Luận văn thạc sĩ ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời TEMPORARY IMMERSION SYSTEM TIS trong nhân giống vô tính in vitro cây lan hồ điệp PHALAENOPSIS)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ---BÙI TRỌNG HẢI ỨNG DỤNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY NGẬP CHÌM TẠM THỜI TEMPORARY IMMERSION SYSTEM- TIS TRONG NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN V

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI



-BÙI TRỌNG HẢI

ỨNG DỤNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY NGẬP CHÌM TẠM THỜI (TEMPORARY IMMERSION SYSTEM- TIS)

TRONG NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN VITRO CÂY LAN

HỒ ðIỆP (PHALAENOPSIS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI -2013



-BÙI TRỌNG HẢI

ỨNG DỤNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY NGẬP CHÌM TẠM THỜI (TEMPORARY IMMERSION SYSTEM - TIS)

TRONG NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN VITRO

CÂY LAN HỒ ðIỆP (PHALAENOPSIS)

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi cũng xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Bùi Trọng Hải

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệu, Ban Quản lý ñào tạo, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ sinh học, các cán bộ và nhân viên Phòng Công nghệ Sinh học Thực vật – Viện Sinh học nông nghiệp - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều kiện thuận lợi, giúp ñỡ tôi về kiến thức và chuyên môn trong suốt thời gian học tập và làm luận văn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Lãnh ñạo Trung tâm Khoa học và Sản xuất lâm nông nghiệp Quảng Ninh, nơi tôi làm việc và công tác, ñã tạo ñiều kiện về mặt thời gian và vật chất, giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình tôi làm việc và thực hiện ñề tài nghiên cứu của mình

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia ñình, người thân và bạn bè ñã ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện ñề tài

Một lần nữa tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, tháng 11 năm 2013

Tác giả luận văn

Bùi Trọng Hải

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iii

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iv

Chương 2 ðỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.3.1 Thiết lập ñiều kiện nuôi cấy vô trùng và khởi ñộng quá trình nuôi cấy

.3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của thể tích môi trường nuôi cấy lên sự nhân

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp v

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng thể tích môi trường nuôi cấy lên sự nhân nhanh

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của các thông số hoạt ñộng của hệ thống Plantima

3.4.1 So sánh, ñánh giá hiệu quả nhân nhanh protocorm của hệ thống

3.4.2 Xác ñịnh giai ñoạn sử dụng hệ thống TIS hiệu quả trong quy trình

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vi

DANH MỤC BẢNG

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vii

DANH MỤC HÌNH

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp viii

ðK : ðường kính (ðường saccharose)

ðTST : ðiều tiết sinh trưởng

HSN : Hệ số nhân

MS : Murashige & Skoog, 1962

α-NAA : 1- Naphtalene Acetic Acid

TIS Hệ thống ngập chìm tạm thời (Temporary Immersion System)

VW : Vacin & Went, 1949

Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 1

MỞ đẦU

đặt vấn ựề

Lan Hồ ựiệp (Phalaenopsis) là loài hoa cao cấp, có giá trị thẩm mỹ và

giá trị kinh tế cao, ựược nuôi trồng phổ biến trên thế giới và trở thành một ngành thương mại mang lại lợi nhuận cao đài Loan, trung bình mỗi năm sản xuất và tiêu thụ trên 80 triệu sản phẩm Hồ ựiệp các loại, kim ngạch xuất khẩu năm 2009 ựạt 124 triệu USD (Số liệu của văn phòng kinh tế đài Loan, 2009) Trung Quốc, những năm qua tốc ựộ tăng trưởng của ngành sản xuất hoa lan là 20%/năm, trong ựó Hồ ựiệp là sản phẩm chủ lực Hiện nay, Trung Quốc xuất khẩu hoa lan ựi 22 nước trên thế giới, mỗi năm thu về trên 150 triệu USD (Nguyễn Quang Thạch, 2005)

Ở châu Âu và châu Mỹ, Hồ ựiệp cũng ựược sản xuất và tiêu thụ mạnh

mẽ không kém Năm 2002, ở Hà Lan, lan Hồ ựiệp từ số lượng tiêu thụ thứ 16 nhảy vọt lên vị trắ thứ hai Còn tại thị trường Mỹ năm 2004, hơn 35,7 triệu cây Lan Hồ ựiệp (tương ựương 102 triệu USD) ựã ựược tiêu thụ, xếp thứ 2 về doanh thu chỉ sau cây Trạng Nguyên (USDA Floriculture Crops, 2005)

Bắc Việt Nam có ựiều kiện sinh thái tương ựồng với các vùng trồng

Hồ ựiệp nổi tiếng của thế giới như Cao Hùng (đài Loan), Quảng Châu (Trung Quốc), tiềm năng phát triển lan Hồ ựiệp là rất lớn trong khi nhu cầu tiêu dùng trong và ngoài nước về loài hoa này còn rất cao để có thể phát triển ựược loài lan quý này như một sản phẩm nông nghiệp có giá trị cao của Việt Nam, việc nắm vững các khâu kỹ thuật về tạo giống, nhân giống và nuôi trồng hoa lan

Hồ ựiệp là yếu tố quyết ựịnh Tuy nhiên, những nghiên cứu cụ thể về vấn ựề này ở Việt Nam do nhiều nguyên nhân, cả chủ quan và khách quan, còn nhiều mặt hạn chế, nhiều khâu kỹ thuật quan trọng, ựặc biệt là công nghệ nhân giống còn ựược xem là bắ quyết không phổ biến

Trong khi trên thế giới cây giống Hồ ựiệp thực sinh từ gieo hạt in vitro

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 2

ñã bị ñào thải và thay thế bằng cây giống vô tính từ nuôi cấy mô phân sinh thì

ở Việt Nam kỹ thuật nhân giống Hồ Ðiệp phổ biến hiện nay vẫn là nhân giống

hữu tính (gieo hạt in vitro) trên môi trường thạch, với nhiều hạn chế ảnh hưởng

ñến chất lượng cây giống cũng như giá thành sản phẩm Giống cho sản xuất hiện nay vẫn chủ yếu phải nhập nội với giá thành cao, bị ñộng, khó kiểm soát ñược chất lượng cũng như nguy cơ lây lan dịch hại

Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Temporary Immersion System – TIS) là một công nghệ mới, hiện ñại, vừa kết hợp ñược các ưu ñiểm của nuôi cấy lỏng và nuôi cấy trên thạch, vừa khắc phục ñược nhược ñiểm của hai

hệ thống nuôi cấy trên, giúp tạo ra môi trường nuôi cấy thoáng khí, cây con khỏe mạnh, tỷ lệ sống sót cao, giảm chi phí nhân công và môi trường nuôi cấy

do không sử dụng thạch, hệ số nhân ñược gia tăng nhiều lần so với khi nhân giống trên hệ thống nuôi cấy thông thường

Nằm mục ñích khảo sát khả năng ứng dụng của hệ thống nhân giống mới này so với các hệ thống nuôi cấy truyền thống, góp phần ñẩy mạnh việc sản xuất cây giống với số lượng lớn, có chất lượng tốt và giá ñáp ứng yêu cầu của thực

tiễn sản xuất Chúng tôi tiến hành thực hiện ñề tài: “Ứng dụng hệ thống nuôi

cấy ngập chìm tạm thời Plantima trong nhân giống vô tính in vitro cây lan Hồ ñiệp (Phalaenopsis)”

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 3

- Xác ñịnh ñược các thông số vận hành tối ưu cho hệ thống ngập chìm tạm thời Plantima: Mật ñộ nuôi cấy, thể tích môi trường nuôi cấy, chu kỳ ngập

chìm ñến khả năng nhân nhanh protocorm và chồi in vitro

- So sánh, ñánh giá hiệu quả nhân giống của hệ thống ngập chìm tạm thời Plantima so với các hệ thống nhân giống khác: thạch, lỏng tĩnh, lỏng lắc Qua ñó xác ñịnh ñược giai ñoạn sử dụng hệ thống ngập chìm tạm thời Plantima

hiệu quả nhất trong quy trình nhân giống, ñưa ra quy trình nhân giống in vitro

ñã ñược cải tiến với hệ số nhân cao hơn, chất lượng cây giống tốt hơn

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Ý nghĩa khoa học

Kết quả của ñề tài sẽ cung cấp và bổ sung những dẫn liệu, cơ sở khoa học về việc ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân giống

vô tính in vitro lan Hồ ñiệp ở Việt Nam Từ kết quả này có thể áp dụng sang

cho những ñối tượng cây trồng khác

Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 4

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về lan Hồ ựiệp

1.1.1 Nguồn gốc và phân bố

Lan Hồ ựiệp có tên khoa học là Phalaenopsis Tên gọi này bắt nguồn từ

tiếng Hy Lạp, trong ựó Phalaina có nghĩa là Ộcon bướmỢ và Opsis có nghĩa là

Ộgiống nhưỢ, có nghĩa là loài hoa có hoa giống như cánh bướm Một cây lan có thể cho từ vài ựến vài chục bông hoa, rung rinh trong gió tạo dáng như quần thể bướm bay lượn nên rất ựược thị trường ưa chuộng

