Bước đầu nghiên cứu sản xuất nước tương lên men phần 5

Bước đầu nghiên cứu sản xuất nước tương lên men

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Bộ y tế viện dinh dưỡng, Bảng thành phần dinh dưỡng thực phẩm Việt Nam,

Nhà xuất bản Y học Hà Nội, 2000

[2] Nguyễn Văn Dậu, Chế biến đậu nành và lạc thành thức ăn giàu protein, Nhà

xuất bản Nông nghiệp, 1983

[3] Lê Song Dự, Giáo trình cây lạc, Bộ Nông nghiệp vụ đào tạo, Nhà xuất bản

Nông Nghiệp, 1979

[4] Đỗ Việt Hà, Tìm hiểu điều kiện thích hợp để thủy phân protein khô lạc bằng

phương pháp hóa giải trong sản xuất nước chấm, Luận văn cao học, HCM 2001

[5] Nguyễn văn Hồng, Nghiên cứu xác định thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy aspergillus oryzae sinh tổng hợp protease theo phương pháp nuôi cấy chìm,

Luận văn thạc sĩ, HCM 2004

[6] Trần Bích Lam, Tôn Nữ Minh Nguyệt, Đặng Thị Nhật Thu, Thí nghiệm hóa

sinh thực phẩm, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2004

[7] Nguyễn Huỳnh Bạch Sơn Long, Nghiên cứu sản xuất tàu vị yểu bằng phương

pháp lên men Luận văn thạc sĩ TPHCM, 2004

[8] Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ enzym, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia

Thành phố Hồ Chí Minh, 2004

[9] Lê Văn Thạch, Kĩ thuật ép dầu và chế biến dầu mỡ thực phẩm, Nhà xuất bản

Khoa học và Kĩ thuật, 1993

[10] Đặïng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân

Sâm, Công nghệ Enzym, Nhà xuất bản khoa học và kĩ thuật 2003

[11] Trần Đình Toại, Nguyễn Thị Vân Hải, Động học các quá trình xúc tác sinh

học, nhà xuất bản khoa học và kĩ thuật, 2005

[12] Lê Ngọc Tú và các cộng tác, Enzym vi sinh vật, Nhà xuất bản Khoa học và

Kỹ thuật, Hà Nội, 1982.

[13] Lê Ngọc Tú, Hóa sinh công nghiệp, Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật, 2000.

[14] Diệp Thanh Xuân, Nghiên cứu lên men bã đậu nành để sản xuất nước

chấm Luận văn đại học, 2002

[15] A.K.Kundu,S.Das,S.Manna,N.Pal, Extracellular proteinase of Aspergillus

oryzae, Applied microbiology, p.1799-1801, 1986

[16] Catrinus van der Sluis, Johannes Tramper and Rene H Wijffels, Enhancing and accelerating flavour formation by salttolerant yeasts in Japanese soy-sauce

Processes, Trends in Food Science & Technology, vol 12, p 322–327, 2001

[17] Danji Fukushima, Industrialization of fermented soy sauce production

centering around Japanese Shoyu, Noda Institude for scientific research, Noda-shi,

Japan, 2004

[18] Desmond K Otoole, Characteristics and use of okara, the soybean residue

from soy milk production- a review, Food chemistry, volume 47, p.363- 371, 1999

[19] Gotz Neurath, Hamburg University Medical School and Department of

Toxicology and Environmental Medicine of the Fraunhofer Society, Germany, MCPD

in Soya Sauce, 2000

[20] IL-Young Maing, I J C Ayres, P.E Koehler, Persistence of aflatoxin during

the fermentation of soy sauce, Appueed microbiology, vol 25, p 1015-1017, 1973

[21] K.O Wong, Y.H Cheong, H.L Seah, 3-monochloropropane-1,2-diol (3-MCPD) in soy and oyster sauces: Occurrence and dietary intake assessment, Food

control 17, p 408-413, 2006

[22] Tadanobu Nakadai D Seiichi Nasuno, Use of Glutaminase for Soy Sauce Made by Koji or a Preparation of Proteases from Aspergillus oryzae, Journal Of

Fermentation Vol 67, No 3, 158-162, 1989

[23] T Hamada, M Sugishita, Y Fukushima, T Fukase, Continuos production of

soy sauce by a bioreaction system, Process biochemistry 26, p 39-45, 1991

[24] Wilfred F M Roling, Kris H Timotius, A Budhi Prasetyo, Adriaan H

Stouthamer, D Henk W Van Verseveld, Changes in Microflora and Biochemical Composition during the Baceman Stage of Traditional Indonesian Kecap (Soy Sauce) Production, Journal Of Fermentation And Bioengineering Vol 77, No 1, P 62-70,

1994

[25] United States Patent 4587127-Process for producing liquid seasonin, 1986 [26] United States Patent 5141756- Process for producing soya sauc, 1992

[27] http://www.peanut-institute.org/

http://www.nationalpeanutboard.org/

http://www.medinet.hochiminhcity.gov.vn/data/news/2007/6/4735/sx3/mcpd htm

PHỤ LỤC

1.Các phương pháp phân tích

1.1.Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson cải tiến

a Hoá chất

Thuốc thử Folin

Dung dịch tyrosin chuẩn (1 µmol/ml): cân 18,12mg tyrosin, hòa tan trong HCl 0,2N và định mức đến 100ml bằng dung dịch HCl 0,2N Từ dung dịch này tiếp tục pha loãng bằng dung dịch HCl 0,2N để nhận được các dung dịch có nồng độ tyrosin từ 0,05 đến 0,3 µmol/ml

Cách pha dung dịch tyrosin chuẩn:

Bảng 1 Xây dựng đường chuẩn tyrosin

Ống nghiệm số 1 2 3 4 5 6

Dung dịch casein 2%: cân chính xác 2g casein, hòa tan trong 30ml dung dịch NaOH 0,1N, có thể đun cách thủy cho đến khi tan hết casein (khuấy đều khi đun) Dùng dung dịch KH2PO4 1/15M để chỉnh pH về khoảng 6-7, sau đó định mức đến 100ml bằng dung dịch đệm phosphat 1/15M

Dung dịch A (NaH2PO4 1/15 M): cân 11,866g NaH2PO4.12H2O pha trong 1 lít nước cất

Dung dịch B: (KH2PO4 1/15 M): cân 9,073g KH2PO4 pha trong 1 lít nước cất Dung dịch đệm phosphat pH= 7,4: trộn dung dịch A và B theo tỷ lệ 4:1

Dung dịch acid tricloacetic (TCA) 10%

Dung dịch Na2CO3 6%

Thuốc thử Folin-Cio-Calteau

b Tiến hành

Trích ly dịch chiết enzym thô:

Canh trường

Dịch chiết

Trộn đều

Cân Nghiền sơ bộ Trích ly

Ly tâm N=5000 vòng/ phút, t=15 phút, ở 4oC

Định mức Nước cất

Hình 1 Sơ đồ trích ly dịch chiết enzym thô

Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp Anson cải tiến:

Cho vào ống nghiệm

Lắc đều, t=10 phút, ở 30oC 5ml TCA

Phản ứng thủy phân Tủa protein Lắc đều, t=30 phút, ở 30oC

Lọc Lấy 1ml dịch lọc Phản ứng tạo màu

1ml Folin Ciocalteau

Đo độ hấp thu λ= 750 nm

Hình 2 Xác định hoạt tính protease

Mẫu kiểm chứng: tiến hành mẫu kiểm chứng giống như đối với mẫu thí nghiệm, nhưng thay 1ml dịch enzym bằng 1ml nước cất

Dựng đường chuẩn tyrosin: từ dung dịch tyrosin chuẩn đã pha loãng ở trên, lấy 1ml dung dịch cho vào ống nghiệm, thêm vào 4 ml dung dịch Na2CO3 6%, lắc đều, thêm tiếp 1ml thuốc thử Folin-Cio-Calteau, lắc đều, để phản ứng 30 phút ở nhiệt độ phòng, đo độ hấp thu A ở bước sóng 750nm, tiến hành dựng đường chuẩn tyrosin theo kết quả thu được

c Tính kết quả:

Tính hoạt độ protease trong 1ml dung dịch enzym đã lấy theo công thức: HP/ml=[T]*8*100/t

Tính hoạt độ protease trong chế phẩm:

HP/g=[HP/ml]/a

Trong đó:

[T]: nồng độ tyrosin được suy ra từ đường chuẩn và độ hấp thu của mẫu nghiên cứu (µmol/ml)

8: số ml toàn bộ hỗn hợp phản ứng (1ml dung dịch enzym, 2ml dung dịch casein, 5ml dung dịch TCA 10%)

τ: thời gian phản ứng (10 phút)

a: số gam chế phẩm

1.2.Hàm lượng nitơ amin (AOAC)

a) Hoá chất

Dung dịch chuẩn glycine: hòa tan 0,1072g glycine và định mức đến 100ml Bảo quản ở 4oC Trước khi sử dụng pha loãng dung dịch này 100 lần được dung dịch A

Hòa tan 10g Na2HPO4.12H2O, 6g KH2PO4, 0,5g ninhydrin và 0,3g fructose trong nước và định mức đến 100ml được dung dịch B Chỉnh pH cuối 6,6 – 6,8 Dung dịch B được bảo quản trong tối ở 4oC, dùng trong 2 tuần

Hòa tan 1g KIO3 trong 300ml nước cất và 200ml cồn 96% v/v được dung dịch C Dung dịch C được bảo quản ở 5oC

b) Cách tiến hành.

Cho 2ml mẫu và 1ml dung dịch B vào mỗi 3 ống nghiệm Đun cách thủy (ở 100oC) trong 16phút, làm nguội về nhiệt độ 20oC trong thời gian 20 phút

Cho tiếp vào ống nghiệm 5ml dung dịch C, lắc đều và đo độ hấp thu ở bước sóng 570nm

Làm 3 mẫu chuẩn song song với 2ml dung dịch A

Làm mẫu trắng với 2 ml dung dịch nước cất để hiệu chỉnh máy so màu về 0

c) Kết quả.

N = AA x2xd

2 1

Trong đó:

N: số mg nitơamin có trong 1l dung dịch cần đo

A1: độ hấp thu của mẫu thí nghiệm

A2: độ hấp thu của mẫu chuẩn (giá trị trung bình)

d : hệ số pha loãng của mẫu

1.3.Xác định hàm lượng nitơ tổng bằng phương pháp Micro kjeldahl

a Tiến hành:

Trước tiên mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đậm đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác Các phản ứng của quá trình oxy hóa xảy ra như sau:

Oxy tạo thành lại oxy hóa các nguyên tố khác: carbon tạo thành CO2, hydro tạo thành H2O, còn nitơ giải phóng ra dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch

NH +H SO → NH SO

Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH

(NH4)2SO4+2NaOH →Na SO2 4+H O2 +2NH3

Cất và thu NH3 bằng một lượng dư H2SO4 0,1N

Định phân lượng H2SO4 còn lại bằng dung dịch NaOH 0,1N chuẩn Qua đó tính được lượng Nitơ có trong mẫu nguyên liệu thí nghiệm

b Hóa chất:

H2SO4 0,1N

NaOH 0,1N

NaOH 40%

HclO4 tinh khiết

Phenolphthalein 1%

c Cách tiến hành:

Vô cơ hóa mẫu: tiến hành trong tủ hotte: hút một thể tích mẫu nhất định cho vào bình Kjeldahl Thêm từ từ 10ml H2SO4 đậm đặc Để tăng nhanh quá trình vô cơ hóa cần phải cho thêm chất xúc tác, có thể dùng HClO4 giải phóng O2 cho phản ứng oxy hóa

Cất đạm: tiến hành trong máy cất đạm tự động Gerhardt Mẫu sau khi cất đạm được đem đi định phân bằng dung dịch NaOH 0,1N

d Công thức tính toán:

10

1000 0014 , 0

l g V

V bT

a x

m dm

−

=

Trong đó:

x: hàm lượng nitơ tổng (g/l)

a: số ml H2SO4 0,1N đem hấp thụ NH3 (ml)

b: số ml NaOH 0,1N tiêu tốn cho chuẩn độ (ml)

T: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0,1N

0,0014: lượng gam nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1N

Vdm: thể tích định mức (ml)

Vm: số ml mẫu đem vô cơ hóa (ml)

1.4.Xác định hàm lượng nitơ amoniac

a Hóa chất:

NaOH 0,1N

NaOH 40%

Phenolphthalein 1%

b Cách tiến hành:

Lấy một thể tích mẫu nhất định, pha loãng đến thể tích định mức Hút 10ml mẫu đã pha loãng cho vào ống phản ứng của máy cất đạm

Hút 10ml H2SO4 cho vào bình phản ứng

Tiến hành cất đạm bằng máy cất đạm Gerhardt, sau đó định phân lượng acid dư có trong bình hứng để xác định lượng nitơ amoniac có trong mẫu

c Công thức tính toán:

10

1000 0014 , 0

l g V

V bT

a x

m dm

−

=

Trong đó:

x: hàm lượng nitơ amoniac (g/l)

a: số ml H2SO4 0,1N đem hấp thụ NH3 (ml)

b: số ml NaOH 0,1N tiêu tốn cho chuẩn độ (ml)

T: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0,1N

0,0014: lượng gam nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1N

Vdm: thể tích định mức (ml)

Vm: số ml mẫu đem vô cơ hóa (ml)

1.5.Xác định độ ẩm

a Tiến hành:

Sấy cốc không đến khối lượng không đổi m0 Cân trên cân phân tích

Bỏ mẫu vào cốc và cân m1 Cân trên cân phân tích

Sấy ở 105-1100C đến khối lượng không đổi m2

Sấy đến khối lượng không đổi là sau khi để nguội và cân, lại cho vào tủ sấy 30 phút, lấy ra để nguội và cân Kết quả giữa hai lần cân liên tiếp không được cách nhau quá 0,5mg cho mỗi gam chất thử

b Công thức:

Độ ẩm = 1 2

1 0

100

−

×

−

Trong đó:

mo là khối lượng cốc (g)

m1 là khối lượng cốc và lượng mẫu trước khi sấy (g)

m2 là khối lượng cốc và lượng mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi

1.6.Xác định độ tro

Tro là thành phần còn lại của thực phẩm sau khi nung cháy hết các chất hữu cơ

a Tiến hành:

Nung chén sứ đã rửa sạch ở lò nung (6000C) đến trọng lượng không đổi Để nguội ở bình hút ẩm và cân trên cân phân tích Cho vào chén m (g) chất thử, cân trên cân phân tích rồi cho vào lò nung 6000C, nung đến tro trắng Lấy ra cho vào bình hút ẩm và cân chính xác trên cân phân tích Tiếp tục nung 30 phút rồi lấy ra cho vào bình hút ẩm và cân chính xác trên cân phân tích đến khối lượng không đổi

b Công thức:

Độ tro = 2

1

100

G G

G G

−

Trong đó:

G là trọng lượng chén

G1 là trọng lượng chén và mẫu

G2 là trọng lượng chén và tro

1.7.Định lượng lipid thô bằng máy Soxhlet

a Hoá chất : ete etylic hoặc ete dầu hoả.

b Tiến hành

Sấy khô nguyên liệu đến khối lượng không đổi (100-1050C) Cân 50g nguyên liệu đã nghiền nhỏ cho vào gói giấy Đặt vào trụ chiết Lắp trụ vào bình cầu và gắn ống sinh hàn (có dung môi trong bình cầu), qua ống sinh hàn dùng phễu cho dung môi vào trụ chiết sao cho một lượng dung môi đã chảy xuống bình cầu, một lượng trên phễu còn ngập mẫu Dùng bông làm nút đầu ống sinh hàn Mở nước lạnh Mở công tắc đèn Chiết 8-12h Thử xem hết chất béo chưa ở đầu xiphon (không còn vết dầu khi dung môi bay hơi) Lấy gói giấy, đặt dưới tủ hotte cho bay hơi dung môi Sấy ở

100-1050C trong 1,5h Để nguội ở bình hút ẩm Cân trên cân phân tích

c Công thức

Lượng Lipid thô : X M1 M2 100

M

−

Trong đó:

M1 : khối lượng gói giấy và mẫu ban đầu

M2 : khối lượng gói giấy và mẫu sau khi trích và sấy

M : khối lượng mẫu ban đầu

1.8.Phương pháp định lượng cellulose

a Dụng cụ, hóa chất

Tủ sấy, lò nung, cối chày sứ, chén nung

Bình cầu 150 có gắn ống sinh hàn khí, phễu, giấy lọc không tro, becher

Thuốc thử Liugon.

b Tiến hành

Cân 25g nguyên liệu đã được nghiền mịn, cho vào một bình cầu cao cổ đã chứa 50ml nước cất, thêm vào 10ml HCl đậm đặc

Đặt bình cầu lên bếp điện trong tủ hotte, gắn ống sinh hàn khí và đun sôi thật kỹ cho đến khi tinh bột bị thủy phân hoàn toàn, thử điểm kết thúc thủy phân bằng cách chấm một giọt dung dịch thủy phân lên lam kính vào giọt thuốc thử Luigon đến mất màu xanh

Lấy bình cầu ra khỏi bếp, lọc qua giấy lọc không tro, lấy bã Rửa bã nhiều lần bằng nước cất Dùng bình tia nước chuyển hết bã vào lại bình cầu đã dùng trên

Thêm vào bình cầu 10ml KOH 10% Đặt bình cầu lên bếp, đun sôi 20- 30 phút nữa

Lọc lấy bã trên hai giấy lọc không tro có trọng lượng bằng nhau Rửa bã 5 lần bằng nước cất, mỗi lần 20ml Sau đó rửa 3 lần bằng dung dịch CH3COOH2% rồi bằng rượu etylic nguyên chất (cồn tuyệt đối) Sau khi rửa bã có màu trắng trong là được Đặt cả 2 giấy lọc và bã vào đĩa petri rồi đưa vào tủ sấy 1050C trong 2 giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm và cân

Đưa cả hai giấy lọc và bã vào chén nung (đã được nung trong lò nung ở 400-

5000C, để nguội và cân trên cân phân tích), tiến hành nung bã trong lò nung ở nhiệt độ 400- 5000C trong 3 giờ đến khối lượng không đổi Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm và cân chén nung chứa tro sau khi nung

c Tính kết quả

Lượng cellulose có trong mẫu được tính theo công thức:

1 2 3 100

X

m

=

Trong đó:

m1: khối lượng bã sau khi sấy (g)

m 2: khối lượng chén nung và tro sau khi nung (g)

m 3: khối lượng chén nung (g) m: khối lượng mẫu (g)