hấp có thể dẫn tới tử vong

Bệnh bại liệt chưa có thuốc ựặc trị, nhưng rất may mắn cho nhân loại là ựã có vacxin phòng bệnh ựặc hiệu đó là vacxin bất hoạt của Salk (1950-1954) lần ựầu tiên ựược sử dụng ở Mỹ Sau năm 1950 việc xuất hiện vacxin sống giảm ựộc lực của Sabin [9], [12], [20], [23], [99] ựã ựưa ựến cho con người khả năng sử dụng dễ dàng và có thể cho nhiều người uống cùng một lúc Do vậy, tắnh ựến thời ựiểm hiện tại, văcxin này ựã ựược sử dụng trên toàn thế giới trong hơn 40 năm qua Năm 1988, WHO ựã dựa vào những thành tựu do văcxin ựem lại ựể ựưa ra chương trình thanh toán bại liệt trên toàn Thế giới vào năm 2010

Việt Nam là một trong những nước thuộc khu vực Tây Thái Bình Dương, nằm trong vùng dịch bại liệt lưu hành cao, tập trung chủ yếu ở các tỉnh phắa Nam nên trẻ em Việt Nam cũng ựã ựược thừa hưởng những thành quả nghiên cứu khoa học của Thế giới về việc có ựược một vacxin phòng bại liệt GS.TSKH Hoàng Thủy Nguyên là người ựầu tiên ựã áp dụng thành công công nghệ sản xuất văcxin Sabin ở Việt Nam vào những năm ựầu 1960, khi có vụ dịch bại liệt rất lớn xảy ra và

nhờ vậy, ñã cứu sống ñược sinh mạng của hàng triệu trẻ em Việt Nam Từ ñó ñến nay, quy trình công nghệ sản xuất vacxin bại liệt ngày càng ñược hoàn thiện cả về

số lượng và chất lượng, góp phần ñáng kể vào việc phòng chống bệnh bại liệt [9], [20], [21], [23], giảm tỷ lệ tử vong, từng bước khống chế và ñã tiến hành thanh toán bệnh bại liệt vào năm 2000 của Bộ Y Tế Việt Nam trong Chương trình Tiêm chủng

mở rộng Hiện nay, Chương trình Tiêm chủng mở rộng có ñặt hàng tại Trung Tâm nghiên cứu sản xuất văcxin và Sinh phẩm Y tế một số lượng vacxin bại liệt xấp xỉ 8

~10.000.000 liều /năm, dành cho các trẻ mới sinh ñể phòng bệnh bại liệt Việc sử dụng vacxin có hiệu quả ñã làm giảm nhanh chóng bệnh bại liệt ở hầu hết các nước phát triển trên Thế giới Việt Nam là một trong những nước sản xuất văcxin sống

giảm ñộc lực, sản xuất trên tế bào thận khỉ tiên phát, vacxin ñảm bảo yêu cầu: An toàn - Hiệu lực

Sự an toàn của vacxin ñược kiểm tra và ñánh giá theo tiêu chuẩn quy ñịnh của Tổ chức Y Tế Thế giới Việc ñánh giá chất lượng văcxin ñược chuyển từ các thử nghiệm trong phòng thí nghiệm sang ñánh giá trên người ñã ñánh dấu một bước quan trọng trong lĩnh vực phát triển văcxin Tổ chức y tế Thế giới ñã từng có những khuyến cáo về khả năng xảy ra “sự cố” khi virus bại liệt hoang dại xâm nhập các nước Bởi vì, virus ñược phân bố ở mọi nơi, ở nguồn nước, trong thực phẩm không

an toàn Chúng cũng có thể có ở người sống ở vùng dịch di chuyển ñến Việt Nam

ñã ñạt ñược các tiêu chuẩn khắt khe và ñược WHO công nhận là Quốc gia thanh toán ñược bệnh bại liệt từ năm 2000 Nhưng chúng ta cũng không chủ quan và cần thiết ñề phòng về việc virus có thể xâm nhập Hiện nay, không có phương pháp nào cho phép chữa trị bệnh lý này và chỉ có tiêm phòng văcxin là hiệu quả nhất Từ trước ñến nay, chúng ta vẫn có chương trình cho trẻ uống văcxin phòng bại liệt hàng năm Tất cả các trẻ dưới 5 tuối và toàn bộ trẻ ở vùng có nguy cơ cao (giáp biên giới)

sẽ ñược uống ñủ 2 liều văcxin phòng bại liệt Hàng năm Chương trình tiêm chủng

mở rộng ñặt hàng với Trung tâm Nghiên cứu, Sản xuất Văcxin và Sinh phẩm Y tế số lượng 8.000.000 – 10.000.000 liều, chất lượng ổn ñịnh, hiệu quả

Vì vậy, trên cơ sở khoa học của việc sản xuất và kiểm nghiệm vacxin bại liệt,

chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài:

“Nghiên cứu sản xuất kháng thể Bại liệt trên thỏ và ñánh giá tính an toàn

của văcxin Bại liệt trong phòng thí nghiệm”

1.2 Mục ñích của ñề tài:

- Sản xuất kháng thể Bại liệt trên thỏ

- Xác ñịnh tính an toàn của vacxin bại liệt sản xuất tại Việt Nam năm 2000-

2006 trong phòng thí nghiệm

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bệnh bại liệt do virus

Virus gây bệnh bại liệt có tên khoa học là Polio, ở người nó ñược gọi là Polio virus Hominis Gọi là virus bại liệt hoang dại ñể chúng ta phân biệt virus gây bệnh bại liệt ở người với virus bại liệt dùng ñể sản xuất văcxin ñã ñược làm giảm ñộc lực Virus này lây qua ñường tiêu hoá Khi vào cơ thể, nó sẽ ở ruột Nếu không có kháng thể chống ñỡ, Polio tiếp tục vào máu, lên não, phá hỏng tế bào thần kinh gây liệt các

cơ tương ứng như chân, tay Nặng nề hơn, nó có thể gây liệt cơ hô hấp Với trường hợp liệt cơ hô hấp, tỷ lệ tử vong rất cao Năm 1959, nước ta ñã từng xảy ra dịch bại liệt rất nặng nề Bệnh có thể lây từ người sang người qua ñường tiêu hoá, qua thức

ăn nhiễm virus bại liệt Do vậy, việc giữ vệ sinh ăn uống là rất quan trọng cho phòng bệnh

Bệnh bại liệt do Polio virus là một bệnh nhiễm cấp tính rất nguy hiểm cho trẻ

em Bệnh có thể gây hậu quả liệt cơ vận ñộng ñể lại di chứng suốt ñời, ñặc biệt nghiêm trọng nếu như gây liệt hô hấp có thể ñe dọa ñến tính mạng Bệnh do 3 týp virus khác nhau gây ra: Týp I, Týp II, Týp III, phổ biến nhất là týp I nó giữ vai trò chính trong việc gây bệnh bại liệt

