Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cho cao chiết ethanol từ cây Medinilla sp.

Đồ án tốt nghiệp này được thực hiện với mục tiêu bước đầu xác định được quy trình phù hợp để khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cho cao chiết ethanol từ cây Medinilla sp. Mời các bạn cùng tham khảo.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC)

CHO CAO CHIẾT ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP

ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: Th S Phạm Minh Nhựt

TS Lương Tấn Trung

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC)

CHO CAO CHIẾT ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP

ETHANOL TỪ CÂY MEDINILLA SP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: Th S Phạm Minh Nhựt

TS Lương Tấn Trung

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên

cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS Phạm Minh Nhựt Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng nãm 2015

Sinh viên

Nguyễn Thị Phượng Hằng

LỜI CÁM ƠN

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Ðại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt những nãm học vừa qua

Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt, người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng các anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài của mình

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con những lúc khó khãn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như trong cuộc sống

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng nãm 2015

Nguyễn Thị Phượng Hằng

MỤC LỤC

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục i

Danh sách chữ viết tắt vi

Danh sách các hình vii

Danh sách các bảng viii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặc vấn đề 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Phạm vi nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về chi Medinilla sp 3

1.1.1 Phân loại, nguồn gốc và phân bố 3

1.1.1.1 Phân loại khoa học 3

1.1.1.2 Phân bố và sinh thái 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật học 3

1.2.3 Một số loài đặc trưng thuộc chi Medinilla sp 3

1.2.3.1 Medinilla septentrionalis 3

1.2.3.2 Medinilla assamica 4

1.2.3.3 Medinilla lanceata 4

1.2.3.4 Medinilla nana 5

1.2.3.5 Medinilla fengi 6

1.2.3.6 Medinilla formosana 6

1.2 Một số thành phần hóa học trong thực vật 6

1.2.1 Carbohydrate 6

1.2.1.1 Khái niệm 6

1.2.1.2 Vai trò 6

1.2.2 Amino acid 7

1.2.2.1 Khái niệm 7

1.2.2.2 Vai trò 7

1.2.3 Alkaloid 8

1.2.3.1 Khái niệm 8

1.2.3.2 Vai trò 8

1.2.4 Glycoside 9

1.2.4.2 Saponin 9

1.2.4.3Glycoside tim 9

1.2.4.4Anthraquinone glycoside 10

1.2.4.5 Flavonoid và anthoxyanosid 10

1.2.4.6 Tannin 10

1.2.4 Steroid 11

1.2.4.1 Khái niệm 11

1.2.4.2 Vai trò 11

1.2.5 Các hợp chất phenolic 11

1.2.5.1 Khái niệm 11

1.2.5.2 Vai trò 12

1.3 Tổng quan về các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật 12

1.3.1 Khái niệm 12

1.3.2 Cơ chế kháng khuẩn chung 12

1.3.3 Một số hợp chất kháng khuẩn và cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất kháng khuẩn trong thực vật 13

1.3.3.1 Alkaloid 13

1.3.3.2 Phenol đơn và acid phenolic 14

1.3.3.3 Flavonoid 15

1.3.3.4 Tannin 16

1.3.3.5 Các hợp chất quinone 16

1.3.3.7 Saponin 18

1.2.4 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới và tại Việt Nam 19

1.2.4.1 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thê giới 19

1.2.4.2 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn từ thực vật ở Việt Nam 20

1.4 Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration _MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimum bactericidal concentration_MBC)21 1.4.4 Khái niệm, ý nghĩa MIC và MBC 21

1.4.1.1 Khái niệm 21

1.4.1.2 Ý nghĩa 21

1.4.3 Sơ lược về một số phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 22

1.4.3.1Phương pháp khuếch tán trên thạch (agar-diffusion methods) 22

1.4.3.2.Phương pháp pha loãng (Dilution methods) 22

1.4.4 Một số kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên thực vật 23

1.4.4.1 Tình hình nghiên cứu MIC trên thế giới 23

CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 25

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 25

2.1.2 Địa điểm thu mẫu 25

2.1.3 Thời gian nghiên cứu 25

2.2.Vật liệu nghiên cứu 25

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.2.2 Vi khuẩn chỉ thị 25

2.2.3 Môi trường 25

2.2.3.1 Môi trýờng nuôi cấy và phân lập 25

2.2.3.2 Dụng cụ và thiết bị 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1 Phương pháp thu và tách chiết các hợp chất từ thực vật 26

2.3.2 Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị 27

2.3.3 Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 27

2.3.3.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật 27

2.3.3.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu 27

2.3.4 Phương pháp pha loãng vi sinh vật 28

2.3.5 Phương pháp xác định mật độ tế bào 28

2.3.6 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (well diffusion agar) 29

2.3.7 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên môi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin (broth dilution resazurin method) 30

2.3.8 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng phương pháp đĩa giấy khuếch tán (disc diffusion method) 31

2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 32

2.4 Bố trí thí nghiệm 32

2.4.1 Thí nghiệm 1: Tách chiết cao ethanol từ cây Medinilla sp 33

2.4.1.1 Sơ đồ tách chiết 33

2.4.1.2 Thuyết minh quy trình 33

2.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol 70% từ cây Medinilla sp bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch 34

2.4.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu quy trình xác định chỉ số MIC của cao chiết ethanol 70% từ cây Medinilla sp 35

2.4.3.1 Thí nghiệm 3.1 Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch 36

2.4.3.2 Thí nghiệm 3.2 Phương pháp pha loãng trên môi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin 37

2.4.3.3 Thí nghiệm 3.3 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán 38

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao ethanol từ cây Medinilla sp 40

3.1.1 Đối với nhóm vi khuẩn Escherichia coli 41

3.1.3 Đối với nhóm Shigella spp 43

3.1.4 Đối với nhóm Vibrio spp 44

3.1.5 Đối với nhóm chủng vi sinh vật gây bệnh khác 45

3.2 Kết quả xác định chỉ số (MIC) của cao chiết ethanol 70% từ cây Medinilla sp (MEE) 46

3.2.1 Xác định chỉ số MIC của cao chiết bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (WDA) 47

3.2.2 Phương pháp pha loãng trên môi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin (MDR) 48

3.2.3 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán (DDA) 50

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………56

4.1 Kết luận………56

4.2 Kiến nghị……… 56

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MEE: Medinilla sp ethanol extract: Cao chiết 70% từ cây Medinilla sp

MIC: Minimum Inhibitory Concentration: Nồng độ ức chế tối thiểu

MBC: Minimum Bactericidal Concentration: Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu

WDA: Agar well diffusion assay: Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch

MDR: Broth dilution resazurin menthod: Phương pháp pha loãng trên môi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin

DDA: Disc diffision assay: Phương pháp đĩa giấy khuếch tán

TSA: Trypticase Soya Agar

TSB: Trypton Soya Broth

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1.1 Medinilla septentrionalis 4