Lan Hồ ựiệp ựược phát hiện vào năm 1750, ựầu tiên ựược Rumphius ựặt

tên là Angraecum album Năm 1753, Linne ựổi tên thành Epidendrum amabile

đến năm 1825 thì ựược Blume, một nhà thực vật Hà Lan, ựịnh danh một lần

nữa là Phalaenopsis amabilis và tên gọi này ựược dùng cho ựến ngày nay

Hiện nay ựã tìm thấy trên 70 giống Hồ ựiệp nguyên thủy, ựại ựa số có nguồn gốc ở vùng Á nhiệt ựới Châu Á, phân bố chủ yếu ở Malaysia, Indonesia, Philippin, phắa đông Ấn độ và miền Bắc Australia Việt Nam

cũng có 6- 7 giống Hồ ựiệp nguyên thủy, ựó là: Phalaenopsis.gibbosa Sweet,

Phalaenopsis.mannii Rchob.f, Phalaenopsis braceana (Hook.f), Christenson, Phalaenopsis Lobbii (Rchob.f), Phalaenopsis.fuscata Rchob.f (Phạm Hoàng

Hộ, 2000)

Các giống Hồ ựiệp trồng làm hàng hoá hiện nay ựều là giống lai Trải qua quá trình lai tạo, tuyển chọn, bồi dục ựã tạo ra hàng vạn giống Hồ ựiệp lai So với giống nguyên thủy, các giống lai thường có hoa to, thời gian ra hoa kéo dài tới 2- 3 tháng, màu sắc và hoa văn thì vô cùng ựa dạng, phong phú, tạo lên một tập ựoàn các giống Hồ ựiệp lai hết sức ựồ sộ

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 5

Hình 1.1: Sự ña dạng và phong phú về màu sắc, hình dáng Lan Hồ ðiệp

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 6

Hình 1.2: Hình thái cây lan Hồ ñiệp

- Thân: Cây ñơn thân không có giả hành, ñược tạo ra bởi một ñỉnh sinh

trưởng hoạt ñộng liên tục Các ñốt thân rất ngắn và thường ñược bao bọc bởi hai hàng bẹ lá xếp dọc chiều dài thân

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 7

- Lá: Lá ñơn nguyên, dày, không cuốn, mọng nước, có bẹ ôm lấy thân

Hình dạng lá ñơn giản với màu xanh ñơn thuần hoặc tạp sắc Thông thường một cây có từ 4 - 5 lá, mỗi lá có hai chồi xếp chồng, chồi bên trên cho ra một trục phát hoa sau khi cảm ứng ra hoa, chồi bên dưới cho ra một cây con trong trường hợp có sự cố về hoạt ñộng của ñỉnh sinh trưởng ngọn

- Rễ: Rễ bất ñịnh, mọc từ gốc thân xuyên qua bẹ lá, khí sinh, phát triển

mạnh Xung quanh rễ có một màng xốp bao bọc Lớp mô xốp này dễ dàng hút nước, muối khoáng và các chất dinh dưỡng cho cây Số lượng rễ khá nhiều, rễ

to và hơi dẹp tạo thành một vành ñai tăng diện tích tiếp xúc với ánh sáng

- Hoa: Hoa mọc thành cụm, lưỡng tính, ñối xứng hai bên Bao hoa dạng

cánh, rời nhau, xếp thành hai vòng: 3 mảnh vòng ngoài và 2 mảnh vòng trong

bé hơn, mảnh thứ ba có hình dạng và màu sắc khác hẳn gọi là cánh môi Gốc cánh môi thường kéo dài ra, chứa tuyến mật Nhị và nhụy dính liền thành cột nhị nhụy Hạt phấn thường dính lại thành khối phấn Hai khối phấn ngăn cách nhau bởi trung ñới Bầu nhụy gồm 3 lá noãn dính nhau thành bầu dưới, mang

nhiều noãn, ñính bên [12] Hoàng Thị Sản, 2003)

Phát hoa hình thành ở nách lá (thường là một phát hoa), có dạng thẳng, ñôi khi phân nhánh Trung bình một phát hoa cho 7 - 15 hoa, mỗi hoa bền khoảng 2 tuần

- Quả: Quả của Hồ ñiệp thuộc dạng quả nang, mở bằng các khe nứt dọc

theo hai bên ñường của giá noãn Quả lan chứa vô số các hạt nhỏ li ti, tùy vào giống và loài mà quả có thể chứa vào trăm ñến vài ngàn hạt Hạt cần trải qua

130 - 150 ngày ñể trưởng thành Hạt nhỏ như hạt bụi, phát tán theo gió ñi xa

Phần lớn hạt bị chết vì chứa phôi chưa phân hóa Theo Bernard (1999), hạt lan muốn nảy mầm ñược phải cộng sinh ñược với nấm Rhizoctonia vì loại

nấm này có tác dụng khởi phát sự tái lập phân bào Trong thực nghiệm, người

ta có thể ñánh thức các “phôi sơ khai” (protocorm) khi sử dụng sốc thẩm thấu

bằng cách nuôi cấy hạt trên môi trường chứa sucrose (Bùi Trang Việt, 2000)

Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 8

- Keiki: Keiki chỉ một cây con mọc từ một mấu trên cuống hoa Một số

loài có hoa nhỏ như Phalaenopsis lueddemaniana thường tạo keiki trên cuống

hoa Hiện tượng này ựược Williams mô tả lần ựầu tiên vào năm 1894

(Williams và Williams, 1894) Keiki còn có thể ựược hình thành ở nhiều loài Phalaenopsis và một số loài thuộc các chi lai Chẳng hạn trong The Genus Phalaenopsis (Sweet,1980) có trình bày rõ khả năng phát triển cây con từ ựốt

phát hoa Phalaenopsis kunstleri ở Kew Gardens Keiki còn có thể hình thành

từ rễ ở các loài Philippin Phalaenopsis stuartiana (Williams và Williams, 1894)

và Phalaenopsis schilleriana (Davis và Steiner, 1952) Các cây Phalaenopsis

dưới ựiều kiện nuôi trồng không thuận lợi thường có xu hướng sẽ tạo ra keiki trên cuống hoa, ựặc biệt khi ựỉnh ựã bị cắt bỏ

1.2 Tình hình phát triển lan Hồ ựiệp trên thế giới và ở Việt Nam

1.2.1 Trên thế giới

Hiện nay, tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới ựang phát triển một cách mạnh mẽ và ựã trở thành một ngành thương mại có lợi nhuận cao Nhờ các thành tựu khoa học và sự phát triển về công nghệ sinh học ựược ứng dụng rộng rãi cùng với phương tiện giao thông phát triển mạnh mẽ, việc xuất, nhập khẩu hoa lan ngày càng tăng với quy mô rộng lớn Năm 2000, tổng giá trị hoa lan bán ựược xấp xỉ là 1,2 tỷ USD (Phan Thúc Huân, 2005)

Tại Hà Lan, lan Hồ điệp từ số lượng tiêu thụ thứ 16 nhảy lên vị trắ thứ 2 (năn 2002), diện tắch hoa lan ựược trồng trong nhà kắnh có tổng diện tắch là 3.081,75 ha Tắnh ựến năm 2003, kim ngạch xuất khẩu hoa phong lan của Hà Lan ựạt 1,8 tỷ USD Ngoài ra, Hà Lan còn ựầu tư 20 triệu USD vào Ấn độ ựể lắp ựặt các thiết bị, máy móc phục vụ cho sản xuất hoa lan xuất khẩu (Ngô Quang Vũ, 2002)

Khác với Thái Lan tập trung phát triển mạnh lan Dendorobium cắt cành, đài Loan lại chú trọng ựầu tư nhiều vào phát triển Hồ ựiệp Ở đài Loan, diện tắch trồng hoa cây cảnh là 12.481 ha, trong ựó diện tắch trồng lan là 484 ha

Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 9

Lan Hồ ựiệp của đài Loan ựược cả thế giới ngưỡng mộ và ựược tiêu thụ khắp toàn cầu Hiện nay, trung bình mỗi năm đài Loan sản xuất và tiêu thụ trên 80 triệu sản phẩm lan Hồ ựiệp các loại, kim ngạch xuất khẩu tăng lên không ngừng: 23,9 triệu USD (2004), 35,38 triệu USD (2006) và tăng vọt lên 124 triệu USD (2009), trong ựó Việt Nam là thị trường xuất khẩu ựứng vị trắ thứ 8 của đài Loan (Số liệu thống kê của Văn phòng kinh tế đài Loan, 2009)

Ở Mỹ, nhu cầu sử dụng hoa lan Hồ ựiệp cũng rất lớn đây là một trong hai loại cây cảnh có doanh số bán cao nhất theo thống kê nhiều năm liền của Bộ Nông nghiệp Mỹ (USDA) xếp thứ 2 về doanh thu sau cây Trạng Nguyên (Poinsettia) Năm 2004, thị trường Mỹ tiêu thụ hơn 35,7 triệu cây Lan Hồ điệp (tương ựương 102 triệu USD) Năm 2007 tổng giá trị hoa lan gần 144

triệu USD, tăng gần 12% so với năm 2006 (USDA Floriculture Crops, 2005)

Nhật Bản ựã ựầu tư 6,6 triệu USD cho Thái Lan ựể mở rộng cơ sở sản xuất với công suất 10 triệu cây hoa lan mỗi năm Hiện nay, Nhật cũng là khách hàng lớn nhất của Singapore với khả năng tiêu thụ 60% số cây lan của nước này (Phan Thúc Huân, 2005)

Từ những thập niên 1980 Trung Quốc cũng bắt ựầu học tập mô hình của đài Loan ựể sản xuất và nuôi trồng lan Hồ ựiệp Tuy là nước ựi sau, nhưng họ ựã tận dụng các lợi thế về ựất ựai, khắ hậu, thị trường rộng lớn ựể phát triển sản xuất hoa lan, những năm qua, tốc ựộ tăng trưởng trung bình của ngành sản xuất hoa lan của Trung Quốc là 20%/năm Trong các năm 2007-

2009, mặc dù khủng hoảng kinh tế toàn cầu, nhưng ngành lan của Trung quốc vẫn tăng trưởng 15%/năm Hiện nay, ở Trung Quốc ựã có hàng trăm công ty,

xắ nghiệp có quy mô lớn, mỗi năm sản xuất vài chục triệu cây Hồ ựiệp/năm, tập trung ở Quảng đông, Phúc Kiến, Bắc Kinh, Vân Nam, Sơn đông, Giang

Tô, v.v Ngoài tiêu thụ nội ựịa còn xuất khẩu lan ựi 22 nước trên thế giới, mỗi năm thu về khoảng 150 triệu USD Diện tắch trồng Hồ ựiệp ở Trung Quốc vẫn ngày càng tăng và nghề trồng lan Hồ ựiệp ở nước này ựã trở thành con ựường làm giàu chắc chắn (Nguyễn Quang Thạch, 2005)

Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 10

1.2.2 Ở Việt Nam

Hiện nay, Lan Hồ ựiệp ựược xem là cây trồng chiến lược trong việc chuyển ựổi cơ cấu cây trồng và vật nuôi đây là cây trồng ựem lại hiệu quả cao gấp 2- 3 lần so với việc trồng lúa, hoa màu Trong xu thế ựất trồng ngày càng hẹp thì cây lan không chiếm diện tắch ựất nhiều nên là giải pháp rất hiệu quả Không chỉ ựẹp về màu sắc, hình dáng, lâu tàn giá thành ngày càng hạ nên ngày càng ựược ưa chuộng và nuôi trồng

Ở khu vực phắa Nam, tại Tp Hồ Chắ Minh và các tỉnh lân cận có rất nhiều vườn trồng Lan Hồ ựiệp với qui mô từ vài trăm ựến vài nghìn cây điển hình là Công ty Lâm Thăng của đài Loan ựầu tư và Công ty Kim Ngân chuyên trồng về Lan Hồ ựiệp, hàng năm có thể cung ứng cho thị trường từ vài nghìn ựến vài chục ngàn cây, nhất là vào dịp Tết Nguyên đán Trang trại RINSUN của công ty Lâm Thăng tại Gia Hiệp - Di Linh - Lâm đồng ựã ựầu tư trang thiết bị hiện ựại có thể tự tạo ra nguồn cây giống ựể sản xuất Sản phẩm ựặc biệt ở ựây là lan Hồ ựiệp với 16 - 17 màu khác nhau Trang trại ựã ựầu tư 10.000 m2 diện tắch nuôi trồng hiện ựại, cung cấp 40.000 chậu lan Hồ ựiệp mỗi năm Ngoài tiêu thụ trong nước, lan Hồ ựiệp của trang trại còn xuất khẩu sang Mỹ, Nhật và các nước châu Âu, đông Nam Á (Phan Thúc Huân, 2005)

Ở khu vực phắa Bắc, nhất là tại thủ ựô Hà Nội, trong khoảng chục năm trở lại ựây khi ựời sống người dân ựược nâng cao, nhu cầu thưởng thức hoa lan tăng mạnh, nhiều khi cung không ựủ cầu, phong trào nuôi trồng Hồ ựiệp phát triển lan rộng (Hà Nội, Bắc Ninh, Hưng Yên, Hải Dương, Hải Phòng, Quảng Ninh, Thái Nguyên, ) khiến các nhà khoa học phải vào cuộc, ựi sâu nghiên cứu, triển khai ứng dụng, hợp tác sản xuất và thương mại hóa hoa lan

Tại Viện Sinh học nông nghiệp - Trường đại Học Nông Nghiệp I Hà Nội ựã cho ra ựời hàng vạn cây hoa lan có giá trị kinh tế như: Hồ ựiệp

(Phalaenopsis), Cát lan (Cattleya), Lan Thái (Dendrobium)Ầ Ngoài ra, Viện

Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 11

còn cố vấn kỹ thuật, chuyển giao quy trình nuôi trồng cho các ựịa phương như Bắc Giang, Lạng Sơn, Hải Phòng

Từ năm 2005, Viện Nghiên cứu Rau quả ựã tiến hành nhập nội một tập ựoàn các giống lan Hồ ựiệp, từ ựó ựánh giá tuyển chọn ựược bộ giống triển vọng có chất lượng hoa tốt, màu sắc phong phú, hoa tươi lâu, chống chịu tốt với ựiều kiện ngoại cảnh, ựược thị trường chấp nhận Từ năm 2006 ựến nay, song song với việc nhập nội giống Viện ựã làm chủ ựược công nghệ sản xuất hoa lan Hồ ựiệp khép kắn với qui mô công nghiệp và ựã ựược nhận cúp vàng tại hội chợ Techmart ASEAN+ 3 năm 2009, ựồng thời chuyển giao công nghệ cho các tỉnh như Bắc Ninh, Hải Dương, Hưng Yên, Năm 2008Ờ 2009 cung cấp cho thị trường 3 vạn cây giống và 4 vạn cây hoa thương mỗi năm

Tại Trung tâm kỹ thuật Rau Ờ Hoa - Quả Hà Nội, 2 năm trở lại ựây, phòng nuôi cấy mô hoạt ựộng cho ra ựời mỗi năm hàng vạn cây lan Hồ ựiệp giống và hàng vạn cây giống lan khác

Tại Trung tâm kỹ thuật Rau - Hoa - Quả Thường Tắn - Hà Tây, tiền thân là liên doanh hoa JAVECO ựược thành lập năm 1997 giữa Tổng Công ty Rau Quả Việt Nam và ựối tác Nhật Bản đến năm 2000 phắa Nhật ựã chuyển giao lại toàn bộ cơ sở vật chất kỹ thuật (phòng nuôi cấy mô hiện ựại nhất miền Bắc, 2 nhà kắnh nuôi trồng lan, 30 nhà ống vinyl và một số thiết bị khácẦ) cùng với một số quy trình nuôi trồng hoa lan cho phắa Việt Nam Hàng năm, Trung tâm cũng sản xuất hàng vạn cây giống và xử lý cho ra hoa hàng nghìn cây Hồ ựiệp

Trung tâm Khoa học và Sản xuất lâm nông nghiệp Quảng Ninh là ựơn

vị khoa học ựịa phương song cũng ựã ựầu tư nghiên cứu, áp dụng khá ựồng bộ

và bài bản dây chuyền sản xuất Hồ ựiệp thương phẩm quy mô công nghiệp với 3.500m2 nhà màng hiện ựại tiêu chuẩn đài Loan đặc biệt ở ựây ựã cải tiến công nghệ, tắch hợp thành công giai ựoạn nuôi trồng và xử lý thúc hoa tại chỗ ngay ở vùng thấp mà không phải ựem cây ựi xử lý thúc hoa ở các vùng núi

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 12

cao, từ năm 2010 ñến nay mỗi năm cung cấp cho thị trường 5-7 vạn cây hoa thương phẩm/năm

Nhìn chung, vấn ñề sản xuất, kinh doanh, xuất khẩu hoa lan ở Việt Nam (trong ñó có lan Hồ ñiệp) vẫn còn ở mức tiềm năng Trong khi ñó, sức cạnh tranh thị trường trên thế giới là rất lớn Những hoạt ñộng, kinh doanh và xuất khẩu trong thời gian qua có ý nghĩa khởi ñộng, hứa hẹn một sự phát triển trong tương lai dựa trên những ñiều kiện thuận lợi sẵn có cho sự phát triển ngành trồng lan Với sự ña dạng về loài lan hiện có với tiềm năng ñất ñai, khí hậu, lao ñộng, nếu Việt Nam chúng ta giải quyết ñồng bộ ñược các vấn ñề về giống, công nghệ thì trong tương lai không xa nhất ñịnh chúng ta sẽ trở thành

nước sản xuất lan lớn trong khu vực

1.3 Các nghiên cứu về nhân giống lan Hồ ñiệp

1.3.1.Nhân giống hữu tính

Nhân giống Hồ ñiệp bằng hạt là phương pháp thường dùng hiện nay ñể sản xuất cây giống hàng hoá Cây con mọc từ hạt gọi là cây giống thực sinh Lan Hồ ñiệp thường thường phải thụ phấn nhân tạo mới kết hạt ñược Nhưng hạt phát dục không hoàn chỉnh, không có phôi nhũ, chỉ có lớp vỏ hạt rất mỏng, gieo trồng trong ñiều kiện tự nhiên rất khó nảy mầm Năm 1922, Knudson – người Mỹ - phát minh ra phương pháp gieo hạt trong ñiều kiện vô trùng và có thể thu ñược một số lượng lớn các cây lan hoàn chỉnh thông qua nuôi cấy mô

tế bào Sự thành công này ñã thúc ñẩy quá trình chọn giống lan cũng như việc sản xuất cây giống và trồng cây lan theo mô hình công nghiệp Gieo hạt trong ñiều kiện vô trùng, hạt sẽ nảy mầm theo 1 trong 2 phương thức sau:

- Dạng thứ nhất là mọc qua thể tiền chồi (Protocorm): Khi hạt mới nảy mầm ñều hình thành nên thể tiền chồi hình cầu màu trắng, kích thước của thể tiền chồi lớn dần lên, trên bề mặt sẽ xuất hiện rễ giả dạng lông hút, tiếp ñó thể tiền chồi sẽ dần chuyển sang màu xanh lục, nhưng thể tiền chồi không mọc dài ra thêm, mà trên ñầu chóp của thể tiền chồi sẽ nảy mầm mọc ra chồi, thông thường các thể tiền chồi này ñều có khả năng phân hoá ra cây

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 13

- Dạng nảy mầm thứ hai là mọc qua thân rễ: Khi hạt nảy mầm, ban ñầu cũng là thể hình cầu màu trắng, nhưng sẽ mọc dài ra rất nhanh tạo thành một dạng hình trụ dài, rồi hình thành nên thân rễ Sau ñó, trên các

kẽ của bề mặt thân rễ mọc ra các rễ giả dạng lông mao, trên môi trường phân hoá, ñỉnh chồi của thân rễ sẽ mọc ra cây non, nhưng tỉ lệ phân hoá ra cây

là rất thấp, các giống lan ñịa sinh ñều nảy mầm theo phương thức này

Lan Hồ ñiệp sau khi ra hoa 4 – 6 ngày, tỷ lệ thụ phấn thành công là cao nhất Ánh sáng và nhiệt ñộ lúc thụ phấn ảnh hưởng rất lớn ñến kết quả thụ phấn Hạt phấn khi thụ phấn nhất thiết phải có màu vàng tươi, có ñộ dính tốt

và rời nhau, không kết mảng lại với nhau Nếu phấn hoa có màu vàng sẫm, nâu vàng bết lại với nhau thì thường thất bại

Sau khi thụ phấn thành công 3 – 4 tháng, quả có thể cấy vào ống nghiệm vô trùng Do trong một quả số lượng hạt rất nhiều, 1 quả lan có thể mọc ra hàng nghìn, hàng vạn cây Vì thế trồng lan công nghiệp chủ yếu vẫn dùng phương pháp gieo hạt vô trùng ñể nhân giống Hiện nay, tỷ lệ cây giống lan thực sinh chiếm 60% ~ 70% tổng số giống lan cung cấp cho thị trường Các bước gieo hạt trong ống nghiệm thao tác như sau:

a) Chọn quả lan: nên chọn các quả 4 tháng tuổi, quả căng ñều, không bị nứt vỡ, không bị sâu bệnh làm nguyên liệu ñể gieo hạt

b) Dùng cồn 75% rửa sạch quả, khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 10 phút Rửa lại quả bằng nước cất vô trùng 5 lần, thấm khô bằng giấy thấm vô trùng Dùng dao tách vỏ quả ñể lấy các hạt nhỏ li ti bên trong và gieo trên môi trường ñã chuẩn bị sẵn ðể gieo hạt lan có thể sử dụng các môi trường nền: Knudson C, Vacine&Went (VW), Murashige - Skoog (MS) có bổ sung thêm ñường và các chất hữu cơ như: dịch nghiền của khoai tây, chuối, cà rốt, nước dừa, pepton…

Nguyễn Quang Thạch và cộng sự tại Viện Sinh học Nông nghiệp- ðại học Nông nghiệp I Hà Nội ñã tiến hành các thí nghiệm trên một số giống

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 14

Hồ ñiệp nhằm tìm ñược tuổi quả thích hợp và loại môi trường nuôi cấy tối

ưu cho việc nhân giống Kết quả cho thấy: chỉ sau khi thụ phấn từ 100 ngày trở lên thì hạt Lan Hồ ñiệp mới ñủ ñộ chín và cho khả năng nảy mầm cao nhất; Môi trường có bổ sung các chất hữu cơ tự nhiên ở dạng riêng rẽ hay tổ hợp ñều có thể rút ngắn thời gian nảy mầm của hạt so với ñối chứng từ 5 - 10 ngày Trong ñó môi trường bổ sung thêm khoai tây tỏ ra có hiệu quả nhất, chỉ sau

20 ngày tất cả các hạt ñã nảy mầm và chất lượng chồi ñạt ñược rất tốt Sử dụng môi trường nền VW có bổ sung: (100mlND+10g ñường +1g pepton + 30g khoai tây+6,5g agar)/l ñể gieo hạt lan Hồ ñiệp là tốt nhất Hạt gieo sau

20 ngày sẽ nảy mầm, sau 50 - 60 ngày hình thành thể tiền chồi (protocorm) kích thước 1-2mm Sau ñó, chuyển các thể tiền chồi sang môi trường:

VW + (100mlND +10g ðK +1g pepton + 6,5g agar + 30g KT + 30g CR)/lít

ñể hình thành các cây non có 2 - 3 lá sau 60 ngày Tiếp tục cấy chuyển cây non sang chính môi trường này, khoảng 60 ngày sau sẽ tạo cây hoàn chỉnh (Nguyễn Quang Thạch, 2005)

Những nghiên cứu về nhân giống Hồ ñiệp bằng gieo hạt của nhiều tác giả khác cũng thu ñược các kết quả tương tự Ví dụ: khi gieo hạt trên môi trường Hoa Bảo số 1 (N-P-K = 7 - 9 - 16) + Chuối nghiền 50g/L + Pepton 2g/L + ñường sacarose 20g/L + agar 8g/L sau 15 ngày có thể quan sát ñược phôi màu xanh nhạt, sau 50 - 60 ngày hình thành thể tiền chồi kích thước 1,5 - 2mm, sau ñó chuyển sang môi trường Hoa Bảo số 1 hoặc môi trường MS + 1mg/L BAP, sau 50 ~ 60 ngày hình thành ra cây non có 2 - 3 lá sau ñó lại cấy chuyển sang môi trường ra rễ của Hoa Bảo số 1, khoảng 60 ngày sau

sẽ mọc ra cây 6 ~ 8cm hoàn chỉnh (Nguyễn Quang Thạch, 2005)

1.3.2 Nhân giống vô tính

1.3.2.1 Tách mầm

ðối với những loài ñơn thân như Phalaenopsis không có giả hành nhưng

trồng lâu năm cây vẫn cao lên, có nhiều rễ gió Trong ñiều kiện thích hợp, các

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 15

mầm tiềm tàng ở vị trí cao của cành hoa cũng có thể mọc thành keiki, có thể tách

ra ñem ñi trồng Muốn cắt trồng nên cắt phần ngọn có 3 rễ, bôi thuốc kích thích

ra rễ, dùng giá thể thật thoáng với than gỗ to Cũng có thể dùng kẽm cột siết chặt giữa thân cây, dưới chỗ cột sẽ mọc lên 2 - 3 keiki Khi keiki có 2 - 3 rễ mạnh thì cắt ra trồng, mở dây kẽm ra, cây mẹ vẫn sống bình thường Hoặc khi hoa tàn thì cắt bỏ và chừa 3 - 4 mắt phía trên phát hoa, những mắt này sẽ mọc lên keiki Hồ ñiệp trồng lâu năm cũng có thể ra keiki từ các nách lá ở gần dưới gốc Khi keiki

có bộ rễ khỏe và có 2 - 3 lá (sau khoảng 6 tháng), ta có thể chiết cây trồng vào chậu, sau khoảng 18 tháng ñến 2 năm cây sẽ ra hoa

Hình 1.3 Keiki hình thành trên phát hoa của Lan Hồ ñiệp

Phương pháp này dễ dàng thao tác, tốn ít công và vốn; tuy nhiên cây con dễ bị nhiễm bệnh do thao tác và không thể ñáp ứng một số lượng giống lớn, ñồng loạt theo mô hình trồng công nghiệp Bên cạnh ñó, thời gian nhân giống rất dài và hệ số nhân rất thấp, hơn nữa cây con tạo thành có sức sống không cao

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 16

1.3.2.2 Nuôi cấy mô

Các bộ phận sinh dưỡng của cây như ngọn, thân, lá, chóp rễ, cành hoa non, mầm nách cành hoa, ñốt của cành hoa ñều có thể ñem ñi nuôi cấy mô tạo thành cây hoàn chỉnh Nhưng thường dùng là mầm nách của cành hoa, ñốt cành hoa, lá non của cây trong ống nghiệm (Nguyễn Quang Thạch, 2000; Hoàng Thị Lan Hương, 2008)

Cành hoa lan Hồ ñiệp khi hoa ñã nở hết, mấy ñốt phía gốc thường có mầm nách, sau khi khử trùng cắt lấy ñoạn cành hoa có ñốt, nuôi cấy trong môi trường MS + 6-BA 3–5mg/lít ở nhiệt ñộ 28oC sẽ có tới 90% mọc ra mầm dinh dưỡng, cắt bỏ cành hoa, lấy mầm ñó cấy lại vào môi trường trên sẽ sinh ra thân

củ, hoặc cắt lấy lá của mầm dinh dưỡng cấy vào môi trường Kyoto + kinetin 10mg/lít + α-NAA 5mg/lít + 10% ND (hoặc nước quả táo) + ñường saccarose 20mg/lít cũng mọc ra thân củ Sau khi khử trùng cuống hoa non (sau khi mầm hoa mọc ñược 45 ngày), cắt nghiêng cuống hoa thành từng lát mỏng dày 1 – 1,5mm, ñặt vào môi trường VM + 1- 3mg BAP/lít + 20mg saccarose /lít ñể nuôi, tỷ lệ ra thân củ có thể ñạt 63 – 77% (Chu Văn Phát, 2004)

Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2000) ñã nghiên cứu ứng dụng phương pháp nuôi cấy lát mỏng trong nhân nhanh các giống lan, trong ñó có

Hồ ñiệp Kết quả cho thấy phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào có hiệu quả rất cao ñối với việc nhân nhanh và tạo nguồn mẫu mới Kích thước lát mỏng tối ưu cho nuôi cấy có tỷ lệ sống và phát sinh hình thái cao là 0,3-0,5 mm Nguyên liệu thích hợp ñể cắt lát mỏng là thể Protocom hoặc chồi non mới hình thành hoặc mới qua 1 lần cấy chuyển Môi trường tối ưu cho nuôi cấy lát mỏng là VW + 100ml/l ND + 0,5 mg/l 2,4-D + 0,3 mg/l kinetin + 10 g/l sacharose + 6,5 g/l agar (Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga, 2000)

Tại Viện Di truyền nông nghiệp, năm 2004, các tác giả Hoàng Thị Lan Hương, Nguyên Xuân Linh, Phạm Thị Liên ñã nghiên cứu quy trình nhân

giống lan Hồ ñiệp “Moscow” bằng phương pháp nuôi cấy in vitro ðến năm

Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 17

2008, Nguyễn Xuân Linh, và cộng sự ựã nghiên cứu kỹ thuật gieo hạt lan Hồ ựiệp HL3 phục vụ cho công tác chọn tạo giống mới (Nguyễn Xuân Linh, 2008) Cùng năm này, các tác giả ựã công bố phương pháp nhân nhanh lan Hồ ựiệp từ

mô lá, bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào Tiếp tục nghiên cứu ựến năm

2009, tác giả ựã công bố phương pháp nhân nhanh giống lan Hồ ựiệp (HL3) từ chóp rễ để tạo vật liệu khởi ựầu, lấy mắt ngủ của cành hoa khử trùng bằng H2O2

15% trong thời gian 20 phút, cấy vào môi trường MT, sau 8 tuần từ mắt ngủ sẽ

phát triển thành cây con Sau ựó lấy chóp rễ của chồi in vitro cấy vào môi trường

VW lỏng + 1,5 mg/l BAP +1 mg/l TDZ ựể tạo mầm rễ Sau 8 tuần nuôi cấy, tỷ lệ chóp rễ phát sinh hình thành các thể protocorm là 84,4% và với hệ số nhân là 9,2 lần Tiếp theo, cấy các thể protocorm vào môi trường VW +50 g/l Khoai tây ựể hình thành và nhân nhanh chồi con với tỷ lệ phát sinh hình thành chồi là 93,8%

và hệ số nhân nhanh chồi là 5,1 lần để tạo cây hoàn chỉnh, các chồi hình thành tiếp tục ựược cấy vào môi trường VW + 50g/l khoai tấy +50 g/l chuối, sau 8 tuần cấy chuyển tiếp sang môi trường VW + 100g/l khoai tấy +100 g/l chuối ựể chồi sinh trưởng và phát triển thành cây hoàn chỉnh có rễ phát triển tốt, mập và khỏe, khối lượng tươi của cây ựạt tới 1.023 g (Hoàng Thị Lan Hương và cs, 2009)

Các tác giả Trần Duy Dương, Trần Duy Quý, đặng Văn đông (2009)

ựã nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR ựể chuẩn ựoán và loại bỏ mầm bệnh vi khuẩn trước khi ựưa mẫu lan Hồ ựiệp vào nuôi cấy mô Các tác giả ựã phân

lập ựược 15 mẫu khuẩn thuộc 2 nhóm vi khuẩn Ewinia cartovora và

Pseudomonas gladioli (Trần Duy Dương, 2009)

1.4 Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Temporary immersion system -TIS)

1.4.1 Giới thiệu chung

Ngày nay, việc nghiên cứu cải thiện các quy trình nhân giống thực vật trong ống nghiệm - nhất là trên ựối tượng hoa, cây cảnh - rất ựược quan tâm bởi nhiều nhà khoa học trên khắp thế giới để khắc phục hệ số nhân thấp của

Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 18

cây trên môi trường thạch, nhiều nghiên cứu ựã sử dụng phương pháp nuôi cấy trong môi trường lỏng có hay không có lắc Kỹ thuật này cho phép ựạt ựược hệ số nhân chồi, tạo phôi soma, protocorm nhiều hơn so với trên môi trường thạch Tuy nhiên, khi nuôi cấy trong môi trường lỏng, mẫu cấy bị trương nước và bị thủy tinh thể do ngập quá lâu trong môi trường Ngoài ra, mẫu còn bị những tổn thương cơ học do quá trình lắc gây ra

để kết hợp những ưu ựiểm của hệ thống nuôi cấy trên thạch với nuôi cấy lỏng, vào năm 1983, Harris và Mason ựã thiết kế hai hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời là hệ thống nuôi cấy nghiêng và hệ thống Rocker Ít lâu sau, vào năm 1985 Tisserat và Vandercook ựã thiết kế một hệ thống nuôi cấy

tự ựộng APCS có thể thay thế ựược môi trường và có thể sử dụng nuôi cấy trong một thời gian dài mà không cần cấy chuyền Ngoài ra, còn có một số hệ thống ngập chìm tạm thời một phần hay toàn phần ựược ựiều khiển tự ựộng bằng máy tắnh hay bán tự ựộng

Hiện nay, ựáng chú ý là hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời RITAệ của hãng Cirad (Pháp), BITệ Twin Flask của Cuba ựã ựược khảo sát

và nghiên cứu trên nhiều ựối tượng khác nhau Một số hệ thống cũng xuất hiện gần ựây là hệ thống Plantimaệ của Công ty Atech (đài Loan) Hệ thống

này cũng ựã ựược tiến hành khảo sát nuôi cấy trên một số ựối tượng như chuối, khoai tây, hoa lan., cây kiểng lá, v.v

1.4.2 Nguyên tắc vận hành và cấu trúc cơ bản của hệ thống

Tất cả các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời ựều tuân theo những ựiều kiện ựược ựề ra bởi Teisson và cộng sự năm 1999 Cụ thể là:

- Tránh sự ngập liên tục (là yếu tố ảnh hưởng tiêu cực lên sự sinh trưởng và phát sinh hình thái của mẫu cấy)

- Cung cấp sự trao ựổi oxy một cách ựầy ựủ

- Cung cấp sự hòa trộn ựầy ựủ

- Hạn chế sự dịch chuyển

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 19

- Có thể thay ñổi môi trường và ñiều khiển tự ñộng

- Hạn chế sự nhiễm

- Giá thành hạ

Tất cả các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời ñều phải tuân theo một nguyên tắc là phải có khả năng tạo ra sự ngập chìm không liên tục theo chu kỳ xác ñịnh Các hệ thống ñều có ngăn chứa môi trường riêng, có thể chung một bình chứa nhưng có hai ngăn khác nhau hay gồm một hệ thống bình chứa nối với hệ thống chứa mẫu cấy bằng hệ thống ống dẫn và bơm ñiều khiển Các mẫu cấy ñược ñặt thành từng cụm trên những ñĩa bằng nhựa polypropylene, ñiều này giúp tiết kiệm ñược thời gian phải cấy mẫu lên trên giá thể thạch trong nuôi cấy thông thường

Về cấu trúc, hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời thông thường có những bộ phận chủ yếu sau:

- Bơm hay máy nén khí tạo áp lực ñể ñẩy môi trường từ ngăn chứa lên ngăn chứa mẫu cấy và ngược lại

- Hệ thống cài ñặt thời gian (Timer) dùng ñể ñiều khiển chu kỳ ngập chìm

- Hệ thống ống dẫn và van ñiều khiển

- Các màng lọc

- Bình nuôi cấy (thường bằng nhựa polycarbonate hay thủy tinh) Dựa theo nguyên tắc và nguyên lý ñể tạo ra hệ thống ngập chìm tạm thời, nhiều nhà khoa học ñã thiết kế và tạo ra các hệ thống ngập chìm khác nhau, tùy vào mục ñích nuôi cấy khác nhau

1.4.3 Phân loại

Hệ thống ngập chìm sử dụng trong vi nhân giống thực vật ñược mô tả

và phân loại theo 4 nhóm chính theo cách thức vận hành như sau:

1 Hệ thống nuôi cấy ngập nghiêng lắc

2 Hệ thống ngập hoàn toàn có sự thay mới môi trường dinh dưỡng

3 Hệ thống ngập một phần có sự thay mới môi trường dinh dưỡng

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 20

4 Hệ thống ngập hoàn toàn trong ñó môi trường dinh dưỡng ñược bơm nhu ñộng vào khu vực nuôi cấy và không có sự thay mới môi trường

Các hệ thống ngập chìm còn ñược phân loại dựa trên các yếu tố về kích thước bình nuôi cấy, loại giá ñỡ, có hay không có sử dụng hệ thống máy vi tính ñể ñiều khiển hay chỉ ñơn giản ñiều khiển bằng các máy hẹn giờ, cách thức vận chuyển môi trường (sử dụng bơm nhu ñộng, bơm khí hay di chuyển bình chứa)

Những ñiểm khác biệt giữa các hệ thống ngập chìm là có hay không có việc tái sử dụng môi trường dinh dưỡng, sử dụng hai bình riêng biệt ñể dự trữ môi trường và tăng sinh mẫu cấy hay chỉ sử dụng một bình

ðặc ñiểm chung của các hệ thống này là sử dụng những bình chứa có dung tích lớn hơn những bình chứa truyền thống, trong suốt và có thể hấp khử trùng ñược Việc vận hành hệ thống này ñơn giản hơn các bioreactor truyền thống và cho phép kéo dài thời gian cấy chuyền

1.4.4.Một số hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời tiêu biểu

1.4.4.1 Hệ thống RITA®

Hệ thống RITA® (Teisson và Alvard, 1995) gồm một bình chứa dung

tích 1 lít có hai ngăn, ngăn trên chứa mẫu cấy và ngăn dưới chứa môi trường Một áp suất vượt mức tác ñộng vào môi trường lỏng ở ngăn dưới và ñẩy chúng dâng lên ngăn chứa mẫu cấy Mẫu cấy ñược ngập chìm trong môi trường lỏng lâu hay mau tùy theo thời gian áp suất vượt mức ñược duy trì Trong thời gian mẫu ngập trong môi trường lỏng, không khí ñược sục vào trong môi trường lỏng dưới dạng những bọt khí góp phần làm xoay trở nhẹ mẫu cấy và làm mới không gian bên trong bình nuôi cấy, áp suất vượt mức sẽ ñẩy không khí trong bình ra ngoài qua một màng lọc khí trên nắp bình

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 21

Hình 1.4 Hệ thống ngập chìm tạm thời RITA ®

Bao gồm:

- Pha 1: Mẫu cấy không ngập trong môi trường

- Pha 2: Hiện tượng ngập ñược hoạt hóa, các van mở ra cho khí ñi qua các màng lọc ñẩy môi trường lỏng lên ngập mẫu cấy

- Pha 3: Sự trao ñổi khí trong hệ thống RITA®

- Pha 4: Chu kỳ kết thúc, các van ñóng lại và môi trường lỏng rút xuống ngăn bên dưới

1.4.4.2 Hệ thống bình ñôi BIT®

Hệ thống bình ñôi BIT® do Escalona và cộng sự (1998) thiết kế, ñược

dự ñịnh dùng ñể nhân giống với số lượng lớn qua con ñường phát sinh phôi soma; thiết kế chủ yếu phục vụ cho việc nhân sinh khối cơ quan do có thể tích bình chứa lớn hơn và có giá thành thấp hơn Cách dễ dàng nhất ñể vận hành

hệ thống nuôi cấy ngập chìm sử dụng áp lực khí là nối hai bình thủy tinh hay plastic có dung tích từ 250 ml - 1000 ml bằng một hệ thống ống dẫn, và ñiều khiển tạo ra áp suất vượt mức ñể ñưa môi trường vào bình chứa mẫu và ngược lại Hệ thống BIT® ñược thiết kế ñáp ứng với những yêu cầu trên

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 22

Hình 1.5 Hệ thống bình ñôi BIT ®

1.4.4.3 Hệ thống Plantima®

Hệ thống này ñược thiết kế tổng thể tương tự như hệ thống RITA®, tuy nhiên có thay ñổi và cải tiến một số chi tiết như hệ thống bơm và vị trí các màng lọc Hệ thống này ñược sản xuất và cung cấp bởi Công ty A - Tech Bioscientific tại ñảo Ðài Loan Cấu tạo và phương pháp vận hành cơ bản như sau:

Hình 1.6: Các thành phần của hệ thống Plantima

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 23

Hình 1.7: Hệ thống Plantima với thiết bị ñiều khiển chu kỳ ngập chìm

1.4.5 Một số ứng dụng trong vi nhân giống

1.4.5.1 Trên thế giới

Hệ thống ngập chìm tạm thời là một trong những phương pháp vi nhân

giống ñầy triển vọng trong sản xuất cây giống thương mại

a, Trong sự nhân nhanh chồi và các ñoạn cắt in vitro

Sự ngập chìm tạm thời kích thích sự nảy chồi Hệ thống này cho phép

sự sinh trưởng liên tục của chồi mà không cần phải cấy chuyển mẫu cấy Chồi thu ñược khi nuôi cấy ngập chìm tạm thời một phần cao hơn và có chất lượng tốt hơn so với những chồi thu ñược trên môi trường bán rắn

Một chứng minh ñầy ñủ và thuyết phục về tính hiệu quả của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong việc gia tăng số lượng chồi khi nuôi cấy

ñỉnh sinh trưởng chuối (Musa, phụ nhóm AAH) ðồng thời Alvard và cộng sự

(1993) chứng minh rằng sử dụng môi trường lỏng tác ñộng mạnh mẽ vào sự

phát triển và gia tăng sự tỷ lệ tạo chồi trong vi nhân giống chuối

- Chồi chuối trong môi trường nuôi cấy lỏng ñơn giản hay trên giá thể bằng cellulose có sự nhân chồi bình thường hay không có gì khác biệt

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 24

- Chồi trên môi trường bán rắn có sự ngập một phần và trong môi trường lỏng có sục khí có hệ số nhân chồi từ 2,2 - 3,1 lần

- Hệ số nhân chồi cao nhất (>5 lần) thu ñược trên mẫu nuôi cấy trong ñiều kiện nuôi cấy ngập chìm tạm thời

Các tác giả này ñã thu ñược kết quả trên khi sử dụng hệ thống RITA®với thời gian ngập là 20 phút cứ mỗi 2 giờ Một nhóm nhà nghiên cứu của

Cuba cũng thu ñược kết quả tương tự trên ñối tượng cây Chuối Musa

acuminata khi sử dụng hệ thống bình ñôi (Teisson và cộng sự, 1999)

Tương tự như vậy, Escalona và cộng sự (1999) ñã sử dụng hệ thống trên

ñể nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng cây Dứa Ananas comosus, kết quả cũng cho thấy

nuôi cấy ngập chìm tạm thời giúp gia tăng hệ số nhân cùng với trọng lượng tươi và trọng lượng khô sau 42 ngày nuôi cấy Hệ số nhân ñược gia tăng khoảng 300% so với nuôi cấy lỏng và 400% so với nuôi cấy trên môi trường

rắn Có gần 5.000 cây Ananas comosus thu ñược từ một hệ thống như vậy ðối với cây cà phê (Coffea arabica và C canephora), nhân giống bằng cách cắt chồi in vitro trên môi trường rắn rất hạn chế do sự sinh trưởng chậm của chồi Hệ số nhân xấp xỉ 6 - 7 lần trong 3 tháng (Sondhal và cộng sự,

chỉ trong vòng 5 - 6 tuần (Berthouly và cộng sự, 1995)

b, Trong sự tạo củ bi in vitro

Sự sinh trưởng và sự hình thành củ bi (mini tuber) khoai tây Solanum

tuberosum L ñược ñẩy mạnh bởi tình trạng ngập chìm tạm thời trong hệ

thống bình ñôi (Akita và Takayama, 1994) Số củ bi hình thành xấp xỉ 500 -

960 củ sau 10 tuần nuôi cấy, nhiều hơn những kết quả trong các công trình

trước ñó (chỉ khoảng 220 củ trong một lần nuôi cấy (Akita và Takayama,

1993) Trọng lượng tổng số và tính ñồng nhất của củ cũng ñược gia tăng

Ngược lại, trong ñiều kiện nuôi cấy ngập liên tục, không thấy bất cứ sự

hình thành củ nào Teisson và Alvard (1999) ñã kiểm chứng lại hiệu quả của

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 25

nuôi cấy ngập chìm tạm thời lên sự tạo củ bi khoai tây bằng cách tiến hành thí nghiệm trên hệ thống RITA® ñôi dựa trên nguyên tắc hệ thống bình ñôi: 3

củ bi ñược hình thành trên 1 ñốt thân trong 10 tuần nuôi cấy, 50% củ có trọng lượng lớn hơn 0,5 g Hệ thống này rất có hiệu quả và nhanh chóng do có từ 3 ñến 4 chồi nảy lên từ một củ

c, Trong sự phát sinh phôi

* Gia tăng sự phát sinh phôi:

- Các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời ñã ñược chứng minh thành công hơn trong nuôi cấy phát sinh phôi khi ñược so sánh với các hệ thống thông thường sử dụng môi trường rắn hay nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác

- Tisserat và Vandercook (1985) thống kê sự sinh trưởng của phôi cây

cà rốt và cây chà là (Phoenix dactylifera) trong hệ thống APCS trong ñó thời

gian ngập chìm là 5 - 10 phút sau mỗi 2 giờ So sánh với những cây nuôi cấy trên môi trường rắn, sự sinh trưởng gấp 1,9 lần trong trường hợp cây cà rốt,

và 4,0 lần ñối với cây chà là trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời Thêm vào ñó chất lượng cũng như số lượng của phôi soma và cây con cà rốt ñược nâng lên

* Sự phát triển phôi:

- Quy trình nhân và chất lượng của phôi soma trên nhiều ñối tượng khác nhau ñã ñược cải tiến bằng nuôi cấy ngập chìm tạm thời

- ðối với cây cao su Hevea brasiliensis sự hình thành phôi soma trên

môi trường rắn cho kết quả rất thấp và số lượng cũng như chất lượng phôi

soma không ñáng kể (Etienne và cộng sự, 1997) Sự tạo phôi soma trong nuôi

cấy ngập chìm tạm thời gấp ñến 4 lần so với nuôi cấy trên môi trường bán rắn với hơn 400 phôi/g trọng lượng tươi của mẫu nuôi cấy phát sinh phôi

- Nuôi cấy ngập chìm tạm thời cũng giúp giảm số lượng phôi bị bất thường xuống còn phân nửa cũng như giúp gia tăng tỷ lệ phôi phát triển lên tiếp Hệ thống này có thể giúp tỷ lệ nảy mầm của phôi lên tới trên 60%, tỷ lệ

Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 26

hình thành trụ trên lá mầm là 35% Theo Teisson và cộng sự (1999) gần 150

phôi soma cây cao su ở giai ựoạn có lá mầm ựã thu ựược trong một hệ thống RITAệ từ tuần thứ tư ựến tuần thứ tám sau khi bắt ựầu chuyển giai ựoạn phát sinh phôi vào trong hệ thống này

- Tuy nhiên, ựể tái sinh thành cây hoàn chỉnh, những phôi nảy mầm cần ựược chuyển vào trong môi trường bán rắn do khi cây phát triển thành phần ngọn và phần gốc, ựòi hỏi phải ựặt cây con luôn ựứng thẳng hướng lên trên cùng hướng phát triển của cây Trong hệ thống RITAệ không thể ựạt ựược yêu cầu trên vì cây luôn di chuyển mỗi khi môi trường dâng lên ngập theo chu kỳ

* Sự tạo phôi ựồng loạt:

- Trên các cây thuộc họ cam chanh, hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời cũng ựã cải thiện tắnh ựồng bộ trong quá trình phát sinh phôi nhờ khả

năng ức chế sự phát sinh phôi thứ cấp (Cabasson và cộng sự, 1997)

- Hệ thống này cũng cải thiện sự ựồng bộ trong suốt quá trình phát triển

và nảy mầm phôi cao su và cà phê Arabica so với quá trình này trên môi trường bán rắn (Etienne và cộng sự, 1997; Etienne-Barry và cộng sự, 1999)

1.4.5.2 Ở Việt Nam

Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời ựã ựược thế giới ựã ứng dụng trong nhân giống cây trồng từ lâu Tuy nhiên, công nghệ này mới bước ựầu ựược thử nghiệm tại Việt Nam trong những năm gần ựây Hệ thống này ựã ựược tiến hành khảo sát trên một số ựối tượng như hoa lan, cây thu hải ựường

và các giống kiểng lá

Năm 2005-2007, Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp Hồ Chắ Minh ựã

tiến hành ựề tài "Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân

giống cây lan Hồ ựiệp lai" do ThS Cung Hoàng Phi Phượng là chủ nhiệm ựề

tài Hệ thống này lần ựầu tiên ựược ứng dụng ở Việt Nam nhằm mở một hướng ựi mới, ựầy tiềm năng cho ngành nhân giống của Việt Nam Hệ thống ngập chìm tạm thời ựược sử dụng là hệ thống Plantima của đài Loan Kết quả

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 27

bước ñầu thu ñược rất khả quan: tỉ lệ nhân protocorm gấp 2,27 lần so với nhân trên môi trường thạch và gấp 1,2 lần so với môi trường lỏng lắc; tỉ lệ chồi gấp 3,37 lần khi so sánh với nuôi cấy trên môi trường ñặc, từ 1 chồi ban

ñầu thu nhận ñược 10 chồi mới, cây con tạo thành phát triển mạnh (Cung

Hoàng Phi Phượng, 2007)

Kết quả cũng chỉ ra hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời khắc phục ñược những hiện tượng bất lợi do sự thiếu thông thoáng của môi trường lỏng ngập liên tục hay trong hệ thống kín trên môi trường rắn, giúp gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng Sự nuôi cấy ñược ñồng bộ hóa vì chất dinh dưỡng ñược khuếch tán ñều do ñó thúc ñẩy sự tăng trưởng ñồng ñều của các chồi nuôi cấy Chồi ñược nhân giống trong hệ thống này sẽ phát triển nhanh hơn, năng suất cao hơn, phẩm chất tốt hơn

Mặc dù vậy, nếu tính sự vượt trội và trung bình protocorm tạo thành từ 1 protocorm ban ñầu thì kết quả vẫn chưa thật sự thuyết phục (23,4 protocorm trong hệ thống TIS so với 18 và 16 protocorm lần lượt trong hệ thống lỏng lắc

và trên môi trường thạch) ðiều này tác giả giải thích là do các thông số như chu kỳ ngập ñược cài ñặt trong thí nghiệm này chưa tối ưu cho việc nhân nhanh protocorm, thời gian ngập tương ñối ngắn chỉ 2 phút 30 giây sau mỗi 2 giờ Ngoài ra, mật ñộ mẫu cấy và thể tích môi trường cũng tác ñộng rất lớn lên quá trình nhân protocorm Vì vậy, ñể ñạt ñược hiệu quả cao nhất khi sử dụng hệ thống TIS trong quá trình nhân protocorm, tác giả ñề xuất cần có thêm những khảo sát và tối ưu hóa các thông số về mật ñộ, thể tích và chu kỳ ngập chìm của

hệ thống này

Cùng với những ưu ñiểm của hệ thống Plantima và phát huy kết quả ñạt

ñược, Trung tâm Công nghệ sinh học TP.Hồ Chí Minh tiếp tục ứng dụng hệ

thống này trong nhân giống cây kiểng lá Spathiphyllum sensation và ñã cho

kết quả ban ñầu cũng rất khả quan: Sau 2 tháng nuôi cấy, các mẫu cấy sống

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 28

100% và có khả năng tái sinh chồi, chồi thu ñược có từ 3 - 4 lá, xanh mướt Xét về số lượng chồi thu ñược hệ số nhân chồi gấp 4 lần trên môi trường thạch [59 ]

Nguyễn Ngọc Quỳnh và cộng sự (2008) tại Viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệp Miền Nam ñã ứng dụng thành công hệ thống bioreactor dạng

TIS trong nhân chồi và protocorm lan Dendrobium và Phalaenopsis Kết quả

thu ñược lượng chồi, protocorm sản xuất cao hơn từ 3-20 lần so với nuôi cấy trên môi trường thạch, chồi khỏe, protocorm có màu xanh ñậm

Trần Thế Mai, Nguyễn Thị Sơn (2012) tiến hành nghiên cứu nuôi cấy mô

2 loài Hoàng thảo là Thạch Hộc (Den nobile Lindl.) và Ngọc vạn vàng (Den

chrysanthum) trên các hệ thống nuôi cấy khác nhau: 1- Trao ñổi khí có giới hạn:

Môi trường nuôi cấy ñặc, bình nuôi sử dụng nút bông; 2- Không trao ñổi khí: Môi trường nuôi cấy ñặc, bình sử dụng nút nylon bịt kín miệng bình ngăn cản trao ñổi khí; 3- Trao ñổi khí hoàn toàn: Môi trường nuôi cấy ñặc, bình sử dụng nút là màng vi lọc khí; 4- Môi trường lỏng tĩnh thoáng khí: Môi trường nuôi cấy lỏng, bình sử dụng nút là mạng vi lọc khí; 5- Môi trường lỏng lắc thoáng khí: Môi trường nuôi cấy lỏng, lắc 100 vòng/ phút, bình sử dụng màng vi lọc khí; và 6- Hệ thống Bioreactor Plantima: Hệ thống ngập chìm ngắt quãng, môi trường lỏng Kết quả thu ñược cho thấy: Trong các phương thức nuôi cấy thử nghiệm, phương thức nuôi bằng Bioreactor Plantima (hệ thống ngập chìm ngắt quãng) là phương thức tối ưu so với các phương thức nuôi cấy mô hiện hành

Những thành công bước ñầu trong việc ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nuôi cấy mô góp phần phát triển ngành nhân giống

in vitro nước ta lên tầm cao mới; và phục vụ tốt cho việc sản xuất theo qui

mô công nghiệp trong thời gian tới Tuy nhiên, ñể hệ thống hoạt ñộng hiệu quả thì việc tối ưu hóa các thông số kỹ thuật (mật ñộ nuôi cấy, thể tích, số lần ngập chìm) cho từng ñối tượng cụ thể là rất quan trọng

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 29

1.4.6 Những ưu ñiểm và nhược ñiểm của hệ thống ngập chìm tạm thời

1.4.6.1.Ưu ñiểm

Hệ thống ngập chìm tạm thời có tác ñộng tích cực lên tất cả các giai ñoạn từ nhân nhanh chồi cho tới phát sinh phôi soma trên nhiều ñối tượng cây trồng khác nhau Sự sinh trưởng và hệ số nhân nhanh chồi của cây ñược nuôi cấy trong hệ thống ngập chìm tạm thời luôn cao hơn so với những cây nuôi cấy trong hệ thống thông thường trên môi trường rắn hay trong những hệ thống bioreactor thông thường

Cây tái sinh và phôi soma thu ñược trong hệ thống này luôn có chất lượng tốt hơn Từ ñó, cây có nguồn gốc từ hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời có tỷ lệ sống sót cao, sinh trưởng khỏe mạnh trong quá trình thuần hoá ngoài vườn ươm Có thể nói, hệ thống ngập chìm tạm thời ñã kết hợp thành công những ưu ñiểm của hệ thống nuôi cấy rắn thoáng khí và hệ thống nuôi cấy lỏng giúp cây tránh ñược những hiện tượng bất lợi do sự thiếu thông thoáng của môi trường lỏng ngập liên tục hay trong hệ thống kín trên môi trường rắn, giúp gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng

Chu kỳ và tần suất ngập chìm là những chỉ số chủ yếu ảnh hưởng ñến

sự phát triển của mẫu cấy cũng như toàn bộ quy trình nhân giống Khi những chỉ số này ñược tối ưu hóa, sản lượng sẽ ñược gia tăng, quá trình kiểm soát sự phát sinh hình thái tốt hơn và còn có khả năng hạn chế tối ña hiện tượng thủy tinh thể Ðây là ưu ñiểm lớn nhất của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời

so với hệ thống bioreactor thông thường

Hệ thống ngập chìm tạm thời tiết kiệm ñược công lao ñộng và không gian phòng nuôi cấy và giảm ñược chi phí sản xuất Những quá trình nhân nhanh phôi soma, tái sinh nhiều chồi, tạo củ bi có khả năng ñược tối ưu hoá trên nhiều ñối tượng cây trồng từ ñó giảm ñược chi phí sản xuất một cách ñáng kể

Trường đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 30

1.4.6.2.Nhược ựiểm

Mật ựộ nuôi cấy là một yếu tố không kém phần quan trọng khi vận hành với hệ thống ngập chìm tạm thời nhưng hiện nay vẫn chưa ựược khảo sát một cách sâu rộng Thời gian ngập tối ưu cũng phải ựược khảo sát và xác ựịnh chắnh xác cho từng giai ựoạn nuôi cấy của từng loại cây cũng như thời gian giữa các lần cấy chuyển ựối với những hệ thống không thể bổ sung môi trường mới Cuối cùng là phải khảo sát tối ưu hóa thành phần môi trường cho từng giai ựoạn nuôi cấy

Hiện nay, nhiều nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời về mặt vật lý là rất cần thiết ựể có thể tối ưu hóa ựiều kiện nuôi cấy trong những hệ thống này

Một ưu ựiểm khác của hệ thống này trong việc giảm ựược hoạt tắnh của các chất ựộc ngoại bào hay các chất ức chế sinh trưởng ựược tiết ra ngoài môi trường trong thời gian nuôi cấy của mẫu cấy vẫn chưa ựược ựánh giá chắnh xác

Trong ựiều kiện Việt Nam hiện nay, giá thành của những hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời tương ựối cao do phải nhập hệ thống này từ nước ngoài như Pháp, Cuba, đài Loan do ựó nếu muốn ứng dụng rộng rãi thì những

hệ thống này nhất thiết phải ựược nghiên cứu thiết kế ngay trong nước ựể giảm giá thành Ngoài ra, những thông số kỹ thuật của hệ thống này cần ựược khảo sát kỹ lưỡng và tối ưu hóa ựối với từng giai ựoạn nuôi cấy của từng loại cây, có ựược những ựiều kiện như vậy thì chúng ta mới có khả năng áp dụng

hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời rộng rãi trong sản xuất cây giống