Hình 1 Hình ảnh của virus Bại liệt

2.2 Lịch sử phân bố

Virus bại liệt ựược phát hiện từ năm 1909 bởi Landsteiner và Popper ựã tiến hành thắ nghiệm tiêm dịch tủy sống của một trẻ bi chết vì bại liệt vào não khỉ Từ trước những năm 1950, việc nghiên cứu còn chậm do chưa tìm ra phương pháp ựơn giản ựể thắ nghiệm Từ sau năm 1950 cùng với những tiến bộ vượt bậc về virus học

và kắnh hiển vi ựiện tử, phương pháp XQuang phóng xạ ựã cho phép xác ựịnh ựược hình thái cấu trúc của Virus bại liệt [5], [8], [10], [17], [19]

Theo thông báo của WHO, Bệnh bại liệt có mặt ở khắp mọi nơi chiếm khoảng 70% số trẻ trên Thế giới sống trong vùng có dịch bại liệt lưu hành

để bảo vệ thành quả này, chương trình tiêm chủng mở rộng vẫn tiếp tục cung cấp văcxin cho trẻ dưới 1 tuổi (uống 3 liều trong những tháng ựầu ựời) uống nền phòng bệnh Tuy nhiên, trước tình hình dịch bại liệt tái xuất ở các nước đông Nam Á như Indonesia - một nước ựã thanh toán ựược bệnh này 10 năm nay và vẫn duy trì tiêm chủng mở rộng - Bộ y tế nhận ựịnh rằng nguy cơ xảy ra ựiều tương tự ở Việt Nam là khá cao Theo khuyến cáo của Tổ Chức Y tế Thế giới, từ nay ựến 2010 tất cả các nước phải sử dụng vacxin bại liệt cho trẻ em (kể cả giảm ựộc lực hoặc bất hoạt)

2.4 đặc ựiểm virus bại liệt

2.4.1 Phân loại virus

Virus bại liệt có tên là virus Polio Virus Polio là thành viên của nhóm virus ựường ruột thuộc họ Picornaviridae Họ này gồm 3 nhóm: Nhóm Enterovirus, Nhóm Rhinovirus và các virus ựường ruột chưa ựược xếp loại [66], [71], [73], [82]

Trong nhóm Enterovirus bao gồm:

- Virus bại liệt: Týp 1, týp 2, týp III

- Virus Coxsakie A: Từ A1 – A24 (không có A23)

- Virus Coxsakie B: Từ B1 – B6

- Virus Echo ở người: Từ 1- 34 (không có Echo 10 hoặc 28)

- Một vài virus ñường ruột khác: Từ 68 – 71

Virus bại liệt ñược coi là thành viên quan trọng nhất trong nhóm này Virus bại liệt bao gồm 3 týp kháng nguyên [58], [66], [73], [84], [95]

- Týp I: Tên gọi là Brunhilde với chủng ñại diện Mahoney (USA) và 1942

(Vi ện Pasteur Paris)

- Týp II: Chủng gốc là Lansing với chủng ñại diện là MEF và 1523 (Viện

và từng vùng ñịa lý

2.4.2 Hình thái cấu tạo

Hình 2 Hình ảnh minh hoạ virus

bại liệt

Dưới kính hiển vi ñiện tử, virus bại liệt có dạng hình cầu, cấu trúc 20 mặt [70], [81] ñường kính khoảng 27 – 30 ηm, không vỏ, trọng lượng phân tử 6,8 x 106 Dalton, bao gồm 1 protein capsit có cấu trúc bền vững bao bọc lấy ARN của virus Capsit bao gồm 60 tiểu ñơn vị giống hệt nhau xếp ñối xứng 20 mặt, mỗi tiểu ñơn vị ñược cấu tạo gồm 4 chuỗi polipeptid là: VP1, VP2, VP3 và VP4 [81], [97]

Bằng phương pháp nhiễm xạ tia X người ta ñã biết ñược cấu trúc chi tiết của hạt virion Polio hoàn chỉnh Các chất hoạt mạch trên bề mặt của virion ñược cấu thành bởi polypeptid VP1, VP2, VP3, trong khi ñó VP4 nằm hoàn toàn bên trong hạt virus [70], [86] Virus bại liệt có cấu trúc không gian 3 chiều, hình ña diện, có 3 cạnh ñối xứng nhau

2.4.3 Tính chất hóa học

Axit nucleic : Là ARN sợi ñơn dương, trọng lượng phân tử ≈ 2,5 x 106 Dalton, chiều dài 2,4 µl cuộn lại nằm trong vỏ capsid [12], [38], [46], [52], [60], [64], 1 polypeptid nhỏ (VPg) gắn vào ñầu cuối 5’, còn ñầu 3’ bị polyadenyl hóa ARN của virus ñược phân thành 3 vùng chủ yếu [70], [81]:

Vùng không phiên dịch ñầu 5’ Vùng không phiên dịch ñầu 3’

- ðầu 5’ bao gồm 740 bazơ chiếm khoảng 10% vật liệu di truyền

- ðầu 3’ bao gồm 70 bazơ chiếm khoảng 1% vật liệu di truyền

Khung ñọc mở bao gồm 6635 nucleotide, chiếm khoảng 89% vật liệu di truyền ðây là trung tâm di truyền của virus Còn ñầu 5’ có liên quan ñến ñộc lực thần kinh và tính ổn ñịnh của virus [32], [33], [34], [35], [36], [42], [43], [44]

ARN của virus hoạt ñộng như một ARN thông tin (mARN) cho quá trình tổng hợp protein của virus, ñầu tiên là sự tổng hợp polyprotein lớn có trọng lượng phân

tử 246 kDa, polyprotein lớn này tách thành 3 protein trung gian (P1, P2, P3) do tác dụng của men proteaza, là các protein chức năng của virus

Protein trung gian P1 sẽ tổng hợp nên protein cấu trúc (VP1, VP2, VP3 và VP4) Protein trung gian P2 và P3 sẽ tổng hợp nên protein không cấu trúc (2A, 2B,

Khoảng 7.450 bazơ

Vùng phiên dịch

2C, 3AB, 3C, 3D)

Protein 2A và 3C có chức năng như men proteaza của virus

Protein 3D là enzym polymeaza phụ thuộc ARN có chức năng sao chép ARN của virus theo ñường sợi trung gian nhạy cảm âm

Các protein:

Protein của virus bại liệt bao gồm 4 loại từ VP1 ñến VP4

VP1 bao gồm 306 axit amin có trọng lượng phân tử 34 kDal

VP2 bao gồm 272 axit amin có trọng lượng phân tử 30 kDal

VP3 bao gồm 238 axit amin có trọng lượng phân tử 26 kDal

VP4 có trọng lượng phân tử 7 kDal bao gồm 69 axit amin [37], [45]

Trong ñó VP1, VP2, VP3 tạo nên cấu trúc bề mặt của virus, còn VP4 nằm trong

vỏ capsid và liên kết với axit nhân (ARN) Các protein bề mặt tạo nên các vị trí kháng nguyên trung hòa: 1, 2, 3 a và 3 b [60], [61], [80], [81] Ngoài ra vỏ capsid còn có tác dụng bảo vệ axit nhân và quyết ñịnh khả năng hấp thụ của virus lên bề mặt tế bào thông qua các thụ thể ñặc hiệu [7], [14], [16]

