BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH …………………… LÊ THỊ HƯƠNG NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG, ĐỘ MẶN LÊN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA TẢO ISOCHRYSIS GALBANA PARKE VÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN, HÀM LƯỢNG AXIT BÉO CỦA NÓ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: THỰC VẬT VINH, 2011 1 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp trong chương trình đào tạo Thạc sỹ Sinh học, chuyên ngành Thực vật tại khoa Đào tạo Sau đại học - Trường Đại học Vinh. Tôi đã nhận được sự ủng hộ giúp đỡ của các thầy cô giáo, các đồng nghiệp, người thân, gia đình và bạn bè. Nhân dịp này, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến GS. TS Võ Hành người thầy hướng dẫn khoa học đã tận tâm chỉ dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận văn. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến GS. TSKH Dương Đức Tiến - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, thầy đã định hướng và có những góp ý trong việc lựa chọn và thực hiện đề tài. PGS. TS Phạm Quốc Long, TS Đoàn Lan Phương, Viện Hóa các hợp chất Thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong việc phân tích và xác định thành phần các axit béo của tảo. PGS. TS Nguyễn Đình San, TS Lê Thị Thúy Hà đã có những đóng góp quý báu trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn. Xin chân thành cám ơn các thầy cô giáo trong khoa Sinh học, các Cán bộ Kĩ thuật phòng thí nghiệm Thực vật Bậc thấp, phòng Nuôi cấy mô, phòng Sinh lí Hóa sinh. Các cán bộ phòng Tảo thuộc Viện Công nghệ sinh học, Phân Viện nuôi trồng thủy sản III đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi thực hiện đề tài. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Vinh, ngày tháng 12 năm 2011 Tác giả Lê Thị Hương 2 MỤC LỤC Trang LỜI CÁM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng nuôi trồng tảo 3 1.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 3 1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 5 1.2. Tình hình nghiên cứu về thành phần axit béo của tảo Isochrysis galbana 9 1.3. Vị trí phân loại, cấu tạo hình thái của tảo Isochrysis galbana 11 1.3.1 Vị trí phân loại 11 1.3.2. Về hình thái và một số đặc điểm sinh học 12 1.3.3. Về giá trị dinh dưỡng 12 1.4. Ảnh hưởng của các nhân tố sinh thái lên sự sinh trưởng và phát triển của tảo Isochrysis galbana 13 1.5. Các phương pháp nuôi trồng tảo 17 1.5.1. Phương pháp nuôi trồng theo mẻ (Hệ thống kín) 17 1.5.2. Phương pháp nuôi trồng liên tục (Hệ thống hở) 18 1.6. Đặc điểm sinh trưởng của tảo 18 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Đối tượng nghiên cứu 20 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 20 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu 20 2.2.2. Thời gian nghiên cứu 20 2.3. Điều kiện thí nghiệm 20 2.4. Phương pháp nghiên cứu 21 2.4.1. Nhân giống tảo Isochrysis galbana trong phòng thí nghiệm 21 2.4.2. Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và độ mặn lên sự sinh trưởng của tảo Isochrysis galbana 22 2.4.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên sự sinh trưởng và phát triển của tảo Isochrysis galbana 23 2.4.