Nghiên cứu chiết tách thành phần hóa học của cây sâm đất (ruelliea tuberosal l ) và ứng dụng vào thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường

Để phân lập, tách chiết và làm sạch các hợp chất tự nhiên tìm được cần phải kiểm soát hệ dung môi trích ly phù hợp với khả năng điện ly của các chất được thực hiện bằng phương pháp sắc k

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC

KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌCCẤP TRƯỜNG

Tên đề tài: Nghiên cứu chiết tách thành phần hóa học của cây sâm đất (Ruellia tuberosa L.) và ứng dụng vào thực phẩm chức năng hỡ trợ

điều trị bệnh đái tháo đường

Mã số đề tài: 184.TP17

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Thu Nguyệt

Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm

Minh, chúng em vô cùng biết ơn Ban lãnh đạo nhà trường cùng toàn thể thầy cô giáo Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm đã tạo một môi trường học tập tốt, trang bị những kiến thức nền tảng vững chắc để chúng em tiếp bước cho sự nghiệp học tập, nghiên cứu và làm việc sau này

Chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Nguyễn Ngọc Tuấn đã quan tâm, nhắc nhở, hướng dẫn chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian thực hiện đề tài, để chúng tôi hoàn thành đề tài này Qua quá trình thực hiện đề tài, chúng em đã có dịp hiểu rõ hơn về những kiến thức mà bản thân đã được học ở trường, để từ đó hệ thống lại các kiến thức cần thiết, phát huy thêm nhiều bài học mới cũng như tinh thần làm việc và khả năng hoạt động nhóm được nâng cao thêm để làm hành trang chuẩn bị cho công việc sau này

Tiếp đến là lời cảm ơn đến gia đình và tất cả bạn bè đã hỗ trợ nhiệt tình trong suốt thời gian chúng tôi thực hiện đề tài

Do thời gian nghiên cứu đề tài có hạn, tuy chúng tôi đã cố gắng để hoàn thành đồ

án nhưng vẫn không thể tránh khỏi những thiếu sót, kính mong nhận được sự giúp đỡ, đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để bài báo cáo được hoàn thiện hơn

Cuối lời, chúng em xin kính chúc quý thầy cô trong Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm dồi dào sức khỏe, đạt được nhiều thành tích trong sự nghiệp của mình Chúng em xin chân thành cám ơn!

TP.HCM, tháng 11 năm 2020

Nhóm sinh viên thực hiện

1.1 Tổng quan về cây sâm đất 1

1.1.1 Nguồn gốc: 1

1.1.2 Phân loại: 1

1.1.3 Đặc điểm lá sâm đất: 2

1.2 Tổng quan về Steroid: 3

1.2.1 Khái niệm: 3

1.2.2 Cấu trúc khung cơ bản: 4

1.2.3 Phân loại: 4

1.3 Tổng quan phương pháp trích ly: 6

1.3.1 Phương pháp chaỵ sắc ký cột 6

1.3.2 Nạp mẫu: 9

1.3.3 Phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC): 11

1.3.4 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất tự nhiên: 13

1.3.5 Phương pháp xác định công thức phân tử và định danh: 15

1.1.6 Phương pháp ức chê emzyme α-glucosidase 18

Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 19

2.1 Nguyên liệu và phương pháp 19

2.1.1 Nguyên liệu 19

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 20

2.1.3 Quy trình xử lý mẫu 23

2.1.4 Tách cao phân đoạn Ethyl Acetat: 24

2.1.5 Tách cao phân đoạn EA2: 26

3.2 Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) 31

3.3 Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) 34

3.4 Phổ DEPT: 36

3.5 Kết quả 39

3.6 Kết quá xét nghiệm: 41

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

4.1 Kết luận: 45

4.2 Kiến nghị: 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO: 46

Hình 1.2: Đánh chữ vòng theo đề nghị của IUPAC 3

Hình 1.3: Gonane 5

Hình 1.4: Cholane 6

Hình 1.5: Cholestane 6

Hình 1.6: Bộ sắc ký cột 7

Hình 1.7: Lựa chọn đường kính cột sơ bộ 8

Hình 1.8: Hướng dẫn tỷ lệ silica gel/mẫu phụ thuộc vào khả năng tách trên bản mỏng 9 Hình 1.9: Hướng dẫn chạy sắc ký bản mỏng 12

