Đồ án tốt nghiệp: Ứng dụng của chitosan sản xuất từ chitin thu hồi bằng phương pháp lên men lactic

Đồ án tốt nghiệp: Ứng dụng của chitosan sản xuất từ chitin thu hồi bằng phương pháp lên men lactic được thực hiện với mục tiêu nhằm ứng dụng chitosan sản xuất từ chitin thu hồi chitin – chitosan bằng phương pháp lên men lactic với nguồn đường rỉ đường. Mời các bạn cùng tham khảo.

ĐỒ ÁN/ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG CHITOSAN SẢN XUẤT TỪ CHITIN THU HỒI BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN LACTIC

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Thanh Nhật

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan nội dung bài đồ án tốt nghiệp là do tự bản thân thực hiện Các thông tin thứ cấp sử dụng trong luận án là có nguồn gốc và trích dẫn rõ ràng, không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, các số liệu trích dẫn trong bài là trung thực Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp được hoàn thành tại trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM Để hoàn thành bài đồ án tốt nghiệp này, trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn đến Quý Thầy Cô giảng dạy tại khoa Công Nghệ Sinh Học – Môi Trường – Thực Phẩm đã tận tình chỉ dạy và truyền đạt cho tôi những kiến thức và những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Đặc biệt, tôi xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới Cô Nguyễn Hoài Hương, người đã tận tình hướng dẫn, động viên và truyền đạt cho tôi những kiến thức chuyên nghành trong suốt thời gian nghiên cứu thực hiện đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô Tuyến công tác tại Viện Sinh học Nhiệt Đới, và Cô Ngọc Yên trường Đại học Bách Khoa TpHCM đã cung cấp cho tôi mẫu chitosan thương mại, bạn Vân Hương, Tuyết Mai lớp 11DSH05 đã cung cấp chủng

nấm Aspergillus flavus CĐP1 để tôi có thể thực hiện đồ án này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy Thành, thầy Dũng đã hỗ trợ về thiết bị hóa chất, vật

tư giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp này Xin cảm ơn sự giúp đỡ rất nhiệt tình của các cộng sự, cảm ơn đến những người bạn đã động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đồ án này

Sau cùng, tôi xin kính chúc quý Thầy Cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học – Môi Trường – Thực Phẩm thật nhiều sức khỏe, niềm tin để tiếp tục sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau Chúc các bạn dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp tương lai

Mặc dù đã cố gắng hết sức để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất Song bài

đồ án vẫn còn nhiều thiếu sót do còn hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm Vì vậy tôi mong nhận được sự đóng góp, phê bình của Quý Thầy, Cô giáo

Tôi xin chân thành cảm ơn!

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 6

1.1 Tổng quan về tôm sú 6

1.1.1 Cấu tạo của vỏ tôm 6

1.2 Tổng quan về chitin – chitosan 7

1.2.1 Lịch sử phát hiện chitin – chitosan 7

1.2.2 Cấu trúc của chitin – chitosan 9

1.2.3 Tính chất của chittin – chitosan 10

1.2.4 Ứng dụng của chitosan 15

1.2.5 Ứng dụng chitosan kích thích nảy mầm hạt giống 18

1.2.6 Tình hình sản xuất chitin – chitosan hiện nay 19

1.3 Tổng quan về vi khuẩn lactic 23

1.3.1 Khái niệm 23

1.3.2 Đặc tính chung 24

1.3.3 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa 25

1.3.4 Giới thiệu các nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn lactic vào lên men thu hồi chitin 29

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 31

2.1 Vật liệu nghiên cứu 31

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 31

2.1.2 Thời gian thực hiện 31

2.1.3 Vật liệu 31

2.2 Phương pháp luận 32

2.3 Phương pháp thí nghiệm 33

2.3.1 Thu thập mẫu và nguyên liệu 33

2.3.2 Xác định thông số về thành phần hóa học của nguyên liệu đầu vỏ tôm

34

2.3.3 Quy trình lên men kéo dài 35

2.3.4 Phương pháp tiến hành 37

2.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của chitosan khả năng ức chế nấm Aspergillus flavus CĐP1 trên môi trường nuôi cấy PDA 45

2.3.6 Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên khả năng kích hoạt sự ra rễ hạt đậu nành, hạt đậu phộng ở các nồng độ tương ứng 46

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48

3.1 Xác định thành phần hóa học của nguyên liệu vỏ tôm 48

3.2 Thông số hóa học sau quá trình lên men lactic thu hồi chitin với tỉ lệ rỉ đường 20% 49

3.3 Hiệu quả khử khoáng và khử protein của quá trình lên men lactic với tỉ lệ rỉ đường 20 %, mật độ giống 3,16 x 10 6 cfu/ ml, 10 ngày 50

3.4 So sánh một số đặc tính, tính chất vật lý chitosan từ chitin theo phương pháp lên men lactic và chitosan thương phẩm 51

3.5 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chitosan lên hoạt tính kháng nấm Aspergillus flavus CĐP1 53

3.6 Khảo sát ảnh hưởng của chitosan lên khả năng kích hoạt nảy mầm hạt đậu tương 58

Kết luận 69

Kiến nghị 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ATP: Adenosine triphosphate

Ctv : cộng tác viên

LAB : Lactic Acid Bacteria

NSC : ngày sau cấy

PDA : Potato dextrose agar

UV: Ultraviolet

DD: dung dịch

DANH MỤC BẢNG

2 3.1 Thành phần hóa học nguyên liệu vỏ tôm 48

3 3.2 Các thông số hóa học sau quá trình lên men lactic thu hồi

chitin của chủng L5 vởi tỉ lệ rỉ đường 20% 49

4 3.3

Hiệu quả khử khoáng của quá trình lên men lactic chủng L5, tỉ lệ rỉ đường 20%, mật độ giống 3,16x 106 cfu/ml, 10 ngày

50

5 3.4

Hiệu quả khử protein (%) của quá trình lên men lactic chủng L5, tỉ lệ rỉ đường 20%, mật độ giống 3,16 x 106cfu/ml, 10 ngày

58

9 3.8

Ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt của hạt giống đối với mẫu chitosan thương phẩm 1

61

10 3.9

Ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt của hạt giống đối với mẫu chitosan thương phẩm 2

63

11 3.10 So sánh nồng độ chitosan 2,0g/l giữa mẫu chitosan lên men 65

và mẫu chitosan thương phẩm lên tỷ lệ nảy mầm, chiều dài

rễ, khối lượng hạt của hạt đậu tương

DANH MỤC HÌNH

3 1.3 Quy trình tổng quát thu nhận chitin và sản xuất chitosan từ

4 1.4

Quy trình sản xuất chitin, chitosan từ nguyên liệu vỏ đầu tôm bằng phương pháp thuần túy hóa học của Robert, đại học Nottingham Trent ( 1998)

21

5 1.5 Quy trình lên men vỏ tôm thu nhận chitin của Bhaskar, viện

nghiên cứu công nghệ thực phẩm Ấn Độ, 2010 22

7 2.1 Sơ đồ xử lý vỏ tôm trước khi thí nghiệm 33

8 2.2 Sơ đồ tóm tắt thí nghiệm xác định thành phần trong nguyên

9 2.3 Quy trình lên men bằng phương pháp lên men lactic sử

10 2.4 Sơ đồ thí nghiệm kích hoạt nảy mầm của hạt đậu nành, hạt

đậu phộng của dung dịch chitosan ở các nồng độ 47

11 3.1 Kết quả thu hồi chitin – chitosan từ vỏ tôm bằng phương

pháp lên men lactic sử dụng rỉ đường 52

12 3.2

Kết quả tản nấm Aspergillus flavus trên môi trường PDA

có bổ sung chitosan sau 7 ngày ủ có chitosan tại pH =5,5 của mẫu chitosan lên men lactic

54

13 3.3

Kết quả tản nấm Aspergillus flavus trên môi trường PDA

có bổ sung chitosan sau 7 ngày ủ có chitosan tại pH =5,5 của mẫu chitosan thương phẩm 1

55

14 3.4

Kết quả tản nấm Aspergillus flavus trên môi trường PDA

có bổ sung chitosan sau 7 ngày ủ có chitosan tại pH =5,5 của mẫu chitosan thương phẩm 2

56

15 3.5

Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt của hạt giống đậu tương đối với mẫu chitosan lên men lactic

59

16 3.6 Ảnh hưởng của chitosan đến kích thích nảy mầm của hạt

giống đậu tương đối với mẫu chitosan lên men lactic 59

17 3.7

Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt của hạt giống đậu tương đối với mẫu chitosan thương phẩm 1

61

18 3.8 Ảnh hưởng của chitosan đến chiều dài rễcủa hạt giống đậu

tương đối với mẫu chitosan thương phẩm 1 62

19 3.9

Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của chitosan đến tỷ lệ nảy mầm, chiều dài rễ, khối lượng hạt của hạt giống đậu tương đối với mẫu chitosan thương phẩm 2

63

20 3.10 Ảnh hưởng của chitosan đến chiều dài rễ của hạt giống đậu

tương đối với mẫu chitosan thương phẩm 2 64

21 3.11

Ảnh huởng của chitosan mẫu lên men lactic tới khả năng kích hoạt nảy mầm hạt đậu phộng của mẫu chitosan lên men lactic

67

22 3.12 Ảnh huởng của chitosan mẫu lên men lactic tới khả năng

kích hoạt nảy mầm hạt đậu phộng của mẫu chitosan thương

68

phẩm 1

23 3.13

Ảnh huởng của chitosan mẫu lên men lactic tới khả năng kích hoạt nảy mầm hạt đậu phộng của mẫu chitosan thương phẩm 2

69

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Nước ta có nguồn thủy sản dồi dào, lượng vỏ giáp xác phế liệu hàng năm rất lớn (năm 2005 là 70.000 tấn) trong đó có vỏ tôm

Tôm là mặt hàng chủ lực của thủy sản Việt Nam, chủ yếu là tôm đông lạnh Theo báo cáo của bộ thủy sản, sản lượng tôm năm 2012 cả nước có 1,529 cơ sở sản xuất tôm sú giống, sản xuất được hơn 37 tỷ con giống và có 185 cơ sở sản xuất tôm chân trắng giống, sản xuất được gần 30 tỷ giống Hiện nay có 30 tỉnh/thành nuôi tôm nước lợ, đã thả nuôi 657,523 ha; đạt sản lượng 476,424 tấn Trong đó diện tích nuôi tôm sú chiếm 94,1% và 67,2% sản lượng Tương ứng với sản lượng tôm hằng năm sẽ có khối lượng phế liệu khổng lồ gồm đầu và vỏ tôm thải ra môi trường Hiện nay ở nước ta nguồn phế liệu đầu và vỏ tôm chưa được tận dụng trên quy mô lớn, chủ yếu là làm thức ăn gia súc hay thải ra môi trường gây ô nhiễm tình trạng trên đặt ra yêu cầu cấp bách là nghiên cứu sử dụng hợp lý và hiệu quả lượng phế liệu để sản xuất ra sản phẩm có giá trị cao Trên thế giới có nhiều nghiên cứu tái

sử dụng vỏ tôm như làm thức ăn gia súc, gia cầm và đặc biệt là thu nhận các hợp chất quý trong vỏ tôm như chitin carotenoid

Hiện nay chitin - chitosan và các sản phẩm nhận được từ chitin – chitosan được ứng dụng rộng rãi trên nhiều lĩnh vực của đời sống như y học, nông nghiệp, bảo vệ môi trường đặc biệt là trong y học chitin - chitosan được coi là polymer dược phẩm

Chitosan có nhiều ứng dụng trong các nghành công, nông nghiệp, y dược và bảo vệ môi trường Trong y dược, từ chitosan vỏ tôm cua có thể sản xuất glucosamine, một dược chất quý đang phải nhập khẩu ở nước ta Ngoài ra còn sản xuất các loại dược liệu khác như: da nhân tạo, chỉ phẫu thuật tự hoại… cũng được nghiên cứu sản xuất từ chitin – chitosan Chitosan còn được dùng sản xuất kem chống khô da, kem dưỡng da ngăn chặn tia cực tím phá hoại da Trong công

nghiệp, từ chitosan có thể chế tạo ra nhiều sản phẩm có giá trị công nghiệp như: vải col dùng cho may mặc, vải chịu nhiệt, chống thấm… Chitosan làm tăng độ bền của giấy, tăng cường độ bám dính của mực in Chitosan được sử dụng trong sản xuất sơn chống mốc và chống thấm Trong nông nghiệp, chitosan được sử dụng để bảo quản quả, hạt mang lại hiệu quả cao Trong công nghệ môi trường hiện nay chitosan được sử dụng để xử lý nước thải công nghiệp rất hiệu quả như xử lý nước thải trong công nghiệp nhuộm vải, xử lý nước trong công nghiệp nuôi tôm, cá Đặc biệt từ chitosan có thể sản xuất ra màng mỏng để bao gói thực phẩm, màng này có thể thay cho PE, màng chitosan có thể tự phân hủy trong môi trường tự nhiên nên vấn đề này rất có ý nghĩa quan trọng trong xử lý nước thải và bảo vệ môi trường Trong công nghệ sinh học, chitosan dùng làm chất mang cố định enzyme và cố định tế bào…

Từ khả năng ứng dụng rộng rãi của chitin - chitosan như đã nói trên mà nhiều nước nghiên cứu sản xuất ra sản phẩm này, trong khi đó sản phẩm này đang phải nhập khẩu ở nước ta

Các quy trình sản xuất chitin – chitosan trước đây là quy trình xử lý vỏ tôm bằng phương pháp hóa học dùng nhiều hóa chất gây ô nhiễm môi trường Nhưng hiện nay bên cạnh quy trình hóa học xuất hiện quy trình sản xuất chitin – chitosan bằng sinh học dựa trên vi khuẩn lactic, cho hiệu quả cao, thân thiện với môi trường Quy trình ứng dụng công nghệ sinh học vào sản xuất chitin – chitosan đã được bắt đầu chú ý ở Việt Nam

Năm 2008 – 2014 đề tài nghiên cứu “ Hoàn thiện quy trình thu hồi chitin – chitosan từ vỏ tôm bằng lên men lactic” đã được nghiên cứu và hoàn thành tại Khoa Công Nghệ Sinh Học - Thực Phẩm - Môi Trường Trường Đại Học Công Nghệ Tp.HCM Căn cứ vào kết quả đạt được của đề tài và nhu cầu thực tiễn về khả năng ứng dụng và những hiệu quả khác mang lại của chitosan, người thực hiện đề tài quyết định thực hiện đề tài “Ứng dụng của chitosan sản xuất từ chitin thu hồi bằng phương pháp lên men lactic” trong khóa luận tốt nghiệp này

2 Tình hình nghiên cứu

Có rất nhiều công trình nghiên cứu về vấn đề này trên thế giới, đặc biệt là ở

Ấn Độ, Nhật Bản, Anh, Pháp đều tìm được điểm chung là phương pháp lên men lactic vỏ tôm sẽ thu được nguồn chitin dễ dàng tinh sạch và hiệu suất cao hơn so với phương pháp xử lý hóa học (Rao và Stevens2005; Prameela và cộng sự 2010)

Tại Trường Đại học Công Nghệ tp.HCM đã có các nghiên cứu về lên men lactic vỏ tôm từ năm 2012

Nguyễn Thị Ngọc Thu 08DSH: khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nước đối với quá trình lên men vỏ tôm bằng L acidophilus xác định tỉ lệ nước là 2,5:1 với vỏ tôm nguyên liệu và thời gian lên men 96 giờ

Lê Thị Hồng Thủy 09 DSH: “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lactic từ nem chua cho quá trình lên lactic thu hồi chitin từ vỏ đầu tôm” cho thấy vi khuẩn LAB phân lập được mang kí hiệu L5 cho kết quả lên men vỏ đầu tôm tốt nhất; khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ đường lên quá trình lên men lactic kết quả cho thấy lượng đường cho kết quả tốt nhất là 20% và không thể giảm hơn nữa; ảnh hưởng của mật

độ giống lên quá trình lên men lactic cho thấy mật độ giống cho kết quả lên men tốt nhất là 3,16x106 cfu/g

Dương Quốc Xuân 10DSH: “ Hoàn thiện quy trình thu hồi chitin – chitosan

từ vỏ tôm bằng lên men lactic đạt hiệu quả cao” Đề tài đã xác định được thời gian lên men lactic vỏ đầu tôm thu hồi chitin – chitosan cho kết quả tốt nhất là 7- 10 ngày, có thể thay thế nguồn đường glucose bằng rỉ đường sau xử lý cho hiệu quả khử khoáng và hiệu quả khử protein là triệt để

3 Mục đích nghiên cứu

Ứng dụng chitosan sản xuất từ chitin thu hồi chitin – chitosan bằng phương pháp lên men lactic với nguồn đường rỉ đường

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

Thực hiện quy trình thu hồi chitin – chitosan từ vỏ tôm bằng phương pháp lên men lactic với nguồn đường rỉ đường

Ứng dụng của chitosan : khảo sát ảnh hưởng của chitosan đến khả năng ức

chế nấm Aspergillus flavus CĐP1, khảo sát khả năng kích thích nảy mầm của chitosan lên hạt giống đậu tương và hạt giống đậu phộng

5 Phương pháp nghiên cứu

6 Các kết quả đạt được của đề tài

So sánh một số đặc tính tính chất vật lý giữa chitosan lên men lactic và chitosan thương phẩm

Khảo sát ảnh hưởng chitosan đến khả năng ức chế nấm Aspergillus flavus

7 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp

Ngoài phần mở đầu, kết luận và kiến nghị , nội dung đồ án tốt nghiệp gồm

3 chương như sau :

Chương 1: Tổng quan

Chương 2 : Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

- Lớp không bị canxi hóa

Lớp màu : tính chất của lớp này do sự có mặt của những thể hình hạt của vật chất mang màu giống dạng melanin Chúng gồm những túi khứ hoặc những không bào Một vài vùng xuất hiện những hệ thống rãnh thẳng đứng có phân nhánh,

là con đường cho canxi thẩm thấu vào

Lớp biểu bì (epcuticle): những nghiên cứu cho thấy lớp màng nhanh chóng

bị biến đổi bởi fucxxin, có điểm pH = 5,1 không chứa chitin Nó khác với các vỏ còn lại, bắt màu với anilin xanh Lớp epicuticle có lipit vì thế nó cản trở tác động của acid hơn là các lớp bên trong Màu của lớp này thường vàng rất nhạt có chứa polyphenoloxidase và bị hóa cứng bởi puinone – tannin Lớp epicuticle liên kết với một số màng mỏng bên ngoài cản trở hòa tan ngay cả trong môi trường acid đậm đặc do nó có chứa các mắt xích paratin mạch thẳng

Lớp canxi hóa: lớp này chiếm phần lớn vỏ, thường có màu xanh trải đều khắp, chitin ở trạng thái tạo phức với canxi

Lớp không bị canxi hóa: trong cùng của lớp vỏ được tạo thành bởi một phần tương đối nhỏ so với tổng chiều dày bao gồm các phức chitin – protein bền vững không có canxi và quinine

1.1.2 Thành phần hóa học của vỏ tôm

Protein : thành phần protein trong phế liệu tôm thường tồn tại ở 2 dạng : dạng tự do và dạng liên kết

Dạng tự do : dạng này là tồn tại ở phần thịt từ một số tôm bị biến đổi và vứt

đi lẫn vào phế liệu hoặc phần đầu và thịt còn sót lại trong đầu và nội tạng của tôm Nếu công nhân vặt đầu không đúng kỹ thuật thì phần protein bị tổn thất vào phế liệu nhiều làm tăng tiêu hao nguyên vật liệu, mặt khác phế liệu này khó xử lý hơn

Dạng phức tạp : ở dạng này protein không hòa tan và thường liên kết với chittin, canxicacbonat, với lipid tạo thành lipoprotein, với sắc tố tạo proteincarotenoit,… như một phần thống nhất quyết định tính bền vững của vỏ tôm

• Chitin : tồn tại dưới dạng liên kết bởi những những liên kết đồng hóa trị với các prrotein dưới dạng phức hợp chitin – protein, liên kết với các hợp chất khoáng và các hợp chất hữu cơ khác gây khó khăn cho việc tách và chiết chúng

• Canxi : trong vỏ, đầu tôm, … có chứa một lượng lớn muối vô cơ, chủ yếu là muối CaCO3, hàm lượng Ca3( PO4)2 mặc dù không nhiều nhưng trong quá trình khử khoáng dễ hình thành hợp chất CaHPO4 không tan trong HCl gây khó khăn cho quá trình khử khoáng Sắc tố trong vỏ tôm thường có nhiều loại sắc tố nhưng chủ yếu là astaxanthin

• Enzyme : Hoạt độ enzyme protesae của đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/ gam tươi Các enzyme chủ yếu là enzyme của nội tạng trong đầu tôm và của vi sinh vật thường trú trên tôm nguyên liệu

Ngoài thành phần chủ yếu kể trên, trong vỏ đầu tôm còn có các thành phần khác như : nước, lipid, photpho

1.2 Tổng quan về chitin – chitosan

1.2.1 Lịch sử phát hiện chitin – chitosan

Chitin đã được phát hiện bởi Heri braconnot vào năm 1881 Lần đầu tiên ông phân lập được chitin như một hợp chất không tan trong kiềm của một số loại

nấm Hợp chất do Braconnot phân lập được còn rất nhiều tạp chất nhưng không khẳng định đây không phải là gỗ

Đến năm 1823, Odier đã cô lập được chitin từ cánh cứng của con bọ cánh cứng và cũng phân lập được chitin khi loại khoáng vỏ cua Từ đó, Odier cho rằng đây là hợp chất cơ bản trong vỏ giáp xác côn trùng

Vào năm 1843 sự tồn tại của nitơ trong phân tử chitin đã được Lassaigne chứng minh

Năm1876, Ledderhose thủy phân vỏ tôm hùm bằng dung dịch HCl và nhận được một muối Clorua của amin 6C Ông đề nghị cấu trúc CHO.(CHOH)4.CH2NH2.HCl

Năm 1894, Winterstein phát hiện ra khi xử lý nấm với H2SO4 hay NaOH rồi thủy phân trong HCl thì đều thu được cùng loại monosaccharide và acid acetic Tuy nhiên, ông ta vẫn gọi hợp chất này là “ cellulose” Cũng trong năm này, khi đun chitin trong dung dịch KOH ở 1080C, Hope – Seyler thu được một hợp chất mới có

số nguyên tử giống như trong chitin và gọi nó là chitosan

Năm 1912, Brach và Furth nhận thấy tỉ lệ acid acetic và glucosamine là 1:1, ông gọi nó là “ polymer mono acetyl glucosamine”

Năm 1928, Meyer và Mark dựa trên phổ nhiễu xạ tia X kết luận rằng chitin

và chitosan nằm ở dạng liên kết 𝛽 ( 1 → 4) giữa các mắt xích pyranoz

Vào năm 1948, Matsusshima cũng đã có một phát minh sản xuất glucosamine từ vỏ cua

Năm 1950, người ta đã sử dụng tia X để phân tích nhằm nghiên cứu sâu hơn sự hiện diện của chitin trong nấm và trong thành tế bào

Và đến năm 1951, quyển sách đầu tiên viết về chitin được xuất bản Bấy giờ, người ta đã phát hiện tiềm năng của các polymer thiên nhiên này

Vào năm 1978, một hội nghị đầu tiên nói về chitin và chitosan diễn ra tại

Mỹ và thu hút được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới

Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hóa ứng dụng của chitosan đã được công bố từ những năm 30 của thế kỷ XX Những nước đã thành công trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitosan đó là : Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Ấn

Độ, Pháp Nhật Bản là nước đầu tiên trên thế giới năm 1973 sản xuất 20 tấn/năm, và đến nay đã lên tới 700 tấn/năm, Mỹ sản xuất trên 300 tấn/năm Theo Know ( năm 1991) thì thị trường có nhiều triển vọng của chitin, chitosan là Nhật Bản, Mỹ, Anh, Đức Nhật được coi là nước dẫn đầu về công nghệ sản xuất và buôn bán chitin, chitosan

1.2.2 Cấu trúc của chitin – chitosan

Chitin là sự kết hợp giữa liên kết 𝛽 (1 → 4) với 2 – acetamido – 2 – deoxy

- 𝛽 − 𝐷 – glucose ( N- acetylglucosamine )

Chitin thường được coi là dẫn xuất cellulose và có chứa 6,9% là N (Black và Schwartz, 1950) Nó có cấu trúc giống cellulose vì có gốc acetamide ( -NH-CO-CH3) ở vị trí C2

Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, sự khác biệt duy nhất giữa chitosan và chitin là ở vị trí C2, ở đó nhóm ( -NH2) thay thế nhóm ( -COCH3)

Chitosan là một polymer tuyến tính 𝛼 ( 1 → 4) − 2 − 𝑎𝑚𝑖𝑛𝑜 − 2 −𝑑𝑒𝑜𝑥𝑦 − 𝛽 − 𝐷 − 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑝𝑦𝑟𝑎𝑛𝑜𝑠𝑒

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của chitin

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của chitosan

1.2.3 Tính chất của chittin – chitosan

1.2.3.1 Đặc điểm và tính chất hóa lý của chitin

Chitin là một polymer sinh học rất phổ biến trong tự nhiên và đứng hàng thứ hai chỉ sau cellulose Chitin tham gia vào thành phần cấu tạo và vách tế bào nấm, cấu tạo nên bộ khung xương của tôm, cua, côn trùng, các động vật giáp xác… Trong các nguyên liệu này, chitin liên kết chặt chẽ với protein, lipid và các muối vô

cơ ( CaCO3 ) và các sắc tố màu ( astarene, astaxanthin, canthaxanthin, lutin…) Chitin là 1 polysaccharide chứa nito, trắng, cứng, không đàn hồi, không tan trong nước, trong môi trường kiềm, acid loãng và các dung môi hữu cơ như ete, rượu… Chitin hòa tan được trong dung dịch đậm đặc, nóng của muối thyoxyanat liti ( LiSCN) và muối thyoxyanat canxi ( Ca(SCN)2) tạo thành dung dịch keo Chitin ở thể rắn có độ kết tinh cao do gốc – NHCOCH3 ở vị trí cacbon thứ hai, làm tăng liên kết hydro giữa các mạch và trong mạch với nhau

Chitin ổn định với các chất oxy hóa khử như KMnO4, H2O2, NaClO hay Ca(ClO)2… có thể lợi dụng tính chất này để khử màu chitin Khi đun nóng trong môi trường kiềm đậm đặc chitin bị khử gốc acetyl tạo thành chitosan Chitin không hòa tan trong hầu hết các dung môi thông thường nên khả năng ứng dụng bị hạn chế Do đó người ta thực hiện quá trình deacetyl hóa chitosan để tạo ra sản phẩm chitosan nhằm cải thiện độ hòa tan, tăng khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực

1.2.3.2 Đặc điểm và tính chất hóa lý của chitosan

a Tính chất vật lý của chitosan

Chitosan là dẫn xuất của chitin, nó được tạo thành bởi phản ứng deacetyl chitin Khi chitin được xử lý với các chất kiềm đặc ở nhiệt độ cao 1200C trong dung dịch, nó sẽ bị loại nhóm acetyl và bị phân hủy khác nhau để cho ra sản phẩm là chitosan Vậy chitosan không phải là một chất đơn thuần mà nó là một nhóm sản phẩm của chitin bị loại nhóm acetyl từng phần ( Attila E, Pavlath và Dominic W.S.Wong, 1996)

Chitosan là sản phẩm biến tính của chitin, là một chất rắn xốp, nhẹ, hình vảy, màu trắng ngà, không mùi, không vị hay được dùng nhiều nhất trong y tế và trong thực phẩm Chitosan được khám phá bởi Roughet vào năm 1859, và nó được đặt tên

là chitosan bởi nhà khoa học người đức Hoppe Seyler vào năm 1894 Chitosan là polymer hữu cơ tự nhiên duy nhất mang điện tích dương, điều này tạo cho chitosan những thuộc tính đặc biệt nhất

Chitosan là polymer không độc, có khả năng phân hủy sinh học và có tính tương thích về mặt sinh học Trong nhiều năm qua, các polymer có nguồn gốc từ chitin, đặc biệt là chitosan đã được chú ý như một loại vật liệu mới có tính ứng dụng trong các ngành công nghiệp như dược, y học, thực phẩm, xử lý nước thải Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, trong kiềm, hoặc các dung môi hữu cơ khác nhưng hòa tan được trong dung dịch acid loãng như: acid acetic, acid formic, acid lactic, HCl, HI, HNO3… tạo thành dung dịch keo nhớt trong suốt Chitosan hòa tan trong dung dịch acid acetic 1 - 1,5% Chitosan kết hợp với aldehit trong điều kiện thích hợp để hình thành gel, đây là cơ sở để bẫy tế bào, enzyme

Chitosan hình thành muối tan được trong nước với một nhóm acid hữu cơ Những nghiên cứu về muối của chitosan và các acid aromatic carboxylic cũng cho thấy khả năng tan được trong nước như chitosan benzoate, chitosan o-amino benzoate và cũng có một số muối không tan hoặc ít tan trong nước như chitosan

phenylacetate… Còn muối của chitosan và acid formic, acid acetic tan rất tốt trong nước

Bản chất điện ly cao phân tử của chitosan trong dung dịch acid : Trong dung dịch acid, những nhóm amin của chitosan bị proton hóa và thể hiện bản chất của chất điện ly cao phân tử Trong dung dịch loãng không có mặt chất điện ly, chỉ

số độ nhớt tăng theo sự tăng nồng độ dung dịch chitosan Đây là đặc trưng của những dung dịch chất điện ly cao phân tử và là kết quả của sự tăng kích thước sợi khi pha loãng dung dịch do lực đẩy tĩnh điện giữa các đoạn mạch Lực đẩy này có thể bị khử mất nằng cách thêm một chất điện ly trọng lượng phân tử thấp có tác dụng che những phần mang điện trên mặt polymer Và đồng thời, chỉ số độ nhớt cũng giảm theo nồng độ chitosan cho trước Chitosan có khả năng tích điện dương

do đó nó có khả năng kết hợp với những chất tích điện âm như chất béo, lipid và acid mật

Chitosan là chất có độ nhớt cao Độ nhớt của chitosan phụ thuộc vào nhiều yếu tố như mức độ deacetyl hóa, khối lượng nguyên tử, nồng độ dung dịch, độ mạnh của lực ion, pH và nhiệt độ…

Mức độ deacetylation ( DDA): là độ chuyển hóa chitin thành chitosan Quá trình loại nhóm acetyl khỏi chuỗi phân tử chitin và hình thành phân tử chitosan với nhóm amin hoạt động hóa học cao Mức độ deacetylation là một đặc tính quan trọng của quá trình sản xuất chitosan bởi vì nó ảnh hưởng đến tính chất hóa lý và khả năng ứng dụng của chitosan sau này Thông thường mức độ deacetylation chitosan đạt khoảng 85 – 95 % Chitosan có mức độ deacetylation khoảng 75 % trở lên thường được gọi là chitosan Chitosan thương mại ít nhất phải có mức DDA ( degree of deacetylation ) hơn 70 % Có rất nhiều phương pháp để xác định mức

độ deacetyl hóa của chitosan bao gồm : thử ninhydrrin, chuẩn độ điện thế, quang phổ hồng ngoại, chuẩn độ bằng HI…

Khối lượng phân tử trung bình ( MW) : được xác định qua độ nhớt của

Onsoyen và Skaugrud, 1990) tùy theo từng loại chitosan Thông thường, nhiệt độ cao sự có mặt của oxy và sức kéo có thể dẫn đến phân hủy chitosan Giới hạn nhiệt

độ là 2800C, sự phân hủy do nhiệt độ có thể xảy ra và mạch polymer nhanh chóng

bị phá vỡ, do đó khối lượng phân tử giảm Nguyên nhân quá trình depolymer là sử dụng nhiệt độ cao và acid như HCl, H2SO4 dẫn đến thay đổi khối lượng phân tử

Độ nhớt là nhân tố quan trọng để xác định khối lượng phân tử của chitosan Chitosan phân tử lượng cao thường làm cho dung dịch có độ nhớt cao Một số nhân

tố trong quá trình sản xuất như mức độ deacetyl hóa, khối lượng nguyên tử, nồng độ dung dịch, độ mạnh của lực ion, pH và nhiệt độ ảnh hưởng đến sản xuất chitosan và tính chất của nó Ví dụ, độ nhớt của chitosan tăng khi thời gian khử khoáng tăng

Độ nhớt của chitosan trong dung dịch acid acetic tăng khi pH của dung dịch này giảm, tuy nhiên nó lại giảm khi pH của dung dịch HCl giảm, việc tăng này đưa đến định nghĩa về độ nhớt bên trong của chitosan, đây là một hàm phụ thuộc của mức

độ ion hóa của lực ion

b Tính chất hóa học của chitosan:

Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức –OH, -NHCOCH3 trong các mắt xích N-acetyl- D-glucosamine và nhóm-OH, nhóm – NH2 trong các mắt xích D-glucosamine có nghĩa là chúng vừa là ancol vừa là amin Phản ứng hóa học

có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế -N, hoặc các dẫn xuất thế O-, N-

Mặt khác chitosan là những polyme mà các monome được nối với nhau bởi các liên kết 𝛽 − 1 − 4 − 𝑔𝑙𝑦𝑐𝑜𝑠𝑖𝑑𝑒, các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất hóa học như acid, tác nhân oxy hóa và các enzyme thủy phân

Phản ứng thủy phân trong môi trường acid:

- Trong môi trường acid chitosan bị thủy phân nhưng mức độ thủy phân phụ thuộc vào loại acid, nồng độ acid và một số các yếu tố khác như nhiệt độ, thời gian phản ứng Những kết quả cho thấy:

- Trong môi trường H2SO4 sự thủy phân chitosan kèm theo quá trình Sulphate hóa, cho sự phân hóa ngẫu nhiên các mạch phân tử

N Trong môi trường HF, chitosan cũng bị thủy phân nhưng kém hơn chitin, tạo thành hỗn hợp các oligome sau 19h ở 200 C

- Trong môi trường acid khác như HCl, H3PO4 sự thủy phân cũng xảy

ra ở những mức khác nhau

Chitosan là một polymer mang điện tích dương nên xem làmột polycationic (pH<5), có khả năng bám dính trên bề mặt có điện tích âm như protein, aminopolysaccharide (alginate), acid béo và phospholipid nhờ sự có mặt của nhóm amino (NH2) ( Knorr, 1984; Muzzanelli, 1996)

➢Các phản ứng của nhóm –OH

- Dẫn xuất sunfat

- Dẫn xuất O - axyl của chitin/chitosan

- Dẫn xuất O - tosyl hóa chitin/chitosan

➢Phản ứng ở vị trí N

- Phản ứng N - acetyl hóa chitosan

- Dẫn xuất N - sunfat chitosan

- Chitosan phản ứng với acid đậm đặc tạo muối khó tan

Chitosan phản ứng với iot trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím Đây là phản ứng dùng trong phân tích định tính chitosan

1.2.4 Ứng dụng của chitosan

1.2.4.1 Ứng dụng trong công nghiệp

Do có tính chất vật lý và hóa học ưu việt, chitosan đang được sử dụng trong một mảng lớn các sản phẩm và ứng dụng khác nhau, từ dược phẩm, mỹ phẩm và bảo vệ thực vật

➢ Mỹ phẩm:

Thông thường, các acid hữu cơ được sử dụng làm dung môi cho các ứng dụng mỹ phẩm như aminopolysaccharide, chitosan được bao phủ trong lớp keo hydrocolloid, tuy nhiên không giống các loại keo hydrocolloid khác, chitosan tạo nhớt khi được trung hòa acid Chúng tạo điều kiện tương tác với da và tóc tốt hơn Ngoài ra chitin và chitosan diệt và kháng nấm tốt Chitosan cũng có thể hấp thụ các chất độc hại như tia UV hoặc các loại thuốc nhuộm khác do có thể dễ dàng liên kết chung với gốc amino của chitosan

Chitin và chitosan và các dẫn xuất của chúng được sử dụng trong ba lĩnh vực mỹ phẩm bao gồm:

- Tóc : dầu gội, dầu xả, thuốc nhuộm tóc, kem tạo kiểu tóc,

- Da: kem dưỡng da, sữa tắm, son môi, phấn nền, phấn mắt, mascara

- Chăm sóc răng : kem đánh răng, nước súc miệng, kẹo cao su

➢ Xử lý nước

Do tính chất polycatinic tự nhiên, chitosan được sử dụng như một tác nhân kết bong, hoặc kết tủa chất bẩn.Weltroswki và cộng sự sử dụng chitosan N_ benzyl dẫn xuất của sulphonat như các chất hấp thụ để loại bỏ ion kim loại trong môi trường acid Năm 1999, Bhavani và dutta sử dụng chúng như chất hấp thụ loại

bỏ màu từ nước thải xưởng nhuộm

Ngoài ra, chitosan còn dùng để laoị khỏi chất thải các chất như: kim loại nặng, asen, plutonium, methyl acetate – thủy ngân, acetaldehyde, kể cả dầu mỏ và dầu khí

➢ Công nghiệp giấy

Do có cấu trúc tương tự cellulose nên chitosan được nghiên cứu bổ sung vào làm nguyên liệu sản xuất giấy.Chitosan làm tăng độ bền dai của giấy, đồng thời việc in trên giấy cũng tốt hơn

Do có khả năng phân hủy sinh học nên chitin- chitosan được sử dụng trong nghành sản xuất giấy tái chế thân thiện với môi trường và bao bì thực phẩm

➢ Chế biến thực phẩm

Chitosan được sử dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm vì tính không độc đối với động vật máu nóng Các hạt tinh tinh thể chitin siêu nhỏ có tính chất nhũ hóa, làm dày và tạo gel cho thực phẩm Nó còn được sử dụng như chất xơ trong thực phẩm nướng Việc sử dụng này giải quyết các vấn đề như màu sắc, mùi vị và hạn sử dụng dài hơn các loại chất xơ Ngoài ra chitin – chitosan còn kháng vi khuẩn, kháng nấm cản trở sự hoạt động của enzyme

1.2.4.2 Ứng dụng trong nông nghiệp

➢ Chất mang trong sản xuất phân bón :

Trong nông nghiệp, việc kéo dài thời gian tác dụng của phân bón và chất điều hòa tăng trưởng hay chất dinh dưỡng là rất cần thiết Chitosan được sử dụng như chất mang tự nhiên để kết hợp và phóng thích từ các hợp chất mong muốn trong đất Chitosan bị phân hủy sinh học trong đất khoảng hai tháng, kèm theo là sự phóng thích các chất Do đó, người ta tiết kiệm được đáng kể lượng chất sử dụng và thời gian bón lặp khi sử dụng làm chất mang

➢ Ứng dụng của màng chitosan trong tồn trữ và bảo quản chất lượng rau quả tươi

Chitosan cũng có tiềm năng là một loại màng bảo quản trái cây NOCC ( N,O- Carboxymethyl chitosan) một dẫn xuất được tạo ra bởi phản ứng của chitosan với acid monochloroacetic Lớp phim được tạo ra bằng cách phun dung dịch NOCC hòa tan lên trái cây hoặc bằng cách nhúng trái cây vào trong dung dịch Kết quả tạo ra màng bán thấm, màng chitosan có thể làm giảm khí quyển bên trong tốt như việc làm giảm sự mất hơi nước thoát ra và làm trì hoãn quá trình chín của trái

➢ Ứng dụng chống vi sinh vật của chitin, chitosan

Chitosan không những ức chế các vi khuẩn gram dương, gram âm mà cả nấm men và nấm mốc Khả năng kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc một vài yếu

tố như loại chitosan sử dụng (độ deacetyl, khối lượng phân tử), pH môi trường, nhiệt độ Mặc dù chưa có một giải thích đầy đủ cho khả năng kháng khuẩn đối với các đối tượng vi sinh vật, nhưng hầu hết đều cho rằng khả năng kháng khuẩn liên quan đến mức độ hấp phụ chitosan lên bề mặt tế bào Trong đó, chitosan hấp phụ lên bề mặt vi khuẩn gram âm tốt hơn vi khuẩn gram dương Khi bổ sung chitosan vào môi trường, tế bào vi khuẩn chuyển từ tích điện âm sang tích điện dương Nhờ tác dụng của những nhóm NH3+. Trong chitosan lên các vị trí mang điện âm ở trên màng tế bào vi sinh vật, dẫn tới sự thay đổi tính thấm của màng tế bào làm cho quá trình trao đổi chất qua màng tế bào bị ảnh hưởng Chitosan cũng có tác động sinh học và thấm hút chất dinh dưỡng của vi khuẩn và có thể ức chế sự phát triển của chúng

Chitosan có thể ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn do có khả năng lấy đi các ion kim loại quan trọng như Cu2+, Co2+, Cd+ của tế bào vi khuẩn nhờ hoạt động của các nhóm amino trong chitosan có thể tác dụng với các nhóm amino của bề mặt thành tế bào Như vậy vi sinh vật sẽ bị ức chế phát triển do sự mất cân bằng liên quan đến ion quan trọng

1.2.4.3 Ứng dụng y sinh

Màng chitosan đã được đề xuất làm màng thận trong sản xuất thận nhân tạo

vì có độ thấm phù hợp và độ bền cao

➢ Mô nhân tạo

Chitosan và một số dẫn xuất đã được nghiên cứu để sử dụng trong một

số ứng dụng y sinh bao gồm băng bó vết thương và làm đầy không gian cấy ghép Chitosan được ứng dụng rộng rãi trong các kỹ thuật mô xương và hệ thần kinh trung ương, ngoài ra chúng còn được nghiên cứu để chữa sụn khớp

Chitosan đã được nghiên cứu để sản xuất chỉ may vết thương và cho thấy tốc độ chữa lành vết thương nhanh hơn bình thường

➢ Điều trị bỏng

Do chitosan có thể hình thành màng thấm nước, có khả năng tương tác sinh học Màng phim có thể hình thành trực tiếp trên vết bỏng bằng cách sử dụng dịch nước của chitosan acetate Một lợi thế nữa của chitosan là khả năng thẩm thấu oxy tốt đây là điều quan trọng để các mô bị thương không bị thiếu oxy Ngoài ra lớp màng phim chitosan có khả năng hấp thụ nước và bị phân hủy tự nhiên bởi các enzyme trong cơ thể nên không cần phẫu thuật loại bỏ

➢ Da nhân tạo

Do nhiều tính chất : tạo màu, có khả năng thẩm thấu oxy, thấm nước, diệt khuẩn, làm mau lành vết thương,… hiện nay chitosan đang được nghiên cứu để sản xuất da nhân tạo phục vụ cho y học

➢ Màng bao thuốc

Chitosan có đặc tính kháng khuẩn kháng nấm, không độc, chitosan là chất vô cùng thích hợp để sản xuất màng bao thuốc

1.2.5 Ứng dụng chitosan kích thích nảy mầm hạt giống

Chitosan được sử dụng để bọc các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt Một trong những hoạt tính sinh học quan trọng của chitosan trên thực vật đó là sự kích thích nảy mầm Trong đậu phộng hạt giống được bao lớp màng chitosan sẽ làm tăng cường khả năng nảy mầm của hạt giống ( Zhou và cộng sự, 2002 trích dẫn bởi Batool Mahdavi và Asghar Rahimi,

2013) Chitosan có thể thúc đẩy sự tăng trưởng và làm tăng năng suất đậu tương ( Dũng và Thắng, 2002)

Các nhà khoa học Nguyễn Thị Huệ, Lâm Ngọc Thụ ( Đại Học Khoa Học

Tự Nhiên, ĐHQG Hà Nội) và Nguyễn Văn Hoan ( Đại Học Nông Nghiệp 1) đã sử dụng các có hoạt tính sinh học cao từ chitin để kích thích nảy mầm những hạt lúa giống quốc gia DH 60 đã bảo quản được 19 – 21 tháng Đồng thời khi sử dụng các chất có hoạt tính sinh học này còn có khả năng kích thích cho sự sống của hạt giống cao hơn, chất lượng cây mầm tốt hơn, góp phần nâng cao giá trị gieo trồng của hạt giống

Viện Khoa học nông nghiệp Miền Nam và Trung tâm công nghệ sinh học Thủy sản cùng tham gia nghiên cứu tác dụng của chitosan lên một số loại hạt dễ mất khả năng nảy mầm và góp phần thúc đẩy tăng trưởng, phát triển cây trồng ngoài đồng Kết quả là có khả năng kéo dài thời gian sống và duy trì khả năng nảy mầm tốt của hạt giống cà chua và hạt đậu cô ve sau thời gian bảo quản 9 – 12 tháng trong điều kiện bình thường

Năm 1987, Bentech đã được cấp bằng sáng chế nhờ nghiên cứu dùng chitosan trong việc bọc nang hạt giống để ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất Trong những vùng mà cây trồng thường bị nấm tấn công vào hệ rễ, nếu hạt giống được bọc nang bằng chitosan sẽ nâng cao được hiệu suất thu hoạch lên 20 % so với không dùng chitosan

1.2.6 Tình hình sản xuất chitin – chitosan hiện nay

1.2.6.1 Tình hình sản xuất chitin-chitosan

Vỏ đầu tôm chứa 3 thành phần chủ yếu chitin, protein và khoáng chủ yếu là CaCO3 Để thu nhận chitin, phải khử khoáng và khử protein và khử màu Để được chitosan cần loại bỏ gốc acetyl Sơ đồ tổng quát công nghệ thu hồi chitin từ vỏ, đầu tôm và sản xuất chitosan được trình bày trên hình 1.3

Hình 1.3 Quy trình tổng quát thu nhận chitin và sản xuất chitosan từ vỏ đầu tôm

Ngoài ra còn có nhiều nghiên cứu khác đến từ các nước Ấn Độ, Nhật Bản, Anh, Pháp, Thái Lan

Hình 1.4 Quy trình sản xuất chitin, chitosan từ nguyên liệu vỏ đầu tôm bằng

phương pháp thuần túy hóa học của Robert, Đại học Nottingham Trent ( 1998) Nhận xét: Đây là quy trình tổng hợp từ cả quy trình sản xuất trước đó Sản phẩm chitosan được sản xuất theo quy trình này có màu sắc đẹp, các chất màu được loại bỏ sạch trong quá trình tẩy màu Hàm lượng protid và khoáng chất còn lại trong chitin thấp.Tuy nhiên, nhược điểm của quy trình này là sử dụng quá nhiều hóa chất nồng độ cao với số lượng lớn, dẫn đến tăng giá thánh sản xuất, đồng thời nếu quá trình xử lý nước thải không tốt sẽ ảnh hưởng rất lớn đến môi trường

1.2.6.2 Quy trình sản xuất chitin bằng phương pháp sinh học

Hiên nay, việc bảo vệ môi trường đang là vấn đề lớn và được nhiều người quan tâm Vì vậy, việc tìm ra một quy trình sản xuất chitin ít gây ô nhiễm đang được nghiên cứu rộng rãi trên thế giới Thay vì sử dụng các hóa chất với nồng độ cao, các nhà khoa học đang ứng dụng sinh học vào quy trình sản xuất và đã đem lại thành công trong vấn đề này

Hình 1.5 Quy trình lên men vỏ tôm thu nhận chitin của Bhaskar, viện nghiên cứu

công nghệ thực phẩm Ấn Độ, 2010 Trong phương pháp này, người ta chủ yếu dùng vi khuẩn lên men lactic để

ủ tôm Acid lactic sinh ra sẽ khử khoáng trong nguyên liệu, đồng thời ngăn không cho các vi sinh vậy gây hôi thối phát triển Đồng thời các vi sinh vật này sẽ phân

enzyme thủy phân protein từ Aspergillus oryzea để thúc đẩy hiệu suất quá trình cao hơn Ngoài ra, Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú (2007) cũng nghiên cứu và tìm được quy trình thu nhận chitin từ đầu – vỏ tôm phế liệu bằng phương pháp enzyme

sử dụng dịch ép vỏ dứa phế thải chứ proteinase bromelain và giàu các acid hữu cơ,

có tác dụng loại các chất khoáng và protein trong đầu – vỏ tôm Phương pháp này

có ưu điểm không cần aicd để loại khoáng tiêu tốn ít xút cho loại protein, hiệu quả thu hồi chitin cao ít gây ô nhiễm môi trường Tuy nhiên phương pháp này mất nhiều thời gian thực hiện quy trình thu nhận enzyme từ vỏ dứa

So sánh hiệu quả xử lý hóa học và sinh học : chất lượng chitin sản xuất bằng phương pháp hóa học có hàm lượng khoáng và protein thấp hơn nhiều so với

xử lý bằng phương pháp sinh học

Theo Bhaskar (2010) thì phương pháp sinh học cho hiệu quả khử protein là

92 % khử khoáng 78 % Theo Rao (2000), thì hiệu quả khử khoáng có thể đạt 86 %

và hiệu quả khử protein cao nhất có thể đạt 86 %

1.3 Tổng quan về vi khuẩn lactic

1.3.1 Khái niệm

Vi khuẩn lactic (LAB) là một nhóm các vi khuẩn Gram dương có một sự thống nhất về hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa và sự trao đổi chất Chẳng hạn như chúng là trực khuẩn ngắn hay que (rod) và cầu khuẩn (cocci) không hô hấp, không sinh bào tử Chúng thường được tìm thấy trong các chất bị phân hủy và sản phẩm chứa lactic, acid lactic được tạo ra như là sản phẩm chủ yếu của sự trao đổi chất và kết thúc của quá trình lên man carbohydrate Vì vậy LAB được dùng trong thực phẩm lên men, aicd hóa ức chế sự tăng trưởng của tác nhân gây hư hỏng Một

số chủng LAB có thể sinh bacteriocins ức chế sinh vật gây bệnh (Klaenhammer, 1987)

Hơn nữa, acid lactic và các sản phẩm trao đổi chất khác góp phần vào tăng giá trị cảm quan và cấu trúc của thực phẩm Vi khuẩn lên men lacic được Pasteur tìm ra từ sữa bị chua và hiện nay chúng được công nhận là an toàn sinh học

(generally recognized as safe – GRAS), do được sử dụng thường xuyên trong thực phẩm và có đóng góp trong hệ si sinh vậy có ích của con người

1.3.2 Đặc tính chung

Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, catalase

âm tính và là những vi khuẩn kỵ khí chịu oxy, trao đổi chất chủ yếu bằng con đường lên men và không hô hấp do không có cytochromes, chỉ trừ giống Bifidobacterium là kỵ khí bắt buộc Vi khuẩn latic có thể len men được các đường monosaccharid, đường disaccharide, protein tan, pepton và acid Phần lớn chúng không lên men được tinh bột và các polisaccharid khác

Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5 μm Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1 - 8μm Trực khuẩn đứng riêng rẻ hoặc kết thành chuỗi

Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau khi tạo thành acid lactic trong môi trường, và sức chịu acid (hay độ bền acid) cũng rất khác nhau Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid lactic cao hơn (khoảng 2 - 3%) liên cầu khuẩn (khoảng 1%) Các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH 3,8 - 4 (cầu khuẩn không thể phát triển được ở môi trường này), hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn ở vùng pH 5,5 - 6

Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của vi khuẩn lactic ưa ấm là 25 - 350C, ưa nhiệt là 40 - 450C và ưa lạnh là thấp hơn 50 C Khi gia nhiệt khoảng 60 - 800C thì hầu hết chúng bị chết sau 10 - 30 phút

Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic thường gặp ở trong đất, trong nước, trong không khí, nhưng chủ yếu là ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm lên men (trên các loại rau, quả, sữa, thịt, )

1.3.3 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa

1.3.3.1 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau Chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cở bản như cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về một số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ

a Nhu cầu dinh dưỡng cacbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrat cacbon từ các monosaccarit (glucoza, fructoza, manoza), các disaccarit (saccaroza, lactoza, maltoza) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin)

Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ

b Nhu cầu dinh dưỡng nitơ

Phần lớn vi khuẩn lactic không tự tổng hợp được các hợp chất chứa nitơ Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường

Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton, Hiện nay cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp không thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém

c Nhu cầu về vitamin

Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của

tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men

d Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác

Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các acid hữu cơ

Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của

vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quả các chủng vi khuẩn lactic

Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid axetic cũng có những tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào Nên người ta thường sử dụng acid axetic dưới dạng các muối axetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic

e Nhu cầu các muối vô cơ khác

Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie đặc biệt là mangan, vì mangan giúp ngăn ngừa quá trình

tự phân và ổn định cấu trúc tế bào

f Nhu cầu dinh dưỡng oxi

Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy và vừa sống được trong môi trường không có oxy

Trong điều kiện hiếu khí sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với điều kiện kỵ khí, trong điều kiện này từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành CO2 và H2O và tổng hợp các enzyme, từ một phân tử glucose tạo ra 36 hoặc 38 ATP

Trong điều kiện kỵ khí từ một phân tử glucose chỉ tạo ra 2 ATP do đó lượng cơ chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng khuẩn

1.3.3.2 Quá trình trao đổi chất

Một tính năng cần thiết của LAB trong quá trình trao đổi chất là khả năng lên men carbohydrate, các ATP tạo ra được sử dụng cho các mục đích tổng hợp sinh học khác và sản phẩm cuối cùng chủ yếu là acid lactic (từ 50% carbon của đường) LAB có khả năng lên men các loại đường hexcose (glucose, mannose, galactose, fructose ), disaccharide (lactose, saccharose ), pentose (arabinose, xylose, ribose ) và các hợp chất liên quan Chúng chỉ sử dụng được các loại đường ở dạng đồng phân D Tuy nhiên, LAB có thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau làm thay đổi cách thức trao đổi chất và dẫn đến các sản phẩm cuối cùng tạo ra cũng khác nhau (Owen R Fennema và cộng sự, 2004)

Dựa vào khả năng lên men lactic từ glucose, người ta chia vi khuẩn lactic làm hai nhóm: Lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình (hình 1.6)

Hình 1.6 Con đường lên men glucose

(A) Lên men đồng hình (con đường glycolysis,, EMB)

(B) Lên men dị hình (con đường 6-phosphogluconate/phosphoketolase)

Các enzyme tham gia vào quá trình : 1 Glucokinase; 2 Fructose-1,6-diphosphate aldolase; 3 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; 4 Pyruvate kinase; 5 Lactate dehydrogenase; 6 Glucose-6-phosphate dehygrogenase; 7 6-phosphogluconate dehydrogenase; 8 Phosphoketolase; 9 Acetaldehyde dehydrogenase; 10 Alcohol dehydrogenase

a Lên men lactic đồng hình

Trong lên men đường, LAB sử dụng 2 cách thức chủ yếu là vận chuyển đường tự do (transport) và phosphoryl hóa đường (phosphorylation) bởi glucokinase (cần 1 ATP) Một số loài sử dụng phosphoenolpyruvate : sugar phosphotransferase system (PTS), mỗi phosphoenolpyruvate là một phần tử cho phosphate, trong trường hợp này đòi hỏi một liên kết phosphate có năng lượng cao

để hoạt hóa phân tử đường

Con đường Glycolysis hay con đường EMB Parnas pathway) được sử dụng bởi hầu hết các LAB (ngoại trừ leuconostocs, nhóm III Lactobacilli, Oenococci và Weissella) tạo ra fructose-1,6-diphosphate (FDP) và nhờ FDP aldolase để tiếp tục chuyển thành dihydroxyacetonephosphate (DHAP) và glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) đối với những chất có mức phosphoryl hóa ở 2

(Embden-Meyerhof-vị trí, sau đó tạo thành pyruvate Trong điều kiện có nhiều đường và hạn chế oxy, pyruvate bị khử thành acid lactic bởi lactate dehydrogenase (nLDH) và NAD+ do đó NADH đã được oxy hóa trước đó, khi thế oxy hóa khử được cân bằng, sản phẩm cuối cùng được tạo ra chủ yếu là acid lactic và quá trình này được gọi là lên men lactic đồng hình

b Lên men lactic dị hình

Ngoài ra còn có một số con đường lên men khác như: con đường pentose phosphate, con đường pentose phosphoketolase pathway, con đường hexose

monophosphate, con đường phosphogluconate và được gọi chung là phosphogluconate / phosphoketolase (6-PG/PK) Đặc điểm của con đường này là sự khử hydro ngay từ bước đầu tạo 6-phosphogluconate Theo sau đó là sự tách carbon tạo pentose-5-phosphate và tiếp tục chuyển hóa thành glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) và acetyl phosphate GAP được tạo thành tương tự như trong con đường glycolysis và kết quả là tạo ra acid lactic Trong điều kiện không có mặt của các chất nhận điện tử, acetyl phosphate sẽ bị khử tạo thành ethanol thông qua CoA và acetaldehyde Khi quá trình này tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm khác như CO2, ethanol thì nó được gọi là lên men lactic dị hình

Thông thường, LAB lên men đồng hình chủ yếu lên men bằng con đường glycolysis và ngược lại LAB lên men dị hình sử dụng con đường 6-PG/PK Tuy nhiên cần chú ý nhận xét trên không phải đúng cho tất cả các trường hợp (Owen R Fennema et al 2004)

1.3.4 Giới thiệu các nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn lactic vào lên men thu hồi chitin

Lên men acid lactic là một trong những phương pháp lên men được sử dụng trong quy trình sinh học để khử khoáng của chitin Nó thu hồi chitin bằng cách thủy phân protein liên kết với chitin trong vỏ đầu tôm (Zakaria et al 1998, George et al 1999)

Nghiên cứu của Kandra Prameela và cộng sự 2010 cũng nghiên cứu thành công sử dụng các chủng lactobacillus lên men lactic thu hồi chitin từ phế thải tôm Các tác giả dựa trên khả năng tổng hợp acid lactic của vi khuẩn lactic thông thường nồng độ acid lactic đạt pH 2 – 3 để khử khoáng

Các tác giả khác trên thế giới sử dụng Lactobacillus plantarum(Rao et al 2000;Prameela et al.2010), Pediococcus acidolactici (Bhaskar et Prameela et al.2010) Các vi khuẩn probiotic LAB và vi khuẩn lên men thịt sữa như Lactobacillus acidophilus, L.plantarum, Lactobacillusbulgaricus, Pediococcus acidilactici,và Streptococcusthermophilus cũng được sử dụng