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn lên sự sinh trưởng và 24 3 phát triển của tảo Isochrysis galbana 2.4.3. Phương pháp nuôi trồng tảo Isochrysis galbana ngoài trời 24 2.4.4. Phương pháp điều chỉnh độ mặn 25 2.4.5. Phương pháp xác định mật độ tế bào tảo 25 2.4.6. Phương pháp lập đồ thị sinh trưởng 26 2.4.7. Phương pháp xác định các yếu tố môi trường 26 2.4.8. Phương pháp thu hoạch tảo 26 2.4.9. Phương pháp phân tích lipit và thành phần axit béo 26 2.4.10. Phương pháp xử lí số liệu 26 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27 3.1. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên sự sinh trưởng, phát triển của tảo Isochrysis galbana 27 3.2. Ảnh hưởng của độ mặn lên sự sinh trưởng của tảo Isochrysis galbana 30 3.3. Thử nghiệm nuôi sinh khối tảo Isochrysis galbana 33 3.4. Nghiên cứu về thành phần, hàm lượng axit béo của tảo Isochrysis galbana 35 3.5. Nghiên cứu về thành phần, hàm lượng các axít béo của tảo Nannochloropsis oculata 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC 51 DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT CT Công thức CT1 Công thức 1 CT2 Công thức 2 CT3 Công thức CTTN Công thức thí nghiệm KQPT Kết quả phân tích ml Mililit MT Môi trường NC Nghiên cứu NTTS Nuôi trồng thủy sản Tb Tế bào U Unsaturated VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm Ytmt Yếu tố môi trường 4 ω Omega DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Trang Bảng 1.1. Thành phần sinh hóa của tảo Isochrysis galbana 12 Bảng 2.1. Các môi trường dinh dưỡng dùng trong các thí nghiệm 21 Bảng 3.1. Sự sinh trưởng của tảo Isochrysis galbana ở các môi trường dinh dưỡng 28 Bảng 3.2. Sự sinh trưởng của Isochrysis galbana ở các độ mặn khác nhau 31 Bảng 3.3. Sự biến động Ytmt trong thí nghiệm nuôi sinh khối Isochrysis galbana 33 Bảng 3.4. Sự sinh trưởng của tảo Isochrysis galbana khi nuôi sinh khối 34 Bảng 3.5. Kết quả phân tích thành phần, hàm lượng axit béo của Isochrysis galbana 36 Bảng 3.6. So sánh thành phần, hàm lượng axit béo của Isochrysis galbana của chúng tôi với các kết quả phân tích của các tác giả khác 37 Bảng 3.7. Kết quả phân tích thành phần, hàm lượng axit béo của Nannochloropsis oculata 40 5 Bảng 3.8. So sánh thành phần axit béo của tảo Isochrysis galbana và Nannochloropsis oculata 40 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Hình thái của tảo Isochrysis galbana 12 Hình 1.2. Các pha sinh trưởng của quần thể tảo 19 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí các thí nghiệm 22 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí nuôi trồng tảo Isochrysis galbana ngoài trời 24 Hình 3.1. Sự sinh trưởng và phát triển của Isochrysis galbana ở các CTTN 27 Hình 3.2. Sự biến động mật độ tế bào ở các độ mặn khác nhau 32 Hình 3.3. Sự biến động mật độ tế bào tảo Isochrysis galbana khi nuôi sinh khối 35 Hình 3.4. Phổ phân tích MS thành phần, hàm lượng axit béo của tảo Isochrysis galbana 42 Hình 3.5. Phổ phân tích MS thành phần, hàm lương axit béo của Nannochloropsis oculata 43 MỞ ĐẦU 6 Việt Nam có bờ biển trải dài hơn 3.200km, có hơn 3.000 hòn đảo lớn nhỏ với diện tích trên 26.000 km 2 , nhiệt độ nước biển dao động từ 18 o C-32 o C, độ mặn trung bình từ 28-40‰ [17]. Dọc bờ biển có khoảng 114 con sông lớn nhỏ đổ ra biển [16]. Với những điều kiện ấy rất thuận lợi cho ngành nuôi trồng thủy sản (NTTS) phát triển. Trong NTTS thì vấn đề thức ăn là khâu then chốt, quyết định đến năng suất nuôi trồng. Hiện nay, nguồn thức ăn chủ yếu được sử dụng là nguồn thức ăn tổng hợp, nguồn thức ăn này có ưu điểm là kích thích khả năng tăng trưởng nhanh nhưng trong đó hàm lượng hoocmon tương đối