Hình 1.10: Sơ đồ xác định công thức hoá học 17

Hình 2.1: Lá sâm đất chọn làm mẫu 19

Hình 2.2: Bột lá sâm đất sau khi xay 20

Hình 2.3: Máy cô quay hiệu EYELA N – 1200A 21

Hình 2.4: Bảng mỏng đoạn EA 2.2 27

Hình 2.5: Bảng mỏng kết quả SD-RTE9 27

Tóm tắt nội dung và phương pháp Error! Bookmark not defined Thời gian lam việc: Error! Bookmark not defined.

Thiết bị và dụng cụ sử dụng 20

Khảo sát phân đoạn mẫu EA2.2 28

Khảo sát phân đoạn mẫu H2.2.2 29

Khảo sát phân đoạn mẫu EA2.2.2: 30

Kí hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic

Resonace

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

DEFT

Distortionless Enhancement by Polarization

Transfer

Phổ DEPT

HSQC Heteronuclear Single

Quantum Correlation

Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết

học

Trong các loại thuốc dân gian, cây sâm đất (Ruellia tuberosa L.) có nhiều tác

dụng như hạ sốt, lợi tiểu, tiêu độc, chống đái tháo đường Ngoài ra, sâm đất thể hiện nhiều hoạt tính sinh học như chống oxi hóa, hạ đường huyết, kháng viêm, độc tính tế bào… Các nghiên cứu về thành phần hóa học của tác giả nước ngoài cho thấy thành phần chính có trong sâm đất là hợp chất steroid, flavonoid, terpenoid, và phenyl etanoid

Sâm đất là một loại dược liệu đã được sử dụng rất nhiều trong nhân gian để trị nhiều bệnh nhưng chưa có một công bố khoa học hay công trình nghiên cứu nào xác thực điều này Bên cạnh đó, sâm đất còn sử dụng để ngâm rượu, nấu nước mát, giúp giải độc, thanh nhiệt và bổ sung một số nguyên tố vi lượng và vitamin Rễ dùng chữa đau răng, đau bụng, cảm mạo, bệnh gan, cao huyết áp, tiểu đường, nhiễm trùng đường tiểu Kinh nghiệm dân gian ở Nam bộ thường dùng củ sâm đất nấu nước uống làm thuốc bổ

Steroid là các chất béo hoà tan có nguồn gốc từ tự nhiên hoặc do con người tổng hợp Steroid còn là tiền chất của một số vitamin nhất định như vitamin D, cholesterol Theo tìm hiểu của chúng em, ở trong nước chưa có nghiên cứu nào công bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây sâm đất Mục tiêu của nhóm là phân lập được một hay nhiều hợp chất tự nhiên thuộc nhiều nhóm chất khác nhau có trong

cao Ethyl Acetate của cây Sâm Đất (Ruellia tuberosa L.) Đây là lần đầu tiên cây sâm

đất được nghiên cứu một cách có hệ thống theo phương diện phân lập hợp chất có trong tự nhiên về nhóm chất Steroid, góp phần làm sáng tỏ kiến thức y học cổ truyền

về cây thuốc dân gian này

Vì vậy nhóm chúng em thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết tách thành phần hóa học của cây sâm đất (Ruellia tuberosa L.) và ứng dụng vào thực phẩm chức năng

hỡ trợ điều trị bệnh đái tháo đường” để góp phần làm giàu danh mục các hợp chất tự

nhiên và khẳng định khả năng trị bệnh của cây sâm đất

tìm được là hướng nghiên cứu chính của nhóm chúng tôi Nhóm chúng tôi đã nghiên cứu sàng lọc, tách chiết và phân lập hợp chất từ cao phân đoạn Ethyl Acetate của cây

sâm đất (Ruellia tuberosa L.)

