1 Bộ giáo dục đào tạo Trờng đại học Vinh ===== ===== nguyễn thị kiều đông Phân lập số chủng vi khuẩn lam có tế bào dị hình đất trồng lúa huyện Hng Nguyên nghiên cứu ảnh hởng chúng lên sinh trởng, phát triển suất giống lúa Khải Phong chuyên ngành: thực vật Mà số: 60.42.20 Luận văn thạc sĩ sinh học Vinh - 2006 Mở đầu Hiện việc sử dụng nhiều phân bón hóa học sản xuất nông nghiệp nguyên nhân gây suy thoái đất trồng gây hậu xấu cho môi trờng Để khắc phục tình trạng nhiều nhà khoa học sở sản xuất đà theo hớng sử dụng nguồn phân bón sinh häc, ®ã sư dơng vi sinh vËt ®Ĩ chun hóa chất hữu thành phân bón đợc øng dơng ë nhiỊu níc trªn thÕ giíi cịng nh Việt Nam Một vi sinh vật đợc quan tâm vi khuẩn lam cố định đạm Hiện ngời ta đà xác định đợc 250 loài vi khuẩn lam có khả cố định đạm Vi khuẩn lam sống tự có khả cố định từ 20 30kg N/ha năm Theo Venkataraman (1982), cố định nitơ vi khuẩn lam ấn Độ đạt tới 15 49 kg N/ha tăng suất lúa đạt từ 10 20% [63] Tại Ai Cập ngời ta sử dụng Anabaena oryzae (phân lập từ địa phơng) đà làm suất lúa tăng 31,6%, đồng thời lúa hấp thu nitơ đợc tăng từ 25 42,5% (Hamdi, 1986) [56] Trung Quốc lây nhiễm vi khuẩn lam ruộng lúa, suất trung bình tăng 15% (Lee, 1992)[58] Việt Nam việc nghiên cứu đặc điểm sinh học lây nhiễm vi khuẩn lam vào ruộng lúa đà đợc nhà khoa học tiến hành nh Trần Văn Nhị cộng (1984, 1994) [32, 30], Dơng Đức Tiến (1990), Nguyễn Thanh HiỊn vµ céng sù (1994) [theo 39, 12] Lµ mét nh÷ng tØnh cã diƯn tÝch trång lóa lín, hàng năm Nghệ An lợng phân bón hoá học đợc sử dụng sản xuất nông nghiệp cao Cho nên, việc ứng dụng đặc điểm sinh lý, sinh hoá vi khuẩn lam cố định đạm vào trồng trọt để thay phần phân bón hóa học việc làm cần thiết Vì tiến hành đề tài: "Phân lập số chủng vi khuẩn lam có tế bào dị hình đất trồng lúa huyện Hng Nguyên nghiên cứu ảnh hởng chúng lên sinh trởng, phát triển suất giống lúa Khải Phong" Mục tiêu đề tài phân lập loài vi khuẩn lam từ chọn chủng có khả cố định đạm sử dụng chúng nh biện pháp sinh học để tăng suất lúa cải tạo đất trồng Chơng Tổng quan tài liệu 1.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn lam giíi vµ ë ViƯt Nam 1.1.1 Mét sè dÉn liƯu vỊ nghiªn cøu vi khn lam ë trªn thÕ giíi Vi khuẩn lam sinh vật tự dỡng có kÝch thíc hiĨn vi, sèng chđ u m«i trêng nớc đất Nghiên cứu vi khuẩn lam đà đợc tiến hành từ thập niên đầu kỷ XIX (C Agardn, 1824; Kuetzing, 1843) [theo 40] vµ theo nhiỊu hớng khác Đầu tiên, ngời ta tiến hành phân loại tìm hiểu quy luật phân bố chúng, sau sâu vào tìm hiểu trình sinh lý, sinh hãa