cao nên không đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP), làm giảm chất lượng sản phẩm. Như vậy, vấn đề đặt ra cho ngành NTTS là phải tìm được nguồn thức ăn rẻ tiền nhưng cho năng suất, chất lượng cao đồng thời đảm bảo VSATTP. Trong NTTS việc tìm nguồn thức ăn tươi sống, giàu chất dinh dưỡng từ vi tảo biển đang được quan tâm nghiên cứu. Những loài vi tảo được sử dụng là những loài có kích thước phù hợp, dễ tiêu hóa lại ít gây độc với môi trường, có khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh, dễ nuôi nhưng lại giàu chất dinh dưỡng… Hiện nay, có khoảng hơn 40 loài vi tảo biển được sử dụng phổ biến làm thức ăn cho các đối tượng thủy sản như: Isochrysis galbana, Tetraselmis suecica, Platymonas sp, Nannochloris atomus, Nannochloropsis oculata…[9]. Tảo Isochrysis galbana ngày càng được quan tâm và sử dụng rộng rãi làm thức ăn cho ấu trùng nhiều động vật thân mềm do có khả năng sinh trưởng, phát triển nhanh và có hàm lượng chất dinh dưỡng cao, đặc biệt là các axit béo không bão hòa thuộc nhóm ω-3 và ω-6 như: axit eicosapentaenoic (20: 5n-3, EPA), axit arachidonic (20:4n-6), axit docosapentanoic (22:6n-3, DHA) [31]. Đây là những axit béo thiết yếu đối với cơ thể động vật và người, trong cơ thể người không thể tổng hợp được các loại axit béo này, nhưng chúng lại có vai trò rất quan trọng đối với con người như ngăn ngừa bệnh tim và tuần hoàn, tạo điều kiện cho sự 7 phát triển tim mạch ở trẻ (Yongmanitchai và Ward, 1991). Y học đã chứng minh rằng, việc tiêu thụ hàm lượng thấp các axít béo thuộc nhóm ω-3 làm gia tăng tỉ lệ mắc các bệnh về tim mạch, ung thư, đột quỵ, tiểu đường, thần kinh…[theo 31]. Tuy nhiên, khả năng sinh trưởng, phát triển, thành phần và hàm lượng các axit béo của tảo phụ thuộc rất nhiều vào chế độ nuôi trồng như: chế độ dinh dưỡng, độ mặn, nhiệt độ, ánh sáng và vào thời điểm thu hoạch tảo (Yongmanitchai và Ward, năm 1989; Roessler, 1990) [theo 31]. Xuất phát từ những lí do trên chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng, độ mặn lên sự sinh trưởng của tảo Isochrysis galbana Parke và phân tích thành phần, hàm lượng axit béo của nó”. Với mục tiêu: Nghiên cứu ảnh hưởng của các môi trường dinh dưỡng, độ mặn khác nhau lên sự sinh trưởng, phát triển của tảo Isochrysis galbana từ đó lựa chọn được điều kiện thích hợp để nuôi trồng tảo và phân tích, xác định được thành phần, hàm lượng axit béo của tảo Isochrysis galbana để đánh giá chất lượng dinh dưỡng của nó. Để thực hiện được các mục tiêu trên, nhiệm vụ cần thực hiện là: 1. Tiến hành nhân nuôi tảo trong phòng thí nghiệm để lấy nguyên liệu. 2. Theo dõi, so sánh sự sinh trưởng và phát triển của tảo ở các môi trường dinh dưỡng, độ mặn khác nhau để lựa chọn được điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng, phát triển của nó. 3. Phân tích, xác định được thành phần, hàm lượng các axit béo của tảo Isochrysis galbana. CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8 1.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng nuôi trồng tảo 1.