Xác định công thức phân tử và tên của các hợp chất tìm được thông qua các phương pháp hoá lý như phương pháp phổ khối lượng MS, phổ cổng hưởng từ hạt nhân NMR

Để phân lập, tách chiết và làm sạch các hợp chất tự nhiên tìm được cần phải kiểm soát hệ dung môi trích ly phù hợp với khả năng điện ly của các chất được thực hiện bằng phương pháp sắc ký cột và sắc ký bảng mỏng Mục tiêu lâu dài của nghiên cứu là tìm hiểu cơ chế tác dụng điều trị của cây sâm đất như chống oxi hóa, hạ đường huyết, kháng viêm, độc tính tế bào… Hoàn thành mục tiêu này sẽ cung cấp thông tin giải thích khả năng chữa bệnh cũng như thành phần, liều dùng và quy trình chiết xuất hợp chất có hoạt tính từ loài này Vậy mục tiêu được đặt ra là “Xác định công thức phân tử

và tên khoa học của các chất tìm được trong cây sâm đất (Ruellia tuberosa L)”

Để đạt được mục tiêu trên, chúng tôi đề nghị các mục tiêu cụ thể như sau:

- Phân lập và tách chiết các cao phân đoạn

- Tinh sạch các hợp chất

- Xác đinh công thức phân tử, tên khoa học của các hợp chất tìm được

- Ứng dụng cao methanol làm thực phẩm chức năng có khả năng ức chế α-glucoside

1

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1.Tổng quan về cây sâm đất

1.1.1.Nguồn gốc:

Cây sâm đất (Ruellia tuberosa L.) là một loại thảo mộc lâu năm phân bố rộng rãi ở

vùng nhiệt đới ở Các nước châu Á và Đông Nam Á bao gồm Thái Lan và Lào Nó đã được sử dụng trong y học cổ truyền Thái Lan như là một chất kháng viêm, sát trùng tốt giống như một loại thuốc giải độc Cây sâm đất, thuộc họ Acanthaceae, có thân đứng, cao từ 20 – 40 cm, khuyết tan cao 60-70cm.[1-4]

Hình 1.1:Cây Sâm Đất (Ruellia tuberosa L

1.1.2.Phân loại:

2

Phân loại khoa học của sâm đất [5]

Phân loại khoa học

Trong các loại thuốc dân gian, cây sâm đất (Ruellia tuberosa L.) có tác dụng hạ sốt, lợi

tiểu, tiêu độc, chống đái tháo đường Ngoài ra, sâm đất thể hiện nhiều hoạt tính sinh học như chống oxi hóa, hạ đường huyết, kháng viêm, độc tính tế bào… Nó là một loại dược liệu đã được sử dụng nhiều trong nhân gian để trị nhiều bệnh Trong số đó có những bài thuốc đông y thường sử dụng sâm đất để làm thuốc bổ, giảm ho, hen suyễn Các nghiên cứu về thành phần hóa học của tác giả ngoài nước cho thấy thành phần chính có trong sâm đất là hợp chất flavonoid và phenyl etanoid [4]

“Theo tài liệu nước ngoài, cây nổ còn có tác dụng gây nôn và dùng thay thế Ipeca

Lá có vị hơi đắng, cay; tính lạnh, có ít độc (gây nôn nếu dùng liều cao) [6]

Lá dùng chữa đau răng, đau bụng, cảm mạo, bệnh gan, cao huyết áp, tiểu đường, nhiễm trùng đường tiểu Kinh nghiệm dân gian ở Nam bộ thường dùng củ sâm đất nấu nước uống làm thuốc bổ

Steroid là nhóm chất các chất béo hữu co hoà tan có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp bao gồm các sterol và acid mật, hormone tuyến thượng thận và hormone giới tính

Hình 1.2:Đánh chữ vòng theo đề nghị của IUPAC

Steroid còn bao gồm một nhóm lớn các chất trung gian cho một loạt các phản ứng sinh học rất đa dạng Phổ biến nhất trong cơ thể là cholesterol, một thành phần thiết yếu của màng tế bào và là điểm khởi đầu để tổng hợp các steroid khác - hormone giới tính, hormone vỏ thượng thận và muối mật Theo SA Bhawani và cộng sự (2010 glococorticoids, mineralocorticoids, androgen, estrogen và proestagens có chức năng như là hormone, kiểm soát sự trao đổi chất, cân bằng muối, sự phát triển và chức năng của các cơ quan sinh dục cũng như sự khác biệt sinh học khác giữa hai giới [8] Steroid ở dạng muối mật (ví dụ, muối của axit cholic và deoxycholic và các liên hợp glycine và taurine của chúng) hỗ trợ trong quá trình tiêu hóa, trong khi một steroid khác là vitamin (calcitriol) tham gia kiểm soát canxi Steroid (tự nhiên hoặc tổng hợp)

4

như methylprednisolone, hydrocortison, glucocortisteroids, corticosteroid, squalamine, oestrogen, androgen, cũng được sử dụng để điều trị các bệnh khác như dị ứng, viêm khớp, một số bệnh ác tính

1.2.2.Cấu trúc khung cơ bản:

Steroid là những hợp chất có khung carbon cyclopentanoperhydro phenanten Có 7 carbon đối xứng, có tối đa 27= 128 đồng phân lập thể

Tính chất của Steroid:

Steroid có hai chức năng sinh học chính: là thành phần quan trọng của màng tế bào làm thay đổi tính lưu động của màng, steroid hoạt động như các phân tử tính hiệu Hàng trăm steroid đucợ tìm thấy trong thực vật, động vật và nấm

Steroid còn có thể thay đổi cấu trúc vòng, ví dụ như cắt một trong các vòng Cắt vòng B sẽ sản xuất secosteroids (một trong số đó là vitamin D3), lipid cholesterol, các hormone giới tính (estradiol và testosterone) và thuốc chống viêm dexamethasone Một steroid bất kỳ sẽ tạo được chất hydroccarbon diel thông qua chưng cất với Selen ở nhiệt độ cao

7

Trong sắc ký cột, chất hấp phụ hay chất làm nền cho pha cố định được nhồi trong

1 ống hình trụ được gọi là “cột” Tùy theo tính chất của chất được được sử dụng làm cột mà quá trình tách trong cột sẽ xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ), cơ chế phân bố (cột phân bố) hay cơ chế trao đổi ion (cột trao đổi ion) Ở đây chúng em chỉ sử dụng phương pháp sắc ký cột hấp phụ

Hình 1.6: Bộ sắc ký cột

Nguyên tắc

Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống thủy tinh thẳng đứng gọi là “cột” với chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò pha động chảy qua chất hấp phụ

Đối với các chất riêng biệt trong hỗn hợp, tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để được lấy ra lần lượt trước hoặc sau

Chất hấp phụ trong sắc ký cột thừơng dùng là oxid nhôm, silicagel, CaCO3, than hoạt tính, polyamid, … [9] Các chất này phải được tiêu chuẩn hóa

Dung môi dùng trong sắc ký cột có thể là từng loại riêng biệt hoặc hỗn hợp 2, 3 loại dung môi có tỉ lệ thích hợp

Với các chất hấp phụ cổ điển, dung môi sử dụng có độ phân cực tăng dần

8

Việc lựa chọn kích thước cột rất quan trọng Thông thường cột có đường kính nhỏ

và chiều dài càng dài thì sự tách càng tốt Một vài cột bán sẵn trên thị trường có kích thước tương ứng với chiều dài và kích thước cột:[11]

Hình 1.7:Lựa chọn đường kính cột sơ bộ

Kỹ thuật triển khai

Chuẩn bị cột

Rửa cột thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô

Cho bông gòn vào đáy cột (có thể cho thêm một lớp bông thuỷ tinh sạch)

Có 2 cách nhồi cột: nhồi cột ướt và nhồi cột khô

Nhồi cột ướt: Dùng cho các chất hấp phụ có khả năng trương phình như Silica

gel, Sephadex … thì phải ngâm trong dung môi trước một thời gian trước khi cho vào cột để tránh làm nứt cột Lắc, trộn đều bột hấp phụ với dung môi thành một hỗn hợp dịch, rót vào cột, chất hấp phụ sẽ lắng tự nhiên xuống đáy cột Hỗn dịch dung môi và chất hấp phụ không nên quá sệt để tránh bọt khí bị giữ trong cột và cũng không nên quá lỏng để rót nhiều lần vào cột Chú ý trong quá trình nhồi cột, dung môi vẫn liên tục chảy đều ra bình hứng, và không được để khô dung môi trong cột Sau khi chất hấp phụ được cho hết vào cột, dung môi vẫn tiếp tục được rót và hứng thêm một khoảng

10

thời gian nữa để cột hoàn tòan ổn định Mặt thoáng trên cột phải phẳng, người ta có thể cho thêm một lớp cát hoặc bông để tránh làm xáo trộn lớp Silicagel khi rót dung môi.[9]

Nhồi cột khô: Dùng cho các chất hấp phụ không có khả năng trương nở như

Al2O3, CaCO3 Chất hấp phụ được nhồi từ từ vào cột ở dạng khô bởi một phểu có cuống dài Dùng một que bằng gỗ hoặc cao su gõ nhẹ và đều xung quanh cột theo chiều từ dưới lên để bột xuống được đều Khi chất hấp phụ được cho hết vào cột, rót dung môi vào và cho chảy liên tục một thời gian để cột được ổn định và không được

để khô dung môi trong cột.[9]

1.3.2.1.Đưa chất phân tích vào cột

Yêu cầu khi đưa chất phân tích vào cột là phải phân tán thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt thoáng phẳng

Có 2 cách để nạp mẫu vào cột là nạp mẫu ở dạng dung dịch và nạp mẫu ở dạng khô Trong khóa luận này sử dụng cách nạp mẫu ở dạng dung dịch với cột Sephadex

và cột đảo, nạp mẫu ở dạng khô đối với cột thường

1.3.2.2.Rửa cột

Rửa cột còn được gọi là giải ly chất ra khỏi cột

Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà có thể tiến hành giải ly cột bằng áp suất thường hoặc áp suất nén

Rửa cột bằng áp suất thường: nghĩa là dung môi chảy ra nhờ vào trọng lực Cột áp suất thường có nhược điểm là chảy chậm, chỉ dùng cho các chất hấp phụ có kích thước hạt lớn

Rửa cột bằng áp suất nén: Thường cho một dòng khí nén (khí nitrogen hoặc không khí) vào đầu cột Tốc độ dồng khí có thể được kiểm soát nhờ vào một van điều chỉnh Cột dùng với áp suất nén phải có nút bảo đảm kín ở miệng, và có khóa hoặc dây buộc chặt vào miệng cột

11

Việc lựa chọn các phương pháp rửa cột khác nhau tùy thuộc vào việc sử dụng kích thước hạt gel làm pha tĩnh và việc sử dụng áp lực để giải ly dung môi ra khỏi cột.[9] Một hợp chất có thể bị chất hấp phụ giữ lại mạnh hay yếu còn tùy thuộc vào độ phân cực của dung môi giải ly

Ở sắc ký cột cổ điển, người ta thường hay dùng dung môi tinh khiết có độ phân cực tăng dần để rửa cột Tạp chất có trong dung môi thường làm thay đổi độ phân cực,

do vậy người ta thường cất dung môi trước khi sử dụng

1.3.2.3.Chọn chất hấp phụ cho cột sắc kí

Thường sử dụng silicagel pha thường cho phân đoạn cao hay hỗn hợp chất cần tách

có độ phân cực thấp đến trung bình, silicagel pha đảo thường được dùng khi cần cô lập các hợp chất phân cực mạnh hơn Trong silica gel pha thường thì hợp chất ít phân cực được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực hơn được giải ly sau và ngược lại đối với silica gel pha đảo Thông thường để tách chất tốt thì trọng lượng chất hấp phụ phải lớn hơn 25 – 50 lần so với trọng lượng của mẫu chất Chiều cao chất hấp thụ và đường kính trong của cột thường là theo tỉ lệ khoảng 10:1.[9]

1.3.3.Phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC):

Sắc ký bảng mỏng (TLC) là một kĩ thuật sắc ký được dùng để tách các chất trong hỗn hợp Phương pháp sắc ký bảng mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ, thường là silica gel, aluminium oxit, hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất trơ Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc ký bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch

12

Hình 1.9:Hướng dẫn chạy sắc ký bản mỏng

Dung môi thích hợp dùng trong sắc ký lớp mỏng sẽ là một dung môi có tính phân cực khác với pha tĩnh Nếu một dung môi phân cực được dùng để hòa tan mẫu thử trên một pha tĩnh phân cực, vệt nhỏ mẫu nhỏ thử sẽ lan tròn do mao dẫn, và các vệt khác nhau có thể trộn lẫn vào nhau Do đó, để hạn chế sự lan tròn của các vệt mẫu, dung môi được sử dụng để hòa tan mẫu thử phải không phân cực, hoặc phân cực một phần, nếu pha tĩnh phân cực và ngược lại

Lựa chọn dung môi tiến hành sắc ký

Trước khi triển khai sắc ký cột cần dùng sắc ký bản mỏng để dò hệ giải ly phù hợp theo các bước sau:

Bước 1: Hòa tan mẫu trong dung môi phù hợp (dung dịch A)

Bước 2: Chuẩn bị những tấm bản mỏng có kích thước 4x10 cm Chấm lên những bản này dung dịch A với nồng độ dung dịch khoảng 2 - 5%

Bước 3: Giải ly bản mỏng với những hệ dung môi khác nhau

Bước 4: Hiện hình các vết trên bản bằng đèn UV hoặc thuốc thử Từ đó nhận định

hệ dung môi phù hợp cho quá trình giải ly cột sắc ký dựa vào giá trị Rf Với:

13

𝑏Trong đó:

a là khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm của vết mẫu thử (đơn vị: cm)

b là khoảng cách từ vạch xuất phát đến vạch dung môi trên cùng đường đi của vết (đợn vị: cm) [9, 11]

R f chỉ có giá trị từ 0 đến l (vào khoảng 0.2 ÷ 0.3 là được) Đối với mẫu cao thô ban

đầu, dung môi giải ly đầu tiên là dung môi đẩy vết ít phân cực nhất lên vị trí có

R f = 0,5 và dung môi chấm dứt sắc ký cột là dung môi đẩy vết phân cực nhất lên vị trí

có R f = 0,2

Chọn chất hấp phụ cho cột sắc kí

Thường sử dụng silica gel pha thường cho phân đoạn cao hay hỗn hợp chất cần

tách có độ phân cực thấp đến trung bình, silica gel pha đảo thường được dùng khi cần

cô lập các hợp chất phân cực mạnh hơn Trong silica gel pha thường thì hợp chất ít

phân cực được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực hơn được giải ly sau và ngược

lại đối với silica gel pha đảo Thông thường để tách chất tốt thì trọng lượng chất hấp

phụ phải lớn hơn 25 – 50 lần so với trọng lượng của mẫu chất Chiều cao chất hấp thụ

và đường kính trong của cột thường là theo tỉ lệ khoảng 10:1

1.3.4.Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất tự nhiên:

Tiến hành xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất thu được bằng các phương

pháp phổ như 1H - NMR, 13C – NMR, HMBC, HSQC, DEPT trên máy Bruker tần số

500 MHz đối với phổ 1H – NMR và 125 MHz với phổ 13C – NMR

- Phổ hồng ngoại (IR)

- Phổ khố MS

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT)

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (HMBC, HSQC)

14

1.3.4.1.Phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H

Nhiệm vụ của phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân là phải tìm được các thông số

từ các phổ ghi ra Ở đây, giới hạn ở việc tìm các giá trị: độ chuyển dịch hoá học δ và

hằng số tương tác spin – spin (J) của các proton và các hạt nhân khác có I = ½

Phổ 1 H-NMR

Cho biết thông tin về các proton 1H có trong phân tử Các thông số phổ 1H-NMR cho biết độ dịch chuyển hóa học 𝛿, hình dạng tín hiệu và hằng số tương tác (J) spin-spin giựa các proton không tương đương kế cận nhau sẽ cho các kiểu ghép vân phổ (tín hiệu bội), cường độ tích phân của tín hiệu thể hiện số lượng proton tương ứng với tín hiệu đó

1.3.4.2.Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C

Vì tất cả các hợp chất hữu cơ đều chứa nguyên tử cacbon mà tron ự nhiên nguyên

tử cacbon -13 chiếm tỷ lệ 1,1% nên phổ cộng hưởng từ nhân 13C (NMR-13C) hiện nay

có ý nghĩa quan trọng, nó cho nhiều thông tin hơn phổ NMR-1H, ví dụ ở hợp chất hữu

cơ khômg chứa hiđro thì không có tín hiệu trong phổ NMR-1H nhưng nó cho tín hiệu của phổ NMR-13C Vì tỷ lệ của 13C nhỏ và hằng số tỷ lệ gyromagnetic thấp nên tín hiệu cộng hưởng từ thường nhỏ, người ta phải đo trên phổ kế cộng hưởng từ biến đổi Fourier (FT) Khi dùng máy này có thể ghi phổ NMR-13C theo một số cách khác nhau, nhưng quan trọng nhất là phương pháp phổ 13C tương tác 1H và xoá tương tác 1H Cả hai phương pháp đều cho các thông tin giá trị trong việc phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ

Phổ 13 C-NMR

Cho thông tin về các cacbon có trong phân tử Các tính hiệu phổ 13C-NMR xuất hiện trong khoảng thang chia độ rộng (0-250ppm) (có thể đến 600ppm cho trường hợp đặc biệt) nên các tín hiệu tách rõ rang, mũi đơn giản dể quan sát Mỗi loại cacbon trong hợp chất hữu cơ có độ dịch chuyển hóa học khác nhau Dựa vào độ dịch chuyển

-DEPT-45 mỗi cacbon có mang hydrogen đều hiện lên 1 mũi trên phổ đồ

-DEPT-90 chỉ những cacbon loại metin-CH cho mũi dương

-DEPT-135 cho xuất hiện mũi dương các cacbon meitn –CH và metil –CH3 xuất hiện mũi âm các cacbon metilen CH2, cacbon tứ cấp không cho mũi trong phổ Cho biết mối liên quan giữa các proton với nhau: proton gem (2 proton gắn trên cùng một cacbon), proton vic (2 proton gắn trên 2 cacbon kề nhau), mối liên quan giữa các nguyên tử H trong một phân tử

1.3.5 Phương pháp xác định công thức phân tử và định danh:

1.3.5.1.Sơ đồ quy tình xác định công thức phân tử:

16

Quy trình xác định công thức hoá học

Phân tích ban đầu:

Dùng các đặc tính lý hoá sơ bộ như: màu, mùi, tỷ trọng, độ tan, m.p, và b.p

Kiểm tra cấu trúc

Phân tích ban đầu

Khảo sát quang phổ

Xác minh các phân mảnh

Lắp ghép các phân mảnh Cấu trúc đề nghị

Cấu trúc chính thức

Gợi ý các hợp chất: Flavonoid, Alkaloid, saponin, steroid

NMR, MS, IR, UV, HSQC

Mảnh nhỏ của cấu trúc phân tử

1.3.5.2.Phương pháp xác định cấu trúc hoá học:

Đốt cháy mẫu tinh khiết, sau đó phân tích nguyên tố: đốt cháy CO2, H20, NO2,

Tính khối lượng các nguyên tố

Xác định cấu phân mảnh thông qua giải phổ (phổ IR, phổ NMR, phổ UV-Vis, phổ

18

1.1.6.Phương pháp ức chê emzyme α-glucosidase

Hoạt tính ức chế α-glucosidase được xác định theo phương pháp của Apostolidis et al (2007) Nguyên tắc của phương pháp là enzym α-glucosidase

thủy phân chất nền p- nitrophenyl-D-glu opyr nosi pNPG để cung cấp cho

α-D-glucose và p-nitrophenol (pNP)

Hình 1.11:Cơ chế hoạt động của α-glucosidase

Cách xét nghiệm ức chế α-glucosidase (α-glucosidase được sử dụng làm enzyme)

Trong acarbose khảo nghiệm này được sử dụng làm thuốc tham chiếu Các thuốc ức chế

α-glucosidase và amylase có trong biểu mô của ruột non được chứng minh là làm giảm đường

huyết sau bữa ăn và cải thiện sự trao đổi chất glucose đã bị suy giảm mà không thúc đẩy bài tiết

insulin ở bệnh nhân NIDMM Những loại thuốc này là hữu ích nhất cho những người vừa được

chuẩn đoán mắc bệnh tiểu đường loại 2 và những người có lượng đường trong máu cao hơn

một chút so với mứ độ được coi là nghiêm trọng đối với bệnh tiểu đường Chúng cũng rất hữu

ích cho những người dùng thuốc sulfonylurea hoặc metformin, những người cần một loại thuốc

bổ sung để giữ mức đường trong máu của họ trong một phạm vi an toàn Do đó, sự chậm trễ và

chậm trễ của sự hấp thụ carbohydrate với một chất ức chế α-glucosidase dựa trên thực vật

cung cấp một phương pháp điều trị tiềm năng cho việc quản lý bệnh tiểu đường loại 2 và bệnh

nhân đường biên Kết quả của nghiên cứu này chỉ ra rằng việc quản lý Sâm đất là một điều tốt

để quản lý mức đường huyết sau bữa ăn và xác nhận việc sử dụng các loại cây này cho những

bệnh nhân này

19

Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1.Nguyên liệu và phương pháp

2.1.1.Nguyên liệu

Với nguồn nguyên liệu là lá sâm đất (15 kg) được thu nhận từ Kiên Tiền Giang mang đi sấy khô 40-50℃, xay nhuyễn thành bột cỡ nhỏ 3-4mm (3 kg) và đem ngâm trong ethanol 96º trong 3 ngày

Tiêu chí chọn là sâm đất: lá già, tươi, còn xanh, chỉ lấy lá nguyên không vò nát hay rách

Hình 2.1:Lá sâm đất chọn làm mẫu

Bột lá sâm đất:

21

14 Máy sấy cầm tay 1

-Máy cô quay chân không hiệu EYELA N – 1200A

Hình 2.3:Máy cô quay hiệu EYELA N – 1200A

-Bếp điện EYELA OSB – 2100 và máy làm lạnh EYELA CCA – 1111

22

-Bình cầu cô quay dung môi dung tích 1000 mL, bình hứng dung môi dung tích 1 lít, bình cầu đựng mẫu cô quay dung tích 250 mL,500 mL và 1000 mL

-Đèn UV bước sóng 365 - 254 nm

-Cân phân tích 05 số lẻ hiệu OHAUS DV215CD

-Sắc ký bảng mỏng tráng silica gel 60 F254 trên tấm nhôm 20 x 20 cm, Merck

-Sắc ký cột thường dùng theo cơ chế hấp thu trên silica gel 60, cỡ hạt: 0.040 – 0.063

mm, Merck và silicagel 60, cỡ hạt 0.06 – 0.02 mm, Merck

-Sắc kí cột Sephadex theo cơ chế lọc gel trên hạt Sephadex LH – 20, hãng GE Healthcare Bio – Sciences AB

Một số thiệt bị tại: Phòng Cộng hưởng từ - Viện Hóa học, Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam; địa chỉ: Số 18 Hoàng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, thành phố Hà Nội

Các thiết bị ghi phổ: phổ 1H-NMR, 13C-NMR, phổ DEPT- NMR 135 và 90: ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker ở tần số 500 MHz cho phổ 1H-NMR và 125 MHz cho phổ 13C-NMR

24

2.1.3.2.Thuyết minh quy trinh:

Nguyên liệu từ lá cây sâm đất được thu hái 15 kg , loại bỏ lá sâu, rửa sạch bằng nước, phơi khô (tránh ánh nắng trực tiếp), xay nhỏ (khoảng 3-4mm) – mẫu khô có khối lượng 3 kg, ngâm dầm với Ethanol (96) trong 3 ngày, sau đó tiến hành lọc, thực hiện cô quay thu hồi dung môi, ngâm lại phần bả 5 lần lỏng chiết kiệt chất Cô quay thu được cao tổng ban đầu- cao ethanol

Cao ethanol được nạp vào cột silica gel, tiến hành trích lỏng-lỏng, giải ly với nhiều loại đơn dung môi có độ phân cực tăng dần theo thứ tự: hexan, ethyl acetat, methanol Thu được 3 cao chiết phân đoạn: cao Hexan, cao Ethyl Acetat, cao methanol

Sau đó sử dụng cao EA, phân lập và tách chiết thông qua các phương pháp sắc ký cột (CC) và sắc ký bảng mỏng (TLC) thu nhận các hợp chất tự nhiên

2.1.4.Tách cao phân đoạn Ethyl Acetat:

Từ cao EA, áp dụng sắc ký cột pha thường, giải ly với dung môi có độ phân cực tăng dần (Hexan, ethyl acetat, methanol) Mỗi đoạn thu 500mL, theo dõi qua sắc ký bảng mong (TLC), thu được 4 phần phân đoạn như sơ đồ:

Sơ đồ quy trình thực hiện: