Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ cây dây chân chim núi (desmos cochinchinensis var fulvescens ban) ở hà tĩnh

Các nghiên cứu dợc lý đã tìm thấy khảnăng kháng nấm, kháng khuẩn v đặc biệt l khả năng sử dụng trong hóa học trịà à liệu của một số th nh phần hóa học của lá v vỏ cây.. à à Mặc dù các câ

Bộ giáo dục và đào tạo Trờng Đại học vinh

Nguyễn Thị Hằng

Phân lập và xác định cấu trúc một số

(Desmos cochinchinensis var fulvescens Ban)

Việt Nam nằm ở vùng trung tâm Đông Nam á hàng năm có lợng ma và nhiệt

độ trung bình tơng đối cao Với khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng, ẩm đã cho rừngViệt Nam một hệ thực vật đa dạng và phong phú Theo số liệu thống kê gần đây hệthực vật Việt Nam có trên 10.000 loài [7], trong đó có khoảng 3.200 loài cây đợc sửdụng trong y học dân tộc và 600 loài cây cho tinh dầu [4] Đây là nguồn tài nguyênthiên nhiên rất quý báu của đất nớc có tác dụng lớn đối với đời sống và sức khỏe củacon ngời

Từ trớc đến nay trên thế giới các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh họcluôn đóng một vai trò hết sức quan trọng trong đời sống của con ngời Các hợp chấtthiên nhiên có hoạt tính sinh học đựơc dùng làm nguyên liệu cho công nghiệp dợcphẩm làm thuốc chữa bệnh, công nghiệp thực phẩm, hơng liệu và mỹ phẩm… Thảo Thảodợc là nguồn nguyên liệu trực tiếp hoặc là những chất dẫn đờng để tìm kiếm các loạibiệt dợc mới Theo số liệu thống kê cho thấy có khoảng trên 60% các loại thuốc

đang đợc lu hành hiện nay hoặc đang trong giai đoạn thử nghiệm có nguồn gốc từcác hợp chất thiên nhiên [5]

Họ Na (Annonaceae) l à họ lớn nhất của bộ Mộc lan (Magnoliales) Chi điển

hình của họ n y l à à Annona Một số lo i đà ợc trồng l m cây cảnh, đặc biệt là à

Polythia longifoliapendula (lá bó sát thân) Các lo i cây thân gỗ còn dùng l m củi.à à Một số lo i có qủa lớn, nhiều thịt ăn đà ợc bao gồm các lo i của chi à Annona (na, na

Nam Mỹ, mãng cầu xiêm) hay chi Asimina (đu đủ Mỹ) hoặc chi Rollinia.

Bên cạnh đó, một số lo i nhà Ho ng lan (à Cananga odorata) còn chứa tinh dầu

thơm v đà ợc sử dụng trong sản xuất nớc hoa hay đồ gia vị Vỏ cây, lá v rễ của mộtà

số lo i đà ợc sử dụng trong y học dân gian chữa bệnh nhiễm trùng, bệnh ho, bệnhgan, bệnh vàng da do gan, bệnh tiêu chảy… Thảo Các nghiên cứu dợc lý đã tìm thấy khảnăng kháng nấm, kháng khuẩn v đặc biệt l khả năng sử dụng trong hóa học trịà à liệu của một số th nh phần hóa học của lá v vỏ cây à à

Mặc dù các cây họ Na (Annonaceae) có giá trị kinh tế cao cũng nh có các hoạttính sinh học quý đợc sử dụng rộng rãi trong dân gian, song việc nghiên cứu vềthành phần hoá học của nó cha đợc tiến hành nhiều ở Việt Nam

Chính vì vậy chúng tôi chọn đề tài: “Phân lập và xác định cấu trúc một số

hợp chất từ cây dây chân chim núi (Desmos cochinchinensis var fulvescens Ban) ở

Hà Tĩnh ” từ đó góp phần xác định thành phần hoá học của các hợp chất và tìm ranguồn nguyên liệu cho ngành hoá dợc

2 Nhiệm vụ nghiên cứu

Trong luận văn này, chúng tôi có các nhiệm vụ:

- Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu đợc hỗn hợp các hợp chất

từ lá dây chân chim núi (Desmos cochinchinensis var fulvescens Ban).

- Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ lá dây chân chim núi

3 §èi tîng nghiªn cøu

§èi tîng nghiªn cøu lµ dÞch chiÕt l¸ d©y ch©n chim nói (Desmos

cochinchinensis var fulvescens Ban) thuéc hä Na (Annonaceae) ë ViÖt Nam.

Chơng 1 Tổng quan 1.1 Họ Na (Annonaceae).

) Theo Leboeuf và cộng sự có khoảng 900 lo i ở Trung v Nam Mỹ, 450 lo i ở

Châu Phi và Madagascar, 950 loài ở Châu á và Australia [2]

Các lo i thuộc họ Na (Annonaceae) có lá đơn, mọc so le (mọc cách), cóà cuống lá v mép lá nhẵn Lá mọc th nh hai h ng dọc theo thân cây Vết sẹo nơià à à

đính lá thờng nhìn thấy rõ các mạch dẫn C nh thà ờng ở dạng ziczăc Chúng không

có các lá bẹ Hoa đối xứng xuyên tâm (hoa đều) v thà ờng l là ỡng tính ở phần lớncác lo i thì 3 đ i hoa nối với nhau ở gốc hoa Hoa có 6 cánh có m u nâu hay v ng,à à à à nhiều nhị hoa mọc th nh hình xoắn ốc Hoa có nhiều nhụy hoa, mỗi nhụy có bầuà nhụy dạng một ngăn chứa một hay nhiều tiểu noãn Có đôi khi hoa mọc trực tiếptrên các c nh lớn hoặc thân cây Qủa l nang, bế qủa hay đa qủa.à à

ở Việt Nam, theo Nguyễn Tiến Bân [1, 2] đã xác định họ Na có 26 chi, 201

lo i.à

1.1.2 Th nh phần hoá học [1 ành phần hoá học [1 7].

Trong 2 thập kỉ trớc đây, 18 loài của họ Na (Chi Annona (8 loài): Annona

cherimola, A glabra, A montana, A muricata, A reticulata, A squamosa, A artemoya (A cherimola x squamosa), A purpurea; chi Artabotrys (2 loài): Artabotrys hexaptalus, A uncinatus; chi Cananga (1 loài): Cananga odorata; chi Fissistigma (2 loài): Fissistigma glaucescens, F oldhamii; chi Goniothalamus (1

loài): Goniothalamus amuyon; chi Polyalthia (2 loài): Polyalthia longifolia, P.

longifolia P “ endula ; ” chi Rollinia (1 loài): Rollinia mucosa và chi Uvaria (1 loài):

Uvariarufa) đã đợc nghiên cứu rất kĩ lỡng Các nhà khoa học đã xác định cấu tạo

hoá học và thử tác dụng sinh học của chúng (về tim mạch, độc tính và các hoạt tínhdợc lý khác) Một số hợp chất có tiềm năng ứng dụng rất lớn để sản xuất thuốc chữabệnh

Mặc dù cây họ Na (Annonaceae) đã đợc khảo sát lần đầu tiên bởi Stehous năm

1855, nhng trong 2 thập kỉ trớc đây vẫn ít đợc tiến hành nghiên cứu, đến năm 1970,

họ Na (Annonaceae) bắt đầu đợc nghiên cứu kỹ Trong đó, phần lớn các đề tàinghiên cứu về alkaloit nhng cây họ Na (Annonaceae) cũng chứa một lợng lớn non-alkaloidal (không phải alkaloit) có nhiều hoạt tính kháng tế bào ung th và chữa bệnh

tim mạch rất quan trọng Các chất không phải alkaloit của họ Na (Annonaceae) baogồm kauran, lignan, acetogenin, steroit và các hợp chất thơm

1.1.2.1 Các hợp chất diterpenoit kauran

Bộ khung cơ bản của các hợp chất diterpenoit kauran gồm 20 cacbon Một số

hợp chất đợc tách ra gồm 19 cacbon và đợc gọi tên nor-kauran diterpenoit Trongnghiên cứu của Wu và cộng sự đã tách đợc 37 hợp chất kauran từ 4 họ khác nhau

bao gồm: A cherimola, A glabra, A squamosa và R mucosa và 7 chất trong số

chúng là chất mới phát hiện Cấu trúc và sự tìm thấy của các hợp chất đợc nêu ra ởbảng 1

