Luận văn thạc sĩ đánh giá đặc điểm nông sinh học và đa dạng di truyền của một số dòng ngô nổ tự phối đời f5 tại gia lâm hà nội

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… iv4.2 ðặc ñiểm nông sinh học của các dòng ngô nổ thí nghiệm 31 4.2.1 ðặc ñiểm sinh trưởng và phát triển của

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-    -

NGUYỄN THỊ BIÊN

ðÁNH GIÁ ðẶC ðIỂM NÔNG SINH HỌC VÀ ðA DẠNG DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ DÒNG NGÔ NỔ

TỰ PHỐI ðỜI F5 TẠI GIA LÂM – HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT

Mã số : 60.62.01

Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN VĂN CƯƠNG

HÀ NỘI - 2012

Trang 2

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, chưa có ai công bố

Tác giả

Nguyễn Thị Biên

Trang 3

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… ii

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tôi ñã nhận ñược sự chỉ bảo, giúp ñỡ tận tình, các thầy cô giáo Khoa Nông học- ðại học nông nghiệp Hà Nội cùng bạn bè và gia ñình

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Cương ñã tận tình hướng dẫn, tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt luận văn của mình

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới các thầy giáo, cô giáo trong

Bộ môn Di truyền - Chọn giống cây trồng – Khoa Nông học – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã quan tâm giúp ñỡ và ñộng viên tôi trong quá trình thực tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia ñình, người thân, bạn bè ñã trợ giúp tôi về tinh thần và vật chất trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp!

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2012

Học viên

Nguyễn Thị Biên

Trang 4

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ iii

2.1 Tình hình sản xuất, sử dụng ngô trên thế giới và Việt NamError! Bookmark not defined

3.5 Kỹ thuật chăm sóc và theo dõi các chỉ tiêu ngoài ựồng ruộng 27

4.1 Diễn biến thời tiết khắ hậu vụ Thu đông 2011 31

Trang 5

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… iv

4.2 ðặc ñiểm nông sinh học của các dòng ngô nổ thí nghiệm 31

4.2.1 ðặc ñiểm sinh trưởng và phát triển của các dòng ngô nổ thí

4.2.7 Một số chỉ tiêu về bông cờ, lượng râu và khả năng phun râu 47

4.2.8 Sâu, bệnh hại và ñặc tính chống ñổ gẫy của ngô nổ 51

4.2.9 Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất lý thuyết của các

Trang 6

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… v

CIMMYT : Trung tâm cải lương Ngô và Lúa mỳ Quốc tế

AFLP : Tính ña hình chiều dài các phân ñoạn ñược nhân bản

SSR : Trình tự lặp lại ñơn giản

RAPD : Phân tích AND ña hình ñược nhân bản ngẫu nhiên

DNA : Deoxyribonucleic acid

dNTP : Deoxy ribunucleotid triphotphat

EDTA : Ethylene Diamin Tetracetic acid

TAE : Tris – Acetate - EDTA

TE : Tris - EDTA

Tris : Trioxymetylaminometan

Trang 7

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… vi

DANH MỤC BẢNG

2.1 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới từ 2003 - 2010Error! Bookmark not defined.2.2 Sản xuất ngô Việt Nam giai ñoạn 1990 -2011.Error! Bookmark not defined

3.2 Tên và trình tự các mồi sử dụng trong thí nghiệm 26

4.1 Thời gian sinh trưởng của các dòng ngô nổ thí nghiệm 32

4.2 ðộng thái tăng trưởng chiều cao cây của các dòng ngô nổ thí

4.3 ðộng thái tăng trưởng số lá của các dòng ngô nổ thí nghiệm 37

4.4 Số lá, diện tích lá và chỉ số diện tích lá của các dòng ngô nổ thí

4.5 Các ñặc trưng hình thái cây của các dòng ngô nổ thí nghiệm 43

4.7 Các ñặc trưng hình thái bắp của các dòng ngô nổ thí nghiệm 48

4.8 Một số chỉ tiêu về bông cờ, lượng hạt phấn và khả năng phun râu

4.9 Một số ñặc tính chống chịu của các dòng ngô nổ thí nghiệm 52

4.10 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của một số dòng

4.12 Chỉ số chọn lọc và các ñặc trưng nông học của 4 dòng ngô nổ

4.13 Số phân ñoạn AND xuất hiện ở từng dòng ngô nghiên cứu 61

4.14 Tỷ lệ phân ñoạn ña hình khi sử dụng 8 phân ñoạn ña hình 68

4.15 Hệ số tương ñồng của các dòng ngô nổ nghiên cứu 71

Trang 8

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… vii

DANH MỤC HÌNH, ðỒ THỊ

ðồ thị 4.1: ðộng thái tăng trưởng chiều cao cây của một số dòng ngô nổ

ðồ thị 4.2: Tốc ñộ tăng trưởng số lá của một số dòng ngô nổ thí nghiệm 38

ðồ thị 4.3: Chỉ số diện tích lá của một số dòng ngô nổ thí nghiệm qua

Hình 4.1 Kết quả RAPD các dòng ngô nổ với mồi OPA 03 62

Hình 4.2 Kết quả RAPD các dòng ngô nổ với mồi OPA 12 63

Hình 4.3 Kết quả RAPD các dòng ngô nổ với mồi OPB 07 64

Hình 4.4 Kết quả RAPD các dòng ngô nổ với mồi OPF 05 65

Hình 4.5 Kết quả RAPD các dòng ngô nổ với mồi OPM 02 66

Hình 4.6 Kết quả RAPD các dòng ngô nổ với mồi OPL 11 67

Hình 4.7 Biểu ñồ mô tả quan hệ di truyền của 40 dòng ngô nổ 73

Trang 9

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 1

1 MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Cây ngô ( Zea mays L ) là một loại cây lương thực dễ trồng, có khả

năng thích ứng rộng và cho năng suất cao Ngô có nguồn gốc từ Mêhicô, trải qua quá trình thuần hóa và chọn lọc lâu dài ñể trở thành một trong những loại cây trồng quan trọng nhất Trong số những cây trồng làm lương thực chính trên thế giới, ngô ñứng ở vị trí thứ ba, chỉ sau lúa mỳ và lúa nước

Ngô làm lương thực cho người; ngô là cây thức ăn gia súc quan trọng nhất, 70% chất tinh trong thức ăn gia súc là lấy từ ngô [1] Ngô còn ñược sử dụng làm thực phẩm: Ngô bao tử làm rau; ngô nếp, ngô ñường dùng ñể ăn tươi hoặc ñóng hộp xuất khẩu; ngô nổ ñược sử dụng làm bỏng ngô và một số loại bánh hấp dẫn Ngô còn là nguyên liệu của ngành công nghiệp nhẹ và công nghiệp thực phẩm ñể sản xuất ra tinh bột, gluco, bánh kẹo,… Ở nhiều vùng trên thế giới, cây ngô gắn liền với ñời sống văn hóa, tinh thần của người dân thông qua các hoạt ñộng tín ngưỡng

Trên thế giới , cây ngô có diện tích khoảng 162,3 triệu ha ( FAO, 2011) với nhiều loại ngô khác nhau như ngô lai, ngô nếp, ngô ñường, ngô rau, ngô nổ

Ngô nổ ( Zea mays Everta sturt) là một loại ngô ñặc biệt ñược người

dân Châu Mỹ phát hiện ra từ hàng ngàn năm trước ñây, có giá trị dinh dưỡng cao và rất ñược ưa chuộng Ngô nổ ñược sử dụng làm caramel, trang trí , bỏng ngô, chất dẫn dụ côn trùng, thức ăn gia súc… Ngô nổ ñược trồng khá nhiều ở

Mỹ, Trung quốc , Brazil và một số nước khác

Trước ñây, Việt Nam có một số giống ngô nổ ñịa phương như ngô nổ Tây Nguyên, ngô nổ Hồng, ngô nổ dài, ngô nổ tím …Hiện nay, diện tích trồng loại ngô này ngày càng ít, thậm chí có nguy cơ biến mất Tuy nhiên, nhu

Trang 10

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ 2

cầu ngô nổ nước ta hiện nay hiện hữu với số lượng lớn với vai trò là thực phẩm ăn quà Tại các siêu thị , hạt ngô nổ ựược nhập nội dưới dạng thực phẩm ựược bán khá ựắt nhưng vẫn ựược khách hàng tiêu thụ mạnh [2] Trong khi ựó các ựề tài nghiên cứu và ứng dụng về ngô nổ rất ắt

và ựa dạng di truyền của ngô nổ là hết sức cần thiết ựể góp phần duy trì, bảo tồn nguồn gen, phục vụ công tác chọn tạo những giống ngô nổ mới trong thời

gian tới, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ựề tài Ộ đánh giá ựặc ựiểm nông

sinh học và ựa dạng di truyền của một số dòng ngô nổ tự phối ựời F5 tại Gia Lâm Ờ Hà NộiỢ

1.2 Mục ựắch yêu cầu của ựề tài

- đánh giá một số ựặc tắnh sinh trưởng, phát triển, khả năng chống chịu,

năng suất và ựộ nổ của các dòng ngô nổ trong vụ thu ựông 2011

- Tiến hành PCR- RAPD , xác ựịnh khoảng cách di truyền của các dòng

ngô nổ, từ ựó xác ựịnh ựược mức ựộ ựa dạng di truyền của các dòng ngô nổ

Trang 11

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nguồn gốc và phân loại ngô nổ

Ngô nổ (Zea mays subsp.everta Sturt) thuộc loài Zea mays, chi Zea, họ

Poaceae (Gramineae) Cách ñây khoảng 1000 năm, ngô nổ ñược người bản ñịa Châu Mỹ phát hiện ra và ngày nay ñược trồng khá nhiều ở các nước như Mỹ, Braxin, Trung Quốc… Ở Việt Nam trước ñây có một số giống ñịa phương như: Ngô nổ Tây Nguyên, ngô nổ Dài, ngô nổ Hồng (ðăk Lăk), ngô nổ Tím (Cao Bằng)…

Căn cứ vào màu sắc hạt và màu sắc lõi ngô ñể phân thành các thứ như sau:

Bảng 2.3 Phân loại ngô nổ Màu sắc

Tên loài phụ

Tên thứ

Trang 12

2.2 ðặc ñiểm và giá trị của ngô nổ

Ngô nổ là một loại ngô thực phẩm, bắp ngô nổ bé, hạt ngô nổ không như các loại hạt ngô khác vì khi gặp nhiệt ñộ cao thì có thể nổ phồng lên rất to, gọi là bỏng ngô Hạt ngô tương ñối nhỏ, dạng hạt gạo, hạt ngọc, có loại hạt nhọn ở ñầu, hạt có vỏ cứng và nội nhũ hầu như hoàn toàn là nội nhũ sừng Khi bị làm nóng, ñộ ẩm trong hạt gây áp lực ép lên thành vỏ hạt, hạt nổ ra với thể tích lớn Hạt bị nổ là do lớp sừng bên ngoài hạt có chất keo dai và ñàn hồi, chứa lượng protein cao; khi nhiệt ñộ còn trong giới hạn hạt chịu ñựng ñược thì hạt có thể chống ñược áp suất hơi nước, khi vượt quá giới hạn ñó thì không thể giữ ñược, hạt ñột nhiên trương to rồi nổ ra làm nội nhũ bật ra thành một ñám bột tơi và nhanh chóng khô lại và xốp, thể tích có thể tăng 15 – 30 lần [5]

Giống ngô nổ có nhiều loại, màu sắc hạt cũng khác nhau như: màu trắng, vàng, ñen, ñỏ, tím, trắng có sọc vàng hoặc sọc tím, hoặc sọc ñỏ … Tuy hạt ngô có màu khác nhau nhưng khi ñã nổ thành bỏng ngô thì thường có màu trắng Chỉ có vỏ hạt ngô là giữ ñược màu sau khi ñã nổ, bỏng ngô nổ xốp và giòn Ngoài ra còn có dạng ngô nổ jargon là loại hạt khi nổ có bỏng ngô trắng sáng như tuyết, ñược ưa chuộng trong ñời sống Loại ngô nổ "nấm" có bỏng hình tròn, sáng, vỏ mỏng ăn giòn [44]

Ngay sau khi thu hoạch ñem nổ ngô sẽ không tốt vì ñộ ẩm hạt còn cao

sẽ nổ kém và mảnh nổ dai Do ñó sau khi thu hoạch cần phơi khô hoặc sấy cho ngô khô nhưng nếu ngô quá khô thì tỷ lệ nổ sẽ giảm, giảm chất lượng hạt

nổ Hạt không nổ do không ñủ ñộ ẩm ñể tạo áp suất nổ hoặc là do vỏ hạt bị răn thủng (Bruce Hamaker of Purdue University) ðộ ẩm thích hợp ñể nổ ngô thường là 14 – 15% trọng lượng hạt ngô Có rất nhiều cách ñể nổ ngô tạo bỏng: dùng máy ñể nổ ngô (Charles Creators thế kỷ 19) làm bỏng ngô với số lượng nhiều; dùng chảo cho một ít dầu ăn vào, khi dầu sôi cho ngô vào nổ nếu

Trang 13

số lượng ít hoặc nổ ngô bằng lò vi sóng Khi nổ ngô có thể thêm ñường, bơ vào ñể tạo vị ngọt và mùi thơm cho bỏng ngô

Ngô nổ ñược chế biến làm bánh ngọt, túi bỏng ngô, hộp ngô nổ, bánh kẹo, dầu ăn…, làm thức ăn chăn nuôi rất tốt cung cấp nhiều protein cho ñộng vật Ở một số vùng trên thế giới dùng ngô nổ ñể làm các thực phẩm như: ngô caramel ở Bắc Mỹ, chế biến bỏng ngô nổ thành Toffee (tương tự caramel) ở nước Anh bán ñược giá và rất ăn khách Ngô nổ có mùi rất hấp dẫn, kích thích khứu giác của con người do trong ngô nổ có chứa các hợp chất thơm 6-acetyl-2,3,4,5-tetrahydropyridine và 2-acetyl-1-pyroline, các chất này ñược sử dụng làm chất phụ gia ñể cho các sản phẩm ñó có mùi như bắp rang

Bảng 2.4 Thành phần dinh dưỡng của 100g ngô nổ

Năng lượng 380 kcal 1600 Kj

Nguồn: USDA Nutrient database

Ngoài ra, ngô nổ còn ñược dùng ñể trang trí lễ hội (tường hoặc cây Noel của một số nơi ở Bắc Mỹ và bán ñảo Balkan), sử dụng trong ngành công nghiệp ñiện, sản xuất túi nilon tự phân hủy, làm chất dẫn dụ côn trùng…[47]

Ngô nổ ñược trồng khá nhiều ở Mỹ, Trung quốc, Braxin và các nước khác Ở Mỹ, hàng năm sản xuất 498,000 tấn ngô nổ trong số ñó có 103,000 tấn ñược nổ bán ra thị trường [24] và có ít nhất 6 vùng ngô nổ ñược mệnh danh

“Thủ ñô ngô nổ của thế giới” là: Valparaiso- Indiana; Van Buren- Indiana;

Trang 14

Marion- Ohio; Ridgway- Illinois; Schaller- Iowa; và North Loup- Nebraska [44]

2.3 Tình hình nghiên cứu ngô nổ trong và ngoài nước

* Ngoài nước:

Ngô nổ ñược trồng ở khá nhiều nước trên thế giới mặc dù không ñược phổ biến và rộng rãi như các giống ngô nếp, ngô tẻ, hay ngô lai khác nhưng ngô nổ có nhiều ñặc ñiểm, tính chất khác biệt Ziegler K E và Ashman B (Khoa nông học, ðại học Tổng hợp Iowa, Mỹ) nghiên cứu về ngô nổ và nhận thấy ngô nổ khác với tất cả các loại ngô khác về màu trắng tuyết của hạt sau khi nổ nhờ sử dụng nhiệt ñộ [20]

Trong nghiên cứu sự liên quan giữa các tính trạng ở ngô nổ của Prodhan, H S., Rai, R (ðại học Nông nghiệp Ấn ðộ) cho thấy có sự liên quan giữa khối lượng và năng suất hạt nổ của ngô nổ nghiên cứu trên 154 dạng Năng suất hạt ñã liên kết chặt với trọng lượng hạt [16]

Khi nghiên cứu ảnh hưởng của các dòng ngô nổ từ dãy núi Ander ñến

sự phát triển của các nguồn gen lấy hạt ở Trung Âu; Hadi, G (Viện hàn lâm khoa học Hunggari) cho biết các dòng ngô cổ sớm, nhiều hàng, ngô ñá hạt cứng có màu hạt nâu ở Trung Âu, và một số dòng ngô răng ngựa ở vùng Chutucuno Chico và Chutucuno Grande (Timothy et al, 1961) chịu lạnh, cảm quang ánh sáng ngày dài, bắp nhỏ, nhiều hàng, nhiều bắp, giống ngô nổ hạt cứng, màu hạt ñỏ nâu ñươc giới thiệu ở Hunggari và Italy Nguồn gen này có

ý nghĩa cho các nước Châu Âu trong chọn giống [12]

Khi nghiên cứu về ảnh hưởng của mật ñộ gieo trồng ñến năng suất và phát triển cây ngô nổ, Joel Grosbach (Bộ môn khoa học và kỹ thuật trường McPherson College) cho thấy sản xuất ngô nổ hàng hẹp có tiềm năng tăng năng suất hơn hàng rộng và mật ñộ hàng hẹp còn làm hạn chế cỏ dại [13] Zhang, J H và cộng sự (Khoa cây trồng, ðại học Nông nghiệp Thượng Hải, Trung Quốc) ñã sử dụng chiều cao cây, trọng lượng 100 hạt, năng suất hạt, tỷ lệ hạt nổ, thời gian nổ và mức ñộ nổ ñể phân loại 8 giống ngô thuộc 3

Trang 15

nhóm phân tắch bằng cách nghiên cứu tắnh trạng số lượng trong phân loại các giống ngô nổ Các giống Guangxiban, Quảng đông 1, Quảng đông 2 và Quảng đông 3 ựược ựề nghị làm nguồn gen (vật liệu) cho chọn giống [19] Wang XiaoLi và cộng sự (đại học Nông nghiệp Henan, Zhengzhou

450002, Trung Quốc) nghiên cứu quần thể và khả năng kết hợp của ngô nổ

với các dòng thuần ngô thường thuộc các nhóm di truyền khác nhau ựã dùng

mô hình NC II, 6 dòng ngô nổ lai với 10 dòng và có 9 tắnh trạng ựược phân tắch Kết quả cho thấy hầu hết trọng lượng hạt/bắp của 60 tổ hợp ngô nổ x ngô thường ựều cao hơn nhiều so với ựối chứng nhưng khối lượng bỏng nổ của chúng rất thấp Vì vậy, ngô nổ lai với ngô thường không có giá trị sử dụng trực tiếp Có 6 dòng ngô nổ ựược xếp vào 4 nhóm di truyền với N04, N05 và N14 cùng nhóm, còn 3 dòng còn lại thuộc 3 nhóm khác [18]

Ly Y L và cộng sự (Khoa Nông học, đại học Nông nghiệp Henan, Zhengzhou 450002, Trung Quốc) nghiên cứu ựa dạng di truyền của các dòng ngô nổ tự phối và nguồn gen của chúng liên quan với các dòng ngô tự phối thường ựã sử dụng phương pháp SSR marker Tập hợp có 56 dòng ngô nổ tự phối và 21 dòng ngô thường tự phối ựược chọn lọc là nhóm có ưu thế lai ựể ựánh giá mức ựộ ựa dạng di truyền giữa các dòng ngô nổ tự phối và nghiên cứu quan hệ di truyền giữa chúng Kết quả cho thấy khoảng cách di truyền giữa các nhóm ưu thế lai của ngô nổ tự phối và các dòng ngô thường tự phối

là khác nhau Phân tắch quần thể các dòng tự phối nhận thấy sự khác biệt giữa nguồn gen nhiệt ựới và cận nhiệt ựới 56 dòng ngô nổ tự phối và 21 dòng ngô thường tự phối ựược chia thành 7 nhóm ưu thế lai tương ứng với kết quả nghiên cứu và chọn giống thực tế trước ựây Từ kết quả thu ựược cho thấy các SSR makers có thể ựược sử dụng ựể ựo khoảng cách di truyền giữa các dòng ngô nổ tự phối, sắp chúng vào nhóm ưu thế lai và sử dụng cho việc nghiên cứu nguồn gen của chúng liên quan ựến các dòng ngô thường tự phối [14] Khi nghiên cứu phân tắch khả năng kết hợp chung và khả năng kết hợp

Trang 16

riêng của quần thể ngô nổ, bao gồm cả bố mẹ tự phối, Viana, J M S và Matta, F de P ựã phân tắch hiệu quả của khả năng kết hợp chung và khả năng kết hợp riêng trong phân tắch lai diallel của quần thể giao phấn, có cả bố mẹ

tự thụ phấn cho thấy, việc phân tắch sự thay ựổi giá trị của quần thể do tự phối còn cho phép ựánh giá trực tiếp tắnh trội, sự lệch trội và sự thay ựổi di truyền trong mỗi quần thể bố mẹ Phương pháp này ựược sử dụng ựể chọn lọc quần thể ngô nổ trong chương trình chọn giống quần thể và sản xuất hạt lai ựược đại học liên bang Vicosa, Minas, Braxin phát triển Kết quả phân tắch ựã có 2

quần thể ngô nổ hạt ngọc ựược chọn ựưa vào sản xuất [17]

*Trong nước:

Trước những năm 1990 ở Việt Nam ngô nổ ựược trồng khá nhiều ở một

số tỉnh miền núi phắa bắc, vùng Tây Nguyên và có màu sắc ựa dạng, giòn và rất thơm ngon Hiện nay, ngô nổ rất hiếm thấy trên ựồng ruộng Việt Nam Một số kết quả ựiều tra thu thập gần ựây cho thấy nguồn giống ngô nổ ở nước ta không nhiều và ựang bị mất dần do xói mòn nguồn gen có thể dẫn ựến tuyệt chủng Các nghiên cứu về ngô nổ lai trong nước còn rất

ắt, chỉ có một vài công bố chắnh thức

Trong khi nguồn giống ngô nổ ựang bị mất dần, nguồn gen bị xói mòn thì hạt ngô nổ vẫn ựược nhập dưới dạng thực phẩm và ựược bán khá ựắt tại các siêu thị nhưng vẫn ựược tiêu thụ mạnh Do ựó Việt Nam cần chú trọng và có nhiều nghiên cứu về ngô nổ nhằm ngăn chặn xói mòn, bảo tồn và phát triển nguồn gen, từ ựó góp phần làm vật liệu ban ựầu cho công tác chọn tạo giống Trường đại Học Nông nghiệp Hà Nội, Viện Nghiên cứu Ngô và một số

cơ quan khác có lưu giữ một số lượng các mẫu giống ngô nổ nhưng không nhiều Gần ựây nhất là công trình nghiên cứu ựánh giá về sinh trưởng, phát triển và khả năng tạo bỏng của ngô nổ vụ Thu đông 2009 tại vùng Gia Lâm Ờ

Hà Nội của Nguyễn Văn Cương và Nguyễn Văn Lộc (Khoa Nông học, trường đại học Nông nghiệp Hà Nội), kết quả cho thấy ngô nổ phắa Bắc có thời gian sinh trưởng 102 Ờ 125 ngày; chiều cao cây 123,5 Ờ 198,5 cm; số lá trung bình

Trang 17

14,4 – 18,8 lá; số bắp trên cây 1 – 2 bắp; số hàng hạt/bắp 10,0 – 16,0 hàng; số hạt/ hàng 12,4 – 32,0 hạt; năng suất của các dòng ngô nổ không cao, trong ñó

Trang 18

2.4 Cơ sở khoa học của ñề tài

2.4.1 Dòng thuần

2.4.1.1 Dòng thuần và phương pháp tạo dòng thuần

Dòng thuần là khái niệm tương ñối ñể chỉ các dòng tự phối ñã ñạt tới

ñộ ñồng ñều và ổn ñịnh cao ở nhiều tính trạng Dòng tự phối là dòng ñồng hợp tử ñược tạo ra do thụ phấn cưỡng bức bằng phấn của chính nó hoặc chị

em với nó trong nhiều ñời Tự phối sẽ làm giảm kiểu gen dị hợp tử và làm tăng kiểu gen ñồng hợp tử

ðối với cây ngô, thường sau 7-8 ñời tự phối sẽ ñạt tới sự ñồng ñều cao

ở nhiều tính trạng ñược coi là dòng thuần Khi sử dụng các dòng thuần mang nhiều các ñặc ñiểm di truyền và sinh lý khác xa nhau làm các dạng bố mẹ trong phép lai sẽ cho phép tạo ra những tổ hợp lai có ưu thế lai cao ðây là cơ

sở cho phép tạo ra những giống ngô lai mới có năng suất cao, sức sống tốt và

ñộ ñồng nhất về di truyền ở thế hệ F1

Vật liệu ñể tạo ra dòng thuần rất ña dạng, bao gồm các giống ngô ñịa phương, giống ngô thụ phấn tự do cải tiến, các giống ngô lai, …

* Các phương pháp tạo dòng thuần ở ngô

Các phương pháp tạo dòng thuần ñược sử dụng trên thực tế:

+ Tạo dòng thuần bằng phương pháp truyền thống (tự phối cưỡng bức – Inbrreeding) Là phương pháp ñược sử dụng phổ biến.Với những dòng có tốc

ñộ ñồng huyết nhanh làm cho quá trình chọn lọc bằng mắt kém hiệu quả Trong trường hợp này tự phối cưỡng bức ñược thay thế bằng phương pháp cận huyết ñồng máu (Fullsib) hoặc nửa máu (Haflsib) hoặc sib hỗn dòng

có thể tạo ra những dòng có sức sống và năng suất tốt hơn dòng rút ra bằng tự phối, nhưng thời gian ñạt tới ñộ ñồng hợp tử dài hơn

Cách tiến hành: Tiến hành bao cách ly bắp khi sắp phun râu và bao

cách ly bông cờ khi nở ñược 1/3 bông cờ Sau ñó tiến hành tự phối cưỡng

Trang 19

bức cho cây, sau 7-8 ñời tự phối như vậy sẽ thu ñược dòng thuần ( Jugenhire, 1976)

+ Tạo dòng thuần bằng phương pháp cải biên: ðể tránh làm giảm

sức sống một cách quá ñáng và trong ñiều kiện hoa ñực hoa cái nở không

cùng lúc hoặc do sự bất hợp mà người ta sử dụng phương pháp tạo dòng

thuần bằng phương pháp cải biên Phương pháp này có sự khác biệt so với

phương pháp thụ phấn cưỡng bức là người ta cho thụ phấn giữa các cây

cùng mẹ có quan hệ chị em Với phương pháp này có thể tạo ra những

giống có sức sống và năng suất tốt hơn dòng rút ra từ con ñường tự phối

Tuy nhiên thời gian ñạt ñến ñộ ñồng hợp tử cao hơn, kéo dài thời gian

chọn lọc dòng [1]

+ Tạo dòng bằng phương pháp nuôi cấy Invitro: ðây là phương

pháp cho phép tạo dòng thuần rất nhanh (chỉ sau một vài thế hệ là tạo ra

ñược dòng thuần) bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn, hạt phấn tách rời

hoặc noãn chưa thụ tinh trong môi trường nhân tạo ñể tạo ra các thể ñơn

bội và ñơn bội kép

+ Tạo dòng thuần bằng phương pháp “thuần hoá tích hợp”

(Additivo cumulative Inbreeding) là phương pháp phát triển dòng thuần

ngô khoẻ mạnh với một số tính trạng quan tâm ñược cải thiện Phương

pháp “thuần hoá tích hợp” ñược công bố lần ñầu tiên vào năm 1999

trong luận án tiến sĩ nông nghiệp của Nguyễn Thị Lưu “Nghiên cứu

chọn tạo giống ngô lai nhiều bắp” Bằng phương pháp này tác giả ñã

tạo ñược các dòng thuần từ MSB.2649, G.5408,…với những ñặc ñiểm

ñịnh trước, ñặc biệt là tán lá bó và tính nhiều bắp

Trong bốn phương pháp trên, tạo dòng thuần theo phương pháp

truyền thống vẫn là tốt hơn cả vì nó tạo ra các dòng thuần có khả năng kết

hợp (KNKH) cao mà các phương pháp khác không có ñược

Trang 20

2.4.1.2 Chỉ số chọn lọc (Selection Index – SELINDEX)

Việc lựa chọn hay loại bỏ dòng trong công tác chọn tạo giống phụ thuộc vào mục tiêu tạo giống Mục tiêu của chúng ta là chọn ra cá thể tốt nhất trong chương trình chọn tạo của mình Tuy nhiên mỗi cá thể mang rất nhiều tính trạng khác nhau, bởi vậy khi tiến hành chọn lọc cần phải xem xét ñồng thời tất cả các tính trạng quan trọng ñối với một loài cây trồng Chỉ số chọn lọc là cơ sở cho việc chọn lọc ñồng thời nhiều tính trạng thông qua sự nhận biết và phân biệt các kiểu gen mong muốn với các kiểu gen không mong muốn dựa vào kiểu hình Công thức tính chỉ số chọn lọc:

I = b1P1 + b2P2 + … + biPi + … + bnPn

Trong ñó: I: chỉ số chọn lọc

2.4.2 Tình hình nghiên cứu tính ña dạng di truyền ở thực vật

2.4.2.1.Một số phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu quan

hệ di truyền thực vật

2.4.2.1.1 Kỹ thuật RFLP(ña hình ñộ dài các ñoạn cắt giới hạn)

Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật sử dụng các endonuclease giới hạn cắt DNA

hệ gen ở trình tự nhận biết ñặc trưng tạo ra hàng loạt ñoạn DNA có ñộ dài xác ñịnh, số lượng các ñoạn này ñược phát hiện bởi ñánh dấu phóng xạ các mẫu

dò DNA bổ sung tạo ra từ một locus RFLP là chỉ thị ñồng trội Ưu ñiểm của RFLP là: chỉ thị tin cậy trong phân tích liên kết và chọn giống vì chúng có thể xác ñịnh ñược một tính trạng ở trạng thái ñồng hợp hoặc dị hợp trong một cá thể, tận dụng ñược biến dị tự nhiên, phát hiện tính biến dị của DNA trong các giai ñoạn phát triển ở cơ quan khác nhau và xây dựng quan hệ di truyền, nghiên cứu quan hệ họ hàng Nhược ñiểm của RFLP là kỹ thuật phức tạp, tốn

Trang 21

kém và mất thời gian Phương pháp này ñòi hỏi một lượng DNA lớn 200ng từ mỗi cá thể)

(50-Ignjatovic-Mic D và cs (2003) ñã sử dụng kỹ thuật RFLP kết hợp với kỹ thuật RAPD ñể xác ñịnh quan hệ di truyền của 2178 giống ngô ñịa phương Kết quả xác ñịnh khoảng cách di truyền dao ñộng từ 0,1311 ñến 0,5075 Tác giả kết luận, dữ liệu phân tích RAPD và RFLP ñều cho kết quả giống nhau nên có thể dùng cả hai phương pháp này ñể xác ñịnh ña hình di truyền

Moretti A và cs (2008) ñã sử dụng RFLP ñể xác ñịnh quan hệ di truyền của Fusarium subglutinans gây bệnh ở ngô

2.4.2.1.2 Kỹ thuật AFLP (ña hình ñộ dài các ñoạn ñược nhân bản chọn lọc)

Kỹ thuật AFLP là kỹ thuật kết hợp của RFLP và PCR AFLP phát hiện một cách có chọn lọc các ñoạn DNA hệ gen ñược cắt bởi enzyme giới hạn và gắn với adaptor (ñoạn tiếp hợp) AFLP hoạt ñộng dựa trên nhiều nguyên tắc tương tự như RAPD, tuy nhiên có ñiểm khác biệt là mồi bao gồm hai phần: phần cố ñịnh dài khoảng 15 bp chứa ñiểm nhận biết của enzyme giới hạn, phần thay ñổi dài khoảng 2-4 bp Phân tích sản phẩm PCR ñược diện di trên gel polyacryamide có ñộ phân giải cao Sự ña hình ñược xác ñịnh bởi sự có mặt hay không có mặt của một phân ñoạn DNA AFLP rất có hiệu quả trong xác ñịnh quan hệ di truyền và lập bản ñồ Hiện nay, phân tích AFLP sử dụng phương pháp nhuộm bạc nên dễ áp dụng, tuy giá thành cao hơn với phương pháp RAPD Kỹ thuật AFLP có ưu ñiểm là phân tích ña hình trong khoảng thời gian ngắn, ñòi hỏi lượng DNA ít, cho sự ña hình cao, tuy nhiên việc thiết

Trang 22

Hartings H và cs (2008) cũng sử dụng kỹ thuật RAPD, RFLP, AFLP và SSR ñể xác ñịnh khoảng cách di truyền của 54 giống ngô Italy [22]

Garcia và cs (2004) ñã kết hợp các kỹ thuật RAPD, RFLP, AFLP và SSR ñể nghiên cứu ña dạng di truyền của 18 dòng ngô lai Sử dụng kỹ thuật AFLP thu ñược 774 băng ña hình, kỹ thuật RAPD khuếch ñại ñược

262 băng DNA, kỹ thuật RFLP thu ñược 185 băng và SSR nhận ñược 68 băng ña hình [23]

Thomas Lubberstedt và cs (2000) ñã xác ñịnh quan hệ di truyền của một

số giống ngô lai bằng kỹ thuật AFLP với việc sử dụng 8 mồi AFLP thu ñược

462 băng DNA ña hình [24]

2.4.2.1.3 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat – trình tự lặp lại ñơn giản)

Kỹ thuật SSR còn ñược gọi là kỹ thuật microsatellies (vi vệ tinh) Kỹ thuật này ñược Litt và Luty phát triển năm 1989 dựa trên nguyên tắc của PCR [21]

Trong cấu trúc hệ gen của sinh vật nhân chuẩn tồn tại một loạt các trình

tự nucleotide lặp lại, chúng ñặc trưng cho loài SSR gồm 2-5 nucleotide lặp

ñoạn SSR Số lần lặp lại nhiều lần làm cho các phân ñoạn DNA ñược nhân có

ñộ dài ngắn khác nhau Các trình tự lặp lại thường có ở vùng dị nhiễm sắc thể trên mỗi nhiễm sắc thể Chúng có vai trò ñiều hòa hoạt ñộng của các gen, góp phần làm tăng tính ổn ñịnh cơ học của nhiễm sắc thể trong phân bào, nó có thể mang thông tin di truyền liên quan ñến sự xác ñịnh giới tính ở cả ñộng vật

và thực vật Do sự khác nhau về số lượng nucleotide trong mỗi ñơn vị lặp lại

mà số ñơn vị lặp lại xuất hiện sự ña hình về ñộ dài của SSR ñược nhân bản Mức ñộ ña hình ñược xác ñịnh sau khi ñiện di sản phẩm trên gel agarose và gel polyacrylamide SSR ñược phân tích trên nhờ PCR nên chỉ cần ñòi hỏi một lượng mẫu DNA rất nhỏ SSR là công cụ hữu ích trong phân tích hệ gen

và chọn giống cây trồng vì ñây là chỉ thị ñồng trội có khả năng phát hiện tính

Trang 23

ña hình rất cao Trong thực tế chỉ thị này ñã ñược sử dụng nghiên cứu một số tính trạng liên quan ñến năng suất, bệnh dại, xác ñịnh giới tính, phân tích quan hệ di truyền, lập bản ñồ gen…Song nhược ñiểm của chỉ thị này là sự phức tạp trong thiết kế mồi và ñánh giá thiết kế mồi cao

Kỹ thuật SSR ñược Qi-lun Yao và cs (2007) sử dụng ñể xác ñịnh khoảng cách di truyền của 54 giống ngô từ Tây Nam Trung Quốc dựa trên 42 cặp mồi SSR, tổng số alelle thu ñược là 256, trung bình mỗi locus có 6,1 alelle [25]

Legesse B.W và cs (2007) cũng sử dụng kỹ thuật này ñể nghiên cứu mức ñộ ña dạng di truyền và ñánh giá cấu trúc gen của các dòng ngô lại cận huyết Kết quả thu ñược 104 alelle với khoảng cách di truyền xác ñịnh ñược

từ 0,28 ñến 0,73, giá trị PIC là 0,58 [26]

Sharopova N và cs(2002) ñã sử dụng kỹ thuật SSR ñể lập bản ñồ di

2.4.2.1.4 Kỹ thuật RADP(Ramdom AmplyfiedPolymorphic ADN)

Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật phân tích sự ña hình các phân ñoạn DNA ñược nhân bản ngẫu nhiên, do hai nhóm nghiên cứu của Willams và CS (1990) [28] và Welsh và McClelland (1991) ñồng thời xây dựng [51] ðây là một kỹ thuật phát hiện chỉ thị di truyền dựa trên phản ứng chuỗi polymerase (PCR) [29] PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phân tích hệ gen thực vật,

vì nó có khả năng tạo ra một lượng lớn các trình tự DNA ñặc hiệu từ bất kỳ

cơ thể nào Hiện nay PCR ñược xem là phương pháp nhanh, chính xác, tương ñối ñơn giản ñể ñánh giá sinh vật chuyển gen, phân tích nhanh chóng sự biến

dị di truyền ở phạm vi quần thể và giữa các cá thể

Sự hạn chế lớn nhất của kỹ thuật này là phải dựa trên một trình tự DNA ñặc hiệu Tuy nhiên, hạn chế này ñã ñược các nhà sinh học phân tử cải tiến,

Trang 24

khắc phục ñó là kỹ thuật PCR sử dụng ñoạn mồi ngẫu nhiêu hay còn gọi là kỹ thuật RAPD [30]

Các thành phần cần thiết ñể tiến hành phản ứng RAPD bao gồm :

- DNA khuôn (DNA template) với nồng ñộ 5-50 ng trong 25 µl

- ðoạn mồi (primer) : chỉ sử dụng một mồi ñó là một oligonucleotide

có trật tự nucleotide ngẫu nhiên và có chiều dài khoảng 10 nucleotide

- DNA polymerase : Hoạt ñộng của DNA-polymerase phụ thuộc vào

dùng là Taq-polymerase

- Bốn loại deoxyribonucleotide triphotphat (dNTP)

Phản ứng RAPD ñược tiến hành qua các giai ñoạn giống như PCR :

cho hai mạch khuôn tách nhau

bám vào sợi DNA khuôn

bắt cặp với các mạch ñơn sẽ ñược kéo dài với sự tham gia của polymerase

Taq-Sau một chu kỳ gồm ba giai ñoạn như trên, một phân ñoạn DNA khuôn ñược nhân lên thành hai, các ñoạn DNA ñược nhân bản trong mỗi chu kỳ lại ñược coi là DNA khuôn cho mỗi chu kỳ nhân bản tiếp theo Vậy sau k chu kỳ

có thể thực hiện từ 40 – 45 chu kỳ

Kỹ thuật RAPD có ưu ñiểm ở chỗ sử dụng các mồi ngẫu nhiên dài 10 nucleotide, quá trình nhân bản DNA là ngẫu nhiên ðoạn mồi này có thể bám vào bất kỳ vị trí nào có trình tự nucleotide bổ sung trên phân tử DNA hệ gen

Trang 25

Với ñặc ñiểm là ngắn nên xác suất ñoạn mồi có ñược ñiểm gắn trên phân tử DNA khuôn là rất lớn Tùy vào nhóm, loài thực vật hay vi sinh vật mà các ñoạn mồi ngẫu nhiên ñược thiết kế chuyên dụng Theo lý thuyết, số lượng mà các ñoạn DNA ñược nhân bản phụ thuộc vào ñộ dài, vị trí của các ñoạn mồi, kích thước và cấu trúc DNA genome Thông thường mỗi ñoạn mồi ngẫu nhiên sẽ tạo ra từ 2 – 10 sản phẩm nhân bản Kết quả là sau khi ñiện di sản phẩm RAPD sẽ phát hiện ñược sự khác nhau trong phổ các phân ñoạn DNA ñược nhân bản Sự khác nhau ñó gọi là tính ña hình Hiện tượng ña hình các ñoạn DNA ñược nhân bản ngẫu nhiên xuất hiện là do có sự biến ñổi trình tự nucleotide tại vị trí các ñoạn mồi liên kết Sản phẩm khuếch ñại ñược phân tích bằng ñiện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide và có thể quan sát ñược sau khi gel ñược nhuộm bằng hóa chất ñặc trưng Vì vậy, tính ña hình thường ñược nhận ra do sự có mặt của một sản phẩm nhân bản [31]

Trong những năm gần ñây, kỹ thuật RAPD ñược sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu ña dạng di truyền Nhiều nghiên cứu ñã cho thấy, RAPD

là một phương pháp có hiệu quả trong việc xác ñịnh kiểu gen, phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền và lập bản ñồ di truyền Phương pháp này còn ñược ứng dụng trong việc ñánh giá bộ gen của giống và khả năng phân tích

Kỹ thuật RAPD còn dùng ñể nhận biết, phân loại các giống cây trồng khác nhau như chuối, lúa mì, ñu ñủ, ñậu tương và phát hiện, bảo tồn sự ña dạng di truyền ñặc biệt là các loài quí hiếm hay một số guống thực vật ñịa phương

2.4.2.1.5 Nghiên cứu sự ña dạng di truyền ở thực vật bằng kỹ thuật RAPD

Hiện nay, kỹ thuật RAPD ñã và ñang ñược ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu và xác ñịnh quan hệ di truyền ở thực vật Kỹ thuật RAPD cũng ñược ứng dụng trong việc ñánh giá ña dạng di truyền giữa các loài và trong việc phạm

vi một loài phân tích và ñánh giá hệ gen thực vật nhằm xác ñịnh những thay ñổi

Trang 26

của các dòng chọn lọc ở mức ñộ phân tử [32], [33] Phương pháp này còn ñược ứng dụng trong việc ñánh giá bộ gen của giống và khả năng phân tích mối quan

hệ di truyền giữa các loài, nhóm các cá thể cùng một loài [7]

Kỹ thuật RAPD ñược sử dụng rộng rãi ñể phân tích di truyền hệ thống sinh học Nó là phương pháp hiệu quả trong việc xác ñịnh kiểu gen, phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền và lập bản ñồ di truyền trên lúa, ngô, ñậu tương, lạc

2.4.2.1.6 Tình hình nghiên cứu sự ña dạng di truyền của ngô bằng kỹ thuật RADP

Vasconcelos M.J.V.D và cs (2008) sử dụng kỹ thuật RAPD trên cây ngô với 47 mồi ngẫu nhiên ñã nhân ñược 221 băng DNA trong ñó có

130 băng biểu hiện ña hình [34]

Souza S.G.H.D và cs (2008) xác ñịnh quan hệ di truyền của 16 dòng ngô lai với sử dụng 22 mồi RAPD khuếch ñại ñược 265 băng DNA

và 16 cặp mồi SSR khuếch ñại ñược 75 băng DNA, 16 dòng ngô ñược chia thành 3 nhóm [35]

Okumus A (2007), 17 giống ngô của Turkey ñược sử dụng nghiên cứu với 14 mồi RAPD thu ñược 125 băng ña hình (chiếm 89%), hệ số sai khác giữa các dòng ngô từ 0,08 – 0,2 [36]

Abdel – Mawgood A.L và cs (2006) ñã sử dụng một số các chỉ thị phân tử RAPD, SSR, 18S rRNA gen ñể kiểm tra các dòng ngô, trong ñó

có ba giống ngô tự nhiên (L1, L2, L3) và hai giống lai F1 bắt nguồn từ họ H1 và H2 Hai trong 5 mồi RAPD sử dụng nghiên cứu biểu hiện tính ña hình, một trong những mồi cho ña hình ñã xác ñịnh ñược con lai H2 từ hai dòng thuần ðối với 18S rRNA thì không phát hiện ñược các băng ña hình [37]

Asif M và cs (2006) ñã tiến hành phân tích DNA cho 6 giống ngô lai bằng cách sử dụng các mồi ngẫu nhiên ñể khuếch ñại ña hình DNA

Trang 27

bằng kỹ thuật RAPD Tác giả ñã sử dụng 40 mồi ngẫu nhiên, trong ñó có OPR – 03, OPR – 11 và OPR – 06 ñã cho ña hình Kết quả ñã kiểm tra ñược 3 trong rất nhiều giống ngô lai và cũng phân biệt ñược nguồn gốc của một số giống ngô lai Tác giả ñã kết luận RAPD là một công cụ hữu hiệu ñể phát hiện sự tinh khiết của giống lai nhằm nâng cao hiệu quả trong trồng trọt và chăn nuôi [38]

Valdemar P.C và cs (2004) nghiên cứu khoảng cách di truyền của

81 giống ngô trong ñó có 79 thuộc vùng bắc Châu Âu và 2 giống cải tiến Sử dụng kỹ thuật RAPD với 32 mồi ñược khuếch ñại, cao nhất là

255 chỉ thị mà có 184 băng DNA (chiếm khoảng 72,2%) là ña hình Dựa trên những chỉ thị RAPD, việc lập một phả hệ sử dụng phương pháp UPGMA Tỷ lệ kiểu di truyền tương tự nhau từ 0,78 ñến 0,91 nhóm số liệu phân tử tập hợp thành 2 nhóm chính, mà màu sắc hạt có tương quan với nhau [39]

Naureen Z Và cs (2005) nghiên cứu ña hình của 30 chủng vi khuẩn ở rễ ngô nhằm chọn tạo giống ngô cho năng suất cao và tách dòng

vi khuẩn rhizo rễ ngô Các tác giả ñã sử dụng 30 mồi oligonucleotide, kết quả sự ña dạng di truyền ñạt mức ñáng kể với khoảng cách di truyền

2 -16% [40]

Amorime P và cs (2003) ñã sử dụng các chỉ thị phân tử RAPD và SSR ñể chọn lọc 13 giống ngô ñường Trong ñó, sử dụng 50 mồi RAPD tạo ñược 104 băng (chiếm 72,2%), còn sự phân tích SSR ñánh giá 7 locus với 42 alen ñạt giá trị PEC từ 0,5 ñến 0,89 Ước tính sự tương ñồng di truyền ñối với mồi RAPD là 0,79 còn chỉ thị SSR là 0,49 [41]

Trang 28

Osipova E.S và cs (2001) nghiên cứu sự khác nhau di truyền học giữa dòng ngô A188 và dòng soma bắt nguồn, ñược ñánh giá qua sự phân tích của kỹ thuật RAPD Sử dụng 15 mồi trong số 17 mồi decanucleotide, từng mồi cho sự khuếch ñại ñạt từ 2 – 17 phân ñoạn dài

200 – 2000 bp Mô hình RAPD không khác giữa những các cá thể của dòng A188, biểu hiện tính ñồng nhất về di truyền học cao Sự khác nhau giữa dòng ban ñầu và dòng soma cao từ 64 – 72% Căn cứ vào sự phân

ly di truyền dòng soma chia làm 2 nhóm Sự phân biệt những nhóm dòng soma này phù hợp với nguồn gốc của chúng [42]

Bauer I (2005) nghiên cứu ñặc tính trưởng thành sớm của ngô lai thu ñược bằng cách ñánh dấu protein và RAPD Khi sử dụng mồi RAPD cho thấy tỷ lệ ña hình cao hơn ñánh dấu protein [43]

Ở Việt Nam, Bùi Mạnh Cường và cs (2002) ñã tiến hành nghiên cứu sự ña hình di truyền của một số giống ngô và xác ñịnh ñược một số cặp lai ưu tú có khả năng cho ưu thế lai cao [3] Ngô Hữu Tình và cs (2002), nghiên cứu khoảng cách di truyền của các cặp lai và nhóm ưu thế lai ở một giống ngô, kết quả tuyển ñược 7/28 cặp lai cho năng suất cao [4]

Ngô Việt Anh (2005) ñã sử dụng kỹ thuật RAPD với 5 mồi ngẫu nhiên ñã nhận ñược 150 phân ñoạn DNA ñược nhân bản ngẫu nhiên từ

hệ gen của 7 giống ngô nếp ñịa phương [8]

2.5 Nhận xét chung

Tăng cường diện tích trồng ngô lai ở nước ta là cần thiết nhăm tăng năng suất ngô ñể sản lượng ñạt và vượt ngưỡng trung bình thế giới Tuy nhiên, thực tế sản xuất ngô Việt Nam vẫn còn thiếu các giống ngô phục vụ ăn tươi, chế biến thực phẩm Vì vậy, việc nghiên cứu ñặc ñiểm nông sinh học các

Trang 29

dòng ngô nổ là hết sức cần thiết nhằm tìm ra các giống ngô nổ có phẩm chất tốt và năng suất ổn ựịnh phục vụ sản xuất

Những công trình nghiên cứu ựánh giá sự ựa dạng di truyền của cây ngô còn ắt Sự ựa dạng di truyền sẽ chỉ ra ựược sự sai khác giữa các dòng ngô nghiên cứu ở mức ựộ phân tử và tắnh ựa dạng nguồn gen cây ngô

3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu

- Vật liệu nghiên cứu bao gồm 40 dòng ngô nổ tự phối ựược trình bày ở

bảng 3.1

- Hóa chất: Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết ựược nhập từ các nước đức, Mỹ, Trung Quốc như: Enzym Taq polymerase MIX, Ethidium bromide, mồi, Sorbitol, EDTA, TrisHCL, dNTPs, NaCl, agaroseẦvà các hóa chất thông dụng khác

- Thiết bị: Thiết bị ựể thực hiện ựề tài thuộc Phòng thắ nghiệm bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ Vi sinh, khoa Công nghệ sinh học, trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Bao gồm các thiết bị như: Tủ sấy dụng cụ, máy ựo

pH, máy PCR, máy Vontex, bể ổn nhiệt, bộ chụp ảnh và xử lý ảnh sau ựiện di, máy lắc lạnhẦ

3.2 Thời gian và ựịa ựiểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: Các thắ nghiệm của ựề tài ựược tiến hành từ

tháng

8/ 2011 ựến tháng 12/2011 trong vụ Thu đông 2011

Trang 30

- địa ựiểm: + Thắ nghiệm ựánh giá ựặc ựiểm nông sinh học của các dòng ngô nổ ựược bố trắ tại khu thắ nghiệm ựồng ruộng Bộ môn Di truyền Ờ Chọn giống, trường đại học Nông nghiệp Hà Nội

+ Thắ nghiệm xác ựịnh ựa dạng di truyền của các dòng ngô nổ ựược thực hiện tại phòng thắ nghiệm bộ môn Sinh học phân tử và công nghệ vi sinh,

Khoa Công nghệ sinh học, trường đại học Nông nghiệp Hà Nội

3.3 Nội dung nghiên cứu

- Theo dõi các ựặc ựiểm nông sinh học của các dòng ngô nổ ựược nghiên cứu trong vụ Thu ựông 2011

- đánh giá ựa dạng di truyền của các dòng ngô nổ theo chỉ thị phân tử RAPD

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Bố trắ thắ nghiệm ựồng ruộng

- Thắ nghiệm ựược bố trắ tuần tự không nhắc lại, mỗi công thức gieo 2 hàng

- Khoảng cách gieo: 70cm ừ 25cm ừ 1 cây/hốc

- Mật ựộ: 5,6 vạn cây/ha

3.4.2 đánh giá các ựặc ựiểm hình thái của các dòng bố mẹ

- Dựa vào các chỉ tiêu ựo ựếm ngoài ựồng ruộng

+ Chỉ tiêu về sinh trưởng

+ Chỉ tiêu về hình thái

+ Chỉ tiêu về tắnh chống chịu

+ Chỉ tiêu về năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất

+ độ nổ

Trang 31

Bảng 3.1 Các dòng ngô nổ tham gia thí nghiệm

2 T2 No8 -1-1-1-1-1611 Bộ môn cây lương thực

3 T3 No8-01 Bộ môn cây lương thực

5 T5 N21 -1-1-1-1-1-1311 Bộ môn di truyền-giống

6 T6 T17 Bộ môn cây lương thực

7 T7 Mã lai 10 Bộ môn di truyền-giống

8 T8 TM5 X09 -1-1-1-1-1011 Bộ môn di truyền-giống

10 T10 TM5 XO9 -1-1-1-1-1011 Bộ môn di truyền-giống

11 T11 No7 - 02 Bộ môn di truyền-giống

12 T12 No20 - B11 Viện Nghiên cứu ngô

13 T13 N19 Viện Nghiên cứu ngô

14 T14 No -16 -B2 Bộ môn cây lương thực

16 T16 N19 Viện Nghiên cứu ngô

17 T17 No18-B4 Viện Nghiên cứu ngô

18 T18 TM5 X09 (2011) Bộ môn di truyền-giống

19 T19 No15 Viện Nghiên cứu ngô

21 T21 No1 - B1 Bộ môn cây lương thực

22 T22 Ve -1-1-1-1-1311 Bộ môn di truyền- giống

Trang 32

25 T25 TM2-2 XO9 -1-1-1-1- 1011 Bộ môn di truyền-giống

27 T27 No12 Viện Nghiên cứu ngô

30 T30 No11 - 01 Bộ môn di truyền-giống

31 T31 N17 -1-1-1-1-1311 Viện Nghiên cứu ngô

33 T33 Vêlê zuêla Bộ môn di truyền-giống

34 T34 N14 - B2 Viện Nghiên cứu ngô

35 T35 No22 Malaixia Bộ môn di truyền-giống

Trang 33

3.4.3 đánh giá ựa dạng di truyền của các dòng bố mẹ theo chỉ thị phân tử RAPD

3.4.3.1 Kỹ thuật PCR- RADP

- Phương pháp RADP ựược Wiliam, Welsh, McCleland ựề xuất vào năm 1990 Phương pháp này thực chất là quá trình nhân bản các ựoạn AND bằng kỹ thuật PCR có sử dụng các mồi ựược thiết kế ngẫu nhiên Các mồi này

sẽ bắt cặp một cách ngẫu nhiên vào AND khuôn ở bất kỳ vị trắ nào mà tại ựó

có trình tự bổ sung với nó

- Phương pháp RADP phù hợp cho phân tắch ựa dạng di truyền và phân tắch các dòng gần ựồng gen ( các dòng chỉ khác nhau ở một tắnh trạng)

3.4.3.2 Các bước tiến hành

* Chuẩn bị mẫu, tách chiết AND

- Chuẩn bị mẫu lá ngô: Mẫu lá của các dòng ngô ựược thu từ những cây treo biển ựánh dấu cho vào ống eppendort 2ml, sau ựó nhanh chóng cho vào ni tơ lỏng Mẫu lá ựược dùng ngay hoặc bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt ựộ

Trang 34

+ Bước 6: Bổ sung 350 µl Isopropanol lạnh, ñảo trộn nhẹ ðể trong tủ lạnh sâu 30 phút hoặc lâu hơn

+ Bước 8: Rửa tủa bằng 700 ethanol và ñể khô trong không khí

* Phương pháp PCR- RADP

+ Các mồi sử dụng:

Sử dụng 9 mồi theo bảng 3.2

Bảng 3.2 Tên và trình tự các mồi sử dụng trong thí nghiệm

Trang 35

* ðiện di sản phẩm RAPD

Pha agarose 2% trong TAE 1X Chạy ñiện di với hiệu ñiện thế 100V trong 90 phút Nhuộm bản gel bằng ethidium bromide 0,5 µg/ml trong 15 phút, rửa sạch bằng nước, soi gel trên ñèn UV và chụp ảnh

* Phân tích số liệu RAPD

Dựa trên sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân ñoạn DNA khi ñiện di sản phẩm RAPD của các giống ngô nổ với các ñoạn mồi ngẫu nhiên

ñể làm cơ sở cho sự phân tích số liệu theo quy ước: Số 1: xuất hiện phân ñoạn DNA, số 0: không xuất hiện các phân ñoạn DNA

Các số liệu này ñược xử lý trên máy vi tính theo chương trình NTSYSpc version 2.0 ñể xác ñịnh quan hệ di truyền của các giống ngô ở mức

Trang 36

* Bón phân:

+ Lượng phân bón cho 1ha như sau:

45kg phân vi sinh + 120kg N + 90kg P2O5 + 60kg K2O

+ Cách bón:

Phân vi sinh và phân lân bón lót toàn bộ

Phân ñạm và kali bón thúc chia thành 3 ñợt:

ngô ñược 3-5 lá

ngô ñược 7-9 lá

- Bón thúc ñợt 3: Bón ñợt phân còn lại vào giai ñoạn xoắn nõn

3.5 1 Các chỉ tiêu theo dõi

* Thời gian sinh trưởng (ngày): Từ khi mọc ñến các giai ñoạn

- Trỗ cờ: khi có ≥ 50 % số cây trỗ cờ

- Tung phấn: Ngày có ≥ 50 % số cây có hoa nở ñược 1/3 trục chính

- Phun râu: Ngày có ≥ 50 % số cây có râu nhú dài từ 2-3 cm

- Chín sinh lý: Ngày có 100 % cây có lá bị khô hoặc chân hạt có chấm ñen

* Các chỉ tiêu hình thái:

- Chiều cao cây (cm): ðo từ mặt ñất ñến ñiểm phân nhánh bông cờ dầu tiên

- ðộ cao ñóng bắp (cm): ðo từ mặt ñất ñến ñốt ñóng bắp trên cùng

- Số lá ( ñánh dấu lá số 5 ñến số 10)

- ðộng thái tăng trưởng chiều cao cây, 7 ngày ño một lần, ño từ mặt ñất ñến ñỉnh lá cao nhất

- ðộng thái tăng trưởng số lá, 7 ngày ño một lần

- ðo diện tích lá và chỉ số diện tích lá ở 3 thời kỳ: 7- 9 lá thật, xoắn nõn

và thời kỳ chín sữa

Dtb: Chiều dài trung bình của tất cả các lá trên cây

Trang 37

Rtb: Chiều dài trung bình của tất cả các lá có trên cây

0,7 là hệ số hiệu chỉnh

+ Chỉ số diện tích lá LAI (Leaf Area Index)

LAI (m2lá/m2ñất) = Diện tích lá (m2lá) / Diện tích ñất (m2)

* Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất:

- Chiều dài bắp: ðo khoảng cách giữa hai ñầu mút của hàng hạt dài nhất

- ðường kính bắp (cm): ðo ở giữa bắp

- Số hàng hạt/bắp: Một hàng ñược tính khi có 50 % số hạt so với hàng dài nhất

- Số hạt/ hàng: ðược ñếm theo hàng hạt có chiều dài trung bình

- Khối lượng 1000 hạt (gram) ở ẩm ñộ 14 %

- Tỷ lệ hạt / bắp (%): Mỗi ô thí nghiệm chọn ngẫu nhiên 10 bắp, tẽ lấy hạt tính tỉ

* P

100

* MC) - (100 SH

* FW

Trang 38

ðiểm 2: Có vết bệnh ở sát gốc

ðiểm 3: Vết bệnh lan ñen những ñốt sát gốc

ðiểm 4: Vết bệnh lan ñến bắp (lá bi)

ðiểm 5: Vết bệnh toàn cây

- Bệnh ñốm lá: (cho ñiểm từ 1 ñến 5 tương tự như với bệnh khô vằn)

kính ñáy)

3.6 Phương pháp xử lý số liệu

Xử lý bằng chương trình Excel, phần mềm chạy chỉ số chọn lọc SELINDEX, và chương trình NTSYS vesion 2.0

Trang 39

4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

4.1 Diễn biến thời tiết khắ hậu vụ Thu đông 2011

Trong vụ Thu đông năm 2011 tại Gia Lâm Ờ Hà Nội, tình hình thời tiết

có nhiều diễn biến phức tạp Những tháng ựầu vụ tuy có ựiều kiện nhiệt ựộ

cũng như sinh trưởng và phát triển của cây ngô nhưng trong thời gian này do chịu ảnh hưởng của những cơn mưa bão lớn ( ngày 12 Ờ 15/9, 19 Ờ 20/9, 29 Ờ 30/9 và 5 Ờ 8/10) ựã làm ảnh hưởng trực tiếp ựến sự nảy mầm, tỷ lệ nảy mầm cũng như sức sống của cây ngô, làm cho cây ngô sinh trưởng phát triển chậm

và giảm năng suất cây trồng Những tháng cuối trong vụ nhiệt ựộ thấp, lạnh kéo dài và cường ựộ ánh sáng yếu dẫn ựến quang hợp kém cũng làm giảm năng suất ngô

4.2 đặc ựiểm nông sinh học của các dòng ngô nổ thắ nghiệm

4.2.1 đặc ựiểm sinh trưởng và phát triển của các dòng ngô nổ thắ nghiệm

Thời gian sinh trưởng (TGST) của cây ngô ựược tắnh từ khi gieo hạt ựến khi chắn sinh lý Thời gian này thường không cố ựịnh mà thay ựổi theo dòng, giống, mùa vụ, kỹ thuật canh tác và ựiều kiện sinh thái của từng vùng

Qua theo dõi thắ nghiệm, chúng tôi nhận thấy: Các dòng ngô nổ thắ nghiệm trồng trong vụ Thu đông 2011 có TGST dao ựộng từ 103 Ờ 130 ngày, Chắn sớm nhất là hai dòng T2, T14( 103 ngày), muộn nhất là dòng T19 (130 ngày)

4.2.1.1 Giai ựoạn từ gieo ựến mọc

Các dòng ngô thắ nghiệm ựược gieo hạt vào ngày 28 tháng 08 năm

2011, ựiều kiện thời tiết tương ựối thuận lợi cho quá trình nảy mầm của hạt Nhiệt ựộ, ựộ ẩm không khắ và ựộ ẩm ựất thắch hợp nên quá trình hút nước và nảy mầm của hạt diễn ra khá thuận lợi

Trang 40

Bảng 4.1: Thời gian sinh trưởng của các dòng ngô nổ thí nghiệm

(%)

G-M (ngày)

G- TC (ngày)

G-TP (ngày)

G-PR (ngày)

TP-PR (ngày)

G-CSL (ngày)

Định dạng
Số trang	96
Dung lượng	1,44 MB