Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ nấm linh chi đen (ganodenrma sinense zhao, xu et zhang) ở việt nam luận văn thạc sỹ hóa học

Gần đây, quả thể và bào tử nấm đang nhận được sự quan tâmcủa giới y học, mà còn là một nguồn hứa hẹn mới của ngành dược phẩm [1].Nhiều hợp chất với các hoạt động tim mạch, điều hòa miễn

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Từ 2000 năm qua, các loại nấm thuộc chi Linh chi đã được giới y họchàng đầu của phương Đông quan tâm, sản phẩm có nguồn gốc từ linh chi hiệnđang có khối lượng bán hàng cao nhất trong thị trường thực phẩm y tế tại ĐàiLoan, Trung Quốc Gần đây, quả thể và bào tử nấm đang nhận được sự quan tâmcủa giới y học, mà còn là một nguồn hứa hẹn mới của ngành dược phẩm [1].Nhiều hợp chất với các hoạt động tim mạch, điều hòa miễn dịch, gây độc tế bào,giảm đau, trị đái tháo đường, chất chống oxy hóa, chất diệt côn trùng đã được

cô lập trong hai thập kỷ qua Chỉ trong có hai loài Ganoderma lucidum (Linh chi đỏ; Xích chi) và Ganoderma applanatum (Cổ linh chi) đã thu được hơn 130 loại

chất chuyển hóa với các nhân tế bào loại lanosterol và ergosterol (provitamin

D2), sự phân lập chúng cùng với việc xác định hoạt tính sinh học được giới thiệutrong một số tài liệu đã công bố [2]

Sự xuất hiện của các chất chuyển hóa thứ cấp chủ yếu là do các loạinấm không thể tổng hợp các phân tử lớn từ cacbon đioxit và năng lượng từ ánhsáng mặt trời mà không có chất diệp lục Do đó, ngoài các điều kiện khí hậu củamôi trường sự phát triển của vi sinh vật được xác định chủ yếu bởi các loại chấtdinh dưỡng của chất nền nơi chúng phát triển, làm cho nấm xuất hiện ở các vùngkhác nhau hoặc phát triển trên các chất nền khác nhau, có thể thay đổi và thayđổi quá trình trao đổi chất của chúng tạo ra nhiều loại hóa chất với cấu trúc khácnhau có thể trở thành chất mới [3],[4]

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa và các loại thực vật đa dạng sinhhọc hứa hẹn một lượng lớn các loài nấm đặc trưng do các điều kiện cần thiết chocác loại nấm không thể sinh tổng hợp các hợp chất đã được nghiên cứu của cùngmột loài xuất hiện ở các nơi khác của thế giới Ở Việt Nam có rất ít nghiên cứuđến thành phần hóa học của nấm như vậy, những nghiên cứu này chủ yếu nhấnmạnh vào nội dung của ergosterol (provitamin D2), mà ergosterol hiện đang

được sử dụng trong một số cây trồng ăn được trên quy mô lớn như một nguồncung cấp thay thế các loại vitamin, khoáng chất, amino axit, chất xơ và ít chấtbéo [5,6]ở Costa Rica.

Vì vậy chúng tôi chọn đề tài: “Phân lập và xác định cấu trúc các hợp

chất từ nấm (Ganoderma sinense Zhao, Xu et Zhang) ở Việt Nam”

2 Nhiệm vụ nghiên cứu

Trong luận văn này, chúng tôi có các nhiệm vụ:

- Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp

chất từ nấm linh chi đen (Ganoderma sinense Zhao, Xu et Zhang).

- Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ nấm linh chi đen

(Ganoderma sinense Zhao, Xu et Zhang)

3 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là dịch chiết từ nấm linh chi đen (Ganoderma sinense Zhao, Xu et Zhang) ở Việt Nam.

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới nấm

Nấm là một nhóm lớn các sinh vật (khoảng 500.000 loài đã được mô tả,nhưng người ta ước tính rằng có thể có từ 1 đến 1,5 triệu loài) được phân bốrộng rãi trong tự nhiên, góp phần vào sự phân hủy các chất hữu cơ và tham giavào chu kỳ sinh học, chỉ một số ít là gây bệnh cho động vật và thực vật Banđầu, các loại nấm được phân loại trong giới thực vật và cấu trúc của các chất tạonên các sinh vật được coi là có cấu trúc của các chất nền mà sinh vật đó pháttriển Tuy nhiên, khi áp dụng sinh học phân tử trong các nghiên cứu phân loạihọc đã chỉ ra rằng chúng chỉ có cấu trúc gần giống với giới thực vật Nấm làsinh vật có nhân điển hình và thường các tế bào khác với tế bào thực vật trongthành phần của thành tế bào và lục lạp thiếu chất diệp lục, nhân có thành tế bào

và sự hiện diện của ergosterol ở màng tế bào chất [8]

Nấm là vi sinh vật dị dưỡng hóa năng nên có được chất dinh dưỡng bằngcách hấp thụ và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ của các sinh vật khác tổng hợpđược từ năng lượng ánh sáng mặt trời và cacbon đioxit Các chất dinh dưỡngđược hòa tan bởi các enzyme tiết ra, sau đó hấp thu qua thành tế bào mỏng vàđược phân phối bởi sự khuyếch tán đơn giản trong những nguyên sinh chất.Cùng với vi khuẩn, là nguyên nhân của sự thối rữa và phân hủy các chất hữu cơ[9] Điều này ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của chúng trong tựnhiên do kết hợp với các chất hữu đang phân hủy, tham gia vào chu trình tựnhiên của cacbon và các chu trình tự nhiên khác Thông thường sinh sản vô tính

và cả sinh sản hữu tính, thông qua các bào tử, sinh sản ra hàng triệu tế bào nấm,đều có khả năng phát triển thành một loài nấm mới Các bào tử sinh ra sau khi

có sự hợp nhất hai hạt nhân của hai sợi nấm tương thích và sự phân bào giảmnhiễm tiếp theo Các hình thái sinh sản của các bào tử nấm rất đa dạng và cần

sự quan tâm rất lớn để xác định cấu trúc và phân loại chúng [8]

1.1.1 Đặc điểm hình thái chung

Nấm là một loài được xác định dựa trên một tập hợp các đặc điểm chung,nhưng không nhất thiết phải tất cả các nhóm đặc điểm xuất hiện cùng nhau, đólà:

a Tổ chức đơn bào, đa bào hay lưỡng hình, không thật sự hình thành các

mô tế bào

b Phần lớn các loại nấm bao gồm các sợi nấm mà sợi mỏng có vách ngăn

với nhau hoặc có thể không có vách ngăn, trong đó, khi có các điều kiện cầnthiết về độ ẩm thì có rất nhiều cách khác nhau để hình thành một cơ thể bào tửquả thể

c Thực vật chủ yếu là lưu trữ vật chất ở dạng tinh bột, nhưng nấm chủ

yếu là lưu trữ ở dạng glycogen tương tự như giới động vật

d Thành tế bào chủ yếu gồm polysaccarit và các protein khác nhau Các

polysaccarit quan trọng nhất là chitin (polyme của N-axetyl glucosamine hay (axetylamin)-2-deoxy-D-glucozơ), mannan (polyme của mannozơ) và glucan(polyme của glucozơ)

2-e Chủ yếu là ưa khí, mặc dù có vi khuẩn yếm khí chọn lọc.

f Dị dưỡng dinh dưỡng, một loại enzyme tiêu hóa hiếm được phân tán

trên bề mặt chất nền và các loại nấm bị thoái hóa được sử dụng như một nguồncung cấp chất dinh dưỡng

1.1.2 Sự phân bố và môi trường sống

Nấm phổ biến và thường có sẵn ở khắp mọi nơi và trên hầu như tất cả cácchất nền Chúng phát triển các chất nền khác nhau: Thân cây mục, trong đấtvườn, phân hữu cơ nguồn gốc động vật khác nhau và thậm chí có thểđược thấy nấm phát triển trên cả thuỷ tinh Về mặt phân bố địa lý hầu hếtcác loài đều phân bố rộng khắp thế giới, tuy nhiên một số loài có vùng phân

bố hạn chế [11] Giống như hầu hết nấm hoại sinh, phát triển trên các chất hữu

cơ mục nát Một số loài hình thành mối quan hệ cộng sinh với rễ của thực vật cóhoa, sự cộng sinh này mang lại lợi ích cho cả hai loài là nấm và thực vật có hoa

Trong sự cộng sinh thì nấm Ectomycorrhizal đóng vai trò đa chức năng trong quá trình cộng sinh với thực vật bậc cao thuộc về hầu hết các Basidiomycetes,

trong số đó có loại nấm xâm nhập vào các mô rễ thực vật và không sản xuất hạtcarpophorus mà ta có thể nhận biết bằng mắt thường [12].

1.1.3 Dinh dưỡng và lối sống

Nấm là sinh vật mà khả năng tìm các nguồn chất hữu cơ rất cần thiết cho

sự sinh trưởng và phát triển của chúng rất cao Điều này có nghĩa là nguồn dinhdưỡng của nấm chính là từ động vật và thực vật, do đó tính chất của nấm đượchình thành phụ thuộc vào nguồn dinh dưỡng từ xác động thực vật và nấm có vaitrò là sinh vật hoại sinh (sinh vật sống trên các xác động thực vật), phụ thuộcvào sinh vật sống cộng sinh (sinh vật sống chung với nhau đều có lợi) và sinhvật sống hội sinh (sinh vật sống chung không có lợi cũng không có hại) hoặc kýsinh trùng (sinh vật sống nhờ vào sinh vật chủ nhưng gây hại cho vật chủ) [9]

1.1.4 Phân loại vị trí

Việc phân loại nấm đã thay đổi rất nhiều trong những thập kỷ gần đây

Tuy nhiên, theo “Dictionary of the Fungi” (từ điển Nấm) tái bản lần thứ bảy, nấm được phân loại theo hai ngành: Ngành nấm nhày (Myxomycetes) cơ thể của

nấm là một khối chất nguyên sinh chất không có vách ngăn bao bọc, kích thướctới vài chục centimet, đơn bào, có một hoặc nhiều nhân (thể hợp bào), di chuyển

và nuốt thức ăn như động vật (amib) Ngành nấm thật (Mycota) là đại diện chính

của giới Nấm, có cấu tạo cơ thể dinh dưỡng là đơn bào (một nhân hay nhiềunhân) hoặc đa bào, tế bào nấm có vách ngăn bao bọc như tế bào thực vật, đa số

có cấu tạo bởi chittin, nhiều tế bào nấm còn tích trữ đường ở dạng glycogen

giống như động vật Tuy nhiên, theo tái bản lần thứ chín của “Dictionary of the Fungi” do sự đối chiếu về phân tử (như ARN ribosome 12S) đã vẽ được cây

phát sinh của nấm cho thấy thực tế nấm không là một nhóm monophyletic(chung nguồn gốc) mà là polyphyletic (nhiều nguồn gốc khác nhau) nhưng do sựtiến hóa hội tụ nên có những điểm tương đồng

Do có những điểm tương đồng nguồn gốc polyphyletic, nấm thuộc về cả

ba giới khác nhau, như giới thực vật, giới động vật nguyên sinh và giới nấm.Được coi đúng là nấm (theo phân chia nấm cũ) mà nay là một ngành của nấm,

được chia thành bốn nhánh (phyla) với những đặc điểm cụ thể, thể hiện trongbảng 1.1.

Bảng 1.1 Phân loại các loài nấm

Sinh sản các bào tử trong nang

Ví dụ: Nấm men

Phylum basidiomycota (nấm đảm).

Vách ngănSinh sản bào tử đảm bên ngoài

Ví dụ: Ectomycorrhizae, Rovellons, Boletus, Linh chi đỏ.

Phylum chytridiomycota (nấm roi -

nấm trứng)

Không vách ngăn bào tử động

1.1.5 Lớp nấm Basidiomycetes

Có một giai đoạn sinh dưỡng bao gồm các sợi nấm vĩ mô Basidiomycetes

trải qua ba giai đoạn phát triển tương ứng với ba hình thức của sợi nấm: sợi nấmdạng nhỏ, sợi nấm dạng vừa và sợi nấm lớn Đầu tiên là các sợi nấm đơn bào cóvách ngăn phát triển sau khi nảy mầm từ một bào tử sinh sản được hình thành từsợi nấm trưởng thành và đơn bội Các sợi nấm có nguồn gốc từ sợi nấm dạngnhỏ Các sợi nấm lớn sẽ xảy ra hình thức sinh sản hữu tính, sợi nấm trong cáccấu trúc như vậy được hình thành cấu trúc hình kẹp (xương mác) trong mỗi vách

ngăn, thông qua đó duy trì tình trạng di chuyển hạt nhân dicariontica vách ngănkhác [6].

1.1.6 Họ Polyporaceae

Có khoảng 25000 loài Basidiomycetes trong đó 500 loài thuộc Polyporaceae phân biệt với những loài khác có các “lỗ chân lông”, bên ngoài

cứng mà chúng mọc trên gỗ mục nát tiêu biểu, hầu hết các loại nấm thuộc

Polyporaceae có thể được tìm thấy ngay cả trong thời tiết khô hoặc vào mùa đông, một số loài tìm thấy quanh năm và loài Basidiocarps được tạo ra trong

thời gian ngắn [13]

1.2 Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum).

Nấm Linh chi đỏ còn được gọi là nấm Reishi, thuộc chi đặc trưng bởi có

hệ thống từ chức sợi nấm đó cung cấp cho độ bền kết cấu, một số bào tử màunâu bất thường có hai vách và sự phân hủy gỗ gây ra màu trắng (do sự suy giảmlignin) Cây mọc hoang trong rừng gần như tất cả các vĩ độ ấm của hành tinh, cảchâu Á và Mỹ và Amazon, vùng khí hậu cận nhiệt đới nhiều hơn trong ôn đới.Tăng trưởng tự nhiên của nó diễn ra hàng năm ở thân cây đã chết hoặc bị hưhỏng, đặc biệt là gỗ sồi, cây phong, cây du, cây liễu, hoa mộc lan, mận [13,14]

Hình 1.1 Linh chi đỏ

1.2.1 Hình thái học

- Mũ nấm (carpophorus): Dài 2-20 cm, lúc đầu thắt nút không đều,

hình quả thận), thường với một bề mặt thô mịn, bóng và sáng, khi trưởng thành

có màu nâu hoặc màu vàng - đỏ với các vùng sáng trắng về phía bên lề, đôi khi

có màu hơi xanh Độ dày có thể đạt tới 5 cm trong giai đoạn cuối của sự tăngtrưởng

- Lớp mô mặt dưới mũ nấm (hymenium): Chiều sâu của ống 2 cm, bề mặt

lỗ có màu trắng, trở thành màu nâu sẫm khi trưởng thành, đường kính trong lỗ

4-7 mm (nhìn thấy bằng mắt thường)

- Cuống nấm (stipe): Thời gian đầu chưa có, sau phát triển thường phổ

biến với chiều dài khoảng 3-14 cm và bề dày đạt tới 3 cm, cùng màu với mũnấm, thường phát triển lệch về một bên

- Bào tử nấm: Kích thước 7-13 x 5-9 μ; ít nhiều có hình elip, đôi khi với

một típ cắt ngắn; khi trưởng thành có thể thô kệch [14,15]

1.2.2 Sự đa dạng các chất chuyển hóa nguồn gốc của nấm

Các chất chuyển hóa thứ cấp là đối tượng của nhiều đề tài nghiên cứu vềnấm, liên quan nhiều đến thành phần hợp chất hóa học của các sản phẩm từ tựnhiên, dẫn đến sự cô lập của một loạt các hợp chất quan trọng có nguồn gốc từnấm mà có thể được phân loại theo bảng [6] (xem bảng 1.2)

a Chất chuyển hóa thứ cấp mà không có sự can thiệp từ axetat (A).

b Chất chuyển hóa thứ cấp có nguồn gốc từ các axit béo (B).

c Polyketit một chất chuyển hóa thứ cấp từ vi khuẩn, nấm, thực vật và

động vật (C)

d Tecpen và sterol (D).

e Chất chuyển hóa thứ cấp có nguồn gốc từ sản phẩm trung gian của chu

kỳ axit tricacboxylic (E)

f Chất chuyển hóa có nguồn gốc từ các axit amin (F).

Bảng 1.2 Đa dạng các chất chuyển hóa có nguồn gốc từ nấm

Phân

D

E Axit roccellaric Heveadrida Roccellaria mollis Heveae helminthosporium 3940

Phytophthora cinnamomi

42Dicetopiperacin cyclo-(L-tyrosyl-

L-proline)

Pestalotia palmarum

43

Axit 6-amino penicillinic Penicillium chrysogenum 45Dicacetoxi-cephalosporin C Acremoniun

*Các cấu trúc được liệt kê trong Phụ lục 2

1.3 Thành phần hóa học của một số loài nấm

Nghiên cứu tiến hành ở các loài khác nhau cho thấy chất chuyển hóa thứcấp của nấm linh chi nhận quan tâm nhiều nhất, bởi vì họ vấn tiếp tục xác địnhcấu trúc mới, phù hợp với hợp chất có nguồn gốc từ nhân tế bào là các dẫn xuấtcủa ergostan (47) và lanostan (48) (chủ yếu là sterol và axit lanostanic) [11]

1.3.1 Các sterol

Các sterol có nhiều nhất trong các loại nấm là ergosta-5,7,22-trien-3--ol

(ergosterol-49) chiếm khoảng 0,3-0,4% trong G Lucidum,

ergosta-7,22-dien-3--ol (dihidroergosterol-50), thêm vào đó là những ergosta-7-en-3-ergosta-7,22-dien-3--ol (51),

ergosta-5,7,9(11),22-tetra-3--ol (52) và peroxide ergosteril (53) [17].

O O

53

Các ergosterol tìm thấy rất nhiều trong một số loài nấm ăn được và đượcchuyển thành vitamin D2 bởi các phản ứng quang hóa bằng cách sử dụng bức xạtia cực tím, cũng là nguyên liệu để tổng hợp phân tử sinh học quan tâm như hoáchất nông nghiệp brassinoesterol, ecdyson và sterol oxy hóa cao [17]

Khi chiếu xạ với ánh sáng cực tím ergosterol tạo ra một preergocalciferolthông qua việc mở vòng, và sau đó thông qua một phản ứng nhiệt được chuyểnthành vitamin D2 (ergocalciferol) Chỉ có 50% ergosterol được chuyển kể từ khi

chúng xảy ra photoreactions thứ cấp gây ra bởi sự kích thích của trien, đó lànhững phản ứng ngược lại tạo vòng của lumisterol [6].

Hình 1.2 Ergosterol chuyển đổi vitamin D2

1.3.2 Nguồn gốc phát sinh của ergosterol

Các sterol là có nguồn gốc Biogenetically của các axetyl (nguồn từ axetat)

thông qua mevalonat và squalene Các ergosterol là chất tiền thân trực tiếp củalanosterol, theo cách thức tương tự có nguồn gốc từ tritecpenoit Sterol tham giavào các quá trình của sinh tổng hợp như metyl hóa của carbon 24, đề metylcacbon 4 và 14, như khử hóa và hiđro hóa [18,19]

H 

2 3

HO

Ergosterol HO

Hình 1.3 Sinh tổng hợp của ergosterol

1.3.3 Lanostanoit tritecpenoit

Có khoảng 130 tritecpenoit loại lanostanoit oxy hóa cao đã được phân lập

từ sợi nấm và bào tử chủ yếu là của G lucidum và các G aplanatum, trong các

axit là ganoderic A, B, C, D, E, F, H, I, J, Md, Me, Mf, N, OP, Q, R, ST, U, V,

lucidenic A, B, C, D, E, F; ganoderiol A, B, C, D, E, F, G, H, I; ganoderol A, B,ganodermatriol, ganodermanontriol; hợp chất B8, B9, C5, C6; metyl ganoderat

M, N, O; metyl lucidenat H, I J, K, L, M, epoxyganoderiol A, B, C; ganoderal A

và B, axit ganoderma Ja, JB, P1, P2, R, T-N, T-O, T-Q, trong số các hợp chấtkhác [20,21]

Gần đây, các nghiên cứu tập trung chủ yếu vào Ganoderma lucidum

[22,23], nổi tiếng tại Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc và khu vực Đông Ákhác, nơi mà y học tự nhiên được sử dụng để điều trị các bệnh như ung thư,viêm gan, viêm phế quản mãn tính, hen suyễn, bệnh trĩ và triệu chứng của mệtmỏi [24] Bên cạnh đó cung cấp một số lượng lớn các hợp chất, ngày nay vẫntiếp tục cô lập các chất chuyển hóa có hoạt tính dược lý mới đã được công bố

gần đây [25,26] Vì vậy, trong những năm gần đây trong nhiều loài nấm thì G tsugae và G australae đã nhận được sự quan tâm hơn cả của nhiều người.

Trong số các hợp chất mới được phân lập từ các bộ phận khác nhau của

G lucidum là:

Các axit 20(21)-dehidrolucidenic A (54) và metyl

20(21)-dehidrolucidenat A (55) và axit hidroxilucidenic 20-D2 (56), F (57), E2 (58), N

(59), P (60) phân lập từ cơ quan quả thể bởi Toshihiro Akihisa và các cộng sự

Các hợp chất khác là axit lucidenic N (61) và các metyl lucidenat F (62)

phân lập từ cơ quan quả thể bởi Tian-Shung Wu và các cộng sự [28]

O

O O

61 62

Ba tritecpenoit loại lanostan với một nhóm andehit gọi là lucialdehit A

(63), B (64) và C (65) phân lập từ quả thể bởi Giang-Cao Jing và các cộng sự

[29]

C

H3

CH3CHO

O

CH3C

H3

CH3

CH3

CH3O

63 64

C

H3

CH3CHO

O H

CH3C

H3

CH3

CH3

CH3O

65

Ngoài ra có tới sáu loại tritecpenoit lanostan oxy hóa cao, được gọi là axit

ganoderic  (66),  (67),  (68),  (69),  (70) và  (71) phân lập từ các bào tử

bởi Min Byung-sun và các cộng sự [30]

H3

CH3COOH

O

CH3C

H3

CH3

CH3

CH3OH

OH

OH O

66 67

C

H3

CH3COOH

O H

CH3C

H3

CH3

CH3

CH3O

OH

O O

68 69

C

H3

CH3COOH

OH

OH

O

O H

C

H3

CH3COOH

O H

CH3C

H3

CH3

CH3

CH3O

OH

O

O OH

Từ loài nấm G concinna, Antonio G Gonzalez và cộng sự phân lập

5-lanosta-7,9(11),24-trien-3-hidroxi-26-al (72), 26-dihidroxi-3-on (73), và 8,9-epoxi-4,4,14-trimetyl-3,7,11,15,20-pentoxit- 5-pregnan (74) [7]

H3

O O

O

O

74

Từ quả thể của loài Hoàng chi (G Golossum), Peter Kleinwachter và cộng

sự phân lập sáu tritecpenoit mới, colosolacton B (75), C (76), D (77), E (78), F

(79) và G (80) [31].

O H

H

O

O C

CH3

CH3H

OH

76 77

CH3

CH3OH

CH3O

O O

CH3

CH3OH

CH3O

O

80

Từ loài nấm G tsugae, Chun-Nan Lin và các cộng sự đã phân lập hai

lanostenoit mới, axit 3-axetoxy-5-lanosta-8,24-dien-21-oic (81) và axit oxo-5-lanosta-8,24-dien-21-oic (82) [32].

CH3

CH3C

H3AcO

Trong cùng loại nấm, Kim-Hong Gan và cộng sự tách ra một lanostenoitmới dạng của este glucosit, axit 3-axetoxy-5-lanosta-8,24-dien-21-oic este -

D-glucosit (83) [33].

CH3

CH3C

H3AcO

Các hợp chất hóa học với tính chất hoạt tính sinh học cao hơn làtritecpenoit và polysaccarit Các polysaccarit có trong hầu hết các loại nấm vàcũng là thành phần chính của thành tế bào, tuy nhiên, các tritecpenoit đặc biệttìm thấy trong nấm linh chi và đã phân lập được chủ yếu là axit ganoderic, cácaxit ganoderiol và axit lucidenic Được tìm thấy nhiều nhất là axit ganoderic[36]

Các hợp chất khác nhau cho thấy sự khác nhau về hoạt tính sinh học, ví

dụ như: chống HIV-1 (ganoderiol F và ganodermanontriol), giảm cholesterol(axit ganoderic B và C) [37], kháng histamin (axit ganoderic C1 và C2), các hoạtchất chống HIV-1 proteas (lucidumol B và ganodermanontriol) [38], tác dụnggây độc tế bào chống lại meth-A (sarcoma) (ganodermanondiol và lucidunol A

và B) [39], ung thư phổi của Lewis (LLC) (lucidunoles A và B axit ganoderic θ)[40], T-47D (ung thư vú) (ganodermanondiol) [41], còn được gọi là sự ức chế vi

khuẩn cariogenic streptococcus mutans của glucosiltransfersa ( axit ganodericS1 và C) [42].

1.4.1 Polysaccarit kháng u

Các phần nhỏ của polysaccarit trong nấm chứa -D-glucan (84) với dư

lượng heterosacarit như xylozơ, galactozơ, mannozơ axit gluconic và các loạiđường khác, cũng như glycopeptit hoặc glycoprotein [43] Phần lớn các -D-glucan cho thấy tính chất kháng u là -(13)-D-glucopyranozơ với trọng lượngphân tử từ 500.000 đồng đến 2.000.000 và phân nhánh -(1 6)-D-glucozyl.Các mức độ hoạt động liên quan chặt chẽ đến khối lượng phân tử, sự phânnhánh và khả năng hòa tan trong nước (khối lượng phân tử lớn, ít phân nhánh,khả năng hòa tan trong nước tốt thì khả năng hoạt động cao) [44]

Ngoài ra polysaccarit tăng cường sản xuất và đời sống của tế bào lymphoCD4 trợ giúp, mà bị phá hủy khi xâm nhập do virus và phối hợp trong việc giảmcường độ của các triệu chứng, cả trong nhiễm virus chẳng hạn như những sảnxuất bởi vi rút AIDS (HIV) [43]

m n

O OH O

OH

O OH

OH O

O O

O

OH O

O OH

OH O

O O

OH O

OH

O

O OH O

OH OH

O

O

-D-glucan [(1-6)-D-glucozyl nhánh -(1-3)-D-glucopyranozơ] (84)

1.4.2 Kháng khuẩn chất chuyển hóa

Theo đánh giá về hoạt động sinh học gần đây của khoảng 200 loài nấm,hơn 75% cho thấy hoạt động kháng khuẩn mạnh [45] Hoạt động này không chỉliên quan đến chất chuyển hóa phân tử nhỏ (như sterol, tritecpenoit, ) mà cảvới những polysaccarit khối lượng lớn có trong thành tế bào

Việc tìm kiếm các hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ Basidiomycetes,

mà con người chia sẻ các nghiên cứu về mầm bệnh vi khuẩn như Escherichia coli (vi khuẩn đại tràng), Staphylococcus aureus (tụ cầu khuẩn hay tụ cầu vàng)

và Pseudomonas areuginosa (trực khuẩn mủ xanh) do đó có kết quả cao từ khả

năng tự vệ của các loài nấm được sử dụng để chống lại vi sinh vật [46]

Ví dụ: hai hợp chất ganomycin A (85) và ganomycin B (86), phân lập từ

một loại nấm châu Âu G pfeifferi cho thấy ức chế sự tăng trưởng vừa phải chống lại sự sống của vi khuẩn gram dương và B subtilis (trực khuẩn vi khuẩn),

S aureus (tụ cầu vàng) và Micrococcus flavus Ngoài các loại nấm này đã thu

được trên ganodermadiol (87), lucidadiol (88), và axit applanoxidic (89) có hoạt

tính kháng khuẩn chống lại loại virut cúm A [47]

COOH

R O

H3O

CH3

CH3

CH3O

H3O

89

Linh chi G applanatum, có sterol như ergost-7-en-3-ol (49); ergost-7,22-dien-3--ol(50); 5,8-epidioxy-5,8-ergost-6,22-dien-3-ol (53),

5-lanostenoit (90) mới với các hoạt tính chống lại vi khuẩn gram dương [48].

O H

COOH

CH3

90 1.4.3 Chất chuyển hóa có đặc tính chống oxy hóa

Oxy hóa có liên quan với tăng nguy cơ bệnh thoái hóa như bệnh tim mạch

và ung thư, rất nhiều bài báo đã được ghi nhận rộng rãi rằng các loài nấm (G lucidum, G tsugae, G aplanatum) có nhiều lợi ích cho các động vật và ảnh

hưởng sức khỏe con người bảo vệ gan, chống ung thư và tim mạch[49] Vì vậycác hoạt tính chống oxy hóa của chất chiết xuất từ các loại nấm là tương quanvới sự hiện diện của triterpenoit polysaccarit-protein phức tạp, và polysaccarit[50]

Các chất chống oxy hóa được phân lập từ họ Polipoaraceae là các sterin

A (91) và sterin B (92) từ các quả thể của Stereum hirsutum [51].

O OH H

OH

OH

CH3

91 92 Hai chất ức chế của lipit peroxy, betulin A (93) và betulin B (94), được

phân lập từ các chiết xuất metanol của Lenzites betulina [52].

1.5 Nấm linh chi đen

Tên thường gọi: Nấm linh chi đen

Tên khoa học: Ganoderma sinense Zhao, Xu et Zhang

Họ: Ganodermaceae

1.5.1 Mô tả

Nấm hóa gỗ, sống một năm hay lâu năm Thể quả có mũ dạng thận, trònhoặc dạng quạt, dày, đường kính 3-10cm, cuống dài đính lệch, hình trụ tròn haydẹt, có khi phân nhánh; mặt trên mũ có những vòng đồng tâm, mép lượn sóng.Bào tử hình bầu dục hoặc hình trứng, cụt đầu, mầu gỉ sắt, có một mấu lồi vànhiều gai nhọn Toàn cây nấm mầu nâu đỏ, đỏ vàng hoặc nâu đen

Hình 1.4 Ảnh nấm linh chi đen

Nấm mọc hoang dại ở nước ta, Triều tiên, Trung Quốc và nhiều nướckhác

1.5.2 Thành phần hoá học

- Những hợp chất đa đường (45% số lượng): beta-D-glucane,arabinogalactane; ganoderane A, B va C;

- Triterpen: các axit ganoderic A, B, C, D, F, H, K, M, R, S, và Y, các axitlucidenic A, B, C, D, E, F, G…, các lucidon A, B, C, các axit ganolucidic A, B,

C, D và E, ganoderal A, các ganoderiol A, B, C, D, E, F, G, H, I, các ganoderol

Theo những tài liệu cổ như Bản thảo cương mục (của Lý Thời Trân),Thần nông bản thảo, Trung dược học Linh chi đã được xếp vào loại Thượngđẳng dược Các loại Linh chi đều có tính chất bổ ích khí huyết, bồi dưỡng ngũtạng suy nhược hư lao, ích trí, dưỡng tâm, an thần, bình suyễn, tăng trí tuệ, dùngtrị các bệnh thuộc ngũ tạng, lục phủ, cơ nhục, xương khớp , dùng lâu sẽ được

“diên niên ích thọ”, thân thể nhẹ nhàng, tinh thần hoà lạc, sảng khoái.Linh chi bình hoà vô độc, nên dùng một thời gian dài liên tục mới thấy hiệu quả

rõ rệt Theo những nghiên cứu gần đây trên thế giới, linh chi có những đặc tínhchung sau đây :

- Cải thiện sự hấp thu chuyển hoá trong dinh dưỡng

- Tăng cường sự thích nghi của cơ thể đối với những biến động trong môitrường sống.

- Giải độc toàn thân, giúp cơ thể thải nhanh các chất độc, kể cả các kimloại nặng, chất độc hoá học, độc của các loại khuẩn Bảo vệ cơ thể, chống ảnhhưởng các tia chiếu xạ

Các bệnh về tuần hoàn: Bổ tim, thông mạch Điều trị xơ cứng mạch máu Cao huyết áp (cần dùng thời gian dài mới hữu hiệu) Động mạch nhiễm mỡ Trị chứng Cholesterol máu cao (làm tan mỡ bám trong thành mạch)

Các bệnh ung thư, u bướu: Trị bệnh xơ cứng bì, bệnh Luput ban đỏ, bantrọc bướu cổ Lượng polysacharit (chất đa đường) trong linh chi có chức năngchống ung thư, điều chỉnh miễn dịch, chống lão hoá

Ngoài ra còn nhờ các chất triterpen, germanium nên có thể điều trị bệnhung thư ở mọi thời kỳ, vì nó có chức năng ức chế, phá hoại, ngăn chặn sự pháttriển của tế bào ung thư, thúc đẩy sự suy vong của chúng Có thể dùng một cáchđơn độc, hoặc dùng hỗ trợ với xạ trị, hoá trị hoặc phẫu thuật, tăng hiệu lực chữalành cho những phương pháp này và giảm thiểu các tác dụng phụ của nó, nhưmệt mỏi tiều tuỵ, gầy mòn, chán ăn

Linh chi có nhiều chất Germanium hơn các loài thảo mộc khác (cao gấp

5 đến 8 lần nhân sâm) Chất này giúp khí huyết lưu thông, các tế bào hấp thu oxitốt hơn Chất Germanium còn là một loại bán dẫn, nó có thể điều chỉnh hiệuđiện thế điển hình cao hơn hiệu điện thế bình thường, vì thế nó có thể làm sạchhiệu thế ung thư trong cơ thể

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM

2.1 Phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Phương pháp lấy mẫu

Mẫu nấm được thu hái vào thời điểm thích hợp trong năm, thường đượclấy vào mùa mưa Mẫu khi lấy về được rửa sạch, để nơi thoáng mát hoặc sấykhô ở 400C Mẫu được xử lý tiếp bằng phương pháp chiết chọn lọc với cácdung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứuđược nêu ở phần thực nghiệm

2.1.2 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất

Để phân tích và phân tách cũng như phân lập các hợp chất, sử dụng cácphương pháp sắc ký như:

- Sắc ký cột thường sử dụng silicagel cỡ hạt 230 - 400/mesh

- Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích được tiến hành trên bản mỏng kínhsilicagel Merck 60 F254 tráng sẵn, độ dày 0,2 mm

Hiện màu: hơi iot và đèn UV 254 nm

- Các phương pháp kết tinh phân đoạn

2.1.3 Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất

Cấu trúc của các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương phápphổ:

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị

Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Yanaco MP-S3

Phổ tử ngoại UV được ghi trên máy Agilent UV-VIS

Phổ hồng ngoại đo trên máy Bruker 270-30, viên nén KBr

Phổ khối lượng EI-MS được ghi trên máy HP 5989 B-MS với năng lượngbắn phá ở 70 eV và phổ ESI-MS đo trên máy LC-MS-Trap-00127

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR được đo trên máy Bruker 500MHz,phổ 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC và COSY được đo trên máy Bruker 125MHz

2.3 Nghiên cứu các hợp chất

2.3.1 Thu mẫu

Nấm Linh chi đen được thu hái ở vườn quốc gia Pù Huống Mẫu đượcđịnh danh bởi TS Ngô Anh, khoa Sinh, Trường Đại học khoa học Huế Tiêubản được lưu giữ khoa Sinh, Trường Đại học Vinh

2.3.2 Phân lập các hợp chất

Mẫu nấm thu thập và sấy khô ở nhiệt độ từ 400-500C trong 48 giờ, sau khisấy khô vật liệu được nghiền qua (3,5kg) ngâm với 5 lít MeOH, với thời gian 8ngày, sau đó lọc và dịch lọc được cất giảm áp suất bằng thiết bị quay cất chânkhông thu được cao metanol thô (121g) Sau đó hòa tan trong nước và chiết lầnlượt với các dung môi etylaxetat và butanol, quay cất chân không thu được 28 gcao etylaxetat và 33g butanol

15:1 9:1

Cao etylaxetat được tiến hành sắc ký cột silica gel hệ dung môi rửa giảihexan: axeton (100:0, 50:1; 25:1; 15:1; 9:1; 4:1:2:1) thu được 10 phân đoạnchính

Phân đoạn 2 sắc ký cột với hexan: axeton 15:1 thu được chất 95 (123mg) Phân đoạn 3 sắc ký cột với hexan: axeton 9:1 thu được chất 96 (31mg)

Sơ đồ 2.1: Phân lập hợp chất trong nấm linh chi đen

Nấm linh chi đen (3,5 kg)

Cao metanol (121g)

Cao etylaxetat

Hợp chất 95 (123mg)

Cao butanol(33g)

- Ngâm với 5 lít metanol

- Cất thu hồi metanol

- Phân bố trong nước

- Chiết lần lượt vớietylaxetat, butanol

- Sắc kí cộtHexan : axeton

Hợp chất 95 (31mg)

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập các hợp chất

Mẫu nấm được cắt nhỏ, phơi, sấy khô ở 400C đem nghiền nhỏ (3,5 kg),ngâm với metanol ở nhiệt độ phòng (8 ngày) Cất thu hồi dung môi được caometanol (121g) Phân bố cao metanol trong nước và chiết lần lượt với các dungmôi chọn lọc, rồi cất thu hồi dung môi đã thu được các cao tương ứng là cao etylaxetat (28g), cao butanol (33g)

Cao etyl axetat được tiến hành sắc ký cột silica gel hệ dung môi rửa giảihexan: axeton (100:0, 50:1; 25:1: 15: 1; 9:1; 4:1: 2:1) thu được 10 phân đoạn

chính Phân đoạn 2 sắc ký cột với hexan: axeton 15:1 thu được chất 95 (123mg) Phân đoạn 3 sắc ký cột với hexan: axeton 9:1 thu được chất 96 (31mg).

3.2 Hợp chất 95

Hợp chất 95 là chất bột màu trắng Phổ tử ngoại (UV) cho hấp thụ cực đại

211nm và 285nm

Phổ hồng ngoại (IR) cho hấp thụ cực đại ở 3433 (OH), 2959, 1726, 1090 cm-1

Phổ khối lượng va chạm electron (EI-MS) cho pic ion phân tử m/z 396

tương ứng với công thức phân tử C28H44O

Phổ 1H-NMR cho thấy có tín hiệu của 6 nhóm metyl  0,61 (3H, s), 0,82

Bảng 3.1 Số liệu phổ 13C - NMR của hợp chất 95

Từ số liệu phổ UV, IR, EI-MS, 1H-, 13C-NMR, DEPT và so sánh với tài

liệu [39] cho phép xác định hợp chất 95 là ergosterol.

Hợp chất ergosterol (hợp chất có trong nhiều loài nấm) được tách ra từcordyceps, dưới tác dụng của tia cực tím ergosterol có thể bị biến đổi thànhvitamin D2 một yếu tố dinh dưỡng có lợi cho sự phát triển của xương ở cả người

và động vật Bên cạnh đó ergosterol là hợp chất có nhiều hoạt tính dược họckhác, chẳng hạn như nó có tính độc kháng virus, tác động rõ rệt đối với chứngloạn nhịp tim, chống khối u, điều hòa miễn dịch [27,49]