Bảng 1.1: Các hợp chất diterpenoit kauran

10 annoglabasin C * COOCH 3 OAc COOH A glabra

11 annoglabasin D * COOCH 3 OAc CHO A glabra

12 annoglabasin F * COOCH 3 OAc OH A glabra

18 annoglabasin E * COOH H CH 2 OH A glabra

24 axit 19-formyl-ent-kauran-17-oic H COOH CHO A squamosa

3

4 56 7

8 9 10

11

12 13 14

15

16

R1

R 2

R318

Có 9 chất lignan (38-47) của họ Na (Annonaceae) đợc Yang và cộng sự; Wu

và cộng sự công bố Các lignan đợc tìm thấy ở loài A montana , A cherimola và R mucosa gồm: (+)-Syringaresinol (38), (+)-epi-syringaresinol (39), (+)-

diasyringaresinol (40) và liriodendrin (41) thu đợc từ loài A cherimola, syringaresinol (42) đợc tách từ loài A montana và yangambin (43), magnolin (44), eudesmin (45), membrin (46) đợc tách từ R mucosa Trong số chúng, 38, 39, 40 và

(-)-42 là các chất đồng phân lập thể và 39, 40 là các chất mới.

6 O

O

H H

OR OMe

OMe

H H

OH OMe

CH3O

O H

OMe

OH OMe

OMe O

O

H H

CH3O

O H

OMe

OH OMe

Một dãy các hợp chất acetogenin (47-103) đã đợc tách từ 2 chi của họ Na

(Annonaceae) là Annona và Rollinia, trong đó có 24 chất mới Phần lớn các

acetogenin gồm một hoặc hai vòng tetrahydrofuran, một α, β-unsaturated-γ-lactonhoặc epoxit trong mạch chính với các nhóm chức nh –methoxy-OH, =O, C=C và diol kềnhau trong mạch dài

O (CH2)9

OH

O OH Me

O

Me

O OH

O OH Me

2 )10

O O

R 1

Me

erythro transthreotrans threo

49, R 1 =H

54, R 1 =OH

O OH

O OH Me

2 )10

O O

Me trans trans

50

threo threo threo

O OH

O OH Me

2 )8

O O

Me

51

erythro transthreo trans threo

O OH

O OH

Me Me

erythro erythrotrans trans

threo

threo

55

O OH

O OH

(CH2)5

OH

(CH2)10

O O

Me Me

trans erythro

trans

56

B¶ng 1.2: C¸c hîp chÊt acetogenin

47 10-hydroxyasimicin R mucosa 72 artemoin A* A artemoya

48 annoglaucin R mucosa 73 artemoin B* A artemoya

49 desacetyluvaricin A artemoya R mucosa 7475 artemoin C*artemoin D* A artemoya A artemoya

50 isodesacetyluvaricin A artemoya 76 diepoxymontin* A montana

51 neoannonin A artemoya 77 epomusenin A* R mucosa

52 rollimusin* R mucosa 78 epomusenin B* R mucosa

53 rolliniastatin-1 R mucosa 79 annomonicin A reticulata

54 rolliniastatin-2

(bullatacin)

A reticulata 80 annonacin A montana

A artemoya 81 annonacin-10-on A montana

R mucosa 82 annoreticuin* A reticulata

55 rollitacin

R mucosa

83

on* A reticulata

annoreticuin-9-56 squamocin

A cherimola 84 corossolin A muricata

A reticulata 85 corossolon A muricata

A squamosa 86 isoannonacin A montana

58 bullatalicinon* R mucosa 90 longifolicin A muricata

12,15-cis-squamostatin-D* A artemoya 92 muricatetrocin B A muricata

61 aromin-A A cherimola 93 muricin A* A muricata

62 bullatanocin A artemoya 94 muricin B* A muricata

63 bullatacinon A reticulata 95 muricin C* A muricata

64 bullatalicin

A artemoya 96 muricin D* A muricata

R mucosa 97 muricin E* A muricata

65 bullatalicinon R mucosa 98 muricin F* A muricata

66 c-12,15-cis-bulatalicin A artemoya 99 muricin G* A muricata

67 c-12,15-cis-bulatanocin A artemoya 100 murisolinon A reticulata

68

c-12,15-trans-bulatanocin A artemoya 101 rolliacocin* R mucosa

69 Squamostatin A A artemoya 102 solamin A reticulata

70 Squamostatin D A artemoya 103 squamon A reticulata

O O H

104

AcO

OH O H

O

105

OH O H

O O

H

O H

106

O H

O

107

1.1.2.5 Các hợp chất flavonoit

Các hợp chất flavonoit là chất phổ biến trong thực vật bậc cao Wu và cộng sự

đã tìm thấy 4 chất flavonoit và tất cả chúng đều là dẫn xuất của glycosit:

quercetin-3-O-rhamnosit (108), kaempferol-3-O- rhamnosit (109), rhamnosit (110), tanarixetin-3-O- rhamnosit (111) thu đợc từ lá của A purpurea.