cđa vi khn lam nh»m phơc vụ lợi ích ngời Đặt móng cho hệ thống phân loại tảo lam Thuret (1875) sau đợc Kirchner (1900) phát triển thêm Sự sửa đổi bổ sung hệ thống phân loại Thurnet Kirchner đợc bắt đầu thực vào đầu kỷ XX tiếp có hàng loạt công trình phân loại tảo lam nhà khoa học có tên tuổi khác đà khiến cho tri thức tảo lam phong phú đầy đủ: Borch (1914, 1916, 1917), Elenkin (1916, 1923, 1936), Geitler (1925, 1932) [theo 40] Các nhà tảo học Liên Xô (cũ) tiếp tục theo hớng nghiên cứu nh Gollerbakh cộng (1953), Kondratieva (1968) [65, 66] vùng nhiệt đới, ngời đặt móng để nghiên cứu phân loại tảo lam phải kể đến Frémy (1930) [theo 40] Nhà tảo học ấn Độ Desikachary (1959) đà phản ánh phong phú taxon tảo lam thờng gặp khu vực khí hậu nóng Èm vµ nhiỊu ma nµy [55] Song song víi híng nghiên cứu phân loại học, nhà khoa học giới nớc Anh, Mỹ, Ba Lan, Pháp, Đức, Tiệp Khắc (cũ) đà nghiên cứu sinh lý, sinh hoá khả cố định nitơ khí tảo, tập trung vào khả đồng hóa nitơ phân tử số chủng vi khuẩn lam [theo 59, 63] Khu vực Châu á, Nhật Bản đặc biệt ấn Độ, vi khuẩn lam có khả cố định nitơ giành đợc ý cao vi khuẩn lam đà đợc sử dụng làm nguồn phân bón cho ruộng lúa Điển hình công trình nghiên cứu Desikachary (1959) [55], Singh (1975) [theo 27] công trình nghiên cứu vi khuẩn lam cố định nitơ Venkataraman (1982) [63], Roge (1989) [theo 27] Ngoài ra, nhà khoa học quan tâm tới độc tố vi khuẩn lam tiết Từ năm 1940, việc phân lập vi khuẩn lam độc đợc Theodose Alson (Đại học tổng hợp Minnesoto - Mỹ) tiến hành Ông đà phân lập đợc nhiều chủng vi khuẩn lam thuộc chi Microcystis Anabaena Từ nghiên cứu độc tố vi khuẩn lam thủy vực đà đợc tiến hành toàn giới [theo 22] 1.1.2 Một số dẫn liƯu vỊ nghiªn cøu vi khn lam ë ViƯt Nam Việt Nam, đầu kỷ XX hầu nh cha có công trình chuyên khảo tảo lam, nhiên có số dẫn liệu đà công bố nghiên cøu tỉng thĨ vỊ phï du thùc vËt níc biĨn nớc Công trình tiên vi khuẩn lam Frémy (1927), ông đà công bố ba loài tảo lam sở định loại mẫu D Gaumont thu thËp [theo 40] Ngêi ViÖt Nam nghiên cứu công bố kết chuyên Tảo lam Cao Ngọc Phơng (1964), bà đà viết 23 taxon tảo lam Sài Gòn Đà Lạt, có 11 chi, với chi có tế bào dị hình loài khoa học Khi phân tích nớc hồ Hoàn Kiếm, nhà tảo học Hungari T Hortobagyi (1967, 1968, 1969) đà xác định đợc 24 taxon vi khuẩn lam thuộc 14 chi, với chi có tế bào dị hình 13 chi tế bào dị hình [theo 40] Nghiên cứu đất trồng lúa miền Bắc Việt Nam, Dơng Đức Tiến (1977) đà công bố 13 loài vi khuÈn lam thuéc chi, víi chi cã tế bào dị hình với khả cố định nitơ chúng [36] Trần Văn Nhị cộng (1984) đà nâng tổng số vi khuẩn lam Việt Nam lên tới 40 taxon, gồm 17 chi có 16 chi có tế bào dị hình chi dạng sợi tế bào dị hình [32] Phùng Thị Nguyệt Hồng (1992) đà công bố tiếng pháp toàn công trình nghiên cứu tảo lam Châu thổ sông Mê Kông với 94 taxon, có loài khoa häc vµ thø míi [theo 40] Trong ln án tiến sỹ khoa học Dơng Đức Tiến, tảo lam Việt Nam đà định loại đợc 344 taxon [40] đất trồng lúa vùng ngoại thành Hà Nội, Nguyễn Thị Minh Lan (2000, 2001) phát đợc 50 loµi thc 19 chi cđa bé Víi u thÕ thuộc chi Nostoc Anabaena, đồng thời phân lập số chủng vi khuẩn lam nhằm thăm dò khả cố định nitơ chúng [25, 26] Trên vùng đất mặn huyện Thái Thụy (Thái Bình), Đoàn Đức Lân (1996) đà phân lập đợc 15 loài vi khuẩn lam cố định đạm nghiên cứu thăm dò khả cố định nitơ chúng So với kết khảo sát ruộng lúa vùng nớc vi khuẩn lam cố định nitơ vùng đất mặn có phần đa dạng chi Nostoc chiếm u thÕ khu vùc nghiªn cøu [27] ë khu vùc Bắc Trung Bộ, Đỗ Thị Trờng (1998) phát đợc 45 loµi vµ díi loµi vi khn lam thc 16 chi, hä, bé ®Êt trång lóa hun Hòa Vang (Đà Nẵng) [44] Nguyễn Công Kình (2001) đà phát đợc 10 loài dới loài vi khuẩn lam 19 cánh đồng lúa thành phố Vinh vùng phụ cận [23] Nguyễn Đình San (2001) đà phát 29 loài vi khuẩn lam thủy vực nớc bị ô nhiễm tỉnh Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh [34] Nguyễn Lê Vĩnh, Võ Hành (2001) đà phát đợc 69 loài vi khuẩn lam thuéc 15 chi, hä ®ã cã chi dạng đơn bào, chi dạng sợi có tế bào dị hình [50] Lê Thị Thúy Hà (2004) đà phát đợc 56 loài sông Cả [8], Nguyễn Đức Diện (2004) nghiên cứu nớc thải công nghiệp nhà máy thuộc da Vinh (TP Vinh) phát đợc 16 loài vi khuẩn lam [2] Cùng với công tác điều tra, nghiên cứu chuyên sâu đặc tính sinh lý, sinh ho¸ cđa c¸c chđng vi khn lam cã ý nghĩa thực tiễn đợc nhiều tác giả đề cập: Nguyễn Đức cộng (1984); Trần Văn Nhị, Đặng Diễm Hồng, Dơng Đức Tiến (1986); Dơng Đức Tiến (1994); Trần Văn Nhị, Đặng Văn Hạnh (1994); Trần Hài (1996); Nguyễn Thị Minh Lan (2000) [5, 31, 39, 30, 9] Nghiªn cøu vi khn lam vïng rƠ lúa lây nhiễm chủng có khả cố định nitơ vào đồng ruộng có tác giả Dơng Đức Tiến, Nguyễn Minh Lan (1986), Dơng Đức Tiến (1990), Trần Văn Nhị cộng (1984, 1991), Nguyễn Thanh Hiền (1991) [theo 39] Nghiên cứu Đặng Diễm Hồng, Nguyễn Hữu Thớc (1987) loài vi khuẩn lam Spirulina platensis vµ Nostoc muscorum cho thÊy cã thĨ sư dơng dịch tảo để xử lý hạt lúa nảy mầm điều kiện thời tiết lạnh [16] Nghiên cứu hiệu tác dụng số loài vi khuẩn lam cố định đạm đến suất lúa cho thấy dịch vẩn chúng có tác dụng thuận lợi tới nảy mầm yếu tố cấu thành suất lúa [39, 59] Nghiên cứu tảo đất, tảo nớc ngọt, nớc lợ nớc mặn có đóng góp tích cực Shirota, Nguyễn Văn Tuyên Dơng Đức Tiến Với mũi nhọn nghiên cứu vi khuẩn lam, Dơng Đức Tiến đà điều tra cách có hệ thống môi trờng nớc (hồ chứa, sông, suối) vi khuẩn lam đất, đồng thời định hớng đắn cho nghiên cứu ứng dụng chúng vào việc nâng cao độ phì đất, sở nâng cao suất chất lợng nông sản, bảo vệ môi trờng, tiến tới nông nghiệp bền vững [41] 1.1.3 Vai trò vi khuÈn lam Vi khuÈn lam chiÕm mét vÞ trÝ quan trọng tự nhiên đời sống ngời Những năm gần đây, số loài vi khuẩn lam đợc sản xuất quy mô lớn nhằm khai thác giá trị dinh dỡng dợc liệu nh Spirulina có hàm lợng Protein cao (chiếm tới 60-70% trọng lợng khô), giàu vitamin, nguyên tố khoáng, sắc tố chất có hoạt tính sinh học nên chúng đà đợc nuôi trồng nhiều nớc giới Những nghiên cứu ứng dụng Spirulina đà đợc tiến hành Việt Nam hai thập kû qua [theo 22] Vi khuÈn lam cßn đợc sử dụng nh tác nhân hữu hiệu biện pháp sinh học xử lý nguồn nớc thải Chúng góp phần loại trừ chất độc hại làm tăng hàm lợng ôxi [13] Nuôi trồng Spirulina platensis nớc thải phân xởng urê, nhà máy phân đạm Hà Bắc vừa có tác dụng khử N-NH (tác nhân gây ô nhiễm chính), vừa thu đợc sinh khối với chi phí thấp hoá chất Khả khử N-NH3 chủng vi khuẩn lam đạt mức tơng đối cao: 0,040 - 0,058g/l/ngày [theo 27] Vi khuẩn lam cố định nitơ - tiềm bổ sung nguồn đạm cho đất trồng, nghiên cứu bang Bihar (ấn Độ) cho thấy hàng năm vi khuẩn lam cố định đợc 14kg N/ha Tây Bengar, giá trị đạt tới 15 - 49kg N/ha (Venkataraman, 1982) [63] Trên cánh đồng mía ngô, riêng loài Cylindrospermum licheniforme cung cấp cho đất 88kg N/ha.năm [theo 27] Tác dụng vi khuẩn lam CĐN gia tăng suất lúa đà đợc khẳng định Năm 1951, Watanabe bắt đầu thí nghiệm qui mô lớn ảnh hởng Tolypothrix tenuis lúa 11 trại thực nghiệm Nhật Bản, tăng luỹ tiến suất lúa sử dụng vi khuẩn lam đợc ghi nhận sau bốn năm lây nhiễm suất lúa tăng 128% so với đối chứng [theo 13] Trên đất lúa Ai Cập, việc sử dụng Tolypothrix tenuis điều kiện không bón phân đạm, lân suất lúa tăng 4,2% Còn sử dụng Anabaena oryzae (phân lập từ địa phơng) dù bón phân nitơ hay không, suất lúa tăng 31,6% (Hamdi, 1986) [56] Vai trò hữu ích vi khuẩn lam CĐN đà đợc chøng minh ë nhiỊu níc kh¸c: Th¸i lan, Mianma, Philippine, Isarel, Liên Xô (cũ), Hoa Kỳ v.v HÃng công nghệ Cyanotech (Hoa Kỳ) đà giới thiệu loại phân bón sinh học hỗn hợp loài vi tảo, cã thĨ cung cÊp 100kg N/ha/vơ [theo 44] Aziz M