Phân lập và xác định cấu trúc ccas hợp chất steroit từ cây bình bát (annona reticulata l) ở việt nam luận văn thạc sỹ hóa học

Chính vì vậy việc nghiên cứu hoá học cũng như hoạttính sinh học của các loài cây thuốc có ý nghĩa quan trọng cho việc sử dụngmột cách hợp lý và có hiệu quả, nhất là nguồn tài nguyên thiê

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

TRẦN VĂN THẠCH

HỢP CHẤT STEROIT TỪ CÂY BÌNH BÁT (ANNONA RETICULATA L.) Ở VIỆT NAM

Chuyªn ngµnh: hãa h÷u c¬

LỜI CẢM ƠN

Luận văn được thực hiện tại các phòng thí nghiệm chuyên đề Hoá hữu

cơ - khoa Hoá, Trung tâm Kiểm định An toàn Thực phẩm và Môi trường, Trường Đại học Vinh, Viện Hoá học-Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Trần Đình Thắng - Khoa Hoá, Trường Đại học Vinh đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS TS Lê Văn Hạc,TS Nguyễn Xuân - Khoa Hoá - Trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện thuận lợi, động viên tôi trong quá trình làm luận văn

TS.Trần Huy Thái (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) giúp định danh mẫu thực vật

Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, cán bộ bộ môn hoá Hữu cơ, khoa Hoá, khoa Đào tạo Sau đại học, các bạn đồng nghiệp, học viên cao học, sinh viên, gia đình và người thân đã động viên và giúp đỡ

tôi hoàn thành luận văn này

Mục Nội dung Trang

2.1 Nguyên liệu, phương pháp và thiết bị 30

2.1.2 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân

lập các hợp chất

30 2.1.3 Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất 30

2.3 Một số dữ kiện về phổ tử ngoại, phổ khối và phổ cộng

hưởng từ hạt nhân của chất đã phân lập

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

CC: Column Chromatography (Sắc kí cột)

FC: Flash Chromatography (Sắc ký cột nhanh)

TLC: Thin Layer Chromatography (Sắc kí lớp mỏng)

IR: Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại)

4

MS: Mass Spectroscopy (Phổ khối lượng)

EI-MS: Electron Impact-Mass Spectroscopy (Phổ khối va chạm electron)

1 H-NMR: Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

proton)

13 C-NMR: Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

cacbon-13) DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer.

HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation

HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation

COSY: Correlation Spectroscopy

br s: singlet tù

dd: dublet của duplet

dt: dublet của triplet

Bảng 1.2.5 Các hợp chất diterpenoit kauran từ cây Na 22

Hình Nội dung Trang Hình 3.2.1 Phổ khối lượng (EI-MS) của hợp chất 1 36

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới ẩm, gió mùa nên có hệ thực vật rấtphong phú và đa dạng với hơn 12.000 loài, bao gồm hơn 300 họ và 1.200 chi.Nguồn thực vật phong phú này đã cung cấp cho con người nhiều sản phẩmthiên nhiên có giá trị Các sản phẩm thiên nhiên có hoạt tính sinh học có ứngdụng rất lớn trong nhiều lĩnh vực khác nhau của cuộc sống, đặc biệt dùng làmthuốc chữa bệnh Các loại thuốc thảo mộc ít gây tác dụng phụ và ít độc hạicho người sử dụng Chúng được dùng như tác nhân điều trị trực tiếp, làm chất

dò sinh hoá để làm sáng tỏ nguyên lí dược học hoặc làm chất chuẩn để pháttriển các loại thuốc mới Chính vì vậy việc nghiên cứu hoá học cũng như hoạttính sinh học của các loài cây thuốc có ý nghĩa quan trọng cho việc sử dụngmột cách hợp lý và có hiệu quả, nhất là nguồn tài nguyên thiên nhiên này

Từ trước đến nay trên thế giới các hợp chất thiên nhiên có hoạt tínhsinh học luôn đóng một vai trò quan trọng trong đời sống của con người Cáchợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học được dùng làm nguyên liệu chocông nghiệp dược phẩm làm thuốc chữa bệnh, công nghiệp thực phẩm, hươngliệu và mỹ phẩm Thảo dược là nguồn nguyên liệu trực tiếp hoặc là nhữngchất dẫn đường để tìm kiếm các loại biệt dược mới Theo số liệu thống kê chothấy khoảng trên 60% các loại thuốc đang được lưu hành hiện nay hoặc đangtrong giai đoạn thử nghiệm có nguồn gốc từ các loại hợp chất thiên nhiên [5]

Ở nước ta, số loài thuộc chi Na (Annona) có 4 loài trong đó 3 loài là cây trồng [2] Na xiêm (Annona muricata L.) có nguồn gốc châu Mỹ và được

nhập sang các nước nhiệt đới khác Quả chín ăn ngon (ăn tươi hoặc nghiềnpha thành “kem sinh tố”) Lá dùng làm gia vị và chữa sốt rét, chữa ho; quảchữa kiết lỵ; hạt để duốc cá, làm thuốc trừ sâu [1,2]

Cây Bình bát (Annona reticulata L.) là loài cây phổ biến ở các nước

Việt Nam, Trung Quốc và được dùng làm thuốc chữa bệnh, đồ gỗ… nhưngchưa được nghiên cứu nhiều về thành phần hoá học Chính vì vậy chúng tôi

chọn đề tài “Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất steroit từ cây

bình bát (Annona reticulata L.) ở Việt Nam” từ đó góp phần xác định thành

phần hoá học của bình bát và tìm ra nguồn nguyên liệu cho ngành dược liệu,hương liệu

2 Nhiệm vụ nghiên cứu

Trong luận văn này, chúng tôi có các nhiệm vụ:

- Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các

hợp chất của bình bát (Annona reticulata L.).

- Sử dụng các phương pháp sắc ký và kết tinh phân đoạn để phân lậpcác hợp chất

- Sử dụng các phương pháp phổ để xác định cấu trúc các hợp chất thuđược

3 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là cây Bình bát (Annona reticulata L.) thuộc họ

Na (Annonaceae) ở Việt Nam.

8

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Chi Na (Annona)

1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Na

Họ Na (Annonaceae) còn được gọi là họ Mãng cầu, là một họ thực vật

có hoa bao gồm các loại cây thân gỗ, cây bụi hay dây leo Với khoảng 2.300đến 2.500 loài trong 120 - 130 chi, đây là họ lớn nhất của Bộ mộc lan

(Magnoliales) Chi điển hình của họ này là Annona (Na hay Mãng cầu ta;

Mãng cầu xiêm hay Mãng cầu gai) Họ này sinh trưởng chủ yếu ở vùng nhiệtđới, và chỉ có một ít loài sinh sống ở vùng ôn đới Khoảng 900 loài ở Trung

và Nam Mỹ, 450 loài ở Châu Phi, và các loài khác ở châu Á [2]

Trong đó, chi Annona (8 loài) gồm: Annona cherimola, A.glabra,

A.montana, A.muricata, A.reticulata, A.squamosa, A.artemoya (A cherimola

x squamosa), A.Purpurea.

1.1.2 Thành phần hóa học

Những năm gần đây họ Na được nhiều nhà khoa học trên thế giới quantâm nghiên cứu Đặc biệt, nhóm nghiên cứu của Y C Wu (Đài Loan) [41] đãtìm được hơn 100 hoạt tính sinh học của các chất tách ra từ cây họ Na

(Annonaceae) Trong đó có nhiều chất có độc tính, hoạt tính kháng vi trùng,

ức chế sự tái tạo tế bào HIV, chống đông tụ tiểu cầu

Nhóm nghiên cứu của D.Q Yu (Trung Quốc) [52] đã nghiên cứu vàtách được các chất có khả năng chống u bướu từ thực vật họ Na: có khoảng

50 acetogenin, 12 styrylpyron và 25 polyoxygenat cyclohexen mới được tách

ra từ 5 loài Uvaria, 4 loài Goniothalamus và 1 loài Annona Bước đầu kiểm

tra hoạt tính sinh học, phần lớn các chất mới tách ra có các hoạt tính chống u,bướu quan trọng Trong quả có 72% glucose, 14,52% saccharose, 1,73%tinh bột, 2,7% protid và vitamin C Trong lá có một alcaloit vô định hình,không có glucozit, lá xanh chứa 0,08% dầu Hạt chứa 38,5-42% dầu, trong đóthành phần axit béo là: axit stearic(9,3%), axit oleic (37%), axit linoleic(10,9%), acid arachidic (3,3%) và isoricinoleic acid (9,8%) [26] Trong hạt cómột alcaloit vô định hình gọi là anonain Chất độc trong hạt và rễ là cácglycerit và các axit có phân tử lớn Lá, vỏ và rễ chứa axit hydrocyanic Vỏchứa anonain

NH

o o

Anonain (1)

Trong các bộ phận khác của Na có alkaloit, chẳng hạn như aporphine,roemerine,norcorydine, corydin, norisocorydine, glaucine và anonain(Kowalska và Puett, 1990) [29]

1.1.2.1 Hợp chất acetogenin

Các hợp chất acetogenin thiên nhiên có mạch cacbon dài từ 35-37, nóđược bắt nguồn từ axit béo C-32/C-34 kết hợp với một đơn vị 2-propanol,các acetogenin có tính chất như một chuỗi dài aliphatic gắn vào vòng -lacton có nối đôi ở vị trí ,  trên vòng còn mang một nhóm metyl, đôi khikết hợp với ketolacton, ngoài ra còn gắn với một, hai hoặc ba vòngtetrahyđrofuran, trên mạch chính có gắn các nhóm thế hyđroxyl, acetoxyl,keton, epoxid và diol, trên mạch chính của một vài hợp chất acetogenin còn

có liên kết đôi C=C [10], [18], [42],[45]

10

Bảng 1.4 Một số hợp chất acetogenin trong các bộ phận của cây

16 cis – Annonacin 58 muricin B

17 iso – Annonacin 59 muricin C

19 cis-10-R-annonacin A-on 61 muricin E

37 Epomuricenin A & B 79 Solamin

42 Goniothalamicin

Các nhà khoa học đã xác định cấu tạo hóa học và thử tác dụng sinh họccủa chúng (về tim mạch, độc tính và các hoạt tính dược lí khác) Một số hợpchất có tiềm năng ứng dụng rất lớn để sản xuất thuốc chữa bệnh

* Các acetogenin thuộc kiểu monotetrahydrofuran:

Trong cấu trúc của phân tử các hợp chất loại này có vòngtetrahydrofuran, hai hay nhiều nhóm – OH, có hoặc không có liên kết đôi C=C

Hợp chất (9) (0,0021%), (15) (0,0032%), (18) (0,0021%) được M.C.Jaramillo và các cộng sự [26] phận lập và xác định cấu trúc vào năm 1999 từ

vỏ của quả na xiêm

O C

H3

(CH2)5

OH

(CH2)3OH

11 10 4

H3

(CH2)5

OH

(CH2)3OH

11 10 4

H3

(CH2)5

OH

(CH2)3OH

11 10 4

(18) Annonacin A Hai hợp chất mono-tetrahydrofuran (13) và (49) được Geum-Soong

Kim và các cộng sự [28] phân lập từ lá của cây na xiêm

O O

35 OH

O (CH2)10

Vào năm 2001 Chih-Chuang Liaw (Đài Loan) và các cộng sự [36] đã

phân lập và xác định được cấu trúc hợp chất (5), (64), (65) từ hạt và hợp chất (1), (35) từ lá của na xiêm Đây là các hợp chất thuộc loại mono-

tetrahydrofuran

32

35

O O

O OH

OH

19 28

(1) Annocatalin

O O OH O

O

OH O

O O

OH OH

OH OH

(65) Muricin I

Fang-Rong Chang and Yang-Chang Wu (Đài Loan) [17] đã phân lập

và xác định được bảy hợp chất cytotoxic monotetrahydrofuran acetogenin:muricin A-G (57-63), các hợp chất này được phân lập từ hạt của na xiêm

32

O O

O O

22 23

(60) Muricin D

OH O

O O

O

OH OH

(61) Muricin E

O OH

OH

O

H OH

(62) Muricin F

OH O

OH

OH

O O

H OH

(63) Muricin G

Trong công trình nghiên cứu của Christophe Gleye (Pháp) và các cộng

sự [20] đã phân lập đồng thời xác định cấu trúc của các hợp chất acetogenin

(72), (73), (74), (80), (81), (82) những hợp chất này thuộc loại

cis-monotetrahydrofuran được trích từ rễ cây na xiêm.

A

72 cis-Panatellin 2 13 H cis

73 cis-Reticulatacin 6 11 H cis

74 cis-Reticulatacin-10-on 6 11 O cis

80 cis-Solamin 4 11 H Cis

81 cis- Uvariamicin I 4 13 H Cis

82 cis-Uvariamicin IV 2 15 H Cis

* Các acetogenin thuộc kiểu non-monotetrahydrofuran:

Hợp chất (52) thuộc loại non-tetrahydrofuran (THF), bốn nhóm –OH

và một liên kết đôi C = C gắn trên mạch dài aliphatic được De Yu LI (TrungQuốc) và các cộng sự tách và xác định cấu trúc từ hạt của quả na xiêm [35]