Hình 1.2 Medinilla assamica 4

Hình 1.3 Medinilla lanceata 5

Hình 1.4 Medinilla nana 5

Hình 1.5 Medinilla formosana 6

Hình 1.6 Cấu tạo amino acid 7

Hình 1.7 Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thiên nhiên 12

Hình 1.8 Berberine 14

Hình 1.9 Eugenol 15

Hình 1.10 Cấu trúc hóa học saponin 18

Hình 2.1 Đường kính vùng ức chế của MEE đối với chủng Escherichia coli O157:H7 29

Hình 2.2 Sự thay đổi màu sắc của chất chỉ thị resazurin 31

Hình 2.3 Đường kính vùng ức chế của cao chiết Medinilla sp nồng độ 100 mg/mlđối với chủng Shi Sonnei 32

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 33

Hình 2.5 Quy trình tách chiết cao ethanol 70% 33

Hình 2.6 Dịch lọc mẫu ethanol 70% 34

Hình 2.7 Quy trình xác định hoạt tính kháng khuẩn 35

Hình 2.8 Quy trình xác định MIC bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch36 Hình 2.9 Quy trình xác định MIC bằng phương pháp pha loãng trên môi trường lỏng bổ sung chất chỉ thị resazurin 37

Hình 2.10 Quy trình xác định MIC bằng phương pháp đĩa giấy khuếch tán 38

Hình 3.1 Hoạt tính ức chế của MEE (100mg/ml) và ciprofloxacin (500µg/ml) đối với nhóm Escherichia coli 40

Hình 3.2 Hoạt tính ức chế của MEE và ciprofloxacin (500µg/ml) đối với nhóm

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây, việc kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh cho con người được báo cáo từ khắp nơi trên thế giới (Piddock và ctv, 1989) Tình hình đáng báo động là việc sử dụng kháng sinh bừa bãi ở các nước đang phát triển (Ahmad và ctv, 2001), mặc dù ngành công nghiệp dược đã sản xuất một số loại kháng sinh mới trong ba thập kỷ qua, nhưng đề kháng của vi khuẩn đối với các loại thuốc đã tăng lên, vì vi khuẩn có khả năng di truyền nên có khả năng kháng thuốc qua các thế hệ (Cohen, 1992)

Thuốc kháng sinh là cơ sở chính để điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn

Từ khi phát hiện ra các loại thuốc kháng sinh và sử dụng chúng như hóa học trị liệu với hy vọng cho ngành y tế rằng kháng sinh sẽ tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật gây các bệnh truyền nhiễm Tuy nhiên, lạm dụng kháng sinh đã trở thành nhân tố chính cho sự xuất hiện và phát triển nên nhiều chủng kháng thuốc của một số nhóm vi sinh vật (Harbottle và ctv, 2006)

Do đó, việc quan trọng là phải tìm ra các loại kháng sinh mới Tuy nhiên theo hồ

sơ trước đây, ngay cả những loại kháng sinh thương mại mới được giới thiệu chỉ có hiệu quả trong một thời gian ngắn (Coates, 2002) Hơn nữa, sự phát triển kháng thuốc và sự xuất hiện của các tác dụng phụ không mong muốn của thuốc kháng sinh thương mại đã dẫn đến việc tìm kiếm các tác nhân kháng khuẩn mới, chủ yếu là các chất chiết xuất từ thực vật, để tìm ra cấu trúc hóa học mới để khắc phục những nhược điểm nói trên (Ordóñez và ctv, 2003) Vì lý do này, các nhà nghiên cứu đang ngày càng chuyển sự chú ý sang các sản phẩm thảo dược, tìm kiếm hy vọng mới cho sự phát triển loại thuốc tốt hơn so với các chủng vi khuẩn đã kháng (Braga và ctv, 2005)

Hàng nghìn năm trước, con người đã biết về lợi ích của việc sử dụng thực vật để làm giảm hoặc chữa bệnh Các loài thực vật tạo thành một nguồn các hợp chất hóa học mới quan trọng có tiềm năng sử dụng trong y học và các ứng dụng khác Chiết

việc điều trị các bệnh khác nhau, và khoảng 30% doanh số dược phẩm bán ra trên toàn thế giới được dựa trên các sản phẩm tự nhiên (Grabley, 1999)

Hiện nay vẫn chưa có nhiều tài liệu khoa học đề cập đến hoạt tính kháng khuẩn củng như quy trình xác định nồng độ kháng khuẩn của chiết xuất từ thực vật được

sử dụng trong y học dân gian.Vì vậy, để làm phong phú cho danh sách các thực vật

có tiềm năng sử dụng thay thế thuốc kháng sinh, và xây dựng quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu áp dụng đối tượng thực vật _ cây thuốc (có màu) là lý do chính để đề tài “Nghiên cứu quy trình xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

cho cao chiết ethanol từ cây Medinilla sp” được thực hiện

2 Mục đích nghiên cứu

Bước đầu xác định được quy trình phù hợp để khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu

(MIC) cho cao chiết ethanol từ cây Medinilla sp

3 Nội dung nghiên cứu

Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cho cao chiết ethanol của chi Medinilla sp

Nghiên cứu một số phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) từ đó đưa

ra quy trình chung cho đối tượng cây thuốc

4 Phạm vi nghiên cứu

Sử dụng dung môi ethanol 70% cho quá trình tách chiết cao

Thử nghiệm trên 20 chủng vi sinh vật chỉ thị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về chi Medinilla sp

1.1.1 Phân loại, nguồn gốc và phân bố

1.1.1.1 Phân loại khoa học

Giới (regnum) : Plantae

Ngành (division) : Magnoliophyta

Lớp (class): Magnoliopsida

Bộ (ordo): Myrtales

Họ (familia): Melastomataceae

Chi (genus): Medinilla

1.1.1.2 Phân bố và sinh thái

Medinilla sp là một chi có khoảng 193 loài thực vật có hoa thuộc họ Melastomataceae, có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới cổ xưa bắt nguồn từ Châu Phi

(hai loài) về phía đông qua Madagascar (khoảng 70 loài) và miền Nam châu Á đến phía tây các đảo Thái Bình Dương Chi này được đặt tên theo J de Medinilla, thống đốc của quần đảo Mariana vào năm 1820 (Renner và ctv, 2004)

1.1.2 Đặc điểm thực vật học

Medinilla thuộc loại cây bụi hoặc dây leo Lá mọc đối diện hay vòng, có

cuống lá hoặc không cuống, phiến lá thường nhẵn, rìa lá có hoặc không có răng cưa

Lá bắc nhỏ, sớm rụng Hoa có 4 hay 6 cánh Có chùy hoa lớn màu trắng hoặc hồng,

có cuống nhỏ và đôi khi có lá bắc con Đế hoa có hình chén, hình phễu, hình chuông, hoặc hình ống Cánh hoa dạng trứng ngược (đầu nhỏ ở phía cuống lá), hình trứng đôi khi xiên Nhị hoa = 2 x cánh hoa Hạt nhiều Bầu nhụy thấp, hình trứng, chóp cụt hoặc với màng bao quanh đỉnh, đôi khi có vách ngăn.(Jie và ctv, 2007)

1.2.3 Một số loài đặc trưng thuộc chi Medinilla sp

1.2.3.1 Medinilla septentrionalis

Là cây bụi, cao khoảng 1 – 7m,

nhiều nhánh, nhánh thẳng đứng đôi khi

xen kẽ Cành dày, hình trụ, nhẵn với vỏ

mỏng có màu nâu Cuống lá dày

cuống hoa 1-2,5 cm, đế hoa có hình chuông 4-4,5 mm

Phân bố: Các rừng rậm, bìa rừng, khu vực râm ẩm ướt; độ cao khoảng

200-1800 m Được tìm thấy ở Trung Quốc (Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam), Myanmar, Thái Lan, Việt Nam

hoặc hình elip có kích thước 10 – 21 ×

3,8 – 11 cm, rìa lá có đường răng cưa

nhỏ, nhọn đỉnh Đế hoa có hình chuông

(15 – 30 cm) Cuống hoa nhỏ (0.,5 - 2

mm), đế hoa có hình chén (3 - 4 mm) Cánh hoa màu hồng, có 4 cánh hình trứng

- Phân bố: tập trung thưa thớt ở rừng rậm, thung lũng, sườn đồi, nơi ẩm ướt,

độ cao khoảng 200 – 1300m Được tìm thấy ở Trung Quốc, Lào, Ấn Độ, Thái Lan, Myanmar, Việt Nam

1.2.3.3 Medinilla lanceata

Hình 1.1 Medinilla septentrionalis

Hình 1.2 Medinilla assamica

Là cây riêng lẽ hoặc bụi, cao

khoảng 2 – 5 m Cuống lá dài khoảng

8 - 10 mm, hơi có lông; lá hình lưỡi

mác đến hình ovate - lanceolate, có

kích thước khoảng 15 - 24 × 3-5,5 cm,

mỏng như giấy, 2 bề mặt lá nhẵn, đỉnh

và đuôi lá nhọn, rìa lá có đường răng

cưa nhỏ nông Cụm hoa chèn vào lá

cành hoặc các đốt của rễ Hoa mọc

theo cụm, hình chùy (15 – 25 cm), đế

hoa có hình chuông (5 - 6 mm), cánh hoa hình trứng rộng, cùn ở đỉnh và tròn dần về cuối

Phân bố rải rác ở rừng rậm, nơi ẩm ướt, dưới bóng cây, thung lũng, sườn đồi,

độ cao khoảng 400 - 1000m Được tìm thấy ở Trung Quốc (Hải Nam, Vân Nam)

thước 2 – 3 × 3 – 5 cm, chùm khoảng 3 - 6 hoặc 16 hoa, cuống hoa (5 - 10 mm), đế hoa hình phễu (4 – 5 mm), hoa có 4 cánh, màu hồng, hình trứng rộng (6 - 7,5 mm), đỉnh cắt xén hoặc nhọn

Phân bố: rừng thường xanh cây lá rộng, những nơi ẩm ướt có bóng, vết nứt của đá, độ cao khoảng 600 - 1800 m Được tìm thấy ở Đài Loan và Trung Quốc (Vân Nam)

1.2.3.6 Medinilla formosana

Là cây bụi, hoặc dây leo Lá mọc đối

diện hoặc mọc vòng quanh thân, cuống lá (5

– 10 mm), nhẵn; phiến lá hình thuôn - trứng

đến trứng - mũi mác, kích thước 10 - 20 × 7

- 14 cm, mỏng như giấy Cụm hoa đầu cuối

hoặc gần cuối, hoa mọc theo chùy, cuống

hoa (6 mm), nhẵn Đế hoa gần hình cầu,

Nguồn gốc các carbohydrate trong tự nhiên: được hình thành từ trong lá cây của thực vật nhờ quá trình quang hợp của ánh sáng mặt trời và sắc tố xanh chlorophyll (diệp lục) (Phùng Trung Hùng và ctv, 2013)

1.2.1.2 Vai trò

Hình 1.5 Medinilla formosana

- Cung cấp năng lượng

- Cấu trúc, tạo hình (cellulose,…)

- Bảo vệ (mucopolysaccharide)

- Chống tạo thể cetone (mang tính acid gây độc cho cơ thể)

- Điểm tựa: bộ khung thực vật

- Dự trữ: tinh bột ở thực vật (hạt, thân, củ) (Nguyễn Huy Công và ctv, 2005)

1.2.2 Amino acid

1.2.2.1 Khái niệm

Amino acid là loại hợp chất hữu cơ tạp chức

mà phân tử chứa đồng thời nhóm amino (-NH2-) và

nhóm cacboxyl (-COOH-)

Công thức cấu tạo: Gồm nguyên tử carbon

trung tâm, nhóm amin (amino), nhóm carboxylate,

1.2.2.2 Vai trò

Vai trò và một số amino acid được thể hiện ở bảng 1.1

Hình 1.6 Cấu tạo amino

acid

Bảng 1.1 Chức năng sinh lý của một số amino acid trong quá trình trao đổi chất Các amino acid Hoạt động sinh hóa

Glycine - Là tiền chất của chlorophyll

Proline và

hydroxyproline

- Điều chỉnh trạng thái cân bằng nước

- Cấu tạo nên thành tế bào (nematostatic action)

- Thiết yếu để tạo phấn hoa Glutamic và

glutamine

Đạm hữu cơ dự trữ để tạo thành các amino acid khác và

protein thông qua phản ứng trao đổi

Serine - Điều chỉnh trạng thái cân bằng nước, rất quan trọng

cho quá trình tổng hợp chlorophyll Arginine - Là tiền chất của polyamine, rất quan trọng để để phân

và cung cấp những loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao (Nguyễn Huy Công và ctv, 2005)

1.2.4 Glycoside

Là những hợp chất hữu cơ có cấu tạo phức tạp Glycoside thường được hòa tan trong dịch tế bào của cây, khi gặp điều kiện thuận lợi thì nó có thể bị các enzyme phân hủy

Khi thủy phân glycoside sẽ cho hai phần: một phần không đường và một phần gồm một hay nhiều đường, phần đường có thể là đường đơn hay đường đa, có tác dụng làm tăng sự hòa tan glycoside trong nước, còn phần không đường (gọi là aglycon hay genin) có cấu trúc hóa học rất khác nhau Tùy theo phần không đường này và tác dụng của các cây thuốc, glycoside lại chia làm nhiều chất khác nhau Có thể kể đến một số glycoside chính sau đây: (Đỗ Tất Lợi, 2004)

1.2.4.2 Saponin

a Khái niệm: Là những glycoside có tính chất gây bọt, phá huyết Những vị thuốc

có chất saponin khi tán nhỏ, lắc với một ít nước thì sẽ gây rất nhiều bọt như bọt xà phòng trong ống thí nghiệm Bọt này rất lâu mới tan

b Vai trò

- Tác dụng bổ, tăng cường sinh lực (saponin có trong họ nhân sâm)

- Tác dụng long đờm, dịu ho (có trong cam thảo, viễn chí)

- Giảm đau nhức khớp xương (có trong ngưu tất, cỏ xước)

1.2.4.3 Glycoside tim

a Khái niệm: Là các glycoside thực vật, có ảnh hưởng kích thích tim và thường có độc tính cao Có đặc điểm là những kết tinh, không màu, có vị đắng Tan trong các dung môi phân cực Dễ bị thủy phân trong môi trường acid

1.2.4.4Anthraquinone glycoside

a Khái niệm: thường có màu từ vàng, cam tới đỏ Gắn vào nhân thường có các nhóm chức -OH, -OCH3, -CH3, -COOH Tuỳ theo vị trí các nhóm chức gắn vào nhân mà có các dẫn xuất khác nhau

b Vai trò: một số nghiên cứu cho thấy các dẫn chất anthraquinone có tác dụng kích thích miễn dịch chống ung thư

1.2.4.5 Flavonoid và anthoxyanosid

a Khái niệm: là những chất glycoside có màu sắc Flavonoid là những sắc tố màu vàng có trong thực vật, còn anthoxyanosid là những sắc tố cùng loại, có thể là màu xanh, tím, đỏ hoặc không màu củng được xếp vào nhóm flavonoid Có đặc điểm là trong thực vật, flavonoid tồn tại chủ yếu ở hai dạng: dạng tự do (aglycol) và dạng liên kết với glucide (glycoside) Trong đó, dạng aglycol thưòng tan trong các dung môi hữu cơ như este, aceton, cồn nhưng hầu như không tan trong nước, còn dạng glycoside thì tan trong nước nhưng không tan trong các dung môi không phân cực như aceton, benzen, chloroform Những chất này có liên quan chặt chẽ với chất tannin (Nguyễn Huy Công và ctv, 2005)

b Vai trò: một chất flavon rất quý là rutin hay rutoside có trong hoa hòe có tác dụng giảm huyết áp, giúp cho cơ thể chống lại những trường hợp đứt mạch máu nhỏ khi huyết áp tăng cao Vai trò của anthoxyanosid hiện nay chưa được xác định rõ rệt

về mặt điều trị (Đỗ Tất Lợi, 2004)

1.2.4.6 Tannin

a Khái niệm: tanin được định nghĩa là những hợp chất polyphenol có trong thực vật

có vị chát được phát hiện dương tính với "thí nghiệm thuộc da" và được định lượng dựa vào mức độ hấp phụ trên bột da sống chuẩn Tannin có đặc điểm:

- Tannin thường là bột vô định hình từ màu ngả vàng cho đến màu nâu sáng, không mùi hoặc mùi rất nhẹ, vị rất chát, gây săn se niêm mạc

- Khối lượng phân tử từ 500 – 20000, điểm chảy không cố định mà thay đổi tùy cách chiết xuất, phân lập

- Tannin thường là những chất rất phân cực, dễ tan trong các dung môi phân cực như cồn, glycerin, aceton…

- Đa số không tan trong các dung môi hữu cơ

- Tủa với alkaloid, muối kim loại nặng (chì, thuỷ ngân, kẽm, sắt)

- Tạo phức tủa bền với các dun dịch của protein (albumin, gelatin…) nên có tính thuộc da, làm cho da bền, ít thấm nước, không bị trương phồng hay thối rửa

b Vai trò

Bảo vệ thực vật khỏi các loài côn trùng, tác dụng như thuốc trừ sâu Tác dụng kháng khuẩn, thường dùng làm thuốc súc miệng Công dụng chữa viêm ruột, tiêu chảy Chữa ngộ độc kim loại nặng và các alkaloid vì làm kết tủa các chất đó (Đỗ Tất Lợi, 2004)

1.2.4 Steroid

1.2.4.1 Khái niệm

Là những hợp chất thiên nhiên có bộ khung cacbon stenan gồm bốn vòng ngưng tụ với nhau, chứa các mạch bên và các nhóm chức khác nhau như: CO, -CHO, -COOH, -OH Steroid tồn tại trong động, thực vật dưới dạng glycosid hoặc liên kết với các cacbon acid amin Steroids có đặc điểm là hợp chất chất béo hữu cơ hòa tan Có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp Khi đun nóng với Se ở 36000C sẽ tạo hợp chất Hidrocacbon Diel

Là những hợp chất hóa học được tìm thấy ở khắp các chất màu của hoa quả được cấu tạo từ các tiểu đơn phân phenol Có đặc điểm là đa số được tổng hợp từ phenylalanine Ở thực vật nhóm phenolics chủ yếu được tìm thấy là caffeic acid

1.2.5.3 Vai trò

- Bảo vệ thực vật chống lại mầm bệnh và các động vật ăn cỏ

- Chất chống oxi hóa tự nhiên và tìm thấy trong táo, trà xanh

- Chống ung thư, ngăn ngừa bệnh tim và kháng viêm

- Một hợp chất phenolic khác là chlorogenic acid được biết như là chất gây ra viêm

da dị ứng ở người

1.3 Tổng quan về các hợp chất kháng khuẩn từ thực vật

1.3.1 Khái niệm

- Là các hợp chất hữu cơ có trong thực vật có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế

sự phát triển của vi khuẩn, ngăn vi khuẩn nhân lên bằng cách tác động ở mức phân

tử, hoặc tác động vào một hay nhiều giai đoạn chuyển hóa cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn hoặc tác động vào sự cân bằng lý hóa của chúng Thường có tác dụng đặc hiệu với một nồng độ rất nhỏ

- Các chất kháng khuẩn thực vật thường là các hợp chất như alkaloid, flavonoid, tannin và một số loại tinh dầu…

1.3.2 Cơ chế kháng khuẩn chung

Hình 1.7 Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất từ thiên nhiên

Cơ chế hoạt động của các hợp chất kháng khuẩn từ thiên nhiên là phá hủy màng

tế bào chất, làm mất ổn định của proton động lực (PMF), dòng điện tử, hoạt động vận chuyển và đông tụ của các tế bào

Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất chủ yếu thông qua : phá vách tế bào, làm rối loạn màng sinh chất và bất hoạt enzyme, protein … của tế bào vi khuẩn

Có nhiều hợp chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật tiêu diệt vi sinh vật thông qua phá vỡ vách tế bào

Có rất nhiều hợp chất tấn công vào màng trao đổi chất tiêu diệt vi khuẩn

+ Thành phần kỵ nước trong tinh dầu hòa tan lipid trong màng tế bào vi khuẩn làm ảnh hưởng đến cấu trúc và thay đổi tính thấm của màng tế bào vi khuẩn (Sikkema J

và ctv, 1994)

+ Một số loại tinh dầu có khả năng kích thích sự tăng trưởng của sợi nấm giả, điều

đó chứng minh rằng nó có thể hoạt động trên các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp thành phần cấu trúc vi khuẩn (Lambert và ctv, 2001)

+ Thymol có khả năng phân hủy màng tế bào của vi khuẩn Gram (-)

Proton động lực Đông tụ

Vách tế bào

Tế bào chất

Màng protein

Màng tế bào chất

Tiêu diệt vi khuẩn thông qua ngăn chặn sự bám dính của vi khuẩn và virus như: mannose specificaglutinin, chrysin…

1.3.3 Một số hợp chất kháng khuẩn và cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất kháng khuẩn trong thực vật

1.3.3.1 Alkaloid

a Cơ chế kháng khuẩn chung của alkaloid

Cơ chế kháng khuẩn alkaloid: là do khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn

Berberine có phổ kháng khuẩn rộng, ức chế được Shigella, S.aureus, Vibrio

choleare,

Có tính kháng khuẩn với nhiều vi khuẩn gram (-) , gram (+ ) và các vi khuẩn acid

b Một số alkaloid có tính kháng khuẩn điển hình

Morphine là một alkaloid được sử dụng trong y tế trong những năm đầu của thế

kỷ XIX Morphine được lấy từ cây thuốc phiện Papaver somniferum Codein và

heroin là hai dẫn xuất của morphine Diterpenoid alkaloids là một loại alkaloid

thường được lấy từ các họ cây mao lương (Ranunculaceae), chúng có đặc tính

kháng kháng khuẩn

- Solamargine

Solamargine, một glycoalkaloid có trong các cây quả mọng họ cà (Solanum

khasianum), và các alkaloid khác trong loài cây này có tác dung chống lại sự lây

nhiễm khi đã mắc phải HIV

Kháng khuẩn tốt nhất đối với 2 nhóm Giardia và Entamoeba, chúng liên quan

trực tiếp đến việc kháng khuẩn đối với các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy

- Berberine

Một đại diện quan trọng của alkaloid có trong

các cây: hoàng đằng, hoàng bá, hoàng liên…

Berberine cũng có tác dụng kháng khuẩn đối

với shigella, tụ cầu khuẩn Những năm gần đây,

một số nghiên cứu mới nhất cho thấy berberine Hình 1.8 Berberine

có tính kháng khuẩn với nhiều vi khuẩn gram dương, gram âm và các vi khuẩn axit Ngoài ra có còn chống lại một số nấm men gây bệnh và một số động vật nguyên sinh Berberine kháng khuẩn hiệu quả đối với trùng gây bệnh sốt rét

Cơ chế kháng khuẩn berberine là do khả năng gây đột biến RNA của vi khuẩn gây bệnh sốt rét, chính vì điều này mà tác dụng kháng khuẩn của Berberine khá mạnh đối với loại trùng gây bệnh này

Đặc biệt khi dùng berberine điều trị các nhiễm trùng đường ruột sẽ không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có ích ở ruột Các nghiên cứu gần đây cũng chứng minh: Khi dùng một số thuốc kháng sinh nếu phối hợp với berberine sẽ hạn chế được tác dụng phụ gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ

vi sinh vật đường ruột

1.3.3.2 Phenol đơn và acid phenolic

a Một số hợp chất phenolic có khả năng kháng khuẩn

Catechol và pyrogallol là hai hợp chất hydroxyl hóa của phenol cho thấy là có độc tính đối với vi sinh vật Cơ chế được cho là nguyên nhân dẫn đến độc tính của các hợp chất phenolic này đối với vi sinh vật bao gồm sự ức chế enzyme bởi các hợp chất oxy hóa, có thể thông qua phản ứng với nhóm sulfhydryl hoặc thông qua

sự tương tác không đặc hiệu của các chất này với protein

Hợp chất phenolic có chứa một nhánh thế mà

có carbon ở trạng thái oxy hóa thấp không chứa

oxy được xếp vào nhóm tinh dầu và thường được

xem như là chất kháng khuẩn Eugenol là đại diện

đặc trưng được tìm thấy trong dầu đinh hương

Eugenol được xem là chất kìm hãm đồng thời

chống lại cả nấm sợi và vi khuẩn

1.3.3.3 Flavonoid

a Cơ chế kháng khuẩn

Hình 1.9 Eugenol

Các flavonoid có hoạt tính kháng khuẩn do chúng có khả năng tạo phức với các protein ngoại bào và thành tế bào vi khuẩn Flavonoid càng ưa béo càng có khả năng phá vỡ màng tế bào vi sinh vật

Flavonoid có khả năng kìm hãm sự hô hấp hay phân chia của vi khuẩn khi có mặt glucose

Flavonoid ức chế transpeptidase làm cho mucopeptide – yếu tố đảm bảo cho thành tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp được

Flavonoid gắn lên màng sinh chất của vi khuẩn, làm thay đổi tính thẩm thấu chọn lọc của màng nguyên sinh chất

Ức chế tổng hợp acid nucleic của vi khuẩn

Có tác dụng vào DNA khuôn, ức chế tổng hợp RNA của vi khuẩn

b Một số hợp chất flavonoid kháng khuẩn điển hình

Trong trà xanh có catechine, catechine vô hoạt độc tố gây bệnh tả của Vibrio

cholerae, ức chế enzyme glucosyltransferase của Streptococcus mutans, ức chế hoạt

động của Shigella và một số vi khuẩn, vi nấm khác

Một số flavonoid như quercetin, hesperetin và catechine có thể chống lại virus type 1 (HSV – 1) gây bệnh mụn giộp, polyvirus type 1, virus type 3 gây bệnh khó thở ở trẻ

Galangin (3,5,7 – trihydroxylflavone) được chiết xuất từ cây thảo mộc sống

lâu năm Helichrysum aureonitens có hoạt tính chống lại vi khuẩn Gram (+) củng

như nấm sợi và virus, đặc biệt là HSV – 1 và coxsackie B type - 1

1.3.3.4 Tannin

a Cơ chế kháng khuẩn

Là những hợp chất polyphenol có trong thực vật, có vị chát được phát hiện dương tính với “thí nghiệm thuộc da” và được định lượng dựa trên mức độ hấp phụ của bột da sống chuẩn

Nhiều hoạt động sinh lý của con người, chẳng hạn như sự kích thích của thực bào các tế bào và chống nhiễm khuẩn tại nhiều cơ quan trong cơ thể được thực hiện bởi các hợp chất của tannin

Một trong những tính chất rất đặc trưng của tannin là tạo phức với các protein thông qua các liên kết không đặc hiệu như liên kết hydro và các liên kết cộng hóa trị Khi liên kết với protein chúng có thể làm mất hoạt tính của các protein chức năng Các protein này có thể là enzyme, các protein vận chuyển hay thành tế bào polypeptide…

Tannin có thể gây độc cho nấm sợi, nấm men và vi khuẩn

1.3.3.5 Các hợp chất quinone

a Cơ chế kháng khuẩn

Quinone là những vòng thơm với hai nhóm thế ketone

Chúng tồn tại khắp nơi trong tự nhiên và có phản ứng đặc trưng cao Những hợp chất này là những hợp chất màu, là nguyên nhân của những phản ứng hóa nâu ở

bề mặt cắt hoặc vết thương của rau trái và là hợp chất trung gian trong con đường tổng hợp melanine ở da người

Quinone gây sự bất hoạt và làm mất chức năng của protein do hình thành phức không phục hồi với các acid amin của vi khuẩn

Hoạt tính chống chảy máu của chúng là do sự dễ dàng bị oxy hóa của chúng

ở các mô trong cơ thể Các amino acid cũng có thể tạo thành quione khi có enzyme xúc tác, chẳng hạn như polyphenoloxydase

Ngoài ra nó còn là nguồn cung cấp các gốc tự do ổn định, quinones được biết

là có thể tạo phức không thay đổi được với các amino acid ái nhân trong protein, thường dẫn đến làm vô hoạt và mất chức năng của protein Vì lí do đó khả năng kháng khuẩn của quinone rất lớn Mục tiêu tác động lên tế bào vi sinh vật là bề mặt

tế bào, polypeptide ở thành tế bào và các enzyme trên màng Quinone cũng tạo ra chất nền không thể sử dụng được cho các vi sinh vật

b Một số hợp chất quinone kháng khuẩn điển hình

Cây óc chó có tác dụng kháng khuẩn: Candida mycoderma, B Subtills,

Hansenula anomala, Botrys cinerea… và nhiều loài nấm mốc, chữa herpes sinh

dục, trị ho, viêm phế quản

Cây bạch hoa xà: S.aureus, Streptococus pyogenes, Pneumococus, E coli…

Có tác dụng chữa các bệnh ngoài da, những vết loét, vết thương

Một số loài thuộc họ Gọng vó có thể kháng Mycobacterium tuberculosis Tác

dụng chữa ho, chống co thắt

Cây lá móng kháng nhóm vi khuẩn: Staphylococus, Streptococus, Brucella

và Salmonella…có tác dụng chữa lở loét, hắc lào, ho, viêm khí quản

1.3.3.6 Terpenoid và tinh dầu

a Cơ chế kháng khuẩn

Terpen: chất chuyển hóa thứ cấp dựa trên đơn vị isopren

Khi các hợp chất có chứa các thành phần bố sung, thường oxi, nó được gọi là terpenoid

Tinh dầu thuộc nhóm chất izoprenoid, là sản phẩm trao đổi chất bậc hai

Về bản chất hóa học tinh dầu thường là hỗn hợp các chức khác nhau: hydrocarbon, rượu, phenol, aldehyde, acid, este, Tuy nhiên quan trọng và thường gặp hơn cả trong hợp phần của tinh dầu là terpen và các dẫn xuất chứa oxy của terpen

Cơ chế tác động của terpen chưa được khẳng định rõ ràng, nhưng được suy đoán là liên quan đến sự phá vỡ màng tế bào bởi các hợp chất lipophilic

b Một số terpenoid và tinh dầu có tính kháng khuẩn điển hình

Cây thanh hao hoa vàng: Artemisin là một secquiterpen chiết xuất từ cây

thanh hao hoa vàng (Artemisia annua) có hoạt tính kháng sốt rét mạnh, hoạt chất

này đã được nghiên cứu và phân lập từ những năm 70

Tinh dầu từ các loài sả - Andropogon spp có tác dụng kháng khuẩn chủ yếu

lên vi khuẩn Gram âm Tác dụng của tinh dầu sả tỉ lệ với hàm lượng citral

Tinh dầu từ cây bạch đàn – Eucalyptus globulus có tác dụng lên Bacillus

subtilis và Staphylococcus aureus nhưng kém tác dụng với E.coli Cineol trong tinh

dầu là thành phần có tác dụng

Menthol có trong tinh dầu bạc hà có tác dụng chọn lọc trên một số chủng

Brucella

1.3.3.7 Saponin

Là nguyên liệu đầu tổng hợp các hormone steroid Chủ yếu là kháng dầu và kháng nấm

a Cơ chế kháng khuẩn của saponin:

Saponin, chủ yếu là asiaticoside có tác dụng lên Mycobacterium leprae, do

asiaticoside làm tan màng sáp của vi khuẩn

Nhiều saponin thuộc nhóm spirostan, nhóm spirosolan, solanidan và olean đã được nghiên cứu, có tác dụng chủ yếu là kháng nấm

b Một số saponin có khả năng kháng khuẩn điển hình

Tomatin có trong cây cà chua nhiều nhất ở lá: hạt không có Tomatin ức chế nhiều loại nấm gây bệnh ở người Tomatin còn ức chế nấm gây bệnh cà chua –

Fusarium oxysporum f lycopersici, một số nấm mốc khác như Aspergillus niger,

Penicillium notatum và một số vi khuẩn: Staph aureus, Bacillus cerus, B mycoides, B subtilis, E coli

Parillin có tác dụng kháng Candida albicans, Trichoderma mentagrophytes, Aspergillus niger

Cyclamin, Primulasaponin (nhóm olean) ngoài tác dụng kháng nấm còn có

tác dụng lên vi khuẩn Staph aureus, E coli

Một số saponin còn có tác dụng ức chế virus cúm type A trên thực nghiệm Saponin của cam thảo có tác dụng mạnh nhất

1.2.4 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới và tại Việt Nam

1.2.4.1 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn của thực vật trên thế giới

- Năm 1858, nhà bác học Pháp Louis Pasteur đã chứng minh được công dụng diệt khuẩn của tỏi Năm 1944, nhà hóa học Chester J Cavallito đã phân tích được hợp

Hình 1.10 Cấu trúc hóa học saponin

Brazil năm 1982 đã chứng minh nước tinh chất từ tỏi có thể chữa được nhiều bệnh nhiễm độc bao tử, do thức ăn có lẫn vi khuẩn, nhất là loại Salmonella (Nguyễn Thị Vân Thái, 2003)

- Vào năm 1967, Binz đã chứng minh được quinin rất độc với Paramecium Quinin

ở nồng độ 1/20000 làm suy yếu hoạt lực của Paramecium để điều trị các bệnh do Paramecium gây ra (Nguyễn Thị Vân Thái, 2003)

- Năm 1928, B P Tokin đã chứng minh nhiều chất bay hơi từ cây xanh có tác dụng đối với vi khuẩn được gọi là Phytocid Gries (1943), Largralge (1956) chiết xuất từ

cây Hồ Đào (Juglals ligra – Juglandaceae) được chất Juglon, đây là một dẫn xuất

Natoquinon, chất này có tác dụng với nhiều loại nấm và vi khuẩn nha bào Năm

1959 Horak, Santavi chiết xuất từ cây Cannabit sativa thuộc họ Cannabinnaceae

được chất Cannabiriolic có tác dụng với vi khuẩn lao ở người và một số vi khuẩn Gram (+), đặc biệt là vi khuẩn kháng lại Penicilin (Nguyễn Thị Vân Thái, 2003)

- Năm 1997 tại Thái Lan, Satapon Direkbusarakom và cộng sự đã thử nghiệm thành

công khả năng kháng khuẩn của các loài cây thảo dược như: O.sanctum, C.alata,

Tinospora cordifolia, Eclipa alba, Tinospora cripspa, Psidium guajava, Clinacanhus nutans, Andrographic panniculata, Momordica charatina, Phyllanthus reticulates, P.pulcher, P.acidus, P.debelis, P.amarus, và P.urinaria đối với Vibrio spp Tuy nhiên, chỉ có hai cây Momordica charatina và Psidium guajava có hiệu

quả ức chế đối với Vibrio spp (Nguyễn Thị Vân Thái, 2003)

- Năm 2007, J.R Soberón và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt chất kháng khuẩn của

chiết xuất từ 12 cây vùng Argentina và chiết xuất Tripodanthus acutifolius có khả

năng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn (Soberón J.R và ctv, 2007)

- Năm 2011, Firdaus Jahan và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt động kháng khuẩn của

chiết xuất từ lá của cây Syzygium cumini (Jamun), Lawsonia inermis (Mehndi),

Zizyphus mauritiana (Ber), Ocimum sanctum (Tulsi) and Ficus religiosa (Peepal)

chống lại chủng Staphylococcus aureus (Firdaus Jahan và ctv, 2011)

- Năm 2011, Naveed Ahmad và cộng sự đã nghiên cứu về sự chống oxi hóa và

kháng khuẩn của chiết xuất từ lá và hoa của cây Calotropis procera bằng nhiều loại

dung môi khác nhau (Võ Văn Chi, 2000)

1.2.4.2 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn từ thực vật ở Việt Nam

- Năm 1959, Phạm Văn Ngữ đã tiến hành nghiên cứu trên 500 cây thuốc có tác dụng kháng khuẩn mạnh Năm 1959, Nguyễn Văn Hưởng cùng cộng sự đưa ra chế phẩm Tô Mộc trị tiêu chảy sau khi nghiên cứu trên 1000 cây thuốc về tính kháng khuẩn (Võ Văn Chi, 1997, 2000)

- Năm 2012, Trần Ngọc Hùng và Trương Thị Thành Vinh đã nghiên cứu bước đầu trong điều kiện phòng thí nghiệm cho thấy dịch ép nguyên chất từ cây cỏ mực

(Eclipta prostrata L) có tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn Streptococus spp (Đỗ

Tấn Lợi, 1968)

- Qua 20 năm nghiên cứu theo dõi trên động vật và người (1987 - 2007) tập thể của các cán bộ khoa học của Học Viện Quân Y, Viện Lão Khoa, Viện Quân Y 103, Bệnh Viện Lao Và Bệnh Phổi TW, Bệnh Viện Xanh Pôn, Bệnh Viện U Bướu Hà Nội, đã chiết xuất thành công Cao toàn phần của loài Azolla microphylla có tên là

Phylamin được thương mại hóa dưới tên “Mediphylamin”

- Năm 2011, Nguyễn Thị Thu Hương đã nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn của

cao chiết từ tỏi (Allium Sativum) đối với một số vi khuẩn gây bệnh ở người (Nguyễn

Thị Thu Hương, 2011)

1.4 Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration _MIC)

1.4.1 Khái niệm, ý nghĩa MIC

1.4.1.1 Khái niệm

Nồng độ ức chế tối thiểu (minimum inhibitory concentration - MIC) là nồng độ thấp nhất của chất kháng khuẩn có khả năng ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật sau khoảng 24 giờ nuôi cấy (Andrews, 2011)

1.4.1.2 Ý nghĩa

Nồng độ ức chế tối thiểu rất quan trọng trong việc xác nhận sự đề kháng của vi

nhân kháng khuẩn mới MIC thường được coi là các đo lường trong phòng thí nghiệm cơ bản nhất của các hoạt động của một tác nhân kháng khuẩn chống lại một chủng vi sinh vật

Nồng độ ức chế tối thiểu về mặt lâm sàng được sử dụng không chỉ để xác định lượng thuốc mà bệnh nhân sẽ nhận được, do đó hạn chế khả năng kháng thuốc của

vi khuẩn

Chỉ số MIC có tác dụng là tiêu chuẩn so sánh để lựa chọn chất diệt khuẩn phù hợp với từng loại vi sinh vật Việc loại trừ sạch vi khuẩn có thể dự đoán dựa vào dữ liệu MIC Chọn được nồng độ tối ưu để làm chậm sự phát triển của vi khuẩn kháng thuốc

1.4.3 Sơ lược về một số phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

Các phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu được phân loại thành 3 nhóm chính: khuếch tán, pha loãng và phương pháp bioautographic

1.4.3.1 Phương pháp khuếch tán trên thạch (agar-diffusion methods)

Trong kỹ thuật khuếch tán, một giếng chứa các hợp chất thử nghiệm ở một nồng độ nhất định được đưa vào tiếp xúc với một môi trường đã cấy vi sinh vật và đường kính ức chế xuất hiện xung quanh các giếng chứa được đo tại đầu và cuối trong thời gian ủ vi sinh vật Ở phương pháp này, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được định nghĩa là nồng độ thấp nhất có thể ngăn cản sự phát triển của vi sinh vật

có thể nhìn thấy Các phương pháp được sử dụng phổ biến như phương pháp đĩa giấy khuếch tán hoặc khuếch tán qua giếng thạch

Phương pháp khuếch tán không thích hợp để thực hiện trên mẫu không phân cực hoặc các mẫu không thể khuếch tán vào môi trường thạch (Paul Cos và ctv, 2006)

1.4.3.2 Phương pháp pha loãng (dilution methods)

Trong phương pháp pha loãng, các hợp chất thử nghiệm được thêm vào môi trường thích hợp đã được bổ sung vi sinh vật Phương pháp thường được sử dụng phổ biến là pha loãng trong môi trường lỏng, so độ đục và dựa vào chất oxi hóa khử Độ đục có thể được ước tính một cách trực quan hoặc xác định chính xác hơn bằng cách đo mật độ quang ở 405 nm Tuy nhiên, không phải mẫu thử nghiệm nào củng hòa tan hoàn toàn vào môi trường, nên sẽ gây ảnh hưởng đến độ đục, vì vậy cần phải thực hiện đối chứng âm và dương để so sánh với kết quả thí nghiệm

Hiện nay các chất oxi hóa khử MTT và resazurin thường được sử dụng để xác định số lượng vi khuẩn (Eloff, 1998; Gabrielson và ctv, 2002) và phát triển của nấm (Jahn và ctv, 1995; Pelloux-Prayeret và ctv, 1998) Resazurin có lợi thế không kết tủa khi cho vào môi trường, cho phép đọc trực tiếp, dễ thực hiện

Phương pháp pha loãng phương pháp pha loãng thích hợp cho khảo nghiệm chiết xuất hoặc hợp chất phân cực và không phân cực để xác định giá trị MIC và MBC/MFC (Paul Cos và ctv, 2006)

1.4.4 Một số kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trên thực vật

1.4.4.1 Tình hình nghiên cứu MIC trên thế giới

Năm 2005, Mullika đã tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối

thiểu của 19 loại thảo dược lên hai loài vi khuẩn Probionibacterium acnes và

Staphylococcus epidermidis bằng phương pháp thạch Kết quả cho thấy 13 loại

thuốc thảo dược có ảnh hưởng đến sự phát triển của hai loài vi khuẩn trên môi trường thạch Trong đó, Garcinia mangostana là thuốc có tác dụng mạnh nhất, với giá trị MIC nhỏ nhất (39 ppm) Điều đặc biệt là giá trị MIC của thảo dược này trên

cả hai loài vi khuẩn thì bằng nhau (Mullika và ctv, 2005)

Năm 2007, Kumar cũng tiến hành thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của thảo dược lên hai loài vi khuẩn Probionibacterium acnes và

Staphylococcus epidermidis, với 12 loại thuốc thảo dược hemidesmus indicus, eclipta alba, coscinium fenestratum, curcubito pepo, tephrosia purpurea, mentha

cordyfolia, thespesia populnea, jasminum officinale Qua phương pháp thạch có 7

loại thuốc cho kết quả ức chế sự phát triển của hai loài vi khuẩn này trên môi trường thạch Và qua phương pháp pha loãng xác định được nồng độ ức chế của Coscinium

fenestratum trên hai loài vi khuẩn này bằng nhau và nhỏ nhất Giá trị MIC trên hai

loài vi khuẩn là 49ppm (Kumar và ctv, 2007)

Chiết suất methanol và acetone từ nhiều cây nấm có tác dụng trên vi khuẩn

baccilus cereus, Staphylococcus aureus, listeria monocitogenes, Escherichia coli, salmonella infantis Qua phương pháp pha loãng xác định được khoảng giá trị MIC

của các chiết suất này từ165 – 2640 mg/ml B.cereus nhạy với hầu hết các chiết suất

từ cinnamomumcassia, azadirachta indica, ruta graveolén, rumex nervosus với khoảng MIC từ 165 – 660 mg/ml Chiết suất từ Cinnamomum cassia chỉ có hiệu quả trên vi khuẩn E.coli, S infantis ở giá trị MIC cao nhất (2640 mg/ml) (Mohan

& ctv, 2004)

Năm 2005, thí nghiệm kiểm tra tác dụng của ethyl acetate và n-butanol chiết

suất từ vỏ quả Punica granatum lên E coli O157:H7, E coli O26:H11, E coli O111:NM và E.coli O22 bằng phương pháp thạch Xác định được giá trị MIC của

cả hai chiết suất này lên E coli O157:H7 là nhỏ nhất (50 ppm) Giá trị MIC của ethyl acetate chiết suất từ Centaurealên vi khuẩn Staphylococcus aureus là 62,5

ppm, thấp hơn so với giá trị MIC của chloramphenicol (125 ppm), nghĩa là ethyl

acetate có tác dụng mạnh hơn chloramphenicol lên vi khuẩn Staphylococcus aureus

(Kiymet & ctv, 2005)

CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp HCM

2.1.2 Địa điểm thu mẫu

Nguồn mẫu được thu tại Vườn quốc gia Bidoup – Núi Bà, tỉnh Lâm Đồng

2.1.3 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 5/2015 đến tháng 8/2015

2.2.Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Toàn bộ mẫu cây Medinilla sp gồm lá, thân, cành

2.2.2 Vi khuẩn chỉ thị

Vi khuẩn chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu là 16 chủng vi khuẩn được cung cấp bởi Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh – Khoa sinh học bao gồm:

- Nhóm vi khuẩn Salmonella spp gồm S enteritidis, S typhii, S typhimurium,

S dublin

- Nhóm vi khuẩn Escherichia coli gồm E coli, ETEC, E coli 0208, E coli O157:H7

- Nhóm vi khuẩn Shigella spp gồm Shi sonnei, Shi boydii, Shi flexneri

- Các vi khuẩn gây bệnh khác: L monocytogenes, L innocua, Enterococcus

feacalis, Staphylococcus aureus

Và nhóm vi khuẩn Vibiro: V parahaemolyticus, V alginolyticus, V Harveyi

V cholerae được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II

2.2.3 Môi trường

2.2.3.1 Hóa chất

Resazurin

Môi trường TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Ðộ)

Môi trường TSA (Trypticase Soya Agar) (HiMedia - Ấn Ðộ)

DMSO – Dimethyl Sulfoxide

Ðũa thuỷ tinh Các loại đầu típ Micropipette 100 µl, 1000 µl Các loại dụng cụ khác như: bao chịu nhiệt, kéo, giấy giói, kẹp gấp,

muỗng, dao, thun,

b Thiết bị

Autoclave (Huxky Ðài Loan)

Tủ ấm 300

C, 370C (Memmert Đức)

Máy ly tâm (Tuttligen Đức)

Máy đo pH (Hach – Đức)

Máy đo UV – VIS (Hach) Cân phân tích (Orbital Đức) Bếp từ (Billy – Anh)

Máy nước cất (Branstead USA)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu và tách chiết các hợp chất từ thực vật

Mục đích: Tách chiết các hợp chất có khả năng kháng khuẩn từ thực vật nhằm phục vụ cho các nghiên cứu về sau

Nguyên tắc: Sử dụng các loại dụng môi để tách chiết các hợp chất có trong cây thuốc nhờ lực liên kết hóa học nhờ đó ta có thể lôi kéo các chất cần thiết ra khỏi mẫu cây thuốc

Phương pháp: Mẫu cây thuốc tươi được rửa sạch để lại bỏ bụi bẩn rồi đem đi phơi khô rồi nghiền thành dạng bột Bột cây thuốc sẽ được ngâm với dung môi trong 24 giờ để trích ly hợp chất, sau đó lọc lấy dịch lọc Bã đem ngâm lại với dung môi, lặp lại từ 3 đến 5 lần cho đến khi dịch lọc trong Dịch lọc sẽ được loại bỏ dung môi để giữ lại phần cao chiết bằng cách cô quay chân không ở nhiệt độ nhỏ hơn

500C hoặc cô cách thủy ở nhiệt độ 700C Cao chiết thu được sẽ được bảo quản ở nhiệt độ -40C (Atta và Mouneir, 2004)

2.3.2 Phương pháp tăng sinh vi sinh vật chỉ thị

Mục đích: Hoạt hoá các vi khuẩn có sẵn trong mẫu phát triển lại bình thường

vì chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản Đây cũng là bước đầu giúp thu sinh khối vi khuẩn nhằm phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo

Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp Môi trường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hoá lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường

Phương pháp: Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và các giống vi khuẩn chỉ thị được giữ trên môi trường TSA hay trong glycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trường TSB Sau đó tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy (Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013)

2.3.3 Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật

2.3.3.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật

Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển Sau đó các chủng này được chuyển vào tủ mát (3 – 50C) để bảo quản Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết Tuỳ từng nhóm vi sinh