A.vµ M A Hashem (2004) thư nghiƯm nhiƠm vi khn lam CĐN đất mặn cho thấy sinh trởng lúa, số nhánh, chiều dài bông, số hạt/bông, trọng lợng 1000 hạt tăng [53] Ngoài khả cố định nitơ, vi khuẩn lam tiết vào môi trờng chất có hoạt tính sinh học cao, ảnh hởng tốt đến sinh trởng phát triển trồng [39] Viện lúa Tasken đà gieo hạt đợc xử lý dịch vẩn vi khuẩn lam CĐN cho thấy suất vợt so với đối chứng 13,8 tạ/ha Các chất tiết môi trờng vi khuẩn lam cã thĨ lµ hormon, vitamin, axit amin, polypeptit Sù phát triển vi khuẩn lam làm tăng khả giữ nớc, độ thoáng khí, cải tạo đất mặn đất chua [theo 27] 1.1.4 Các yếu tố ¶nh hëng ®Õn sinh trëng cđa vi khn lam 1.1.4.1 ánh sáng Là vi sinh vật quang tự dỡng nên ánh sáng nhân tố quan trọng hàng đầu sinh trởng phát triển vi khuẩn lam Reynaud Roger (1978) đà cho vi khuẩn lam đặc biệt mẫn cảm với cờng độ chiếu sáng cao đợc coi nhóm a ánh sáng Tuy nhiên có loài vi khuẩn lam sinh trởng, phát triển tốt cờng độ ánh sáng mạnh nh Cylindrospermum (Mali) hay Aulosira fertilissima (Ên §é) [theo 39] §a số vi khuẩn lam giàu tính cảm quang, nhìn chung chúng đồng hoá nitơ tối chậm sáng Sự sinh trởng, phát triển cố định nitơ Anabaena cylindrica tăng cờng độ ánh sáng tăng tới 16.000 lux 13 - 14 giê [6] 1.1.4.2 NhiÖt ®é NhiƯt ®é tèi u cho sinh trëng cđa vi khn lam 30 - 350C Sù dao ®éng vỊ nhiƯt độ ảnh hởng tới sinh khối, thành phần khu hệ khả sinh sản chúng Nhiệt độ thấp cao ảnh hởng bất lợi đến trình quang hợp, sinh trởng cố định nitơ vi khuẩn lam Nhiệt độ cha phải yếu tố giới hạn vi khuẩn lam đồng lóa [39], ®èi víi vi khn lam ®Êt, tồn điều kiện nhiệt tõ 50 - 700C Mét sè VKL sèng ë níc nãng cã nhiƯt ®é cao tíi 70 –82 0C, cã thể tới 870C [theo 27] 1.1.4.3 Độ pH môi trờng Độ pH môi trờng ảnh hởng trực tiếp đến thẩm thấu ion đất vào tế bào tảo vi khuẩn lam trình sống lại làm thay đổi pH đất, pH tối u cho cho sinh trëng cđa chóng kho¶ng 6,5 – 7,0 Tuy có loài sinh trởng môi trêng cã pH lµ - thËm chÝ pH 3,5 - 6,5 [39] 1.1.4.4 Các nguyên tố khoáng - Phốtpho Trong đất hàm lợng phốtpho dễ tiêu đóng vai trò thiếu sinh trởng cđa vi khn lam, nã t¬ng quan d¬ng tÝnh víi mật độ vi khuẩn lam cố định nitơ, tăng hoạt tÝnh nitrogenaza Theo Fogg vµ céng sù (1973), sù cè dịnh nitơ vi khuẩn lam hầu hết bị hạn chế pH thấp thiếu phôtpho [theo 27, 39] - Cacbon Nguồn cacbon đợc vi khuẩn lam sử dụng quang hợp CO2 Nồng độ CO2 tèi thÝch cho sù ph¸t triĨn cđa vi khn lam điều kiện chiếu sáng thích hợp trung bình 0,1% 150C 0,25% 200C Sự đồng hóa dừng lại nồng độ CO2 0,5% [39] Ngoài mật độ vi khuẩn lam cố định nitơ cácbon tổng số đất lúa có mối quan hệ dơng tính cha thể chặt chẽ [theo 27] - Nitơ Nhu cầu vi khuẩn lam ®èi víi nit¬ lín h¬n phèt pho, nhng ®iỊu kiện tự nhiên nitơ chất dinh dỡng chđ u giíi h¹n sinh trëng cđa vi khn lam Nhiều vi khuẩn lam có khả lấy nitơ khí không phụ thuộc vào nguồn nitơ liên kết, nồng độ nitơ liên kết cao ức chế sinh trởng vi khuẩn lam, mức độ kìm hÃm (ức chế) không phụ thuộc vào dạng 10 nitơ liên kết mà phụ thuộc thời gian trạng th¸i sinh lý cđa vi khn lam [39] - C¸c nguyên tố khác Bên cạnh yếu tố khoáng đà đề cập trên, vai trò nguyên tố nh: Ca, Mg, Mo, K, Mu, S, Bo, Zn, Cu… trình sinh trởng vi khuẩn lam đà đợc nhiều tác giả khẳng định Ngoài ảnh hởng đến sinh trởng phát triển vi khuẩn lam có yếu tố sinh học hoạt động canh tác ngời [39, 27] 1.2 Hình thái vµ cÊu tróc cđa Vi khn lam cã tÕ bµo dị hình Vi khuẩn lam thể mà tế bào chúng cha có nhân điển hình (cha có màng nhân), vật chất di truyền đợc tập trung chất nhân, DNA tạo thành sợi khép lại thành vòng Hình dạng tế bào dinh dỡng cđa vi khn lam cã thĨ chia thµnh kiĨu: - Tế bào dạng hình cầu, elíp rộng, hình lê hình trứng - Tế bào đợc kéo dài phía, hình elíp kéo dài, dạng hình thoi, hình ống Có tế bào sống riêng rẽ liên kết thành tập đoàn (coloni) hay hình sợi Các sợi riêng kết lại với thành cục nhầy hay lớp váng mỏng Màng tế bào vi khuẩn lam dµy, cã líp bäc ngoµi (Peptidoglycan) dµy tõ – 200 A0 Chất nguyên sinh tế bào đợc bao quanh b»ng líp mµng Mét sè loµi vi khn lam có màng tế bào hoá nhầy hình thành bao nhầy chuyên hoá bao quanh tế bào, nhóm tế bào hay toàn dÃy tế bào (sợi) Bao đồng hay phân lớp Chất nguyên sinh tế bào vi khuẩn lam thiếu nhân, trớc quan niệm chúng phân hoá thành miền - gọi miền chất màu (Chromatoplasm) miền không màu gọi miền trung tâm (Centroplasm); nhiên phân tách quy ớc Một số tác giả tách chất nguyên sinh tế bào tảo làm thành chất nhân, quang hợp (lamel), thể ribô vµ ... phần phân bón hóa học vi? ??c làm cần thiết Vì tiến hành đề tài: "Phân lập số chủng vi khuẩn lam có tế bào dị hình đất trồng lúa huyện Hng Nguyên nghiên cứu ảnh hởng chúng lên sinh trởng, phát triển. .. ruộng lúa, góp phần làm tăng suất lúa 3.3 Phân lập tìm hiểu vài đặc điểm sinh học số chủng VKL có tế bào dị hình đất trồng lúa Hng Nguyên 3.3.1 Thành phần loài VKL có tế bào dị hình đà đợc phân lập. .. phần loài Hng Nguyên nhiều 3.2 Vi khuẩn lam cố định nitơ đất trồng lúa huyện Hng Nguyên Trong số 17 loài VKL phát đợc đất trồng lúa huyện Hng Nguyên, có loài có tế bào dị hình có khả cố định