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Trên thế giới, tảo được biết đến cách đây trên 250 năm trong hệ thống phân loại của Carl Von Linner (1754) [4]. Từ đó đến nay, ngày càng có nhiều công trình nghiên cứu về tảo. Tuy nhiên, lịch sử về công nghệ sản xuất đại trà tảo bắt đầu tương đối muộn hơn so với lịch sử phát hiện ra tảo. Trong nuôi trồng thủy sản (NTTS) thì sinh khối tảo là thức ăn quan trọng, là điều kiện tiên quyết bởi nó là nguồn thức ăn không thể thiếu trong giai đoạn ấu trùng của nhiều loài thủy sản. Năm 1939, Bruce và cộng sự đã phân lập thành công và nhân nuôi tảo Isochrysis galbana, Pyramimonas grossii để nuôi ấu trùng hầu. Sớm hơn nữa, năm 1910, Alla và Nilson đã dùng tảo silic để làm thức ăn cho động vật không xương sống [9]. Năm 1940, những thực nghiệm về nuôi trồng đại trà Chlorella được bắt đầu ở Đức, sau khi người ta nhận thấy tế bào tảo này có tới 50% protein trong sinh khối khô và có khả năng tăng sinh khối khô lên gấp nhiều lần trong ngày [9]. Đầu những năm 1950, các nhà khoa học Mỹ cho thấy hàm lượng chất béo và protein trong tế bào Chlorella có thể điều khiển bằng cách thay đổi điều kiện nuôi trồng. Một số Pilôt nuôi trồng đại trà tảo này đã được xây dựng tại đây [9]. Năm 1957, Tamiya và cộng sự đã công bố các công trình liên quan tới nuôi trồng Chlorella tại Nhật Bản. Có thể nói Nhật Bản là quốc gia đầu tiên sản xuất và kinh doanh Chlorella dưới dạng thức ăn bổ dưỡng và tác nhân kích thích sinh trưởng. Ngoài ra, ở Nhật còn sử dụng rất nhiều sinh vật phù du như: Chaetoceros sp., Penaeus japonicus và Metapenaeus ensis, Isochrysis sp., Pavlova lutheri, Tetraselmis sp., Nannochloropsis oculata, Chlamydomonas sp. làm thức ăn trong quá trình ương nuôi nhiều loài ấu trùng thủy sản. Trong đó Nannochloropsis oculata và Isochrysis galbana được coi là nguồn thức ăn tươi sống quan trọng nhất trong các loài thực vật phù du. Từ năm 1986, Maruyama và cộng sự đã nuôi 9 Nannochloropsis oculata hay còn gọi là “Chlorella nước mặn” dùng làm thức ăn cho rotifer. Nannochloropsis có thể nuôi quanh năm tại Nhật Bản, tuy nhiên mật độ nuôi giảm mạnh trong mùa mưa [9]. Vào năm 1953, các nhà khoa học Đức đã nghiên cứu khả năng dùng CO 2 phế thải của vùng công nghiệp Rhur để nuôi trồng Chlorella và Scenedesmus. Nghiên cứu này được giáo sư Soeder và cộng sự tiếp tục nhiều năm sau đó. Đầu những năm 1970, chính phủ Đức tài trợ cho 3 dự án lớn cho nuôi trồng Scenedesmus tại Ấn Độ, Pêru và Thái Lan [theo 9]. Năm 1960 tại Tiệp Khắc, các nhà khoa học đã xây dựng mô hình nuôi trồng đại trà Scenedesmus trên nền bể có độ nghiêng 3 o và tạo dòng chảy nhờ bơm. Mô hình bể này đã được áp dụng thành công tại Rupite, Bungari một địa danh có suối nước nóng nổi tiếng để sản xuất đại trà tảo Chlorella và Scennedesmus, sau đó tảo Scenedesmus được nuôi trồng đại trà tại nhiều nước trên thê giới như: Đức, Italia, Isarel và một số nước Đông Âu [9]. Đầu những năm 1960, vi tảo lam Spirulina lần đầu tiên được phát hiện tại hồ Tchad (Châu phi) và nhanh chóng được các nhà khoa học Pháp đưa vào nuôi trồng đại trà tại Texco, Mehico. Sau đó được mở rộng và sản xuất ở quy mô lớn tại các nước như: Mỹ, Đài Loan, Isarel, Italia, Trung Quốc, Thái Lan, Ấn Độ và Việt Nam. Ở Pháp đã tiến hành nuôi trồng đại trà tảo Porphyridium (tảo đỏ) để thu polysacarit và axit arachidonic. Việc nuôi trồng đại trà tảo đã sinh ra hàng loạt các công nghệ sản xuất, thu hoạch và chế biến sinh khối tảo [9]. Hiện nay, nhiều loài vi tảo là nguồn protein đơn bào quan trọng đối với người và ngành chăn nuôi. Những loài tảo thuộc các chi được sản xuất đại trà: Chlorella, Spirulina, Nitzschia, Haematococcus, Dunaliella, Chaetoceros, Tetraselmis, Skeletonema, Nannochloropsis, Scenedesmus, Isochrysis… 1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 10