O

O H

OH

O

R 1

R 21

4

8 7 6

Các hợp chất benzoit tìm thấy chủ yếu trong thực vật bậc cao Hai mơi hợp

chất benzoit (112-131) đợc tách ra từ thân cây loài A cherimola Trong số đó, 131 là

loại hợp chất quinon và các chất khác là dẫn xuất của benzenoit chứa 1 vòng benzen

với các nhóm chức khác nhau hoặc các mạch nhánh gồm: p-hydroxybenzaldehyt

(112), axit p-hydroxybenzoic (113), methylparaben (114), axit 3-chlorobenzoic

(115), vanillin (116), isovanillin (117), axit vanillic (118), axit isovanillic (119), methyl vanillat (120), methyl isovanillat (121), syringaldehyt (122), axit syringic

(123), axit 3,4,5-trimethoxybenzoic (124), trans-methyl-p-coumarat (125), axit ferulic (126), axit p- dihydrocoumaric (127), 3-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-

1,2-propanediol (128), 3,4,5-trimethoxyphenyl-β-D-glucopyranosit (129), thalictosit

CH2OH OH

H

128

O

O H O H

Các hợp chất steroit thờng đợc tách ra từ cây họ Na (Annonaceae) và các họ

khác nh: β-sitosterol (132), stigmasterol (133), β-sitosterol-D-glucosit (134), stigmasterol-D-glucosit (135), β-sitostenon (136), stigmasta-4,22-dien-3-on (137), 6β-hydroxy-β- sitosteron (138), 6β-hydroxystigmasteron (139) đợc tách ra từ thân

cây A cherimola Trong đó, 132, 133 là các chất thờng đợc tách nhiều nhất và đợc

phân bố trong hầu hết các loài của họ Na (Annonaceae).

RO

19 1 2

3 4 5

6 7 8

9 10

11 12 13 14 15 16 17

18

20 22 23

1 2 3

4 6

7

8 10

12 13 14 15

16 OH O

140

O O

H

O H

OH

1 2

3

4 5 6 7

8 9 10

1.1.2.9 Các hợp chất khác

Từ thân cây của F oldhamii các nhà khoa học đã tách đợc một furanon là

fissohamion (144) và hai cyclopentanon là stigmahamon I (145) và stigmahamon II (146) chúng đều là chất mới.

O O

3 4 5

3 4 5

Các tác giả đã tìm thấy một vài isoquinolin ở cây họ Na (Annonaceae) Trong đó

chỉ có 3 isoquinolin đơn giản: doryphornin (147), cherianoin (148), thalifolin (149)

đợc tách từ thân cây loài A cherimola.

144, R=OCH3

145, R=OH

7 8

4 3 1

R

CH3

b Benzylisoquinolin

Sáu hợp chất benzyltetrahydroisoquinolin (150 –methoxy- 155) đợc tách từ họ Na

(Annonaceae) Chúng bao gồm: reticulin (150) là một chất thờng thấy của

benzyltetrahydroisoquinolin, coclaurin (151) và N-methylcoclaurin (152) đợc tách

từ A squamosa; (+)-Orientalin A (153), annocherin A (154) và annocherin B (155)

đợc tách từ thân cây A cherimola Trong đó 154, 155 là chất mới.

