Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan tất cả số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận tốt nghiệp này là khác
MỞ ðẦU
ðặt vấn ủề
Cây cà chua (Licopersicon esculentum Mill.) thuộc họ cà (Solanaceae) có nguồn gốc từ Chõu Mỹ, là một trong những loại rau phổ biến và ủược trồng rộng rói ở rất nhiều nước trên thế giới
Sản xuất cà chua ở miền Bắc nước ta khỏ thuận lợi ủặc biệt là vụ ủụng xuõn nờn loại rau này ủược trồng chủ yếu từ thỏng 10 ủến thỏng 4 năm sau (chiếm 70% sản lượng thu hoạch) Cà chua vụ ủụng xuõn cho năng suất và chất lượng khỏ cao Tuy nhiờn do thu hoạch tập trung nờn giỏ cả tương ủối thấp, ảnh hưởng ủến thu nhập của người sản xuất Trong khi ủú, từ thỏng 6 ủến thỏng 9 do thời tiết núng bức mà nhu cầu cà chua ăn tươi, làm nước giải khát hay phục vụ chế biến và công nghiệp ủồ hộp lại rất cao, thực tế cà chua ở thời ủiểm này rất khan hiếm, giỏ lỳc này tăng gấp 2-3 lần so với thời chớnh vụ Vỡ thế, ủó cú nhiều biện phỏp kỹ thuật nhằm rải vụ cà chua như trồng sớm hoặc muộn, trồng trong nhà lưới và dùng các giống chịu nóng, úng và sâu bệnh, tuy nhiên chi phí cho sản xuất cao nên hiệu quả kinh tế khụng cao hơn so với vụ ủụng xuõn
Hiện nay, trờn thế giới ủó phỏt hiện một số dạng ủột biến làm quả chớn chậm hoặc khụng chớn, từ ủú kộo dài thời gian chớn và thời gian tồn trữ sau thu hoạch Những giống cà chua cú ủặc tớnh này quả dự ủạt kớch thước và tớch lũy ủủ chất khụ nhưng không chín trên cây do mất hoặc giảm khả năng sinh tổng hợp ethylene, là hoocmon tín hiệu giúp hoạt hóa nhiều enzyme xúc tiến cho quá trình làm quả chín quả (Barry và cộng sự, 2005) Tớnh chớn chậm hoặc khụng chớn ủược xỏc ủịnh là do một số gen quy ủịnh như: gen ức chế quỏ trỡnh chớn của quả, ký hiệu là rin
(repening inhibitor) nằm trên nhiễm sắc thể 5 (Vrebalov và cộng sự, 2002) , gen nor (non-repening) quy ủịnh tớnh khụng chớn nằm trờn nhiễm sắc thể số 10, gen Nr
(Never-ripening) quy ủịnh tớnh khụng thể chớn nằm trờn nhiễm sắc thể số 9
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………
(Mirrison và cộng sự, 2001) Hiện nay người ta ủó tỡm thấy một số chỉ thị phõn tử
DNA giúp phát hiện và chọn lọc các gen liên quan đến đặc tính chín muộn ở cà chua Quả cà chua chín muộn có thời gian sử dụng lâu hơn và độ cứng cao hơn cà chua chín bình thường nhờ ít bị thối dập khi vận chuyển, giúp kéo dài thời gian bảo quản và thời gian sử dụng mà vẫn đảm bảo chất lượng Chính vì thế, việc chọn tạo giống cà chua có đặc tính chín muộn được xem là một giải pháp ưu việt cho sản xuất, cho phép rải vụ mà không cần trồng liên tục nhiều vụ trên đồng ruộng.
Một vấn ủề nữa mà sản xuất cà chua ở miền bắc cũng như nhiều nơi trờn thế giới gặp phải là sự phỏ hại nặng của virus, ủặc biệt ở vụ sớm, muộn và trỏi vụ Cho ủến nay, biện phỏp sử dụng giống cà chua khỏng virus ủược coi là hướng hiệu quả nhất ủể phũng chống bệnh Chớnh vỡ vậy, chọn tạo giống cà chua cú khả năng khỏng virus là rất cần thiết Hiện nay, ủó cú 5 gen khỏng virus ủược phỏt hiện là Ty-1, Ty-
2, Ty-3, Ty-4 và Ty-5 Các chỉ thị phân tử DNA dựa trên PCR cho gen Ty-1 (marker
JB-1), Ty-2 (T0302) và Ty-3 (P6-25) cũng ủó ủược phỏt triển và sử dụng rộng rói
(Pena và cộng sự, 2010) Trong số 3 gen này, Ty-3 ủược cho là cú thể mang lại tớnh kháng tốt với các loài virus ở đông Nam Á (Ji và cộng sự, 2007a)
Trong quỏ trỡnh giao lưu và hợp tỏc, bộ mụn cụng nghệ sinh học ứng dụng ủó thu thập được một tập đồn các mẫu giống cà chua đa dạng, phong phú, cĩ chứa các gen chớn chậm và khỏng virus ðể sử dụng chỳng trong việc tạo ra giống cú ủặc tớnh ủiểm chớn chậm và khỏng virus thỡ cần thiết phải khảo, sỏt ủỏnh giỏ ủặc ủiểm nụng sinh học, năng suất, chất lượng, khả năng mang gen kháng virus và gen chín chậm
Vì những lý do trên, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Phan Hữu Tôn, chúng tôi ựã tiến hành ựề tài: Ộ đánh giá, tuyển chọn một số giống cà chua có khả năng chín chậm và kháng virus xoăn vàng lá”
Mục ủớch và yờu cầu
- đánh giá ựược các ựặc ựiểm nông sinh học, năng suất, chất lượng, ựặc
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………
3 tớnh chớn chậm và khỏng virus trờn ủồng ruộng của cỏc mẫu giống cà chua thu thập
- Phát hiện gen chín chậm và kháng virus trong tập đồn cà chua bằng chỉ thị phân tử DNA
- Tuyển chọn ủược một số dũng giống tốt
- Khảo sỏt ủỏnh giỏ cỏc ủặc ủiểm nụng sinh học, năng suất và chất lượng, ủặc tớnh chớn chậm và khỏng virus trờn ủồng ruộng của cỏc mẫu giống cà chua thu thập
- Sử dụng chỉ thị phân tử DNA phát hiện gen rin (ripening inhibitor) và gen kháng virus xoăn vàng lá
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu, ủịa ủiểm và thời gian nghiờn cứu
Vật liệu nghiờn cứu gồm 50 mẫu giống cà chua ủược nhập nội từ: Mỹ, Phỏp, Nhật Bản và Nga, ủối chứng là giống HT7 Danh sỏch nguồn vật liệu nghiờn cứu ủược trỡnh bày trong bảng 3.1
Bảng 3.1 Nguồn vật liệu sử dụng trong nghiên cứu
STT Ký hiệu Nguồn thu thập STT Ký hiệu Nguồn thu thập
25 98 Nhật 51 HT7 (ðC) Việt Nam
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………
3.1.2 ðịa ủiểm và thời gian nghiờn cứu
Các nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Nghiên cứu, Bộ môn Công nghệ Sinh học Ứng dụng và khu thí nghiệm đồng ruộng thuộc Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, tại Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội, trong thời gian từ ngày 22/09/2010 đến 07/2011.
Nội dung nghiên cứu
Thí nghiệm 1 khảo sát một số đặc điểm nông sinh học, năng suất và chất lượng quả của các mẫu giống cà chua nhập nội Đồng thời đánh giá khả năng kháng virus trên ruộng để đánh giá tiềm năng canh tác và đáp ứng của chúng trong vụ mùa xuân năm 2011.
- Thí nghiệm 2: phát hiện gen Ty-3 kháng virus xoăn vàng lá trong tập đồn các mẫu giống bằng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi P6-25F2/R5
- Thí nghiệm 3: phát hiện gen chín chậm rin trong tập đồn các mẫu giống bằng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi C43F/R
Thử nghiệm 4 đánh giá đặc tính chín chậm của quả ở các mẫu giống mang gen chín chậm được phát hiện nhờ PCR, và so sánh với một số mẫu giống không mang gen này Việc xác định bằng PCR cho phép phân loại nhanh các mẫu trước khi theo dõi thời gian chín Kết quả cho thấy quả từ các mẫu mang gen chín chậm có thời gian chín kéo dài so với mẫu đối chứng, thể hiện sự khác biệt đáng kể về thời điểm thu hoạch và chất lượng sau thu hoạch Những phát hiện này có ý nghĩa cho quản lý thu hoạch và chọn lọc giống, nhằm tối ưu chu kỳ chín và năng suất trong nông nghiệp.
- Thớ nghiệm 5: khảo sỏt một số ủặc ủiểm nụng sinh học, năng suất, chất lượng quả, khả năng khỏng virus trờn ủồng ruộng của một số mẫu giống tốt trong vụ xuân hè muộn 2011.
Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Các thí nghiệm khảo sát đánh giá tập đồn cà chua
- Thí nghiệm khảo sát tập đồn cà chua được bố trí theo kiểu tuần tự một hàng không nhắc lại, mỗi mẫu giống trồng 20 cây
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………
- đông xuân: gieo ngày 21/9/2010, trồng ngày 21/10/2010
- Xuân hè muộn: gieo ngày 25/2/2011, trồng ngày 26/3/ 2011
Kỹ thuật trồng và chăm sóc: Áp dụng theo hướng dẫn trong tiêu chuẩn ngành 10TCN219: 2006 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (Bộ NN và PTNT, 2006)
- Giai ủoạn vườn ươm: hạt giống ủược gieo trờn giỏ thể gồm trấu hun và ủất bột theo tỷ lệ 1:1 Hạt ủược gieo trong khay bầu, tưới phun mự ủủ ẩm, ủặt trong nhà cú mỏi che Hàng ngày chăm súc, tưới nước và giữ ẩm cho cõy Khi cõy con ủược 5-6 lá thì trồng
- Giai ủoạn trồng ở ruộng sản xuất:
+ Chọn ủất, lờn luống: thớ nghiệm ủược bố trớ trờn ủất trồng lỳa, lờn luống cao 25 cm, mặt luống rộng 1 m, rãnh rộng 50 cm
+ Mật ủộ 2.67 vạn cõy/ha, trồng 2 hàng/luống, cõy x cõy 50 cm, hàng x hàng 65 cm
+ Lượng phân bón cho 1 ha: 20 tấn phân hữu cơ,100kg N, 100kg P 2 O 5, 100kg K 2 O Bún lút toàn bộ phõn hữu cơ, toàn bộ phõn lõn, 1/3 phõn ủạm và 1/3 kali Lượng ủạm và kali cũn lại chia ủều bún thỳc vào 3 lần xới vun
+ Tưới nước: sau khi trồng cần tưới nước giữ ẩm cho ủất khoảng 75%
+ Vun xới, làm cỏ: vun xới kết hợp bón thúc lần 1 sau trồng 30 ngày, lần 2 khi sau trồng 60 ngày, lần 3 sau trồng 80 ngày Thường xuyên nhổ bỏ cỏ dại
+ Làm giàn hình chữ A khi cây cao 30 - 40 cm
+ Tỉa cành: ủối với giống vụ hạn tỉa bỏ cành phụ, chỉ ủể lại 2 thõn chớnh
+ Phòng trừ sâu bệnh hại: theo dõi và phòng trừ bệnh xoăn vàng lá, mốc sương, héo xanh vi khuẩn bằng thuốc Daconil, Zinep; phòng trừ sâu cắt lá, sâu xám, sõu vẽ bựa, sõu xanh, sõu ủục quả bằng thuốc Sherpa
+ Thu hoạch khi quả bắt ủầu chuyển màu (bắt ủầu chớn), số lần thu căn cứ
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………
30 vào ủặc ủiểm chớn của giống
Các chỉ tiêu theo dõi: áp dụng theo hướng dẫn trong tiêu chuẩn ngành
10TCN219: 2006 (Bộ NN và PTNT, 2006) và 10TCN557-2002 (Bộ NN và PTNT, 2002)
- Cỏc giai ủoạn sinh trưởng:
- Thời gian từ trồng ủến ra hoa: khi 50% số cõy trong ụ thớ nghiệm cú hoa ủầu tiờn
- Thời gian từ trồng ủến thu quả ủợt 1: khi 50% số cõy theo dừi cú quả chớn
- Thời gian từ trồng ủến kết thỳc thu hoạch: tớnh ủến ngày thu hết quả thương phẩm
- Một số chỉ tiêu về cấu trúc cây và hình thái lá:
- Kiểu hỡnh sinh trưởng: quan sỏt ủặc tớnh ra hoa và sinh trưởng của cõy vào giai ủoạn ra hoa: kiểu hữu hạn, khi cõy ra hoa rộ thõn chớnh ngừng sinh trưởng; kiểu vô hạn, cây ra hoa thân chính vẫn tiếp tục sinh trưởng và kiểu bán hữu hạn, trung gian giữa hai kiểu trên
+Mức ủộ xanh của lỏ: quan sỏt màu mặt trờn phiến lỏ khi thu hoạch lứa quả thứ 2-3, cỏc mức: xanh ủậm, xanh, xanh sỏng
+ Dạng lá: quan sát sự phân thùy của lá chét thời kỳ thu hoạch lứa quả thứ 2
- 3, gồm dạng lá bình thường và dạng lá khoai tây
+ Số ủốt từ gốc tới chựm hoa thứ nhất: theo dừi thời kỳ ra chựm hoa thứ 2 - 3 + Chiều cao từ gốc tới chựm hoa thứ nhất: ủo từ cổ rễ ủến chựm hoa 1, theo dõi thời kỳ ra chùm hoa 2 - 3
+ Chiều cao thõn chớnh: ủo từ cổ rễ ủến ủỉnh sinh trưởng, giai ủoạn kết thỳc thu hoạch
- Cấu trỳc chựm hoa và ủặc ủiểm nở hoa
+ Kiểu chựm hoa: ủơn giản - hoa ra trờn một nhỏnh chớnh; trung gian - hoa ra trên 2 nhánh chính; phức tạp - chùm hoa chia thành nhiều nhánh
+ Số hoa/chựm: số hoa nở của 5 chựm ủầu tiờn trờn 3 cõy thời kỳ hoa rộ, lấy trung bình
+ ðặc ủiểm nở hoa: quan sỏt và phõn ra nở hoa rộ tập trung hay nở hoa rải rỏc
- Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất:
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………
+ Tỷ lệ ủậu quả: ủếm số quả ủậu của 5 chựm hoa ủầu tiờn của 3 cõy vào thời kỳ kết thỳc ủõụ quả ủể xỏc ủịnh tỷ lệ ủậu quả trờn từng chựm và tỷ lệ ủậu quả trung bình, gồm các mức: rất thấp (dưới 10%), thấp (10 - 20%), trung bình (21- 40%), cao
+Tổng số quả/cây: tổng số quả các lần thu/cây, theo dõi 5 cây, lấy trung bình + Khối lượng trung bỡnh quả: tổng khối lượng của số quả ủiều tra/số quả + Năng suất cỏ thể (khối lượng quả/cõy): tổng khối lượng quả thu ủược/cõy, theo dõi 5 cây, tính trung bình
- ðặc ủiểm hỡnh thỏi và chất lượng quả:
+ ðường kớnh quả (ủộ lớn quả): ủo ủường kớnh quả ở phần lớn nhất của 10 quả chớn thuộc lứa quả thứ 2 hoặc 3 ủể xỏc ủịnh ủộ lớn của quả
+ Chiều cao quả (H): bổ dọc quả, ủo chiều cao từ ủỉnh ủến ủỏy quả của 10 quả chín, chùm quả 2-3
+ Chỉ số hỡnh dạng quả: I = H/ D, dựa vào chỉ số hỡnh dạng quả ủể phõn biệt các dạng quả: dạng quả dẹt (I < 0.6), tròn dẹt (0.6 < I < 0.9), tròn (0.9 < I < 1.1), tròn dài (1,3 > I >1,1) và dài (I > 1,3)
+ Số ngăn hạt/ quả: bổ ngang quả ủếm số ngăn hạt của 5 quả, lấy trung bỡnh + ðộ chắc quả: dùng tay nắn khi quả chín hoàn toàn, chùm quả 2-3 Gồm các mức: mềm, trung bình, cứng
+ Mức ủộ xanh của quả: quan sỏt màu phần ủỏy quả xanh của chựm quả 2 -
3, mụ tả mức ủộ: xanh nhạt, xanh, xanh ủậm
+ Màu sắc vai quả xanh: quan sát sự khác nhau về màu xanh vai quả so với phần cũn lại của quả trưởng thành lứa quả 2-3, mụ tả mức ủộ: khụng ủổi, xanh nhạt, trung bỡnh, xanh ủậm
+Màu sắc quả chín: quan sát màu quả của chùm quả thứ 2 - 3 khi chín hoàn toàn + đánh giá hương vị quả: có hay không hương vị thơm ựặc trưng của cà chua hoặc có hương vị phụ khác (hăng, ngái)
+ ðộ Brix%: ủo khi quả chớn hoàn toàn (dựng khỳc xạ kế), lấy ngẫu nhiờn quả của lứa 2-3 của 5 cây mẫu, phân tích chậm nhất sau thu hoạch 3 ngày, các mức:
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………
32 thấp (dưới 3,5%), trung bình (3,6-4,4%), cao (4,5 - 6,0%), rất cao (trên 6%)
+ Khẩu vị (*): ủỏnh giỏ cảm quan theo cỏc mức: chua, chua dịu, nhạt, ngọt dịu, ngọt, ngọt ủậm
+ ðộ ướt thịt quả (*): dùng dao sắc cắt ngang quả và phân biệt: ướt - mặt thịt quả ướt, không có dịch quả chảy ra; khô nhẹ - mặt thịt quả lấm tấm dịch quả; khô - mặt thịt quả ráo nước
(*): theo hướng dẫn của trung tâm nghiên cứu và phát triển giống rau chất lượng cao, ðại học Nông nghiệp Hà Nội
- đánh giá tình hình nhiễm một số sâu bệnh hại chắnh trên ựồng ruộng: bệnh mốc sương và hộo xanh ủược ủỏnh giỏ theo tiờu chuẩn ngành 10TCN219:
2006 của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn (bộ NN và PTNT), bệnh xoăn vàng lỏ ủược ủỏnh giỏ theo chỉ số mức ủộ nghiờm trọng bệnh (Lapidot và Friedmann, 2002)
+ Bệnh mốc sương (Phytophthora infestans): ủỏnh giỏ sau trồng 30, 60 và
90 ngày theo thang ủiểm từ 0 ủến 5:
[1] Dưới 20% diện tích thân lá nhiễm bệnh
[2] Từ 20-50% diện tích thân lá nhiễm bệnh
[3] Từ 50-75% diện tích thân lá nhiễm bệnh
[4] Từ 75-100% diện tích thân lá nhiễm bệnh
+ Bệnh héo xanh vi khuẩn (Ralstonia solanacerum Smith): theo dõi từ trồng ủến thu hoạch, ủếm số cõy cú triệu chứng bệnh, tớnh tỷ lệ% cõy bệnh
+ Bệnh virus xoăn vàng lỏ: theo dừi từ trồng ủến kết thỳc thu hoạch, ủỏnh giỏ theo chỉ số mức ủộ nghiờm trọng bệnh từ 0 ủến 4:
[0] không thấy xuất hiện các triệu chứng bệnh;
[1] vàng rất nhẹ ở mộp lỏ chột trờn lỏ ủỉnh;
[2] biến vàng nhẹ và ủỉnh lỏ chột cuốn nhẹ;
[3] một loạt các lá vàng, xoăn, và cong hình thìa nhưng cây vẫn tiếp tục phát triển;
[4] các cây cây còi cọc rất nặng, lá vàng, xoăn, và cong hình thìa rất rõ, cây
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………
Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………
3.3.2 Nghiên cứu phát hiện gen Ty-3 kháng virus xoăn vàng lá và gen chín chậm rin
DNA được chiết xuất theo phương pháp CTAB (Doyle và Doyle, 1990) và đã được cải tiến bởi bộ môn Công nghệ Sinh học Ứng dụng, Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Phương pháp CTAB cho phép tách DNA an toàn và hiệu quả từ các mẫu có nhiều polysaccharide và phenol, đảm bảo chất lượng DNA cao cho các nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học Các cải tiến nhằm tối ưu hóa điều kiện phản ứng, giảm nhiễu và tăng năng suất chiết được ứng dụng rộng rãi để phù hợp với nhiều loại mẫu khác nhau Việc áp dụng CTAB cải tiến tại Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội góp phần nâng cao chất lượng DNA cho các dự án nghiên cứu và ứng dụng trong nông nghiệp công nghệ cao.
DEB (DNA Extraction Buffer) được pha từ 2% CTAB (w/v), 1,5 M NaCl, 100 mM Tris-HCl, 20 mM EDTA, 2% PVP (w/v) và 2% β‑Mercaptoethanol Hòa tan CTAB và các hóa chất khác trong nước cất hai lần bằng cách ủ ở 65 °C Thêm 2% β‑Mercaptoethanol ngay trước khi sử dụng.
+ TE buffer: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0
+ Hóa chất khác: Phenol : Chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1), Chloroform: isoamyl alcohol (24:1), 100 % ethanol, 76 % ethanol
- Qui trình chiết xuất DNA:
+ Thu cỏc lỏ non vào buổi sỏng, ủặt trờn ủỏ lạnh và ủưa về phũng thớ nghiệm càng sớm càng tốt
Phương pháp xử lý số liệu
Cỏc số liệu nghiờn cứu ủược xử lý bằng phần mềm Excel 2007.