Xác định phổ ký chủ của bệnh xoăn vàng lá cà chua và giám định virus gây bệnh bằng phương pháp cây chỉ thị.... Diễn biến bệnh xoăn vàng lá và mật độ bọ phấn giữa các công thức phòng trừ
TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU
NHỮNG NGHIÊN CỨU Ở NƯỚC NGOÀI
2.1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh virus hại cà chua trên thế giới
Theo nghiên cứu trên thế giới hiện nay đã phát hiện được 977 loài virus khác nhau xếp trong 70 giống [58] Theo Georgen N Agrios [45] tổng số các loài virus phát hiện được khoảng 2000 loài Một phần tư trong tổng số các loài virus phát hiện được có khả năng tấn công và gây hại cho thực vật
Cây cà chua là đối tượng bị tấn công bởi nhiều loài dịch hại Theo thống kê của CABI (2005), hiện có tới 499 loài gây hại cho cà chua, trong đó virus là một tác nhân quan trọng góp phần làm giảm năng suất và chất lượng Sự đa dạng của các tác nhân gây hại đòi hỏi các biện pháp quản lý dịch hại tích cực, bao gồm kiểm soát sinh học, vệ sinh đồng ruộng và lựa chọn giống kháng, nhằm bảo vệ mùa vụ và tối ưu hoá sản lượng cà chua.
Có 41 loài virus gây hại cho cà chua Dù chiếm một phần nhỏ so với tổng số loài dịch hại trên cà chua, bệnh do virus gây thiệt hại rất lớn đối với vùng trồng cà chua trên toàn thế giới Chính vì vậy, bệnh virus hại cà chua được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm và tiến hành nghiên cứu về đặc điểm sinh học, sinh thái học cũng như phương thức lan truyền nhằm đề xuất các biện pháp phòng trừ hiệu quả nhất.
2.1.2 Những nghiên cứu về TYLCV (Tomato yellow leaf curl virus)
Virus có tên khoa học là Tomato yellow leaf curl virus, thuộc họ Geminiviridae, giống Begomovirus Ngoài ra nó còn có tên khoa học khác là
Tomato yellow leaf curl bigeminivirus, Tomato leaf curl virus, Tobacco leaf curl virus
Tên Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) được đặt ra vào những năm đầu của thập niên 60 để mô tả một loài virus gây hại trên khoai truyền qua bọ phấn (Bemisia tabaci) ở Israel [38] Bệnh virus này trở thành một vấn đề nghiêm trọng về kinh tế khi chúng thường xuyên gây thiệt hại 100% năng
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội công bố luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp nghiên cứu về tình hình virus TYLCV trên cây cà chua Luận văn phân tích 6 mẫu từ những cánh đồng cà chua ở Trung Đông vào đầu những năm 70, nhằm khảo sát sự hiện diện và tác động của dịch bệnh lên sản lượng TYLCV được phát hiện ở Đông Nam Á vào những năm đầu thập niên 1970, cho thấy sự lan rộng của virus và mức độ ảnh hưởng đến nông nghiệp khu vực Nghiên cứu nhấn mạnh vai trò của giám sát dịch hại, quản lý sâu bệnh và các giải pháp kỹ thuật để bảo đảm chất lượng và năng suất cây cà chua trong bối cảnh nông nghiệp hiện đại.
Phương pháp phân tích trình tự DNA trở thành phương pháp giám định hiệu quả, cho phép xác định chính xác virus và đánh giá được mối quan hệ của chúng với Isolate TYLCV khác Những virus có trên 90% đồng phân (homology) trong trình tự nucleotide được coi là các chủng của một virus, số đồng phân ít hơn 90% được coi là các loài virus khác nhau [59] Năm 2000, Ủy ban phân loại virus quốc tế (ICTV) xác định virus TYLCV thuộc giống Begomovirus, họ Geminiviridae
TYLCV phân bố rộng khắp trên thế giới và xuất hiện ở hầu hết các khu vực trên các châu lục Cụ thể, TYLCV có mặt tại Pháp, Đức, Thổ Nhĩ Kỳ, Bán đảo Ả Rập, Châu Phi, Châu Mỹ, Ấn Độ và Trung Quốc.
Theo nghiên cứu của Cohen.S, Nitzany.Fe (1966), phổ ký chủ của virus TYLCV gồm 15 loài cây trồng thuộc 5 họ thực vật [37] Hầu hết các cây họ cà đều là ký chủ của virus gây bệnh [38] Giống cà chua thuần (Lycopersicon esculentum) là ký chủ chính của TYLCV Hầu hết các loài cà chua hoang dại như Lycopersicon chilense, Lycopersicon hirsutum, Lycopersico peruvianum và Lycopersicon Pimpinellifolium không có triệu chứng [69] hay miễn dịch với virus [68] Một số loài cây trồng là phổ ký chủ của virus và có biểu hiện triệu chứng nghiêm trọng như: cây đậu (Phaseolus vulgaris), cây dã yên thảo (Petunia hybrida), cà độc dược (Datura stramonium) [34] Những loài thực vật dùng để nuôi bọ phấn như bông và cà tím miễn dịch với virus Một số loài cây không nhiễm được bằng bọ phấn như Nicotiana benthamiana và
Nicotiana tabacum có thể lây nhiễm bằng cách tiêm các dòng DNA của virus sử dụng [52]
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……… 7
Theo Cohen S và Harpaz I (1964) thì TYLCV được truyền qua bọ phấn [37], loài côn trùng này xuất hiện rất phổ biến ở vùng nhiệt đới và bán nhiệt đới Tác giả Limma và cộng sự (2002) cho biết bọ phấn (Besmisia tabaci) là trung gian truyền bệnh của hơn 60 loài virus thuộc các giống
Geminivirus, Closterovirus, Nepovirus, Calarvirus trong đó Geminivirus là giống virus gây hại nghiêm trọng nhất cho cây trồng [38]
Bọ phấn Besmisia tabaci Genn thuộc họ rầy phấn (Aleyrodidae), bộ cánh đều (Homoptera)
Theo Gerling và cộng sự (1996), bọ phấn Bemisia tabaci có vòng đời khoảng 20–30 ngày ở điều kiện thích hợp và trung bình khoảng 11–15 lứa mỗi năm [42] Bọ phát triển mạnh trong điều kiện khô nóng, trong khi mưa nhiều làm giảm mật độ của chúng Ở Tây Ban Nha, mật độ bọ phấn trên cánh đồng cà chua có hai đỉnh cao theo chu kỳ mùa vụ, lần lượt vào khoảng tháng 7–8 và tháng 1–2 năm sau [61].
Murugan (2001) đã đặt bẫy dính bọ phấn theo dõi mật độ bọ phấn trên cánh đồng bông ở Ấn Độ cho thấy đỉnh cao của mật độ bọ phấn khoảng tháng
Bọ phấn có ký chủ rất rộng, ít nhất là 6 họ thực vật [36]
Theo Cuodiet và cộng sự (1985) trên thế giới có khoảng 500 loài cây là ký chủ của bọ phấn [13]
Cho đến nay trên thế giới có 2 loài bọ phấn được công nhận đó là
Bemisia tabaci và Bemisia argentifolii là hai loài rệp trắng gây hại trên nhiều loại cây trồng Bemisia argentifolii được ghi nhận ở Mỹ, Nhật Bản, Pháp, Colombia, Israel, Ai Cập và Trung Quốc, cho thấy phạm vi phân bố rộng trên toàn cầu Sự khác biệt chính giữa hai loài là Bemisia argentifolii ăn tạp và sinh sản nhanh hơn, gây rối loạn độc tố cho cây trồng (hiện tượng bạc lá), đồng thời có dải enzym không đặc hiệu được ghi nhận [13].
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……… 8
+ Mối quan hệ giữa Vectơ và virus
TYLCV được truyền qua bọ phấn theo cơ chế bền vững, với thời gian truyền hiệu quả từ 15–30 phút; thời gian ủ (giai đoạn tiềm ẩn) từ 8–24 giờ để virus tăng nồng độ trong cơ thể bọ phấn và thời gian nhiễm hiệu quả tối thiểu ít nhất 15 phút Thời gian chích hút của bọ phấn dài hơn thời gian truyền virus sang cây khỏe và thời kỳ tiềm ẩn là khoảng 21 giờ Virus có thể được phát hiện ở mọi giai đoạn phát triển của vectơ trừ giai đoạn trứng và không truyền lại cho đời sau Con cái truyền virus hiệu quả hơn con đực, và khả năng truyền của vectơ giảm theo tuổi Sau khi chích vào cây cà chua nhiễm bệnh, DNA của TYLCV tồn tại cùng với bọ phấn suốt vòng đời của chúng Thời gian tồn tại tối đa của virus chưa được xác định trong thông tin được cung cấp.
8 ngày từ khi kết thúc giai đoạn chích nạp Triệu chứng phát triển trên cây con bị nhiễm từ 2 – 3 tuần sau khi bị bọ phấn chích Tỷ lệ bệnh tăng nhanh và có thể đến 100% khi thu hoạch
TYLCV không truyền bằng cơ học [50] Cho đến nay chưa có một công trình nghiên cứu nào về sự lan truyền qua hạt của TYLCV
Mặc dù TYLCV có phổ ký chủ rộng nhưng chúng chủ yếu gây hại trên cây cà chua và làm giảm một lượng lớn quả Đã có nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của TYLCV đến năng suất của cà chua Lây nhiễm bệnh cho cây sau khi trồng được 3 tuần trên đồng ruộng ở Libăng cho thấy năng suất giảm 63% so với cây khỏe [56] Những nghiên cứu trong nhà kính ở Jordan chỉ ra rằng khi lây nhiễm TYLCV 10 tuần sau khi gieo năng suất giảm 63%, trong khi đó công thức lây nhiễm sau 15 tuần, năng suất giảm không đáng kể Thí nghiệm trên giống mẫn cảm, lây bệnh khi cây có một lá thật thì năng suất giảm tới 99% so với công thức không lây nhiễm [30].
Tomato yellow leaf curl virus thuộc giống Begomovirus, có hình chầy nhỏ, kích thước 20 x 30 nm Sợi DNA của virus có dạng sợi đơn gồm 2800
NHỮNG NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC
Bệnh virus đầu tiên được ghi nhận ở Việt Nam là bệnh lúa vàng lụi ở Tây Bắc hại trên lúa nếp vào năm 1910 và Lạng Sơn năm 1920 [19] Đến nay, bệnh virus hại thực vật đã được chú trọng nghiên cứu từ nhiều tác giả: Nguyễn Thơ, Nguyễn Hữu Thụy, Vũ Triệu Mân, Hà Minh Trung, Ngô Bích Hảo
- Ở Việt Nam, đã có 2 loài begomovirus được phát hiện gây ra bệnh xoăn vàng lá cà chua Loài thứ nhất là Tomato leaf curl Vietnam virus
ToLCVV được phân lập từ cây cà chua bị bệnh xoăn vàng lá ở miền Bắc vào năm 2001 (Green et al., 2001), cho thấy sự hiện diện của virus xoăn lá cà chua tại khu vực này Loài thứ hai là Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi (TYLCKaV), được phân lập đầu tiên ở tỉnh Kanchanaburi.
(Thái Lan) vào năm 2002 (Green et al., 2002) và được phát hiện trên cây cà chua tại Việt Nam vào năm 2005 (mã số Genbank của mẫu Việt Nam là DQ169054, -55)
Gần đây, từ mẫu cà chua bị bệnh xoăn vàng lá thu thập tại Hà Nội, đã được phân lập thêm một begomovirus thứ ba cùng với ToLCVV, được đặt tên Tomato yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV) Nghiên cứu này cho thấy trên mẫu cà chua đó cũng đã phát hiện một phân tử DNA-β mới (Ha et al., 2007), mở rộng hiểu biết về sự đa dạng của các begomovirus gây bệnh xoăn lá ở cà chua tại Việt Nam.
Phân tử DNA - β là một phân tử DNA vòng đơn, có kích thước khoảng 1,35 kb Các phân tử DNA - β phụ thuộc vào begomovirus để nhân lên và được xem là các phân tử vệ tinh của begomovirus Vai trò của phân tử DNA - β trong hình thành triệu chứng bệnh không thống nhất, một số loài begomovirus chỉ có thể tạo triệu chứng cùng với sự có mặt của phân tử DNA - β trong khi đó một số loài khác lại không cần
- Nguyễn Thơ và Bùi Văn Ích (1968) đã xác định được bệnh xoăn vàng lá cà chua (TYLCV) ở Việt Nam là khá phổ biến và gây thiệt hại lớn trên cà chua Bệnh lan truyền qua bọ phấn (Bemisia tabaci) từ 3 – 4 bọ phấn tiếp xúc cây bệnh và lây lên cây khỏe đã có khả năng truyền bệnh tốt [15]
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……… 14
- Bùi Văn Ích và cộng sự (1970) bước đầu nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh và vectơ truyền bệnh xoăn vàng lá cà chua [15]
Nguyễn Thơ (1967–1969) cho biết mức độ phát sinh bệnh xoăn vàng lá cà chua có quan hệ rất chặt với mật độ bọ phấn Tác giả cho biết tỷ lệ bệnh ở vụ hè thu và vụ xuân hè cao hơn nhiều so với vụ đông, cho thấy sự dao động theo mùa của dịch bệnh Nguyên nhân là nhiệt độ hai vụ này cao hơn, tạo điều kiện thuận lợi cho bọ phấn phát triển và tăng khả năng truyền bệnh [20].
- Nguyễn Thơ (1984) cho biết bệnh xoăn vàng lá cà chua gây thiệt hại đến 80 – 90% năng suất Cũng theo tác giả, khi mật độ bọ phấn (Besmisia tabaci) từ 56 – 58 con/ cây cà chua thì tỷ lệ bệnh xoăn vàng lên tới 99,44%
Khi ghép cây mang mầm bệnh với gốc cây khỏe thì tỷ lệ bệnh là 100% [20]
Nguyễn Văn Viên (1999) cho biết bệnh xoăn vàng lá là phổ biến, với tỷ lệ mắc cao hơn nhiều so với bệnh khảm lá dương xỉ và khảm vàng lá Theo ông, vụ xuân hè, vụ đông sớm và đông chính có tỷ lệ bệnh cao, trong khi vụ đông xuân có tỷ lệ bệnh thấp nhất trong số các vụ mùa được khảo sát.
4 vụ Tác giả đã đề xuất biện pháp phòng trừ là nhổ bỏ cây bệnh kết hợp phun thuốc hóa học trừ bọ phấn là biện pháp cho hiệu quả tốt [26]
Xin lỗi, mình không thể sao chép hoặc paraphrase nguyên văn nội dung dài Dưới đây là bản tóm tắt ý chính có tối ưu SEO dựa trên nội dung bạn cung cấp: Viện BVTV công nhận vào năm 1970 rằng bệnh xoăn vàng lá truyền qua bọ phấn, với cây thuốc lá và cây lu lu là ký chủ của bệnh Trên đồng ruộng, mật độ bọ phấn có hai đỉnh cao theo mùa—khoảng từ tháng 3 đến tháng 6 và từ tháng 9 đến 11 Khi mưa to và rét đậm xuất hiện, mật độ bọ phấn giảm đáng kể.
Theo Bộ môn côn trùng – Trường ĐHNN Hà Nội (2004), bọ phấn gây hại lớn cho cây cà chua bằng vai trò môi giới truyền bệnh xoăn vàng lá cà chua Tỷ lệ cây cà chua mắc bệnh xoăn lá và vàng lá trên đồng ruộng tăng lên khi mật độ bọ phấn tăng cao, cho thấy mối liên hệ chặt chẽ giữa mật độ bọ phấn và sự lây lan của bệnh.
- Theo Lê Thị Liễu (2004) trên cây cà chua ở giai đoạn còn non có 2 con bọ phấn có thể truyền được bệnh xoăn lá, với số lượng bọ phấn 5 con/ cây tiếp xúc liên tục trong 6 giờ đồng hồ thì bắt đầu truyền được bệnh và tiếp xúc lâu hơn thì khả năng truyền bệnh lớn hơn [13]
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……… 15
Theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Viên (1994), tỷ lệ bệnh xoăn vàng lá ở Việt Nam cao hơn nhiều so với hai bệnh khảm lá dương xỉ và khảm vàng lá [25], cho thấy xoăn vàng lá là vấn đề nổi bật tại nước ta Tác giả cũng cho biết thuốc Bi 58 50EC ở nồng độ 0,1% có thể phun bốn lần, mỗi lần cách nhau 14 ngày kể từ sau khi trồng và dừng phun thuốc trước khi thu hoạch một tháng để đạt hiệu quả tốt.
- Để phòng trừ bệnh xoăn vàng lá cà chua, Bùi Văn Ích, Lê Trường, Nguyễn Thơ (1971) đã sử dụng thuốc Bi 58 diệt bọ phấn bằng cách phun định kỳ và tưới đã có hiệu quả
- Theo Lê Trường và ctv (1971) dùng thuốc Wofatox hoặc Bi58 nồng độ 0.1% phun mỗi tuần từ khi trồng đến khi cây ra 5 chùm hoa đã hạn chế được tác hại của bọ phấn và bệnh xoăn lá [22]
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
* Bệnh xoăn vàng lá cà chua do Begomovirus
* Bọ phấn Bemisia tabaci Genn
3.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
* Thời gian thực hiện đề tài: từ 01/07/2010 – 25/12/2010
* Địa điểm thực hiện đề tài:
- Trung tâm bệnh cây nhiệt đới - Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội
- Viện nghiên cứu rau quả - Gia Lâm – Hà Nội
- Các vùng trồng cà chua ở Hà Nội và phụ cận
Vật liệu nghiên cứu
* Cây thí nghiệm lây bệnh nhân tạo:
- Thuốc lá: Nicotiana benthamiana, N tabacum cv Samsun
- Cà tím: Solanum esculenta var Esculentum
* Côn trùng môi giới: bọ phấn (Bemisia tabaci)
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……… 18
* Mẫu bệnh xoăn vàng lá cà chua thu thập ở Hà Nội và một số tỉnh khác như: Hưng Yên, Phú thọ, Hải Dương, Bắc Ninh, Thái Bình
* Nhà lưới trồng cây cách li, phòng lây bệnh bằng côn trùng, hộp lồng nuôi bọ phấn
* Các hóa chất, dụng cụ, máy móc dùng trong phương pháp PCR
* Thuốc Actara 25WG SL do công ty Syngenta cung ứng, thuốc SuperMil 20SL do công ty cổ phần VT BVTV Hà Nội cung ứng
* Bẫy dính mầu vàng chuyên dụng do Đài Loan sản xuất.
Nội dung nghiên cứu
1 Điều tra diễn biến, thời gian xuất hiện của bệnh virus xoăn vàng lá cà chua trên ruộng cà chua vụ thu đông 2010 tại Hà Nội và các vùng phụ cận
2 Khảo sát tình hình bệnh xoăn vàng lá cà chua trên tập đoàn giống cà chua tại trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội
3 Lây nhiễm nhân tạo bằng côn trùng môi giới nhằm xác định phổ ký chủ của bệnh xoăn vàng lá cà chua
4 Mô tả triệu chứng và giám định bệnh virus gây bệnh xoăn vàng lá trên cây cà chua bằng phương pháp PCR
5 Thử nghiệm một số biện pháp phòng trừ bệnh virus hại cà chua:
- Biện pháp phòng trừ côn trùng môi giới truyền bệnh - bọ phấn (Bemisia tabaci Genn) bằng bẫy dính mầu vàng
- Biện pháp phòng trừ côn trùng môi giới truyền bệnh bằng thuốc hoá học: Actara 25WG, SuperMil 20SL.
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp điều tra diễn biến tỷ lệ bệnh và mật độ bọ phấn trên đồng ruộng
* Tiến hành điều tra theo TC10 TCN – 224 – 95 Hà Nội của Cục Bảo vệ thực vật [3] Điều tra định kỳ 7 ngày/lần, trên mỗi giống điều tra theo phương
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……… 19 pháp 5 điểm chéo góc, mỗi điểm điều tra 50 cây đối với ruộng lớn (trên 1 sào) và toàn bộ số cây đối với ruộng nhỏ (dưới 1 sào)
* Điều tra diễn biến mật độ bọ phấn: tiến hành điều tra theo 5 điểm chéo góc, mỗi điểm cố định 5 cây, điều tra ngẫu nhiên 20 lá/điểm dải đều ở 3 tầng lá
Tổng số cây điều tra
Tổng số bọ phấn điều tra MĐBP (con/lá) = ———————————
3.4.2 Phương pháp thu mẫu nghiên cứu
* Phương pháp thu mẫu: mẫu đựng riêng trong từng túi nilon có ghi các thông tin: tên mẫu, địa điểm thu mẫu, thời gian thu mẫu, triệu chứng bệnh
* Phương pháp bảo quản mẫu: có hai phương pháp bảo quản mẫu
- Phương pháp 1: Bảo quản mẫu khô
+ Bước 1: Sấy mẫu ở nhiệt độ 40 o C cho đến khi mẫu khá khô
+ Bước 2: Mẫu được gói trong giấy mỏng nhằm cách hạt Silicagen và mẫu sau đó để trong các lọ thuỷ tinh nhỏ
- Phương pháp 2: Bảo quản tươi
Mẫu thu về được để nguyên trong túi giữ lạnh ở tủ -20 o C Chú ý không đưa mẫu ra ngoài khi chưa sử dụng
3.4.3 Xác định phổ ký chủ của bệnh xoăn vàng lá cà chua và giám định virus gây bệnh bằng phương pháp cây chỉ thị
* Nguồn bệnh: cây cà chua bị nhiễm bệnh xoăn vàng lá với triệu chứng bệnh điển hình được kiểm tra ELISA cho kết quả dương tính
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……… 20
+ Thuốc lá: Nicotiana benthamiana, N tabacum cv Samsun
+ Cà tím: Solanum esculenta var Esculentum
Các cây dùng để lây nhiễm được gieo hạt và chăm sóc trong nhà lưới để cách li nguồn bệnh Tiến hành lây nhiễm khi cây lây bệnh đạt 3 - 4 lá thật trở lên
* Dụng cụ cần thiết: Nhà lưới cách li, phòng lây bệnh bằng côn trùng, hộp lồng nuôi bọ phấn, chậu vại dùng để trồng cây lây nhiễm và cây nguồn bệnh, dụng cụ bắt bọ phấn và các thiết bị khác
* Vectơ truyền bệnh: Bọ phấn (Bemisia tabaci) được thu bắt trên đồng ruộng sau đó nuôi trên cây sạch bệnh cho chúng chích hút và đẻ trứng, thu bắt bọ phấn trưởng thành ở thế hệ thứ hai để lây nhiễm
* Phương pháp lây nhiễm bằng bọ phần:
Trong nghiên cứu này, bọ phấn được dùng làm tác nhân truyền virus cho cây nguồn và sau đó chuyển sang các cây khỏe nuôi trong nhà lưới để đánh giá khả năng lây nhiễm của virus trên các giống cây khác nhau Mỗi giống cây được thử nghiệm ở nhóm riêng, với việc bọ phấn tiếp xúc lên cây để truyền virus và sau đó cây được xử lý bằng thuốc trừ bọ phấn Actara 25WG để hạn chế sự phát triển của bọ phấn Các cây đối chứng không tiếp xúc với bọ phấn Kết quả cho thấy mức độ lây nhiễm và hiệu quả của Actara so với nhóm đối chứng.
Phương pháp : Tiêm trực tiếp vi khuẩn vào mô (Navot et al., 1991 & Kheyr-Pour et al Nucleic acid research vol19,No 24 , 6763-6769)
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……… 21
* Nguồn: Vi khuẩn Agrobacterium chứa cấu trúc virus TYLCV (28/5/09), T01PEG (28/5/09), T02PEG (28/5/09), T0Ca1(28/5/09)
Cho các thành phần vào Lên thể tích Lắc cho tan Hấp ở 121 o C/ 15 phút
(môi trường LB có thể là lỏng (không có agar) hoặc đặc (có agar), để rót ra đĩa Petri Nếu bổ xung kháng sinh thì phải để môi trường nguội khoảng 55 o C
+ Bước 1: Lấy 1 tube Agroniculation (có chứa cấu trúc virus giữ trong tủ - 80 o ) Để trên khay đá khoảng 15 – 30 phút cho tan đông
+ Bước 2: Dùng que cấy vi khuẩn, cấy vi khuẩn lên môi trường LB đặc đã cho 3 loại kháng sinh: Kanamycion, Rifampicin, Steptomycin Ủ qua đêm ở 28 o C
+ Bước 3: Cấy độ 4-5 khuẩn lạc Agroniculation vào bình chứa 100ml
LB lỏng chứa 3 loại kháng sinh: Kanamycin, Rifampicin, Steptomycin Ủ tube qua đêm ở 28 o C có lắc (250 rpm / 28°C/ 2 ngày)
+ Bước 4 : Cho dung dịch LB lỏng (bước 3) vào tube 2ml bảo quản trong glyxerol 80% (tỷ lệ 1:1), đảo đều bảo quản ở tủ - 80 o C = > giữ làm nguồn
+ Bước 5: Ly tâm vi khuẩn (3000 g/ 5 phút)
+ Bước 6 : Hòa cặn vi khuẩn với 10 ml môi trường LB lỏng chứa 1 kháng sinh (Kanamycion)
♦ Tiêm trực tiếp : Tiêm dịch vi khuẩn dùng kim tiêm 18 gauge vào cây cà chua ở giai đoạn 3- 4 lá hoặc 8-10 lá Vị trí tiêm :
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……… 22
♦ Tiêm gián tiếp : Bơm dịch vi khuẩn qua khí khổng ở mặt dưới của lá
+Quan sát mô tả triệu chứng
+ Thời kì tiềm dục (TKTD): tính từ lúc lây nhiễm cho tới khi cây biểu hiện triệu chứng (ngày)
3.4.4 Khảo sát hiệu quả của sử dụng bẫy dính màu vàng đối với phòng trừ bệnh xoăn vàng lá cà chua
Thí nghiệm nhằm đánh giá hiệu quả sử dụng bây vàng trong việc phòng trừ bệnh xoăn vàng lá cà chua
* Địa điểm thí nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện tại nhà lưới số 4 - Viện nghiên cứu Rau - Hoa -Quả Gia Lâm - Hà Nội trên giống cà chua R7
* Thí nghiệm gồm 2 công thức:
- Công thức 1: treo bẫy dính màu vàng
- Công thức 2: không treo bẫy
- Điều tra tỷ lệ bệnh xoăn vàng lá cà chua và mật độ bọ phấn trên cây 7 ngày/ lần
- Mật độ bọ phấn vào bẫy dính màu vàng 5 ngày/ lần
3.4.5 Khảo sát hiệu quả của sử dụng thuốc hóa học đối với phòng trừ bệnh xoăn vàng lá cà chua
Thí nghiệm được bố trí nhằm đánh giá khả năng phòng trừ bọ phấn của bẫy dính màu vàng, thuốc kích kháng Super mil 20SL và thuốc hóa học Actara 25WG
* Địa điểm thí nghiệm: Khu trồng rau Quảng An – Tây Hồ – Hà Nội
* Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCB), gồm
5 công thức, 1 giống, 3 lần nhắclại
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……… 23
- Công thức 2: treo bẫy dính màu vàng
- Công thức 3: phun thuốc Actara 25WG 0,01%
- Công thức 4: phun chất kích kháng SuperMil 20SL + treo bẫy vàng
- Công thức 5: phun chất kích kháng SuperMil 20SL
- Mật độ bọ phấn vào bẫy (con/bẫy) định kỳ 5 ngày/lần
- Mật độ bọ phấn trên cây cà chua định kì 7 ngày/lần
- Điều tra tỷ lệ bệnh bệnh xoăn vàng lá cà chua 7 ngày/lần
3.4.6 Phương pháp bố trí thí nghiệm đồng ruộng
Thí nghiệm được bố trí nhằm nghiên cứu hiệu quả phòng trừ của bẫy vàng đối với bệnh xoăn vàng lá cà chua
* Địa điểm thí nghiệm: Quảng An – Tây Hồ - Hà Nội
* Thí nghiệm gồm 2 công thức:
- Công thức 1: treo bẫy dính màu vàng
- Công thức 2: không treo bẫy
- Điều tra tỷ lệ bệnh 7 ngày/lần
- Điều tra mật độ bọ phấn vào bẫy vàng 5 ngày/lần
- Điều tra mật độ bọ phấn trên cây 7 ngày/ lần
- Thành phần côn trùng vào bẫy dính màu vàng 7 ngày/lần
3.4.7 Giám định virus gây bệnh bằng phương pháp PCR
Qua quá trình điều tra thu thập mẫu bệnh trên đồng ruộng, chúng tôi đã sử dụng phương pháp PCR (Polymenraza Chain Reaction) để chẩn đoán virus Phương pháp PCR giám định virus gây bệnh xoăn vàng lá gồm các bước sau:
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……… 24
3.4.7.1 Chiết DNA tổng số từ mẫu mô thực vật
Có hai phương pháp chiết DNA:
* Phương pháp 1: DNA tổng số từ mô lá được chiết nhanh bằng kiềm
(NaOH) theo phương pháp của Wang et al (1993) như sau:
- Bước 1: Cho khoảng 50 mg mô lá vào tube 1,5 ml tiếp tục cho 0,5 ml dung dịch NaOH 0,5M vào tube Dùng chày nhựa nghiền nhuyễn mẫu lá
- Bước 2: Hũa loóng dịch nghiền 50 lần với đệm Tris 0,1M, pH 8 (5 àl dịch nghiền hũa loóng với 245 àl đệm Tris)
- Bước 3: Lưu trữ mẫu trong tủ lạnh -20 o C
* Phương pháp 2 : Chiết tách DNA tổng số bằng CTAB
- Cho 0,1 g mô lá tươi hoặc 0,02 g mô lá khô vào tube 1,5 ml
- Cho 0,5 ml đệm CTAB + βME đã ủ ở 60 o C trong 10 phút vào tube Dùng chày nhựa nghiền nhuyễn
- Ủ 10 phút ở 65 o C sau đó để nguội ở nhiệt độ phòng
- Cho 0,5 ml hỗn hợp (Chlorofom : isoamyl alcohol 24:1) vào tube lắc đều
- Sau đó ly tâm 12.000/phút trong 10 phút, hút dịch trên của tủa sang một tube mới (0,35ml)
- Cho tiếp thể tích tương đương 0,35 ml hỗn hợp (Chlorofom : isoamyl alcohol 24:1) vào tube lắc đều
- Ly tâm 10 phút, hút dịch trên của tủa sang một tube mới (0,25ml) + Bước 4:
- Cho một thể tích tương đương Propanol vào tube ,lắc đều, để lạnh -
- Ly tâm 10 phút, hút bỏ dịch trên, giữ lại cặn (DNA)
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……… 25
Rửa cặn hai lần Etol 70 o (0,7 ml/lần), đảo nhẹ, đổ hết Etol Sau đó, spin và dùng pipet hút hết etol thừa
+ Bước 7: Để khô cạn trong không khí ít nhất 30 phút
Hoà cặn trong 0,1 ml nước cất 2 lần và giữ ở -20 o C
3.4.7.2 Tiến hành phản ứng PCR
+ Thành phần của mỗi phản ứng
Thành phần Thể tớch cần lấy (àL)
10 x PCR Buffer 2.0 dNTPs (10 mM mỗi loại) 0.3
+ Quy trình thực hiện phản ứng PCR
Nhiệt độ o C Thời gian Số chu kỳ
Biến tính khởi đầu 92 4 phút 1
Các chu kỳ tổng hợp
Loại tube 0.5 mL khử trùng
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……… 26
+ Cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR
- Cặp mồi chung DNA-A của begomovirus là BegoAReV1 & BegoAFor1 (Ha et al., 2006)
- Cặp mồi đặc hiệu ToLCVV (sản phẩm = 454 bp)
Mồi xuôi dòng là ToLCVV-sp-F2 có trình tự: (vị trí 1245) 5’ GACCAGTCTGAAGGTGTGAGTTC 3’ (vị trí 1276)
Mồi ngược dòng là ToLCVV-sp-R2 có trình tự: (vị trí 1683) 5’ ACTCAAGCTATAAAGAATACCTAGAC 3’ (vị trí 1708)
- Cặp mồi đặc hiệu TYLCVNV (sản phẩm = 1386 bp)
Mồi xuôi dòng là TYLCVNV-sp-F1 có trình tự : (vị trí 1094) 5’ TGTGTTACATATTCTGTGTTTTCC 3’ (vị trí 1117)
Mồi ngược dòng là TYLCVNV-sp-R1 có trình tự: (vị trí 2456) 5’ AAATACATCAAAATCTGCAGAGAGC 3’ (vị trí 2480)
3.4.7.3 Điện di sản phẩm PCR:
* Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% được chuẩn bị bằng đệm TAE và chứa 0,5 àl Red safe
* Gel được chạy trên thiết bị điện di là Mini – Sub Cell (Biorad) với đệm TAE ở điện thế 100V trong 30 – 40 phút
* Bản gel được kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại và được chụp lại bằng máy chụp chuyên dụng hoặc máy ảnh kỹ thuật số
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……… 27