Lipid:

Virus bại liệt không chứa lipid ðây là loại virus trần không có vỏ lipid Do ñó,

nó không bị tác ñộng bởi ether, cồn, phenol 1% và các thuốc tẩy thông dụng [5], [7], [10], [12], [14], [16] Dựa vào tính chất này, người ta ñã sử dụng clorofom ñể xử lý bệnh phẩm trước khi phân lập virus mà không làm mất ñi hoạt tính của virus [4], [15], [17]

vào tính chất này ở Việt Nam ñã sử dụng MgCl2 làm tăng sức bền của văcxin sống giảm ñộc lực

Virus bại liệt bị bất hoạt bởi tia cực tím và ñông khô [71], [82] Vì vậy, người ta không sử dụng phương pháp ñông khô ñể bảo quản virus, ñồng thời trong khi nuôi cấy virus cũng không ñược bật ñèn tím

2.4.4 Cấu tạo của kháng nguyên

Kháng nguyên của hạt virus hoàn chỉnh có khả năng gây nhiễm trùng gọi là kháng nguyên D (hoặc còn gọi là kháng nguyên N) Khi hạt virus bị ñun nóng ở 500C –

600C thì hình thái của hạt virus bị thay ñổi và kháng nguyên D trở thành kháng nguyên C (hoặc còn gọi là kháng nguyên H) [5], [7], [10], [11], [12], [14], [16], [19], [21], [71] Kháng nguyên D có hằng số lắng là 160S, còn kháng nguyên C có hằng số lắng là 80S – 90S [7], [11], [14], [16], [19], [21] Kháng nguyên D là hạt virus hoàn chỉnh bao gồm cả ARN và vỏ capsid, còn kháng nguyên

C chỉ là vỏ capsid không có axit nhân và VP4 Kháng nguyên D và C không có phản ứng miễn dịch chéo, hai kháng nguyên này ñược phát hiện bằng phản ứng kết hợp bổ thể và phản ứng miễn dịch kết tủa trên gel

Kháng nguyên D có chức năng tạo ra kháng thể trung hòa ñặc hiệu týp Ngoài ra,

nó còn có chức năng quan trọng khác là bám vào các thụ thể (Receptor) của tế bào

cảm thụ [70], [81] Nhờ có chức năng này mà virus có thể xâm nhập vào bên trong

tế bào cảm thụ ñể nhân lên, vận dụng chức năng này mà người ta sản xuất văcxin bằng phương pháp nuôi cấy trên tế bào cảm thụ Trong sản xuất văcxin từ nuôi cấy

tế bào ñã tạo ra số lượng lớn, chủ yếu là kháng nguyên D Chính kháng nguyên D này là chỉ số ñể ñánh giá hiệu lực của văcxin bại liệt bất hoạt [78], [89] dựa vào ñơn

vị kháng nguyên D

Kháng nguyên C là kháng nguyên chung cho tất cả các týp [70], [81], nó kích thích cơ thể tạo ra kháng thể kết hợp bổ thể [5], [10], [12] Nếu dùng kháng nguyên này ñể chế tạo huyết thanh thì sẽ không thu ñược kháng thể trung hòa [7], [11], [14], [16], [19], [21]

Khi cơ thể bị nhiễm virus bại liệt sẽ tạo kháng thể trung hòa và kháng thể kết hợp bổ thể Ở giai ñoạn cấp, huyết thanh bệnh nhân phản ứng mạnh với kháng nguyên C Kháng nguyên D kích thích cơ thể tạo kháng thể ở giai ñoạn muộn hơn

và tồn tại lâu trong máu [5], [7], [10], [11], [12], [14], [16], [19], [21]

2.4.5 Tính chất miễn dịch học

Miễn dịch thụ ñộng ñược truyền từ mẹ sang con Kháng thể này chỉ xuất hiện ở trẻ sơ sinh, sau ñó giảm dần và biến mất khi trẻ ñược 6 tháng tuổi [10], [87], [98] Miễn dịch chủ ñộng là sự ñáp ứng miễn dịch khi cơ thể bị nhiễm virus tự nhiên hoặc do dùng văcxin ðây là loại miễn dịch quan trọng mà loài người ñã biết ứng dụng ñể phòng bệnh bằng cách dùng văcxin Khi cơ thể bị nhiễm virus bại liệt tự nhiên hay dùng văcxin, cơ thể sẽ tạo ra miễn dịch ñặc hiệu chống lại sự xâm nhập của virus vào cơ thể Kháng thể ñặc hiệu chủ yếu là miễn dịch dịch thể bao gồm các loại Ig miễn dịch như: IgM, IgG, IgA và IgA

Những người bị thiếu hụt miễn dịch, khi bị nhiễm virus bại liệt (kể cả virus văcxin Sabin ñều có nguy cơ mắc bệnh bại liệt [11], [19], [21] Chính vì vậy mà văcxin Sabin bị chống chỉ ñịnh ñối với những người này Còn ñối với văcxin IPV vẫn có thể dùng ñược khi người ñó có nguy cơ mắc bệnh cao

Một số yếu tố làm giảm khả năng miễn dịch tại chỗ như: những người cắt bỏ tuyến giáp và tuyến hạnh nhân [11], [19], [21] Ở trong một số vụ dịch người ta thấy

trẻ em dưới 5 tuổi, phụ nữ có thai, trẻ suy dinh dưỡng có tỷ lệ mắc bệnh cao hơn [19], [28], [33], [86], [97]

* Sự nhân lên của virus bại liệt trong tế bào cảm thụ:

Bệnh bại liệt ñược mô tả sớm, năm 1840 Hein chứng minh và xếp bại liệt thành một bệnh riêng biệt Năm 1949 Ender, Weller và Robbins ñã phát hiện ñược virus bại liệt có thể nhân lên trên tế bào bào thai người và tế bào thận khỉ Bệnh bại liệt là một nhiễm trùng ñường ruột cấp tính do virus gây ra Virus bại liệt ñặc biệt gây tổn thương các tế bào sừng trước tuỷ sống và các tế bào vận ñộng của thần kinh trung ương [11, 12]

Hình 3 Nuôi cấy tế bào thận khỉ tiên phát

Nuôi cấy tế bào giữ một vai trò quan trọng trong nghiên cứu virus bại liệt

Tế bào ñược sử dụng ñể phân lập, ñịnh týp, chuẩn ñộ hiệu giá và xác ñịnh tính kháng nguyên của virus ðặc biệt tế bào còn ñược sử dụng ñể sản xuất văcxin bại liệt [11], [12]

Sự nhân lên của virus trong tế bào ñã ñược biết ñến từ năm 1913 Người ta dựa vào ñặc tính ưa thần kinh của virus mà các nhà nghiên cứu ñề nghị dùng mô não, tủy ñể phân lập virus Năm 1949 Enders ñã thành công trong việc nuôi cấy virus bại liệt trên tế bào mô của ñộng vật có vú ở trong phòng thí nghiệm [19],[28], [33], [78], [89] Năm 1954 với các công trình nghiên cứu ông ñã khẳng ñịnh virus bại liệt có khả năng nhân lên trong tế bào mô