CH3(CH2)13

OH

OH

OH (CH2)4

O OH

(52)Muricatenol Công trình nghiên cứu của Christophe Gleye (Pháp) và cộng sự [52] đãphân lập được hai hợp chất acetogenin non - monotetrahydrofuran, chúngđược tách ra từ hạt của trái na xiêm Trên mạch chính có gắn với hai nhóm -

OH liền kề nhau và một liên kết đôi C = C

CH322

34

O O O

(30)Cohibins D Trong công trình nghiên cứu của C Gleye (Pháp) và các cộng sự phânlập hợp chất (46) từ rễ của cây na xiêm, hợp chất này thuộc loại acetogeninđiol liền kề và trên mạch chính có chứa hai liên kết đôi C = C [21]

16

O

O O

34 33

2 17

32

35

(78) SabadelinCác acetogenin quan trọng nhất là anonin hoặc anonacin: simicin,annonastatin, bullatacin, ullatacinone và squamocin Những chất nàycó tácdụng độc hại khi ăn côn trùng và có thể ức chế sự phát triển của côn trùng,phát triển và sinh sản Anonins gây độc tế bào Aedes aegypti với nồng độ chỉ

10 ppm, cơ chế hoạt động của nó là gây ức chế hô hấp (Londershausen et al,

1991 a, b) [37] Các asimicin có hiệu quả chống lại loại sâu bệnh, chẳng hạn

như A.aegypti, A.vittatum, A gossypii, Colliphora vicina, Epilachna

varivertis, Tetranychus urticae, và Caenoharbiditis Hợp chất này có 256

đồng phân được biết đến, trong đó bullatacin là độc nhất (Li et al, 1990) [31]

Bullatacin nguyên nhân gây tử vong 80% của A aegypti, A.gossypii và

Diabrotica undecimpunctata khi ở nồng độ 1, 10 hoặc 24 ppm, tương ứng.

Một số này acetogenin có thể được sử dụng như côn trùng thuốc chống(Hernández và Angel, 1997) [25]

Trong đó có 7 cấu định trúc mới được xác định là: squamocin - O1, - O2

(Araya et al., 2002) [14], squamosten - A (Araya et al., 1994a) squamocin –

N, - E, - B (Sahai et al., 1994) [14], và squamostanal – A (Araya et al.;1994b)[32].

O OH

O OH

(CH2)5

OH

(CH2)10

O O

Me Me

trans erythro

C

H3

O O

CH3

O H OH

OH

Squamosin 2 (81)

O O

C

H3

O O

37

O H OH

R3

R1

Squamocin 2 (81) R1 = H R2 = H R3 = OH R4 = H Squamocin – C (82) R1 = H R2 = H R3 = H R4 = OH

18

Squamocin –G (83) R1 = OH R2 = H R3 = H R4 = H Squamocin – L (84) R1 = H R2 = H R3 = H R4 = H

Squamocin –O1,- (85)- O2 (86) R1 = H R2 = OH R3 = OH R4 = H

O O

C

H3

O O

37

O H OH

C

H3

O O

37

O H OH

C

H3

O H

O O

37

OH R

Squamocin- B (93) R= OH Squamocin- J (94) R= H

O O

C

H3

O H

O O

37

OH

R

Squamocin- E (95) R= OH Squamocin- K (96) R= H

O O

C

H3

O O

1.1.2.2 Các hợp chất ligan

R Ranjan và M Sahai [44] đã tách và phân lập được 3 chất từ hạt na :

o o o

H OCH3

N-Nitrosoxylopin (110) Roemerolidin (111) Duguevallin (112)

Hợp chất benzylisoquinolin đã được tách ra từ cây Annona squamosa

gồm: reticulin (113) là một chất thường thấy của benzyltetrahydroisoquinolin,

Wu [53] xác định gồm 2 chất mới là xiclosquamosin H (116) -1 và - I(117)-2,

và sáu hợp chất đã biết là squamin A (118)-3, squamin B (119)-4,

22

xiclosquamosin A (120)-6, xi-closquamosin D (121)-7, xiclosquamosin E (122)-8,và cherimolacy-clopeptide B (123)-9.

Các hợp chất xyclopeptit được Li Chao Ming lần đầu tiên tách ra từ hạt

của quả bình bát (Annona glabra) [33] vào năm 1995 Ngày này đã có nhiều

công trình nghiên cứu về việc phân tách loại hợp chất này từ na xiêm

C C

H2NH C CH NH C CH NH C

H C HN C

HC

N

C

H2C HN

O O

O

O O

Gly

Ala

Annomuricatin A (124)

Vào năm 1995, nhóm nghiên cứu của Li Chao-Ming đã tiến hành phân

lập và đã xác định được cấu trúc của annomuricatin A (124) từ hạt của quả na

xiêm [32] Từ hạt của cây na xiêm nhóm nghiên cứu cũng phân lập và xác

định được cấu trúc annomuricatin B (125) vào năm 1996 [34].

N H

NH C

NH C CH

H N

C

H2C HN HC C N HC C

H N

H

C C

CH C

CH

H

O O

O

O

O

C NH2O

Asn Pro

Thr

Gly

Leu Trp

Ala

O

Annomuricatin B (125)

Năm 2004, Alassane Wélé và các cộng sự [50], từ hạt của na xiêm đã

phân lập được hợp chất mới annomuricatin C (126).

NH C CH NH C CH

H N C HC HN C

H2C HN C

O

O

O O

Nhiều hợp chất diterpenoit kauran đã được tách ra từ cây na và trong

số đó nhiều chất có hoạt tính sinh học cao, như hợp chất axit

16β,17-26

dihydroxy-ent-kaurane-19-oic (131) được tách từ quả Annona squamosa có

hoạt tính chống sự sao chép HIV trong tế bào bạch cầu H9 với giá trị ED50 =0,8 µg/ml [36]

H C

H3

R3

R1

R2H

129 axit 17-hydroxy-16α-hydro-ent-kauran-19-oic CH 2 OH H COOH

130 axit 16α,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic CH 2 OH OH COOH

131 axit 16β,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic OH CH 2 OH CH 2 OH

133 axit 17-hydroxy-16β-hydro-ent-kauran-19-oic H CH 2 OH COOH

134 axit 17-acetoxy-16β-hydro-kauran-19-oic H CH 2 OAc COOH

140 axit 17-acetoxy-16β-hydroxyl-kauran-19-al OH CH 2 OAc CHO

Trà làm từ gốc rễ là tẩy cao, trong khi nó được làm từ các lá nhẹ là thuốcnhuận tràng (Leal, 1990) Nó có tác dụng bổ tiêu hóa đường ruột (Leal, 1990).Ethanol chiết xuất từ vỏ cây xuất hiện có tác dụng chống khối u hoạt động.Chất chiết xuất từ hạt có độc tính rất cao với côn trùng [26].

Quả Na vị ngọt, chua, tính ấm; có tác dụng hạ khí tiêu đờm Quả xanhlàm săn da, tiêu sưng Hạt Na có vị đắng, hơi hôi, tính lạnh, có tác dụng thanhcan, giải nhiệt, tiêu độc, sát trùng Lá cũng có tác dụng kháng sinh tiêu viêm,sát trùng Rễ cầm ỉa chảy

 Sử dụng:

Trồng Na chủ yếu để lấy quả ăn tươi Quả Na ngon, ngọt, có mùi thơmthanh khiết nên được nhiều người ưa thích Nhiều nước như Ấn Độ, Braxin,Thái Lan đánh giá Na rất cao Quả Na chín được dùng với tác dụng bổ dưỡng,rất tốt cho người cao tuổi, người mới ốm dậy và phụ nữ sau khi sinh

Ngoài ra quả Na dùng chữa đi lỵ, tiết tinh, đái tháo, bệnh tiêu khát.Quả xanh dùng chữa lỵ và ỉa chảy Quả Na điếc dùng trị mụn nhọt, đắp lên vú

bị sưng Hạt thường được dùng diệt côn trùng, trừ chấy rận Lá Na dùng trịsốt rét cơn lâu ngày, mụn nhọt sưng tấy, ghẻ Rễ và vỏ cây dùng trị ỉa chảy vàtrục giun

28

Ở Vân Nam (Trung Quốc), lá dùng trị xích lỵ cấp tính; lá dùng trị trẻ

em lòi dom; quả dùng trị phù thũng ác tính

Ở Thái Lan, lá tươi và rễ dùng trị chấy, mụn nhọt, nấm tóc và lang ben

Ở Ấn Độ, rễ được dùng gây xổ; hạt, quả và lá dùng diệt côn trùng, duốc cá,diệt chấy; hạt kích thích, chất chiết xuất từ những hạt Na được sử dụng để gâysẩy thai bởi các bộ lạc ở Madhya Pradesh (Salluja và Santani, 1990) [41],thường được kết hợp với lá của cây Zeylanica

Các lá có dạng thuôn dài hình mũi mác và màu xanh đen, chiều dài của

lá từ 25 đến 30cm và rộng khoảng 7cm, trên lá có từ 10 đến 20 cặp gân lá và

ở cuống lá có nhiều lông tơ

Hoa của nó rất giống với hoa của Na (Annona squamosa), chỉ khác là,

hoa thường tập hợp lại thành cụm từ 2 đến 10 hoa, với chiều dài của cuốnghoa từ 1,5-3,0cm Loài cây này có khả năng thụ phấn tự nhiên thấp và khảnăng đậu trái kém

Quả của nó nặng từ 0,1 đến 1,0 kg và thường có hình trái tim, nhưngđôi khi có dạng hình nón, hình trứng, thỉnh thoảng không có hình dạng cụ thể,

chiều dài của quả từ 10 đến 12 cm Vỏ quả có có màu vàng hơi đo đỏ và dai,với các đường viền rất rõ trên lá noãn (khoảng 5 đến 6 hõm nghiêng) Thịtquả có màu trắng sữa và có mùi thơm nhưng vị thì nhạt nhẽo Quả Bình bátđược coi là loại kém ngon nhất trong các loại cây thuộc họ Na được trồng để

ăn quả Mỗi quả có khoảng hơn 40 hạt, các hạt có dạng hình thuôn, màu đen

và hơi nâu

Cây Bình bát được cho là có nguồn gốc tại Antilles và một số khu vực

ở vùng ven Caribbean Từ Antilles , các nhà thám hiểm người Tây Ban Nha

đã mang loài này đến Mexico, và từ đó, chúng được phân bố đến châu Á vàChâu Phi Tế bào nguyên thủy đầu tiên được Người Mĩ bản địa và những cưdân hoang dã ở vùng Costa Rica mang sang Ngày nay, mặc dù loài này phân

bố khá rộng rãi ở vùng nhiệt đới, nhưng quả của nó không có giá trị về mặtkinh tế

Bình bát là loài cây rất phổ biến, thường được tìm thấy ở các vườn nhàcủa các thành phố hoặc thị trấn ven biển ở khắp nhiệt đới Châu Mĩ Nó cũngđược trồng nhiều ở Ấn Độ, Sri Lanka, Malay Archipelago, Polynesia,Philippin, Australia và hầu hết ở các nước châu Phi

30

1.2.2 Thành phần hóa học

Thịt quả cây Bình bát chín có màu vàng kem, có vị ngọt, hàm lượngaxit thấp Tuy nhiên, mùi vị của quả không bằng của các quả từ loài khác

trong chi Na (như là Annona cherimoya và Annona squamosa) Các thành

phần cụ thể được trình bày ở bảng dưới đây [41]:

O H

Từ rễ của Bình bát, Suresh và cộng sự [47] đã tìm thấy hợp chất có tên

reticulin (141) là một alkaloid thuộc khung aporphin.

N O

H

O H

H

H3CO

H3CO Reticulin (141)

1.2.2.2 Amin béo

Một dãy các N-fatty acyl triptamin được Maeda và cộng sự [38] phânlập từ hạt của cây Bình bát Trong đó vị các gốc chứa nhóm acyl là từhexadecanoyl đến hexacosanoyl

32

O O

NH O

O O O

H

O

H

O N

1.3.2 Hoạt tính sinh học

Các acetogenin cho thấy có hoạt tính sinh học mạnh với các tế bào ungthư như: ung thư bàng quang [54], ung thư biểu mô vú [43], bạch cầu, ung thưphổi, ung thư biểu mô mũi-họng, ung thư ruột kết ác tính [16], ung thư gan[15] Các alkaloit cũng có khả năng gây độc đối với các dòng tế bào u ác tính,

tế bào Hela, chứng tăng bạch cầu [47] Dịch chiết từ vỏ thân cây bình bát chothấy có khả năng giảm đau, chống viêm [46], dịch chiết từ rễ có khả năngchống lại các tế bào u ác tính [48]

34

Chương 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Nguyên liệu, phương pháp và thiết bị

2.1.1 Phương pháp lấy mẫu

Mẫu thực vật được thu hái vào thời điểm thích hợp trong năm Mẫu tươisau khi lấy về được rửa sạch, để nơi thoáng mát hoặc sấy khô ở 400C Mẫuđược xử lý tiếp bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp

để thu được hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu được nêu ở phần thựcnghiệm

2.1.2 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất

Để phân tích và phân tách cũng như phân lập các hợp chất từ các caodịch chiết, chúng tôi đã sử dụng các phương pháp sắc ký như: sắc ký cột(CC), sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích, các phương pháp kết tinh phân đoạn

- Sắc ký bản mỏng phân tích được tiến hành trên bản mỏng kínhsilicagel Merck 60 F245 tráng sẵn, độ dày 0,2 mm Hiện màu: hơi iot và đèn

UV 254 nm

- Sắc ký cột thường, sử dụng silicagel cỡ hạt 230-400/mesh

2.1.3 Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất

Cấu trúc các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp của các phươngpháp phổ:

m, H-3); 1,01 (3H, s, 19-CH3); 0,92 (3H, d, J= 6,2 Hz, 21-CH3); 0,84 (3H, d,

36

J = 7,0 Hz, 29-CH3); 0,83 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-26); 0,81 (3H, d, J =6,5 Hz,

27-CH3); 0,68 (3H, s, 18-CH3) Phổ 13C-NMR (125MHz, CDCl3) ( ppm):140,8 (C-5); 121,7 (C-6); 71,8 (C-3); 56,8 (C-14); 56,1 (C-17); 50,2 (C-9);45,9 (C-24); 42,3 (C-4, C-13); 39,8 (C-12); 37,3 (C-1); 36,5 (C-10); 36,2 (C-20); 33,9 (C-22); 31,9 (C-7); 31,7 (C-8); 29,7 (C-2); 29,2 (C-25); 28,3 (C-16);26,1 (C-23); 24,3 (C-15); 23,1 (C-28); 21,1 (C-11); 19,8 (C-19); 19,4 (C-27);19,1 (C-26); 18,8 (C-21); 11,9 (C-18, C-29)

Hợp chất 2: Tinh thể hình kim, đ.n.c: 155o-157oC IR (KBr) max (cm-1):

3400, 3025, 1410, 1250, 820, 690 Phổ EI-MS m/z: 412 [M+] (7), 300 (7), 255(11), 231 (4), 213 (8), 173 (7), 145 (20), 133 (20), 83 (49,3), 55 (100), 43(90) Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3) ( ppm): 5,35 (1H, m, H-6), 5,14 (1H,

m, J =12,0, 3,0 Hz, H-22), 5,03 (1H, dd, J =12,0, 3,0Hz, H-23), 3,28 (1H, m, H-3), 0,90 (3H, d, J=6,5 Hz, 21-CH3), 0,82 (3H, d, J=6,6 Hz, 26-CH3), 0,83

(3H, t, J = 7,0 Hz, 29-CH3), 0,80 (3H, d, J=6,5 Hz, 27-CH3), 0,79 (3H, s,

19-CH3) và 0,64 (3H, s, 18-CH3) Phổ 13C-NMR (125MHz, CDCl3) ( ppm):140,8 (C-5); 138,3 (C-22); 129,3 (C-23); 121,7 (C-6); 71,8 (C-3); 56,9 (C-14); 56,0 (C-17); 51,3 (C-9); 50,2 (C-24); 42,3 (C-4, C-13); 40,5 (C-20); 39,7(C-12); 36,5 (C-10); 37,3 (C-1); 31,9 (C-7, C-8); 31,7 (C-2, C-25); 28,9 (C-16); 25,4 (C-28); 24,4 (C-15); 21,2 (C-27); 21,1 (C-11); 19,4 ( C-19); 19,0(C-26); 12,2 (C-21); 12,0 (C-29); 11,9 (C-18)

Hợp chất 3: Chất rắn vô định hình, đ.n.c: 283-285°C IR (KBr) max (cm

-1): 3400, 3050, 1650 và 815 EI-MS m/z 396 [M-glc]+ 1H-NMR (500HzDMSO-d6) ( ppm): 5,32 (1H, d, J=3,0, H-6); 2,40 (1H, s, H-4b); 2,20 (1H, q,

J= 2,5, 13,5Hz, H-4a); 0,98 (3H, s, 21-CH3); 0,91 (3H, d, J=6,5Hz, 27-CH3);0,67 (3H, s, 18-CH3) 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6) (ppm): 140,4 (C-5),121,1 (C-6); 100,8 (C-1’); 77,0 (C-3); 76,7 (C-5’); 76,6 (C-3’); 73,4 (C-2’);70,1 (C-4’); 61,1 (C-6’); 56,2 (C-14); 55,4 (C-17); 49,6 (C-9); 45,1 (C-24);

41,8 (C-13); 40,1 (C-4); 40,0 (C-12); 38,2 (C-1); 36,8 (C-20); 36,2 (C-10);35,4 (C-22); 33,3 (C-7); 31,4 (C-8); 31,3 (C-2); 29,2 (C-23); 28,7 (C-16);27,7 (C-25); 25,5 (C-15); 23,8 (C-28); 22,6 (C-11); 20,6 (C-27); 19,7 (C-19);19,0 (C-21); 18,9 (C-26); 11,7 (C-18, C-29).

Phổ 1H-NMR (500Hz CDCl3) ( ppm): 5,80 (1H, br s, H-4); 4,34 (1H, br s, H-6b); 1,38 (3H, s, 21-CH3); 0,92 (3H, d, J=6,5 Hz, 26-CH3); 0,85 (3H, d,

J=2,0 Hz, 19-CH3); 0,82 (3H, d, J= 3,5 Hz, 29-CH3); 0,81 (3H, s, 61-CH3);

0,74 (3H, s, 18-CH3); Phổ 13C-NMR (125MHz, CDCl3) ( ppm): 200,4 (C-3);168,5 (C-5); 126,3 (C-4); 73,3 (C-6b); 56,1 (C-17); 55,9 (C-14); 53,7 (C-9);45,9 (C-24); 42,6 (C-13); 39,7 (C-12); 38,6 (C-7); 38,0 (C-10); 37,1 (C-1);36,1 (C-20); 34,3 (C-2); 34,0 (C-22); 29,8 (C-8); 29,2 (C-25); 28,2 (C-16);26,2 (C- 23); 24,2 (C-15); 23,1 (C-28); 21,0 (C-11); 19,8 (C-26); 19,5 (C-19);19,1 (C-27); 18,8 (C-21); 12,0 (C-18, C-29)

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập các hợp chất

Mẫu lá cây Bình bát thu hái ở Tiền Giang vào tháng 3/2010 được TS.Trần Huy Thái, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật định danh, tiêu bảnđược lưu giữ tại khoa Sinh, Trường Đại học Vinh Lá (5,0 kg), được phơikhô, xay nhỏ và ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng (7 ngày), 3 lần.Dịch chiết được cất loại dung môi thu được cao metanol (316 g) Phân bố caometanol trong nước, sau đó chiết lần lượt với hexan, etyl axetat, butanol rồicất loại dung môi thu được các cao dịch chiết tương ứng là 31g, 82 g và 47 g

38

Sơ đồ 2.1: Phân lập hợp chất trong lá cây bình bát

Cao hexan (31g) được tách trên sắc kí cột silica gel với hệ dung môi giảihấp là hexan:axeton (25:1; 19:1; 15:1; 9:1; 4:1; 2:1) thu được 14 phân đoạnchính Phân đoạn 3 tiếp tục phân tách bằng sắc kí cột trên silica gel với hệ

dung môi rửa giải là hexan:axeton (15:1) thu được hợp chất 1 (302 mg) và hợp chất 2 (135 mg) Phân đoạn 6 sắc kí lại nhiều lần thu với hệ dung môi hexan:axeton (9:1) được hợp chất 4 (31 mg).

Cao butanol (47g) được tách trên sắc kí cột silica gel với hệ dung môi giảihấp là clorofoc:metanol:nước (40:1:0,05; 30:1:0,05; 20:1:0,05; 10:1:0,05;4:1:0,05) thu được 10 phân đoạn chính Phân đoạn 5 tiếp tục phân tách bằngsắc kí cột trên silica gel với hệ dung môi rửa giải là clorofoc:metanol: nước

(9:1:0,05) thu được hợp chất 3 (235 mg)

(5,0 kg).

Cao metanol

- Ngâm với metanol

- Cất thu hồi metanol

- Phân bố trong nước

- Chiết lần lượt với etylaxetat, butanol

Từ phổ 1H-NMR và 13C-NMR với kĩ thuật DEPT của hợp chất 1 cho thấy

tín hiệu của các nguyên tử H như sau: tại Ha-3 3,51ppm là tín hiệu của protongắn trên C-3 có C 71,8 ppm; tín hiệu H 5,31 ppm là của nguyên tử hiđro gắntrên nguyên tử C-6 (C 121,7) tại nối đôi C=C Ngoài ra còn xuất hiện tínhiệu của 6 nhóm metyl ở các vị trí tương ứng H 0,68; 0,87; 0,91; 1,01; 1,1;1,17 Các số liệu phổ thu được so với [30] là hoàn toàn phù hợp với -sitosterol Hợp chất này tồn tại rất phổ biến trong thực vật [19]