N O

4 5

6

7 8

CH3O

N O

H

O H

OR H

1.1.3 Sử dụng v hoạt tính sinh học ành phần hoá học [1

Một số lo i của họ Na (Annonaceae) đà ợc trồng l m cây cảnh, đặc biệt là à

Polythia longifolia pendula (lá bó sát thân) Các lo i cây thân gỗ còn dùng l m củi.à à Một số lo i có qủa lớn, nhiều thịt ăn đà ợc bao gồm các lo i của chi à Annona ( na, na

Nam Mỹ, mãng cầu xiêm) hay chi Asimina (đu đủ Mỹ) hoặc chi Rollinia Bên cạnh

đó, một số lo i nhà Ho ng lan (à Cananga odorata) còn chứa tinh dầu thơm v đà ợc sửdụng trong sản xuất nớc hoa hay đồ gia vị

Trong kết quả nghiên cứu của Wu Y C và cộng sự [15] đã tìm đợc hơn 100hoạt tính sinh học của các chất tách ra từ cây họ Na (Annonaceae) Trong đó cónhiều chất có độc tính, hoạt tính kháng vi trùng, ức chế sự tái tạo tế bào HIV, chống

đông tụ tiểu cầu … Thảo

Năm 1999, Viện dợc học, Học viện Khoa học y dợc và Trờng Đại học BắcKinh - Trung Quốc đã nghiên cứu và tách đợc các chất có khả năng chống u bớu từthực vật họ Na: có khoảng 50 acetogenin, 12 styrylpyron và 25 polyoxygenat

cyclohexen mới đợc tách ra từ 5 loài Uvaria, 4 loài Goniothalamus và 1 loài Annona.

Bớc đầu kiểm tra hoạt tính sinh học, phần lớn các chất mới tách ra có các hoạt tínhchống u, bớu quan trọng [10, 23].

Vỏ cây, lá v rễ của một số lo i cây họ Na (Annonaceae) đà à ợc sử dụng trong yhọc dân gian dùng để điều trị bệnh nhiễm trùng, bệnh ho, bệnh về gan, bệnh tiêuchảy và bệnh ung th Các nghiên cứu dợc lý đã tìm thấy khả năng kháng nấm, khángkhuẩn v đặc biệt l khả năng sử dụng trong hóa học trị liệu của một số th nh phầnà à à hóa học của lá v vỏ cây Nghiên cứu bà ớc đầu các cây thuốc chữa ung th ở Việt

Nam thì trong đó có lợng lớn cây họ Na (Annonaceae) [1, 2]

Ví dụ: cây mãng cầu xiêm (lá, rễ và hạt) đợc dùng làm thuốc tại rất nhiều nơitrên thế giới, nhất là tại các quốc gia Nam Mỹ :

- Tại Peru, trong vùng núi Andes, lá mãng cầu đợc dùng làm thuốc trị cảm, xổmũi; hạt nghiền nát làm thuốc trừ sâu Trong vùng Amazon vỏ cây và lá dùng trị tiểu

đờng, làm dịu đau, chống co giật

- Tại Guyana: lá và vỏ cây nấu thành trà giúp trị đau và bổ tim

- Tại Batay, trong vùng Amazon, lá nấu thành trà trị bệnh gan; dầu ép từ lá vàquả còn non trộn với dầu oliu làm thuốc thoa bên ngoài trị thấp khớp, đau sng gâncốt

- Tại Jimaica, Haiti và West Indies: quả hay nớc ép từ quả dùng trị nóng sốt,giúp sinh sữa và trị tiêu chảy; vỏ thân cây và lá dùng trị đau nhức, chống co giật, ho,suyển… Thảo

- Tại Việt Nam, hạt đợc dùng nh hạt Na, nghiền nát trong nớc, lấy nớc gội đầu

để trị chí rận Một phơng thuốc Nam khá phổ biến để trị huyết áp cao là dùng vỏ quảhay lá mãng cầu xiêm sắc chung với rể nhàu và rau cần thành nớc uống hàng ngày

1.2 Cây nghiên cứu

Tên khoa học: Desmos cochinchinensis var fulvescens Ban

Tên thông thờng: Dây chân chim núi

Thuộc họ Na (Anonaceae)

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Hoa giẻ (Desmos) thuộc họ Na (Annonaceae) với khoảng 20 loài phân bố ở các

khu vực có khí hậu nhiệt đới thuộc Đông Nam á, Trung Quốc, ấn Độ [1] ở nớc ta,

chi Hoa giẻ (Desmos) có 5 loài và 2 thứ (cả 2 thứ là đặc hữu) [1,3],

Cây bụi trờn hoặc dây leo thân gỗ, dài 4-10 m Cành non thờng có lông tơ màuvàng nâu Lá phần lớn hình thuôn hoặc bầu dục thuôn, cỡ (8)11-15(18) x (3)4-5(6,6)

cm, chóp lá hình mũi ngắn, gốc lá thờng hình tim; mặt trên (trừ gân chính) nhẵn, mặtdới có lông; gân bên 8-11 đôi, rõ ở mặt dới hơi cong hình cung và gần tận mép; mạnglới, không đều; cuống lá dài 4-6 mm, có lông nh cành non Hoa mọc đơn độc, ở ngoàinách lá và so le với lá, cuống hoa dài 2,5-4 cm, có lông tơ, mang 1 lá bắc nhỏ ở cáchgốc chừng 1 cm Lá đài hình trứng nhọn, dài 6-8 mm, rộng 4-5 mm có lông ở cả haimặt (nhng mặt ngoài rậm hơn) Cánh hoa khi tơi màu vàng, không thơm, mỏng, có

lông hình mác dài, hơi không đều nhau: những chiếc ngoài dài 3-5,5 cm, rộng 10-15mm; cánh hoa trong dài 2,5-4 cm, rộng 6-8 mm Nhị nhiều, dài chừng 1 mm, chỉ nhịkhông rõ, mào trung đới lồi Lá noãn 10-15, dài chừng 2 mm; bầu có lông rậm, vòirất ngắn; núm nhụy gần hình đầu, không có lông Noãn 4-6 Phân quả 2-5 hạt, hìnhchuỗi hạt, ở trên cuống ngắn 3-7 mm, khi chín màu vàng, đốt phân quả gần hình cầuhay hình trứng, thờng có lông (khi già lông rụng) Hạt màu vàng nâu, nhẵn và láng[1,3].

Hình 1.1: ảnh cây dây chân chim núi

Cây dây chân chim núi (Desmos cochinchinensis var fulvescens Ban) là thứ

đặc hữu ở Việt Nam, phân bố ở Hà Tĩnh, Nghệ An, Thừa Thiên-Huế, Quảng Nam,Khánh Hòa, Kon Tum, Gia Lai, Đắc Lắc, Đắc Nông, Lâm Đồng, Đồng Nai Câymọc rãi rác ở ven rừng, nơi sáng, ra hoa tháng 4-7, mang quả 9-12 [1,3]

1.2.2 Th nh phần hoá học ành phần hoá học [1

ở Việt Nam mới chỉ có một số công trình nghiên cứu về mặt hóa học ở chi này

[5,6] Hầu hết các loài thuộc chi Hoa giẻ (Desmos) đều có chứa tinh dầu hoặc hơng

thơm, song hàm lợng và thành phần hóa học của tinh dầu ở mỗi loài thờng khác nhau[4,6]

Nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu lá cây dây chân chim núi

(Desmos cochinchinensis var fulvescens Ban) ở Hà Tĩnh bằng phơng pháp sắc ký khí

(GC) và sắc ký khí khối phổ (GC/MS), hơn 70 hợp chất đã đợc tách ra từ tinh dầu,trong đó có 53 hợp chất đợc xác định (chiếm đến 89,7% của tổng hàm lợng tinh dầu)

Thành phần chính của tinh dầu là elemen (16,1%), -cadinen (13,8%) và caryophyllen (13,7%) Tiếp theo là germaren B (7,7%), germacren A (5,7%),epizonaren (3,9%), elemol (3,6%), α-humulen (2,7%), -pinen (2,3%), β-selinen(2,3%), -terpinen (1,8%), -elemen (1,7%), β-cubenen (1,5%), eudesma-4 (15), 11-dien-9-on (1,3%), α-selinen (1,3%), -elemen (1,1%) (xem bảng) Các chất còn lạiphần lớn có hàm lợng nhỏ hơn 1,0%.

β-1.2.3 Sử dụng v hoạt tính sinh học ành phần hoá học [1

Các loài trong chi Hoa giẻ là nguồn nguyên liệu để tách chiết các flavonoit cóhoạt tính sinh học cao có khả năng diệt khuẩn, chống ung th, HIV,…[4,5,11] ở ViệtNam mới chỉ có một số công trình nghiên cứu về mặt hóa học ở chi này [5,6]

Chơng 2 Phơng pháp nghiên cứu

2.1 Phơng pháp lấy mẫu

Mẫu thực vật đợc thu hái vào thời điểm thích hợp trong năm Mẫu tơi sau khilấy về đợc rửa sạch, để nơi thoáng mát hoặc sấy khô ở 400C Mẫu đợc xử lý tiếpbằng phơng pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu đợc hỗn hợp cáchợp chất dùng cho nghiên cứu đợc nêu ở phần thực nghiệm

2.2 Phơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất

Để phân tích và phân tách cũng nh phân lập các hợp chất, sử dụng các phơngpháp sắc ký nh:

- Sắc ký cột (CC)

- Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích

- Các phơng pháp kết tinh phân đoạn

2.3 Phơng pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất

Cấu trúc của các hợp chất đợc khảo sát nhờ sự kết hợp các phơng pháp phổ:

3.1.Thiết bị và phơng pháp

3.1.1 Hoá chất

Các dung môi dùng để ngâm chiết mẫu thực vật đều dùng loại tinh khiết(pure), khi dùng cho các loại sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột sử dụng loại tinh khiếtphân tích (PA) Dung môi đợc sử dụng là: metanol (CH3OH), n-butanol (C4H9OH),etylaxetat (CH3COOC2H5), axeton (CH3COCH3), nớc cất

Sắc ký cột thờng, sử dụng silicagel cỡ hạt 230-400/mesh

3.2 Dụng cụ và thiết bị

- Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boetius

- Phổ tử ngoại UV đợc ghi trên máy Agilent

- Phổ hồng ngoại IR ghi trờn mỏy Bruker

- Phổ khối lợng va chạm electron EI-MS đợc ghi trên máy MS AgilentTechnologies 5973 Phổ khối lợng phun mù electron ESI-MS đợc ghi trên máy LC-MS-Trap-00127

- Phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H-NMR đợc đo trên máy Bruker 500MHz, phổ

3.3 Nghiên cứu các hợp chất từ cây dây chân chim núi

3.3.1 Phân lập các hợp chất

Mẫu cây dây chân chim núi đợc thu hái ở Thạch Hà, Hà Tĩnh vào tháng 3/2007 đợc PGS.TS Vũ Xuân Phơng, Phòng Thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật định danh

Sơ đồ 3.1: Phân lập hợp chất trong lá cây dây chân chim núi Lá dây chân chim núi (3,0kg), đợc phơi khô, xay nhỏ và ngâm chiết kiệt với metanol ở nhiệt độ phòng (7 ngày) Dịch chiết đợc cất thu hồi dung môi thu đợc cao metanol (256g) Phân bố cao metanol trong nớc, sau đó lắc lần lợt với etylaxetat, n-butanol Cất thu hồi dung môi thu đợc các cặn dịch chiết tơng ứng là 42, 57g Cao n-butanol (57g) đợc tách trên sắc ký nhồi silicagel, hệ dung môi giải hấp là cloroform:metanol:nớc (40:1:0,05, 30:1:0,05, 20:1:0,05, 10:1:0,05) thu đợc 12 phân đoạn chính Phân đoạn 4 tiếp tục phân tách bằng sắc ký cột trên silicagel, hệ dung môi rửa giải là cloroform:metanol: nớc (10:1:0,05) thu đợc hợp chất 156 (219 mg) và 157 (345mg) Phân đoạn 6 sắc ký lại nhiều lần thu đợc hợp chất 158 (45mg) 3.3.2 Một số dữ kiện về phổ tử ngoại, phổ khối và phổ cộng hởng từ hạt nhân của chất đã phân lập Hợp chất 156: chất rắn màu vàng, nhiệt độ nóng chảy: 129-1300C Lá cây dây chân chim núi (3,0 kg) Cao metanol (256g) Cao etylaxetat (42g) dịch nớc Chất 156, 157, 158 Cao butanol (57g) - Ngâm với metanol - Cất thu hồi metanol - Phân bố trong nớc - Chiết lần lợt với etylaxetat, butanol - Sắc kí cột Cloroform : metanol:nớc

Phæ UVmaxMeOHnm (log): 203, 248, 283 vµ 316.

Phæ (EI-MS) m/z: 298[M]+

Phæ 1H-NMR 500 MHz (DMSO-d 6 ) ( ppm): 12,76 (1H, s), 8,12 (2H, dd, J

=1,0, 6,0 Hz), 7,63 (3H, m), 7,04 (1H, s), 6,99 (1H, s), 3,94 (1H, s) vµ 3,74 (3H, s).

Phæ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6) ( ppm): xem b¶ng 4.1

Phæ khèi lîng va ch¹m electron (EI-MS) m/z: 284 [M]+

Phæ 1H-NMR 500 MHz (DMSO-d 6 ) ( ppm): 13,48 (1H, s), 8,76 (1H, s), 8,09 (2H, dd, J =1,5, 5,5 Hz), 7,61 (3H, m), 6,97 (1H, s), 6,94 (1H, s) vµ 3,93 (3H, s).

Phæ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6) ( ppm): xem b¶ng 4.2

Phæ UVmaxMeOHnm (log): 277, 290, 330, 380

Phæ ESI-MS m/z: 285 [M-H]+

Phæ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) ( ppm): 11,72 (s, 5), 8,21 (s, 6), 7,54 (dd, J=8,0, 1,6Hz, H-2’ vµ H-6’), 6,28 (s, H-8), 7,45 (m, H-3’, H-4’ vµ H- 5’) vµ 3,82 (3H, s, OCH3-7), 3,34 (1H, m, Ha-3) vµ 2,82 (1H, m, Hb-3)]

OH-Phæ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6) ( ppm): xem b¶ng 4.3

Chơng 4 kết qủa và thảo luận 4.1 Phân lập các hợp chất

Mẫu lá đợc cắt nhỏ, phơi, sấy khô ở 400C sau đó đem nghiền nhỏ (3,0 kg),ngâm với metanol ở nhiệt độ phòng (7 ngày) Cất thu hồi dung môi đợc cao metanol(256g) Phân bố trong nớc, chiết lần lợt với etyl axetat, n-butanol cất thu hồi dungmôi đợc các cao tơng ứng có khối lợng là: 42, 57g

Từ cao n-butanol bằng các phơng pháp sắc ký cột trên silicagel đã phân lập đợc

các hợp chất 156, 157 và 158, xác định cấu trúc các hợp chất này bằng các phơng

pháp phổ

4.2 Xác định cấu trúc hợp chất 156

Chất 156 là chất rắn màu vàng, không tan trong nớc, khó tan trong etanol,

clorofom, tan trong dung dịch kiềm loãng tạo thành dung dịch màu vàng tơi Nhiệt

độ nóng chảy 129-1300C

Phổ tử ngoại (UV) của hợp chất 156 cho hấp thụ cực đại tại 203, 248, 283,

316 nm, đặc trng cho hợp chất flavon

Phổ hồng ngoại (IR) của hợp chất 156 cho các hấp thụ cực đại tại 3445, 2361,

1669, 1364, 1088 cm-1 chứng tỏ trong phân tử có chứa nhóm OH, C=O

Phổ khối lợng (EI-MS) của hợp chất 156 cho pic ion phân tử [M]+ m/z 298,

+ 2 cacbon thuộc 2 nhóm OCH3

Bảng 4.1: Số liệu phổ 13 C-NMR của hợp chất 156

Thực nghiêm Tài liệu [15]

HSQC so sánh với tài liệu [15], cho thấy cấu trúc của chất 156 là

5-hydroxy-3,7-dimethoxyflavone (3,7-dimethylgalangine)

Hợp chất này đã tìm thấy trong các loài Boesenbergia pandurata, Cheilanthes

kaulfussi, Escallonia langleyensis và Notholaena spp [11].

5 6

7

8 9

3' 4' 5' 6'

3

OH

OCH O

O

CH3O

(156) 5-Hydroxy-3,7-dimethoxyflavone

H×nh 4.1: Phæ UVcña hîp chÊt 156

H×nh 4.2: Phæ IR cña hîp chÊt 156

H×nh 4.3: Phæ khèi lîng (EI-MS) cña hîp chÊt 156

H×nh 4.4: Phæ 1 H-NMR cña hîp chÊt 156

H×nh 4.5: Phæ 1 H-NMR cña hîp chÊt 156

H×nh 4.6: Phæ 13 C-NMR cña hîp chÊt 156

H×nh 4.7: Phæ 13 C-NMR cña hîp chÊt 156

H×nh 4.8: Phæ DEPT cña hîp chÊt 156

H×nh 4.9: Phæ DEPT cña hîp chÊt 156