Có hai loại tế bào nhạy cảm với virus bại liệt là:

• Dòng tế bào thường trực

• Dòng tế bào tiên phát

Tế bào thường trực là loại tế bào có thể tách nhiều lần mà không ảnh hưởng ñến virus bại liệt, ñó là HEP2C (có nguồn gốc từ tế bào ung thư biểu mô thanh quản của người)

Tế bào tiên phát (hay còn gọi là tế bào Vero, có nguồn gốc từ thận khỉ xanh Châu Phi)

Tế bào tiên phát là dòng tế bào tách trực tiếp từ mô ñộng vật như: Thận khỉ, thận thỏ, Tế bào thận khỉ tiên phát nhạy cảm nhất với virus bại liệt, dựa vào tính chất này mà các nhà nghiên cứu ñã sử dụng thận khỉ tiên phát ñể sản xuất văcxin sống giảm ñộc lực Tế bào HEP2C ñược sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm ñể phân lập virus bại liệt và kiểm tra hiệu giá của văcxin ñơn týp, ña týp (ñặc biệt là HEP2C do Tổ chức y tế Thế giới cung cấp [86], [97]

* Quá trình nhân lên của virus bại liệt trong tế bào:

Virus bại liệt chứa vật liệu di truyền là ARN sợi dương Quá trình nhân lên của chúng có một số ñặc ñiểm khác với các loại virus khác là:

- ARN của virus khi vào trong tế bào sẽ hoạt ñộng như ARN thông tin

- Quá trình này bao gồm 5 giai ñoạn:

1 Hấp phụ và xâm nhập

2 Hủy hoại capsid virus

3 Tổng hợp axit nucleic và protein capsid

4 Lắp ráp virus

5 Giải phóng virus

2.4.6 Khả năng gây bệnh thực nghiệm

Năm 1909, lần ñầu tiên con người gây bệnh thực nghiệm ñối với bệnh bại liệt do Landsteiner và Poper thực hiện Năm 1950, khỉ là ñộng vật duy nhất dùng ñể phân lập virus bại liệt [4], [15], [17] và các thử nghiệm có liên quan ñến virus bại liệt Có rất nhiều loại khỉ nhạy cảm với virus bại liệt như: Loài tinh tinh, Khỉ Macacus rhesus, Cynomolgus, Cercopithecus, [5], [10], [12] ðường gây nhiễm là ñường não hoặc tủy sống (Riêng loài tinh tinh có thể gây nhiễm bằng ñường uống [11], [19], [21] Thời gian ủ bệnh dài hay ngắn là khác nhau tùy thuộc vào các loài khác nhau và ñường gây nhiễm Thường là từ 15 – 25 ngày sau gây nhiễm [83], [94] Triệu trứng lâm sàng giống như bệnh bại liệt ở người Xét nghiệm giải phẫu bệnh lý

tổ chức não và tủy sống cho thấy hình ảnh tổn thương ñiển hình Các tế bào thần kinh vận ñộng bị phá hủy Các chất nhiễm sắc thể bị ly giải, thể Nissl bị biến mất trong bào tương của tế bào thần kinh Ngoài ra còn có hiện tượng thực bào tế bào thần kinh bởi thực trạng viêm nhiễm Các bạch cầu ñơn nhân tập trung xung quanh các mao quản Những tổn thương mạnh mẽ và rất ñặc hiệu thường thấy ở sừng trước tủy sống ðể ñánh giá mức ñộ tổn thương do virus bại liệt, người ta giải phẫu con vật, quan sát các tổn thương ở não, hành tủy, tủy sống, các hạch thần kinh, Ngày nay, khỉ vẫn ñược dùng làm súc vật thí nghiệm [31], [33], [40], [41], [48], [57], [65], [72] Trung tâm Nghiên cứu, Sản xuất Văcxin và Sinh phẩm Y tế ñã dùng khỉ Macaca Mulatta ñể kiểm tra tính an toàn của văcxin [2], [4]

2.4.7 Sự biến ñổi vật liệu di truyền của virus bại liệt

Cũng giống như virus chứa ARN khác, vật liệu di truyền của virus bại liệt có một tỷ lệ ñột biến nhất ñịnh Người ta nhận thấy các virus nhân lên trong cùng một

tế bào cũng không hoàn toàn ñồng nhất về mặt di truyền [47], [55], [58], [66], [77], [88] Sự so sánh các vùng vật liệu di truyền bằng kỹ thuật PCR – RFLP ñã cho thấy các chủng phân lập ñược ở các vùng khác nhau hoặc ở các thời ñiểm khác nhau có các kiểu gen khác nhau

Sự phát triển nhanh của virus bại liệt trong tự nhiên dẫn ñến sự biến ñổi của vật liệu di truyền [31], [33], [41] Tuy nhiên sự biến ñổi này không ñều nhau ñột biến hay xảy ra ở vùng không mã hóa ñầu 5’ từ 90 nucleotid nằm sát khung ñọc mở là bền vững [12] Trong vùng ñọc mở, gen mã hóa cho protein VP1 có khả năng biến ñổi cao, nhưng những vùng mã hóa cho các protein không cấu trúc thì bền vững hơn [13], [22], [24], [90]

2.5 Bệnh bại liệt ở người

Bệnh bại liệt xâm nhập vào cơ thể qua ñường tiêu hóa và nhân lên tại ruột, tại các tổ chức lâm ba kế cận, chúng xâm nhập chủ yếu ở các nơron vận ñộng gây nhiễm trùng thể ẩn ( Bên ngoài không có biểu hiện gì, ở tình trạng người lành mang virus chiếm 99%) Nếu xâm nhập mạnh có thể gây bệnh nhẹ, làm cho bệnh nhân bị

sốt, khĩ chịu, buồn ngủ, đau đầu, buồn nơn, táo bĩn, đau bụng và kèm các triệu chứng khác, bệnh nhân tự hồi phục sau vài ngày Nếu bị nặng sẽ trở nên trầm trọng: Biểu hiện là bệnh viêm màng não vơ khuẩn, ở trường hợp này khĩ chẩn đốn vì virus bại liệt khơng phải là tác nhân duy nhất gây bệnh mà cịn cĩ các tác nhân khác, đặc biệt là thành viên các nhĩm virus đường ruột [19], [26] Bệnh nhân cĩ một vài triệu chứng của bệnh, kèm theo đau bụng và cứng cơ Bệnh kéo dài từ 2 – 10 ngày, sau đĩ hồi phục hồn tồn

2.5.1 ðặc điểm lâm sàng

Hình 4 Biểu hiện sốt li bì Hình 5 Bệnh cĩ thể gây tàn phế

suốt đời

Thơng thường khoảng 1% với các triệu chứng sau:

- Thời kỳ ủ bệnh: Kéo dài từ 7- 14 ngày, cĩ khi kéo dài đến 35 ngày mà khơng

Ngồi ra mức độ gây tổn thương của virus bại liệt đối với hệ thần kinh trung ương mà cĩ biểu hiện khơng điển hình đặc biệt khác:

Thể liệt cơ hơ hấp: Thường gặp ở người lớn, dễ gây tử vong

Thể liệt các dây thần kinh khác: Dây thần kinh sọ não, hay gặp là nhĩm dây 7 dẫn đến liệt mặt hoặc liệt các cơ vận nhãn

ðiều trị:

- Hiện nay chưa cĩ phương pháp điều trị đặc hiệu Chủ yếu là điều trị nâng đỡ Bệnh nhân bất động hồn tồn, dùng thuốc để tăng thể trạng Trong giai đoạn cấp của bệnh khơng được can thiệp bằng tiêm hoặc châm cứu

- ðiều trị phục hồi chức năng là vấn đề rất quan trọng, nhằm hồi phục từng phần hoặc hồn tồn di chứng bại liệt

2.5.2 Chẩn đốn phịng thí nghiệm

Phân lập bệnh phẩm được thực hiện như sau:

*Bệnh phẩm: Phân, nước ngốy họng của bệnh nhân liệt mềm cấp

Não của bệnh nhân chết khơng quá 6 – 8 giờ

Thời gian lấy bệnh phẩm tốt nhất đối với bệnh nhân cịn sống là 1 – 2 tuần sau khi bị nhiễm bệnh, sau đĩ gây nhiễm trên tế bào [1], [12]

*Tế bào dùng phân lập virus: Tế bào thận khỉ tiên phát và tế bào HEP2C để

phân lập virus Khi gây nhiễm virus phát triển trên tế bào cảm thụ và gây hủy hoại hồn tồn tế bào trong vài ngày Biểu hiện: Tế bào co lại, tách khỏi chai nuơi cấy [28], [76]

*ðịnh týp virus phân lập được: Sau khi gây nhiễm, cần xác định xem týp nào

gây bệnh, dựa vào kháng thể đặc hiệu và phương pháp trung hịa kháng nguyên Virus bại liệt phân lập được gồm 3 týp là: TýpI, týp II, týp III, mỗi týp tương ứng với kháng thể đặc hiệu của týp đĩ

Dựa vào kháng thể đặc hiệu, áp dụng phương pháp trung hịa kháng nguyên, người ta tìm ra virus phân lập được là týp nào trong 3 týp bại liệt hoặc khơng phải là virus bại liệt [12], [69], [81]

Virus bại liệt phân lập được cĩ thể là virus bại liệt hoang dại hoặc virus bại liệt

văcxin ðể phục vụ chương trình thanh tốn bại liệt, Tổ chức Y tế Thế giới yêu cầu các phịng thí nghiệm xác định virus phân lập được để xác định xem là virus bại liệt hoang dại hay virus bại liệt Sabin, hiện nay phịng thí nghiệm cĩ 2 phương pháp:

Phương pháp kháng thể đơn dịng

Phương pháp sinh học phân tử

Kháng thể đơn dịng được sản xuất từ tế bào lai cĩ nguồn gốc từ tế bào lympho miễn dịch Kháng thể đơn dịng nhận biết được một kháng nguyên và một axit amin thay đổi Kháng thể đơn dịng týp 1 được đánh số từ 1 – 16, týp 2 từ 21 – 26 và týp III từ 31 – 36 Kháng thể 11, 12, 15 khơng trung hịa với virus týp 1 hoang dại, kháng thể 24 khơng tác dụng với virus týp 2 hoang dại, kháng thể 33 và 34 khơng phản ứng với virus týp III hoang dại [78]

Phương pháp sinh học phân tử cịn gọi là phản ứng chuỗi men polymeraza (PCR) do Kary Mullis đề ra năm 1985 và nhanh chĩng được áp dụng trong nhiều nghiên cứu y sinh học khác nhau, để đo độ nhạy và khả năng khuyếch đại rất lớn của nĩ [66], [78] Phương pháp PCR cho phép nghiên cứu vùng vật liệu di truyền VP1 bao gồm 480 bazơ hay thay đổi và phân biệt được virus hoang dại hay virus liên quan đến văcxin [34], [52]

*Chẩn đốn phân biệt: Cần cĩ các chuyên gia đầu ngành về thần kinh Trên

lâm sàng, bệnh bại liệt thường được phân biệt với:

* Nhiễm các virus đường ruột khơng phải là virus bại liệt nhưng cĩ khả năng gây liệt như: virus ECHO và virus Coxsackie

* Liệt giả: Bị viêm dây thần kinh thứ phát do tiêm bắp

* Hội chứng Grullain Barre: Viêm dây thần kinh chấn thương, viêm tủy cắt ngang [27], [28]

* Chấn thương do ngã hoặc tai nạn xe cộ

2.6 Tiêu chuẩn Việt Nam về phương pháp kiểm tra tính an tồn của văcxin phịng bại liệt

Nguyên tắc: Phải kiểm tra tính an tồn ở tất cả các cơng đoạn của quy trình sản

xuất theo tiêu chuẩn của Tổ Chức Y Tế Thế Giới

Bản chất của văcxin chính là virus và các thành phần ñược tách chiết từ chúng như: ñộc tố Polysaccharides, enzyme, chất ngưng kết hồng cầu (hemaglutinin), ñã ñược làm bất hoạt hoặc giảm ñộc lực, nhưng vẫn còn có tác dụng kích thích cơ thể tạo ra kháng thể ñặc hiệu chống lại tác nhân gây bệnh ðây là thành phần chủ yếu của văcxin ñược gọi là kháng nguyên Như vậy, văcxin phải ñảm bảo an toàn (nghĩa

là không còn gây bệnh và tai biến), ñồng thời phải có hiệu lực (nghĩa là phải có khả năng kích thích cơ thể sản sinh kháng thể thích ứng ñặc hiệu trong huyết thanh và bảo vệ cơ thể không bị mắc bệnh ñó khi bị nhiễm tác nhân Xuất phát từ yêu cầu ñó, một chế phẩm sinh học sau khi ñược chế tạo ñể sử dụng phòng bệnh cho người cần ñảm bảo an toàn và hiệu lực

Phương pháp ñánh giá tính an toàn và hiệu lực của văcxin:

Chủng virus bại liệt: Chủng virus bại liệt dùng trong sản xuất văcxin bại liệt (uống) phải ñược xác minh bởi hồ sơ lý lịch, bao gồm thông tin về nguồn gốc của chủng và các phương pháp sử dụng ñể làm giảm ñộc lực Chỉ những chủng ñã ñược

cơ quan Kiểm ñịnh Quốc gia chấp thuận, mới ñược dùng

Hệ thống giống virus : Sản xuất văcxin phải dựa trên hệ thống giống virus Giống virus dùng ñể sản xuất văcxin phải là giống dùng ñể chế văcxin gốc hay hệ thống giống virus chế, từ ñó theo phương pháp và ở lần cấy truyền từ chủng gốc virus ñã ñược chấp thuận bởi cơ quan Kiểm ñịnh Quốc gia Giống virus phải ñược chế từ nuôi tế bào thận khỉ với những ñiều kiện thoả mãn những ñòi hỏi về ñộng vật sạch cần ñể sản xuất văcxin và chế phẩm sinh học Một lượng lớn giống virus cần

ñể riêng ra coi như nguyên liệu cơ bản mà người sản xuất sẽ dùng ñể sản xuất các

mẻ văcxin Tất cả các giống virus phải bảo quản ở nhiệt ñộ dưới – 600C

Khỉ dùng sản xuất văcxin phải ñược kiểm tra và thử nghiệm cẩn thận, phải ñược duyệt bởi Cơ quan Kiểm ðịnh Quốc Gia Khỉ phải có tình trạng sức khỏe tốt, không ñược dùng cho các thí nghiệm trước ñó Khỉ phải ñược nuôi trong chuồng ñủ tiêu chuẩn về vệ sinh và an toàn, thông thoáng, cách xa nơi sản xuất Phải ñược kiểm tra

các tiêu chuẩn ñánh giá mức ñộ sạch dành cho sản xuất như: Không có kháng thể kháng virus SV40, không có virus gây suy giảm miễn dịch ở khỉ (SIV), không có kháng thể kháng virus Foamy, không có kháng thể bại liệt và không bị nhiễm vi khuẩn lao Khỉ ñược nuôi cách ly trong thời gian 6 tuần trước khi sử dụng, chuồng nuôi phải ñảm bảo luôn luôn sạch sẽ chống lây nhiễm

Kiểm tra nuôi cấy tế bào sử dụng cho sản xuất văcxin: Vào ngày gây nhiễm virus, mỗi loại tế bào nuôi cấy nên ñược kiểm tra về sự hủy hoại gây nên bởi một tác nhân ngoại lai nào thì toàn bộ mẻ nuôi cấy ñó không ñược dùng ñể sản xuất văcxin

Mẫu nước nổi của nuôi cấy tế bào phải ñược kiểm tra trên nuôi cấy thận khỉ cùng loài, nhưng không phải cùng một con khỉ ñó (kiểm tra trên tế bào cùng loài khác)

2.7 Văcxin phòng bệnh bại liệt

Văcxin, dù ở bất kỳ dạng tồn tại nào, cho dù ñó là văcxin nguyên thể, tức là văcxin chứa nguyên vẹn cả tế bào vi sinh vật, hay văcxin phân tử, tức là văcxin ñơn thuần chỉ chứa những thành phần protein có tính kích thích miễn dịch, ñều mang một chức năng chung là tạo miễn dịch cho cơ thể người và ñộng vật, phòng chống lại các bệnh truyền nhiễm và nhiều tác nhân gây hại khác

Nói ñến văcxin, phải nói ñến yếu tố quyết ñịnh tính miễn dịch của chế phẩm ñược chọn làm văcxin ñó Yếu tố quyết ñịnh tính miễn dịch chính là thành phần protein ñặc biệt có trên bề mặt của tác nhân gây bệnh, hay trên bề mặt của chế phẩm văcxin của chính tác nhân gây bệnh ñó [11]

Thành phần ñặc biệt có bản chất là protein này ñược gọi là kháng nguyên (Antigene), do một gene hay một số gene của vi sinh vật quyết ñịnh tổng hợp nên Những gene chịu trách nhiệm về việc sản xuất thành phần protein có tính kích thích miễn dịch ñược gọi là gene kháng nguyên Gen kháng nguyên này, về nguyên tắc,

có thể ñược tách ra, và ghép vào một hệ thống vector thích ứng nào ñó, sử dụng ñể biểu thị sản xuất protein của gene kháng nguyên ñó ñể làm văcxin Tất cả phải ñược

lựa chọn phù hợp, mới có thể thu ñược protein có tính kích thích miễn dịch mong muốn ban ñầu như protein nguyên gốc Protein tái tổ hợp ñược sản xuất ra, nhiều khi vẫn có thể có tính kháng nguyên và miễn dịch, nhưng không còn là văcxin chống lại tác nhân gây bệnh cần phòng trừ Những văcxin ñược tạo ra bằng kỹ thuật gene như thế này (nghĩa là chịu sự thao tác trực tiếp về gene), ñược gọi là văcxin tái

tổ hợp gene, hay vắn tắt là văcxin công nghệ gene Thành phẩm văcxin thuộc loại này ñược coi là văcxin thế hệ mới Những văcxin thuộc thế hệ cũ, là các loại văcxin tạo ra bằng các phương pháp cổ ñiển (truyền thống) ðể ñược là văcxin, thành phẩm

ñã bị biến ñổi về bản chất (và cả về gene) nhưng không chịu sự thao tác trực tiếp

Dù thế nào chăng nữa, văcxin cổ ñiển hay văcxin thế hệ mới, nếu ñược ñịnh nghĩa về góc ñộ miễn dịch thì văcxin phải là các chế phẩm sinh học của vi sinh vật hay tế bào, chứa chính tác nhân gây bệnh hay các sản phẩm của chúng (kể cả vật liệu di truyền), nếu ñược làm giảm ñộc lực hay vô ñộc bằng các phương pháp lý, hóa, hay sinh học (ñối với văcxin cổ ñiển), hoặc các phương pháp sinh học phân tử (ñối với văcxin thế hệ mới), lúc ñó chúng không còn khả năng gây bệnh ñối với ñối tượng ñược hưởng văcxin, nhưng khi ñưa vào cơ thể bằng các phương pháp khác nhau, ñều có khả năng kích thích cơ thể sinh miễn dịch thuộc các loại hình như miễn dịch dịch thể (humoral immunity) hay miễn dịch qua trung gian tế bào (cellular-mediated immunity) Như vậy nói ñến văcxin, là phải nói ñến khả năng gây miễn dịch Một thành phẩm nào ñó tuy là chế phẩm sinh học nhưng không gây miễn dịch bảo vệ cơ thể như mong muốn thì không ñược coi là văcxin [11], [12]

*ðiều kiện cần của một văcxin :

Một văcxin phải có ñủ 2 ñiều kiện chính: An toàn và có hiệu lực

An toàn: Là tiêu chuẩn ñánh giá khi sử dụng văcxin trên chính ñối tượng ñược hưởng,

tức là văcxin không ñược gây bệnh và không ñược chứa các tác nhân ngoại lai

Hiệu lực: ðiều quan trọng nhất là văcxin phải có hiệu lực, tức là văcxin phải kích

thích sinh miễn dịch cho cơ thể Tính hiệu lực thực chất là mức ñộ biểu hiện gây miễn dịch của kháng nguyên Văcxin có hiệu lực cao hay thấp, tức là nói ñến mức

ñộ gây miễn dịch của văcxin ñó

dịch: Miễn dịch dịch thể (Kháng thể) và miễn dịch tế bào (Tế bào lym pho T)

Ở Việt Nam hiện ñã và ñang sản xuất, sử dung văcxin cổ ñiển.Văcxin sống giảm ñộc lực, còn ñược gọi là văcxin Sabin ñược sản xuất trên tế bào thận khỉ tiên phát hoặc tế bào thận khỉ thứ phát (Vero) Chủng của 3 týp dùng ñể sản xuất văcxin Sabin ñược nhận từ chủng giảm ñộc do Sabin cấy truyền và cải tạo từ chủng virus hoang dại ðây là văcxin sử dụng rộng rãi trong chiến lược thanh toán bại liệt [23], [30], [34], [36], [38], [44]

Một số yếu tố trong sản xuất ảnh hưởng ñến chất lượng văcxin

Có 3 dòng tế bào ñược sử dụng ñể sản xuất OPV hiện nay [10], [81], [89], ñó là:

Tế bào thận khỉ tiên phát, Tế bào lưỡng bội người (MRC-5 hay W38) và Tế bào thường trực Vero Các yếu tố chủ yếu của quá trình sản xuất ảnh hưởng ñến chất lượng văcxin là nhiệt ñộ nuôi cấy virus và thời gian nuôi cấy virus Tế bào ñã gây nhiễm virus ñược nuôi cấy tại một nhiệt ñộ nhất ñịnh trong khoảng từ 330C – 340C

và virus ñược gặt trong khoảng thời gian không quá 96 giờ sau khi gây nhiễm [10], [88], [99] Một số yếu tố quan trọng khác trong quá trình sản xuất là ñộ kín của lớp

tế bào, tuổi của tế bào tại thời ñiểm gây nhiễm Tỷ lệ gây nhiễm virus, thành phần

và pH của môi trường nuôi cấy virus [12], [88], [99] Virus văcxin thu ñược từ tế

bào thận khỉ tiên phát hoặc tế bào người, được lọc để loại bỏ xác tế bào Virus văcxin thu được từ tế bào Vero cần phải tiến hành bổ sung các cơng đoạn tinh chế

để loại bỏ các thành phần khơng cần thiết của tế bào [12], [75], [85] Thơng thường một số mẻ gặt đơn của cùng một týp virus được trộn lại thành một loại văcxin bán thành phẩm

Tính bền vững của văcxin bại liệt sống uống giảm độc lực

Văcxin Bại liệt sống giảm độc lực ( Oral Polio vaccine - OPV)

OPV đã được sử dụng rộng rãi vì rất dễ sử dụng và giá thành rẻ OPV khơng chỉ tạo kháng thể trong huyết thanh mà cịn tạo ra kháng thể tại chỗ ở ruột và nĩ tạo

ra kháng thể bền vững giống như bị nhiễm virus trong tự nhiên

Tổ Chức Y Tế Thế Giới đã dùng OPV cho chương trình tiêm chủng mở rộng trên tồn Thế giới Khoảng trên 80% trẻ em dưới 1 tuổi trên Thế giới đã được gây miễn dịch cơ bản bằng OPV và virus bại liệt hoang dại đã khơng cịn cĩ thể hồnh hành gây đại dich được

Sự đáp ứng kháng thể của trẻ sơ sinh thấp hơn so với những trẻ lớn hơn Khoảng 70% số trẻ sơ sinh cĩ đáp ứng miễn dịch tại chỗ trong ống ruột và 30% đến 50% trẻ sơ sinh tạo được kháng thể trong máu đối với 1 hoặc 3 týp Nhưng những trẻ này sẽ tạo được miễn dịch đầy đủ trong những lần tiêm chủng tiếp theo

2.8 Nghiên cứu sản xuất kháng thể bại liệt

ðể chủ động nguồn nguyên liệu sẵn cĩ trong nước và hạ giá thành của sản phẩm

là một trong những hướng phát triển mà các cơ sở nghiên cứu và sản xuất văcxin cần nhắm tới Qua thực tế sản xuất văcxin bại liệt, việc xét nghiệm phân lập virus

để chẩn đốn xác định là rất cần thiết vì: ða số trẻ em nhiễm virus bại liệt khơng cĩ biểu hiện lâm sàng, 5% cĩ biểu hiện giống cảm cúm, bệnh nhi thường bị đau ở các chi sắp bị liệt và xuất hiện liệt mềm trong những ngày cuối của tuần đầu tiên Trong một số trường hợp cĩ thể liệt cơ hơ hấp gây suy hơ hấp và tử vong, cịn những trường hợp qua khỏi để lại di chứng liệt suốt đời ðể việc chẩn đốn xác định bệnh bại liệt thuận lợi, thì việc nghiên cứu sản xuất kháng huyết thanh là việc làm cần

thiết, các nghiên cứu sản xuất trên sẽ gĩp phần vào việc: Chẩn đốn nhanh chính xác bệnh để can thiệp sớm, việc nghiên cứu trong phịng thí nghiệm sẽ cĩ nhiều thuận lợi để thử nghiệm trung hịa độc tố, đào thải chúng ra ngồi Kháng huyết thanh cĩ nguồn gốc động vật, từ huyết thanh cĩ kháng thể chống bệnh Các huyết thanh này chứa rất nhiều kháng thể và gây được miễn dịch thụ động cho người dùng sau vài giờ, nhưng thời gian được miễn dịch ngắn khoảng 8 – 15 ngày sau khi tiêm Kháng huyết thanh là một sinh phẩm chứa các globuline miễn dịch đặc hiệu thu được bằng phương pháp tinh chế huyết thanh thơ, cĩ xử lý với enzyme và kết tủa phân đoạn trong muối ammonium sulfate cơ đặc bằng TFF và tẩy màu bằng acid Caprylic Chế phẩm được bảo quản bằng Merthiolate 1/10.000

3 ðỐI TƯỢNG, ðỊA ðIỂM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 3.1 ðỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

ðể thực hiện ñề tài: “Nghiên cứu sản xuất kháng thể bại liệt trên thỏ và ñánh giá tính an toàn của văcxin bại liệt trong phòng thí nghiệm”, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên các ñối tượng là:

Virus bại liệt chuẩn ñể sản xuất Văcxin do Viện Kitasato Nhật Bản cung cấp Văcxin bại liệt ñơn týp và văcxin bại liệt tam liên (có cả 3 týp I, II, III)

ðộng vật thí nghiệm (Khỉ tách tế bào, thỏ và chuột tiêm thử nghiệm,…)

Tế bào, môi trường và dụng cụ nuôi tế bào

3.2 ðỊA ðIỂM

Phòng Kiểm ñịnh TTNCSX văcxin và Sinh phẩm Y tế (135 Lò ñúc và 418 Vĩnh Hưng- Hà Nội)

Trại chăn nuôi khỉ ðảo Rều - Quảng Ninh

3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.3.1 Nghiên cứu sản xuất kháng thể bại liệt trên thỏ

3.3.1.1 Sản xuất kháng nguyên bại liệt

3.3.1.2 Tạo kháng thể bại liệt trên thỏ

3.3.1.3 Thu, xử lý và bảo quản huyết thanh thỏ

3.3.2 Xác ñịnh tính an toàn của văcxin bại liệt trong phòng thí nghiệm

3.3.2.1 Kiểm tra nguyên liệu ñầu (khỉ) dùng cho sản xuất tế bào

3.3.2.2 Kiểm tra tế bào dùng trong sản xuất văcxin

3.3.2.3 Kiểm tra an toàn văcxin bán thành phẩm

3.3.2.4 Kiểm tra 5 loạt văcxin tam liên sản xuất năm 2007

3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hiện nay, chúng tôi nghiên cứu sản xuất kháng thể bại liệt trên thỏ, dựa theo quy trình sản xuất văcxin bại liệt sống uống tại Trung tâm nghiên cứu sản xuất văcxin và Sinh phẩm y tế Quy trình ñang nghiên cứu và thực hiện có tham khảo tài liệu của nước ngoài

3.4.1 Sản xuất kháng thể bại liệt

3.4.1.1 Phương pháp sản xuất kháng nguyên bại liệt

Chủng giống tế bào ñược Viện nghiên cứu bại liệt Nhật Bản cung cấp, nuôi cấy trên tế bào thận khỉ sạch (chưa sử dụng cho các thử nghiệm nào, không nhiễm các loại virus do WHO ñề ra)

a) Nuôi cấy tế bào thận khỉ tiên phát trên chai roux 225 cm2

* Nuôi tế bào trên chai 225 cm2

- Ly tâm hỗn dịch tế bào ở 1500 vòng/ phút trong 5 phút, chắt bỏ nước nổi

- Lấy 30ml môi trường ñã pha ở trên cho từ từ vào tuýp ñể ñánh tan tế bào

- Hút toàn bộ lượng hỗn dịch tế bào ñã ñánh tan vào chai môi trường ñã pha, trộn ñều và chia vào chai 225 cm2, mỗi chai 120ml

- ðậy chặt nút lắc ñều

- Nuôi ở nhiệt ñộ 370C

b) Tinh sạch kháng nguyên và pha kháng nguyên

- Hộn các loạt kháng nguyên ñã sản xuất

- Lọc qua 0,2 µm → cho vào ampul bảo quản ở - 800C

- Pha kháng nguyên 106CCID/0,1ml

3.4.1.2 Tạo kháng thể bại liệt trên thỏ

Hình 6 Chọn thỏ Hình 7 Nuôi nhốt cách ly mỗi con

một lồng

b) Phương pháp tiêm thỏ

Có 2 phương pháp tiêm thỏ bao gồm: Phương pháp tiêm dưới da và tiêm bắp ñùi

* Phương pháp tiêm dưới da:

- Thỏ ñủ tiêu chuẩn cho sử dụng tiêm kháng nguyên gây ñáp ứng miễn dịch cần tiêm trong da thỏ với các liều lượng tuỳ chọn

- Quy trình tiêm thỏ kéo dài trong 4 tuần gồm 3 mũi tiêm theo sơ ñồ dưới ñây:

Nhập thỏ Gây nhiễm (M1) Gây nhiễm (M2) Gây nhiễm (M3) Lấy máu kiểm tra kháng thể bại liệt trước khi tiêm sau thời gian nuôi cách ly

1 tuần

+ Tiêm mũi 1: vào ngày thứ 1 sau 1 tuần nuôi cách ly

Tiêm trong da 0,5 ml kháng nguyên + 0,5 ml tá dược toàn phần (FCA/thỏ)

Hình 8 Thỏ trước khi tiêm Hình 9 Thỏ khi tiêm

+ Tiêm mũi 2: vào ngày thứ 14

Sau tiêm mũi 1 là 14 ngày, tiêm trong da 0,5 ml KN + 0,5 ml tá dược không toàn phần (FIA/thỏ)

Hình 10 Thỏ sau khi tiêm Hình 11 Vết sẹo tiêm trong da Thỏ

sau 2 tuần

+ Tiêm mũi 3: vào ngày thứ 21

Sau tiêm mũi 2 là 7 ngày, tiêm trong da 0,5 ml KN + 0,5 ml tá dược không toàn phần (FIA/thỏ)

* Phương pháp tiêm bắp ñùi:

Phương pháp này về cơ bản giống phương pháp trên, song, vị trí tiêm dưới

bắp ñùi và tỷ lệ liều lượng tiêm là 2,5 ml kháng nguyên + 2,5 ml tá dược

c) Thu huyết thanh thỏ

Lấy máu, sau ñó chắt huyết thanh ñể kiểm tra ñáp ứng miễn dịch:

Lấy máu từ mũi 1 ñến mũi 4 lần lượt theo các ngày thứ :

1 → 21 → 28 → 38 → 55 → 66 ngày sau khi tiêm kháng nguyên

Hình 12 Chuẩn bị lấy máu Hình 13 Vị trí lấy máu

ðến ngày thứ 66 (sau tiêm mũi 3 là 38 ngày), lấy toàn bộ máu thỏ vào chai dẹt ñể ở nhiệt ñộ phòng 4 tiếng Chắt huyết thanh lần 1 bảo quản 40C qua ñêm, sau

ñó, chắt toàn bộ huyết thanh rồi ly tâm 3000rpm/20 phút Bảo quản bằng cách cho vào týp nhựa 50 ml ở ( -300C)

Hình 14 Lấy máu từ mũi 0 ñến mũi 4 Hình 15 Lấy máu toàn bộ (mũi 5)

e) Xử lý huyết thanh thỏ và bảo quản huyết thanh bại liệt

- Ly tâm huyết thanh 3000 vòng/ 7 phút Chắt phần huyết thanh phía trên

- Chứa huyết thanh trong týp nhựa 50 ml Bảo quản huyết thanh vào tủ lạnh –

- MT : môi trường duy trì 2% BS (MEM 2% Bovin serum)

- Nhỏ mẫu ñã pha loãng vào phiến 96 giếng Nhỏ 100 µl/ giếng, mỗi nồng

ñộ nhỏ 8 giếng (theo chiều dọc từ hàng A → hàng H theo sơ ñồ phiến)

- Mỗi mẫu nhỏ 4 nồng ñộ từ 10 -5 → 10 -8

Nhỏ tế bào

- Tế bào HEP2C ñược tách thành hỗn dịch tế bào

- Pha hỗn dịch về nồng ñộ 105 tế bào / 1 ml

- Pha hỗn dịch tế bào bằng MEM 2% Bovin serum

- Nhỏ 100 µl hỗn dịch tế bào/ giếng và nhỏ vào tất cả các giếng

Trong ñó:

- L là log của nồng ñộ pha loãng cao nhất có 100% có số giếng huỷ hoại

- D là sự chênh lệch log giữa các nồng ñộ pha loãng mẫu, ở ñây do pha loãng bậc 10 nên D = 1

- S là tổng số giếng huỷ hoại ở nồng ñộ pha loãng trong ñó không có 100% số giếng huỷ hoại

- N là số giếng gây nhiễm cho mỗi nồng ñộ pha loãng

Nhận ñịnh kết quả

- Mỗi mẫu phải làm lặp lại 3 lần và tính hiệu giá trung bình

- Hiệu giá giữa các lần thực hiện cho phép dao ñộng 0,5 log10

- Mẫu KHT ñơn týp ñược chấp nhận khi hiệu giá pha loãng nhất có sự trung hoà giữa KN và KT

3.4.2 Xác ñịnh tính an toàn của vắc xin bại liệt trong phòng thí nghiệm

3.4.2.1 Phương pháp kiểm tra nguyên liệu ñầu vào – Khỉ dùng cho sản xuất tế bào

a) Lấy máu khỉ:

L ấy máu khỉ ở vị trí tĩnh mạch cẳng chân phải: