Đồ án tốt nghiệp: Đánh giá biến dị di truyền các nhóm tôm sú (Penaeus monodon) làm vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống

Đồ án tốt nghiệp này được thực hiện với mục tiêu nhằm tìm được một số chỉ thị microsatellite phù hợp và tiềm năng trong việc đánh giá đa dạng di truyền giữa các quần đàn tôm sú Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Gia Hóa và Nội Địa; cung cấp thông tin di truyền cho chương trình chọn giống quốc gia. Mời các bạn cùng tham khảo.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ BIẾN DỊ DI TRUYỀN CÁC NHÓM TÔM

SÚ (PENAEUS MONODON) LÀM VẬT LIỆU BAN

ĐẦU CHO CHƯƠNG TRÌNH CHỌN GIỐNG

Giảng viên hướng dẫn : Th.s Bùi Thị Liên Hà

MSSV: 115 111 0388 Lớp: 11DSH02

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

LỜI CAM ĐOAN

Nhóm thực hiện đồ án với đề tài “Đánh giá biến dị di truyền các nhóm tôm sú

(penaeus monodon) làm vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống” cam đoan

rằng nội dung trong đồ án này là do nhóm thực hiện dưới sự hướng dẫn trực tiếp của Th.s Bùi Thị Liên Hà – cán bộ phòng Sinh học thực nghiệm thuộc Viên Nghiên Cứu và Nuôi Trồng Thủy Sản II

Số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án này là hoàn toàn trung thực chưa từng được ai sử dụng để công bố trong bất kỳ công trình nào khác Mọi tham khảo dùng trong đồ án này được trích dẫn rõ ràng, tên tác giả, tên công trình, thời gian và địa điểm công bố

Mọi hành vi sao chép không hợp lệ hay vi phạm quy chế đào tạo, nhóm thực hiện

đề tài xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Sinh viên

Trần Thị Thanh Trúc

LỜI CẢM ƠN

Qua thời gian thực tập tại Viện Nghiên Cứu và Nuôi Trồng Thủy Sản II, em đã học hỏi được nhiều kinh nghiệm, kiến thức thực tiễn cũng như được thực hành trên các thiết bị hiện đại mà em đã được học trên lý thuyết

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Th.s Phạm Minh Nhựt đã tạo điều kiện cho em có cơ hội được thực tập tốt nghiệp tại Viện Nghiên Cứu và Nuôi Trồng Thủy Sản II

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến với các quý thầy cô trường Đại học Công Nghệ TP.HCM đặc biệt là thầy cô thuộc khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường đã tận tình giảng dạy, trang bị kiến thức giúp em nắm bắt và chủ động trong quá trình thực tập

Em xin trân trọng cảm ơn chị Th.s Bùi Thị Liên Hà cùng các anh chị đang công tác tại phòng Sinh học thực nghiệm thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy sản II đã trực tiếp hướng dẫn cũng như tận tình giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập

Và cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến các gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh và ủng hộ em vượt qua khó khăn để hoàn thành tốt bài báo cáo này

Tuy đã rất cố gắng nhưng không tránh khỏi thiếu sót, rất mong nhận được sự góp ý quý báu từ quý thầy cô Em xin chân thành cảm ơn

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG ix

DANH MỤC BIỂU ĐỒ HÌNH ẢNH x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7

1.1 Giới thiệu về tôm sú 8

1.1.1 Vị trí phân loại 8

1.1.2 Phân bố 8

1.1.3 Đặc điểm hình thái cấu tạo 9

1.1.4 Chu kì phát triển 10

1.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng 12

1.1.6 Đặc điểm về sinh trưởng, sinh sản và phát triển 13

1.1.7 Tình hình nuôi trồng tôm sú ở thế giới 14

1.1.8 Tình hình nuôi trông tôm sú ở Việt Nam 14

1.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN 15

1.2.1 Đa dạng di truyền 15

1.2.2 Quần thể 16

1.2.3 Nguyên nhân xuất hiện đa dạng di truyền trong quần thể 17

1.2.4 Ý nghĩa của đa dạng di truyền trong nuôi trồng thủy sản 18

1.3 KỸ THUẬT MICROSATELLITE 19

1.3.1 Khái niệm về kỹ thuật Microsatellite 19

1.3.2 Tính chất 20

1.3.3 Ưu - nhược điểm của microsatellite 20

1.3.4 Các loại Microsatellite 21

1.3.5.1 Cơ chế hình thành Microsatellite 22

1.3.5.2 Vai trò của Microsatellite 22

1.3.6 Các phương pháp phát hiện Microsatellite 23

1.3.6.1 Phương pháp lai 24

1.3.6.2 Phương pháp PCR 24

1.3.6.3 Phát hiện microsatellite bằng mồi microsatellite 25

1.4 ĐỊNH LƯỢNG DNA BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ 28

1.5 KỸ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 29

1.5.1 Nguyên lý chung của kỹ thuật PCR 29

1.5.2 Các yếu tố cần thiết cho phản ứng PCR 30

2.6 KỸ THUẬT ĐIỆN DI 31

2.6.1 Điện di trên gel agarose 31

2.6.1.1 Khái niệm 31

2.6.1.2 Các bước thực hiện 32

2.6.2 Điện di mao quản Capillary Electrophoresis (CE) 33

2.6.2.1 Nguyên tắc 33

2.6.2.2 Cơ chế điện di 33

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 34

2.1 Vật liệu 35

2.1.1 Vật liệu sinh học 35

2.1.2 Hóa chất 36

2.1.2.1 Mồi (primer) 36

2.1.2.2 Thang (ladder) 38

2.1.2.3.Hóa chất ly trích DNA 38

2.1.2.4 Hóa chất chạy PCR 38

2.1.2.5 Hóa chất chạy điện di agarose 39

2.1.2.6 Hóa chất chạy điện di mao quản 39

2.1.2.7 Dụng cụ thí nghiệm 39

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

2.2.1 Phương pháp trích ly DNA tổng số 40

2.2.2 Phương pháp kiểm tra độ tinh sạch và định lượng DNA 43

2.2.3 Phương pháp tối ưu hóa phản ứng PCR và khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite 44

2.2.3.1 Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite 45

2.2.3.2 Khảo sát nồng độ MgCl2 47

2.2.3.3 Khảo sát hàm lượng DNA khuôn 48

2.2.3.4 Khảo sát tính ổn định của quy trình PCR 49

2.3 Phân tích thống kê đa dạng di truyền của bốn quần đàn mẫu tôm sú bằng các phần mềm Cervus, Fstat, Genepop 50

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52

3.1 Kết quả trích ly DNA 53

3.2 Kết quả nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite 55

3.2.1 Kết quả nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi microsatellite W1 trên bốn mẫu tôm A09, T30, G30, N03 đại diện cho bốn vùng Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Gia Hóa và Nội Địa 55

3.2.2 Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi microsatellite P1 trên bốn mẫu tôm A09, T30, G30, N03 đại diện cho 4 nhóm Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Gia Hóa và Nội Địa 56

3.2.3 Kết quả nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi microsatellite L1 trên bốn mẫu tôm A09, T30, G30, N03 đại diện cho 4 nhóm Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Gia Hóa và Nội Địa 57

3.3 Khảo sát nồng độ MgCl2 tối ưu 59

3.3.1 Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 ở microsatellite W1 60

3.3.2 Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 ở microsatellite P1 60

3.3.3 Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 ở microsatellite L1 61

3.3.4 Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 ở microsatellite N1 62

3.4 Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn 64

3.4.1 Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn cho cặp mồi microsatellite W1 64

3.4.2 Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn cho cặp mồi microsatellite L1 65

3.4.4 Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn cho cặp mồi microsatellite N1 67

3.5 Kết quả kiểm tra tính ổn định của phản ứng PCR và sàng lọc các cặp mồi microsatellite 69

3.5.1 Kết quả kiểm tra tính ổn định của phản ứng PCR 69

3.5.2 Sàng lọc các cặp mồi microsatellite 72

3.6 Kết quả phân tích đa dạng di truyền của bốn quần đàn tôm sú 74

3.6.1 Kết quả thông tin đa hình của 4 quần đàn tôm sú: Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Gia Hóa và Nội Địa 74

3.6.2 Sự khác biệt di truyền của các quần đàn mẫu phân tích 78

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 80

4.1 Kết luận 81

4.2 Kiến nghị 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO 83

Tài liệu tiếng việt 83

Tài tiệu tiếng anh 85

Tài liệu internet 87 PHỤ LỤC A A1 PHỤ LỤC B B1

DMSO : Dimethyl sulfoxide

DNA : Deoxyribonucleic acid

dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate

EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid

GTE : Glucose-Tris-EDTA

He : Expected heterozygosity (dị hợp tử mong đợi)

Ho : Observed heterrozygosity (dị hợp tử phát hiện)

HWE : Cân bằng Hardy - Weinberg

ISSR : Inter Simple Sequence Repeats

M : Ladder DNA (thang DNA)

Marker : Chỉ thị

mM : Milimolar (milimol/lite)

Na : Number of alleles per locus (số lƣợng alen trên locus)

NS : không khác biệt có ý nghĩa

NST : Nhiễm sắc thể

PCR : Polymerase chain reaction

CE : Capillary Electropherosis (Điện di mao quản)

EOF : Electro – Osmotic Flow xi

EFF : Electric Field Force

PIC : Polymorphic Information Content (thông tin đa hình)

SDS : Sodium Dodecyl Sulphate

SSR : Single sequence repeat - Microsatellite

STE : Sodium Chloride-Tris-EDTA

RE : Restristion Enzyme (enzyme cắt giới hạn)

Ta : Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp)

TBE : Tris Borate EDTA

Tm : Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)

VNCNTTS II : Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II

VNTR : Variable Number Tamdem Repeat

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Danh sách 137 mẫu tôm sú 35

Bảng 2.2 Thông tin các cặp mồi 37

Bảng 2.3 Gradient nhiệt độ lai cho 15 cặp mồi microsatellite 46

Bảng 2.4 Nồng độ MgCl2 khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite 47

Bảng 2.5 Hàm lượng DNA khuôn khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite 48

Bảng 2.6 Thành phần buffer, dNTP, cặp mồi microsatellite, DNA khuôn, Taq polymerase cho một phản ứng PCR 49

Bảng 3.1.Kết quả đo OD kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ của DNA 54

Bảng 3.2 Nhiệt độ bắt cặp (Ta) sau khi tối ưu của 15 cặp mồi microsatellite 59

Bảng 3.3 Kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 của 15 cặp mồi microsatellite 64

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát hàm lượng DNA khuôn tối ưu của 15 cặp mồi microsatellite 69

Bảng 3.5 Hiệu suất PCR và số allen của 15 cặp mồi microsatellite trên 28 mẫu DNA tôm sú 72

Bảng 3.6 Thông tin đa dạng di truyền của 4 quần đàn tôm sú 75

Bảng 3.7 Giá trị Fst được phân tích theo nhóm 79

Bảng 3.8 Tổng hợp kết quả tối ưu của 10 cặp mồi microsatellite 81

DANH MỤC BIỂU ĐỒ HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Tôm sú (Penaeus monodon) 8

Hình 1.2 Đặc điểm cấu tạo bên ngoài của tôm sú (Penaeus monodon) 9

Hình 1.3 Vòng đời tôm sú (Penaeus monodon) 12

Hình 1.4 Quá trình giao vĩ của tôm sú (Penaeus monodon) 13

Hình 1.5 Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số 25

Hình 1.6 Vùng flanking (vùng sườn) ở 2 bên trình tự microsatellite 26

Hình 2.1 Thang chuẩn DNA 100bp 38

Hình 2.2 Chu trình nhiệt của máy PCR sau khi tối ưu nhiệt độ bắt cặp các cặp mồi 50

Hình 3.2 Tối ưu nhiệt độ bắt cặp ở cặp mồi microsatellite W1 khi tiến hành phản ứng PCR theo gradient nhiệt độ 56

Hình 3.3 Tối ưu nhiệt độ bắt cặp ở cặp mồi microsatellite P1 khi tiến hành phản ứng PCR theo gradient nhiệt độ 57

Hình 3.4 Tối ưu nhiệt độ bắt cặp ở cặp mồi microsatellite L1 khi tiến hành phản ứng PCR theo gradient nhiệt độ 58

Hình 3.5 Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite W1 khi tiến hành phản ứng PCR theo nhiệt độ tối ưu 60

Hình 3.6 Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite P1 khi tiến hành phản ứng PCR theo nhiệt độ tối ưu 60

Hình 3.6 Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite P1 khi tiến hành phản ứng PCR theo nhiệt độ tối ưu 61

Hình 3.7 Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite L1 khi tiến hành phản ứng PCR theo nhiệt độ tối ưu 62

Hình 3.8 Tối ưu nồng độ MgCl2 ở cặp mồi microsatellite N1 khi tiến hành phản ứng PCR theo nhiệt độ tối ưu 63

Hình 3.9 Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite W1 65 Hình 3.10 Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite L1 66

Hình 3.12 Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite N1 67 Hình 3.12 Kết quả tối ưu hàm lượng DNA khuôn của cặp mồi microsatellite N1 68 Hình 3.13 Kết quả kiểm tra tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi

microsatellite W1 70

Hình 3.14 Kết quả kiểm tra tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi microsatellite P1 70

Hình 3.15 Kết quả kiểm tra tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi microsatellite N1 71

Hình 3.16 Kết quả kiểm tra tính ổn định của phản ứng PCR với cặp mồi microsatellite L1 71

Hình 3.17 Biểu đồ thể hiện hiệu suất PCR (%) của 15 cặp mồi microsatellite 73

Hình 3.18 Biểu đồ thể hiện số allen của 15 cặp mồi microsatellite 73

Hình 3.19 Biểu đồ thể hiện giá trị Ho và He theo từng quần đàn tôm sú 78

MỞ ĐẦU

1.Tính cấp thiết của đề tài

Tôm sú là đối tượng nuôi phổ biến ở các vùng nước lợ, mặn trên toàn quốc Trong báo cáo tổng kết ngành thủy sản 2004 và kế hoạch 2005 của Bộ Thủy Sản cho biết hằng năm, ước tính có khoảng hơn 10 tỷ tôm sú giống giai đoạn PL15 được sản xuất từ hàng nghìn trại sản xuất tôm giống Tôm bố mẹ cung cấp cho các trại sản xuất tôm giống hiện nay hầu như hoàn toàn phụ thuộc vào nguồn tôm bố mẹ khai thác tự nhiên và nhập nội Sử dụng nguồn tôm bố mẹ còn mang tính thụ động, tự nhiên, cộng với những yếu tố khác do chính điều kiện sản xuất, kinh doanh tại các trại sản xuất tôm giống không được đảm bảo, có dấu hiệu suy giảm sinh trưởng, mang mầm bệnh, tiềm ẩn rủi ro lớn cho người nuôi tôm

Do đó, để có được nguồn giống tăng trưởng tốt, sức chống chịu, kháng bệnh tốt cung cấp cho người nuôi trồng tôm sú, không phải phụ thuộc vào nguồn tự nhiên hay nhập nội thì việc nghiên cứu sản xuất giống tôm sú cung cấp cho người nuôi sản phẩm giống tốt, có tốc độ sinh trưởng nhanh, chống chịu tốt là điều hết sức cần thiết

Nước ta có diện tích mặt nước ngọt, lợ, biển khá lớn, bao gồm các sông, suối, ao, hồ chứa nước với thành phần giống loài thủy sản phong phú là tiềm năng to lớn để phát triển và nuôi trồng thủy sản Năm 2012, diện tích nuôi trồng thủy sản toàn quốc ước tính 1.200.000 ha, trong đó diện tích nuôi tôm sú chiếm phần lớn với 622.118 ha chiếm 88,1%, hàng thủy sản Việt Nam đã có mặt ở trên 164 quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới Kim ngạch xuất khẩu năm 2014 đạt 7,9 tỷ USD, tăng gấp 18% lần so với cùng kì năm trước Sự tăng trưởng này chủ yếu nhờ vào kết quả xuất khẩu của mặt hàng tôm, với giá trị xuất khẩu cao nhất từ trước tới nay khoảng 4,1 tỷ USD, tăng 25% so với năm 2013 (http://xttm.agroviet.gov.vn/)

Trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu chú ý đến nâng cao chất lượng

di truyền, tăng khả năng chống chịu ở tôm sú đã được thực hiện nhằm đặt ra cơ sở khoa học, kỹ thuật để có thể nâng cao chất lượng của loài thủy sản giá trị cao này

như “Nghiên cứu buồng trứng và khả năng sinh sản của các dòng tôm sú gia hóa” (Nguyễn Văn Bình, 2012), “Đánh giá tính đa hình của ba quần đàn tôm sú

(Penaeus monodon) nuôi ở Việt Nam bằng phương pháp microsatellite” (Nguyễn

Thị Thảo và ctv, 2004) với mục tiêu có được sản phẩm giống tôm sú tốt, cải thiện di truyền sản phẩm giống, tập trung cao vào các tính trạng kinh tế quan trọng là sức sinh trưởng, kháng bệnh, chống chịu và phải đa hình di truyền

Các nghiên cứu xác định biến dị di truyền kết hợp với các biến dị hình thái thể hiện

về sinh trưởng, sức sống với các chỉ thị ở mức độ phân tử của các quần thể tôm sú, giữa các cá thể trong cùng một quần đàn là hướng nghiên cứu phù hợp cần thiết, ứng dụng cao Chính vì thế, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn giao cho Viện

Nghiên cứu và Nuôi trồng thủy sản II thực hiện đề tài cấp nhà nước “Ứng dụng di

truyền số lượng và di truyền phân tử để tạo vật liệu ban đầu cho chọn giống tôm sú (Penaeus monodon) theo tính trạng tăng trưởng”, đề tài này được thực hiện trong 4

năm (1/2012 – 12/2015) và nhóm thực hiện đồ án tham gia vào một phần nhỏ với đề

tài “Đánh giá biến dị di truyền các nhóm tôm sú (Penaeus monodon) làm vật liệu

ban đầu cho chương trình chọn giống” nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho chương

trình chọn giống tôm sú quốc gia Đề tài được thực hiện ở Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II dưới sự hướng dẫn của Thạc sĩ Bùi Thị Liên Hà

phân lập được 49 cặp mồi microsatellite từ ngân hàng gen của loài tôm sú (Penaeus

monodon), qua sàng lọc đã chọn ra được 36 cặp tốt nhất được sử dụng để đánh giá

đa dạng di truyền quần đàn tôm sú nuôi tự nhiên cho kết quả thông tin đa hình dao động trong khoảng từ 0,63 – 0,96

-“Sử dụng các chỉ thị microsatellite trong chọn giống tôm sú (Penaeus monodon)”

(Wuthisuthimethavee và ctv, 2003) Nghiên cứu này được tác giả thực hiện trên quần đàn tôm sú hoang dã ở Thái Lan, sử dụng 30 cặp mồi microsatellite tự thiết kế

để đánh giá tính đa hình Kết quả cho thấy thông tin đa hình (PIC) dao động trong khoảng từ 0,4275 – 0,9264

-“Sử dụng các chỉ thị microsatellite để phân tích sự khác biệt di truyền giữa các quần đàn tôm sú vùng Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương” (En-Min You và ctv,

2005) Trong bài báo này, các tác giả đã sử dụng 10 cặp mồi microsatellite có số dị hợp tử mong đợi >0,92 của Pan và ctv (2004) để phân tích khác biệt di truyền của

330 cá thể tôm sú thuộc 2 vùng Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương Kết quả phân tích thông tin đa dạng di truyền cho thấy: số dị hợp tử quan sát được dao động từ 0,638 – 0,743 Sự khác biệt có ý nghĩa về cân bằng di truyền Hardy – Weinberg (p<0,05) Giá trị sai khác di truyền (Fst) giữa quần đàn tôm sú Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương là khá cao (Fst=0,069; p≤ 0,0067)

-“Đánh giá đa dạng di truyền của quần đàn tôm sú (Penaeus monodon) nuôi tự nhiên và hoang dã bằng chỉ thị microsatellite” (D.Aziz và ctv, 2011) Tác giả và

cộng sự đã tiến hành thu mẫu tôm sú nuôi tự nhiên và hoang dã ở Malaysia, bằng 30 cặp mồi microsatellite được lấy từ ngân hàng gen Biobasic, Canada, các tác giả đã công bố kết quả phân tích đa dạng di truyền của mẫu tôm sú trên Số lượng allen trên mỗi cặp mồi là từ 3 – 36, số dị hợp tử quan sát He= 0,5166 nhỏ hơn so với dị hợp tử mong đợi He=0,5552 Giá trị sai khác di truyền (Fst) giữa quần đàn tôm sú nuôi tự nhiên và hoang dã là rất cao (Fst=0,6308; p≤ 0,009)

Trong nước

Những nghiên cứu đa dạng di truyền đã được thực hiện như: Trường Đại học quốc gia TP HCM, Viện NCNTTS I và Viện NCNTTS II đã có những khảo sát đa dạng

di truyền một số quần thể đàn tôm sú (Penaeus monodon) bằng hai kỹ thuật RAPD

và mtDNA PCR-RFLP Theo đó, kết quả chỉ đánh giá khả năng ứng dụng từng kỹ thuật vào các mục đích tìm hiểu khác nhau, nhưng đây là một nỗ lực trong đánh giá

di truyền một số quần thể tự nhiên

Để đánh giá sự khác biệt di truyền giữa hai quần đàn tôm càng xanh Việt Nam và Trung Quốc và làm cơ sở cho việc quản lý, bảo tồn nguồn gen tôm càng xanh tại

Việt Nam Nghiên cứu “So sánh sự đa dạng di truyền giữa tôm càng xanh Việt Nam

và tôm càng xanh Trung Quốc sử dụng phương pháp Microsatellite và RAPD”

(Nguyễn Thành Tâm và Phạm Thanh Liêm, 2012) nhằm kiểm tra sự khác biệt di truyền của hai quần đàn tôm càng xanh Việt Nam và Trung Quốc cùng với 6 cặp mồi microsatellite và 5 mồi ngẫu nhiên RAPD Theo kết quả báo cáo không có sự khác biệt di truyền giữa quần đàn tôm càng xanh Việt Nam và Trung Quốc khi phân tích bằng chỉ thị microssatellite tuy nhiên với 5 mồi ngẫu nhiên RAPD cho kết quả thông tin đa hình (PIC) của quần đàn tôm càng xanh Việt Nam và Trung Quốc lần lượt là 0,84 và 0,88

Một số các nghiên cứu thăm dò khác: “Microsatellite nghiên cứu biến dị về màu sắc

thịt trắng và thịt vàng của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)” (Nguyễn Hữu

Ninh, 2003); “Bước đầu thăm dò, ứng dụng một số chỉ thị DNA phân tích đa dạng

di truyền cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)” (Bùi Thị Liên Hà, 2004).v.v…

3 Mục đích nghiên cứu

- Tìm được một số chỉ thị microsatellite phù hợp và tiềm năng trong việc đánh giá

đa dạng di truyền giữa các quần đàn tôm sú Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Gia Hóa và Nội Địa

- Cung cấp thông tin di truyền cho chương trình chọn giống quốc gia

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite qua quy trình PCR

- Phân tích đa dạng di truyền của các mẫu tôm sú thuộc 4 nhóm khác nhau trong chọn giống thông qua chỉ thị microsatellite nhằm phục vụ cải tạo giống tôm sú

5 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp trích ly DNA tổng số dựa trên quy trình tách chiết DNA Salt extraction (Miller và ctv, 1988)

-Phương pháp kiểm tra độ tinh sạch và định lượng DNA

- Phương pháp tối ưu hóa phản ứng PCR và khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite

- Phân tích thống kê đa dạng di truyền của bốn quần đàn mẫu tôm sú bằng các phần mềm Cervus 3.0.3, Fstat, Genepop

6 Các kết quả đạt được của đề tài

- Tối ưu hóa các phản ứng khuếch đại của các chỉ thị microsatellite

- Kiểm tra độ ổn định và tính chính xác của các chỉ thị microsatellite lựa chọn

- Phân tích đa dạng di truyền của các nhóm mẫu tôm sú chọn giống

- Đưa ra nhận định hỗ trợ cho chương trình chọn giống tôm sú

7 Kết cấu của đồ án tốt nghiệp

Đồ án tốt nghiệp “Đánh giá biến dị di truyền các nhóm tôm sú (Penaeus monodon)

làm vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống” bao gồm 4 chương:

Chương 1 Tổng quan tài liệu: tóm tắt về các đặc điểm, đặc tính của đối tượng

nghiên cứu là loài tôm sú (Penaeus monodon) Giới thiệu về kỹ thuật microsatellite

và các cặp mồi microsatellite sử dụng trong báo cáo này

Chương 2.Vật liệu và phương pháp: nêu ra các vật liệu sử dụng và những phương

pháp dùng để phân tích trong đề tài

Chương 3 Kết quả và thảo luận: báo cáo về các kết quả đã đạt được trong đề tài và

đưa ra nhận xét, so sánh với các nghiên cứu liên quan

Chương 4 Kết luận và kiến nghị: đưa ra các kết luận chung về các kết quả đã đạt

được và đề xuất các hướng giải quyết tiếp theo để hoàn thiện hơn

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về tôm sú

1.1.1 Vị trí phân loại

Tôm sú (tên khoa học: Penaeus monodon) là một loài động vật giáp xác đại dương

được nuôi để dùng làm thực phẩm, là đối tượng rất quan trọng trong lĩnh vực nghiên cứu và nuôi trồng thủy sản Theo Hothuis (1980) và Barnes (1987) (trích dẫn bởi Nguyễn Văn Chung và Trần Ngọc Hải, 2004) tôm được phân loại trong hệ thống phân loại như sau:

Trên thế giới, tôm sú được phân bố chủ yếu ở Ấn Độ - Tây Thái Bình Dương, Đông

và Đông Nam Châu Phi, Pakistan, Nhật Bản, Malaysia Đặc biệt, bắt gặp nhiều nhất

Hình 1.1 Tôm sú (Penaeus monodon)

trưởng thành có tập tính sống ở biển khơi, thường được tìm thấy ở độ sâu 180m, nhưng tôm giống thường xuất hiện ở vùng ven bờ ( Nguyễn Văn Thường và Trương Quốc Phú, 2004)

Ở Việt Nam, theo Nguyễn Văn Chung (1995) (được trích dẫn bởi Nguyễn Đel, 2009) Tôm sú phân bố ở vịnh Bắc Bộ, ven biển Nam Trung Bộ, vùng Tây Nam Bộ, sông Ông Đốc, Khánh Hội, Kim Quy, Hòn Chông, Hà Tiên… Tôm sống ở độ sâu từ

0 – 126m, đáy cát bùn hay bùn cát, thích hợp nhất là các thủy vực có độ mặn cao,

ổn định

1.1.3 Đặc điểm hình thái cấu tạo

Quan sát cơ quan bên ngoài của tôm sú gồm các bộ phận sau:

Chủy: tôm sú có chủy dài kéo dài đến rìa của cuốn râu I, hơi cong lên ở vuốt, hình dạng như lưỡi kiếm, có răng cưa ở phía trên lưng và cả phần phía dưới, nhờ có răng

cưa này mà ta phân biệt được các loài tôm khác nhau trong giống penaeus Với tôm

Hình 1.2 Đặc điểm cấu tạo bên ngoài của tôm sú (Penaeus monodon)

Antennule và Antennae là cơ quan nhận biết và giữ thăng bằng cho cơ thể của tôm

3 cặp châm hàm: giúp cho việc ăn

5 cặp chân ngực: giúp để ăn và bò

5 cặp chân bụng: dùng để bơi

Hai đôi mắt kép có 2 cuống mắt

Carapace có gai râu và gai gan nhưng không có gai hốc mắt

Đuôi có một cặp chân đuôi giúp cho tôm có thể bơi lên cao hay bơi xuống thấp

Cơ quan sinh dục nằm ở dưới bụng: tôm sú thuộc loại dị hình phái tính, con cái có kích thước to hơn con đực Khi tôm trưởng thành phân biệt rõ đực cái thông qua cơ quan sinh dục phụ bên ngoài Petasma và thelycum là cơ quan phân biệt đực cái ở tôm, Petasma có ở con đực và thelycum có ở con cái

Con đực: cơ quan sinh dục chính của con đực nằm ở phía trong phần đầu ngực, bên

ngoài có cơ quan giao phối phụ nằm ở nhánh ngoài đôi chân ngực thứ 2, lỗ sinh dục đực mở ra hốc háng đôi chân ngực thứ 5 Tinh trùng thuộc dạng chứa trong túi

Con cái: buống trứng nằm dọc theo mặt lưng phía trên, hai ống dẫn trứng mở ra ở

khớp háng đôi chân ngực thứ 3 Thelycum nằm giữa gốc đôi chân bò thứ 4 và 5

1.1.4 Chu kì phát triển

Vòng đời của tôm sú chia làm 6 thời kì: phát triển phôi, ấu trùng và hậu ấu trùng, giai đoạn ấu niên, giai đoạn thiếu niên, giai đoạn sắp trưởng thành, giai đoạn trưởng thành (Nguyễn Văn Chung và ctv, 1997)

Phát triển phôi: trứng tôm sú hình cầu, màu vàng xanh, đường kính trung bình

0,3mm Thời gian để phôi phát triển qua 2 giai đoạn tế bào, giai đoạn phôi nang và thời điểm xuất hiện Nauplius trong trứng là 0,5; 1,5; 8 giờ sau khi đẻ xong

Ấu trùng và hậu ấu trùng: ấu trùng và hậu ấu trùng tôm lột xác nhiều lần, phát

triển qua các giai đoạn Nauplius, Zoea, Mysis, Postlarvae

- Giai đoạn Nauplius: nauplius mới nở hình quả lê, qua 5 lần lột xác biến đổi dần và trở nên dài ra Nauplius sống phù du trôi nổi ở tầng trên, dinh dưỡng chủ yếu bằng noãn hoàng, vận động theo kiểu zích zắc, không định hướng, không liên tục, hướng quang mạnh

- Giai đoạn Zoea: cơ thể bao gồm 3 phần rõ rệt (đầu- ngực- bụng) Zoea bơi nhờ 2 đôi râu (đôi 1 phân đốt, đôi 2 phân nhánh) bơi lội có định hướng về phía trước Ấu trùng Zoea bắt đầu ăn thức ăn ngoài bằng hình thức ăn lọc

Do chúng bắt mồi liên tục nên chúng có phần đuôi phân dài (Lục Minh Diệp (2003) trích dẫn bởi Nguyễn Văn Bình, 2012) Ba giai đoạn phụ của ấu trùng Zoea phân biệt nhờ sự xuất hiện của chùy trán, cuống mắt kép, sự phân đốt của phần bụng và sự phát triển của gai cứng, gai bên các đốt bụng Thời gian phát triển các giai đoạn phụ là từ 30-48 h tùy theo nhiệt độ

- Giai đoạn Mysis: trải qua 3 giai đoạn biến thái phụ Cơ thể tôm sú đã giống dạng trưởng thành hơn so với Zoea Mysis sống ở tầng trên, đặc trưng của Mysis là bơi ngược về sau, đầu chúc xuống dưới Phân biệt các giai đoạn phụ của Mysis dựa vào sự xuất hiện và phân đốt của chân bơi

- Giai đoạn ấu hậu ấu trùng Postlarvae: hình dạng giống tôm trưởng thành nhưng chưa hoàn thiện về màu sắc Postlarvae bơi thẳng, có định hướng về phía trước, hoạt động bơi lội chủ yếu nhờ vào chân bụng Tuổi của Postlarvae được tính theo ngày kể từ khi biến thành Postlarvae đầu tiên Từ P1-P5 chúng sống trôi nổi, từ P5 trở đi chúng sống đáy

Giai đoạn ấu niên: từ P5-P20 tôm chuyển sang sống đáy, giai đoạn này tôm bắt

đầu bò bằng chân bò và bơi bằng chân bơi

Giai đoạn thiếu niên: tôm bắt đầu ổn định về tỷ lệ và bây giờ có thể phân biệt được

tôm đực và tôm cái dựa vào petasma của con đực và thelycum của con cái

Giai đoạn sắp trưởng thành: giai đoạn này đặc trưng bởi sự phát triển của tuyến

sinh dục đực, con đực đã bắt đầu có tinh trùng nằm trong túi tinh và con cái có buồng trứng phát triển, khi con cái giao vĩ thì nó có túi tinh

Giai đoạn trưởng thành: là giai đoạn chín sinh dục hoàn toàn, di cư xa bờ tới vùng

biể sâu để sinh sản

1.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng

Tôm sú là loài ăn tạp, thức ăn của tôm bao gồm giáp xác, giun nhiều tơ, nhuyễn thể, các côn trùng, tảo và các mảnh thực vật Tính ăn của chúng thay đổi theo giai đoạn,

ở giai đoạn tôm bột và tôm giống chúng ăn nhiều các mảnh thực vật, vi tảo… Khi tôm lớn chúng ăn các loại động vật không xương sống như ruốc, mọi giáp xác chân đều, giun nhiều tơ… Ở giai đoạn thành thục, trong suốt mùa sinh sản tôm ăn nhiều nhuyễn thể trong khi những tháng khác tôm ăn nhiều cá hơn (Dall, 1998), được trích dẫn bởi Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2004)

Hình 1.3 Vòng đời tôm sú (Penaeus monodon)

Tôm ăn suốt ngày đêm nhưng ăn nhiều vào ban đêm, tôm giảm ăn vào những lúc lột xác, khả năng bắt mồi của tôm còn phụ thuộc rất lớn vào môi trường sống (Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2004)

1.1.6 Đặc điểm về sinh trưởng, sinh sản và phát triển

Hiện tượng lột xác: trong quá trình tăng trưởng, khi trọng lượng và kích thước tăng

lên đến mức độ nhất định, tôm phải lột bỏ lớp vỏ cũ để lớn lên Sự lột xác thường xảy ra vào ban đêm Sự lột xác đi đôi với việc tăng thể trọng, cũng có trường hợp nhưng không tăng thể trọng Khi quan sát tôm nuôi trong bể, hiện tượng lột xác xảy

ra như sau: lớp biểu bì giữa khớp đầu ngực và phần bụng bị nứt ra, các phần phụ của đầu ngực rút ra trước, theo sau là phần bụng và các phần phụ phía sau rút ra khỏi lớp vỏ cứng, với động tác uốn cong mình toàn cơ thể Lớp vỏ mới mềm sẽ cứng lại sau 1-2h đối với tôm nhỏ, 1-2 ngày đối với tôm lớn

Hiện tượng giao vĩ và đẻ trứng: khi tôm cái vừa lột xác, tôm đực thường giao vĩ,

các túi tinh với sự giúp đỡ của petasma sẽ được đưa vào thelycum của con cái Hoạt động giao vĩ thường diễn ra vào ban đêm, sức sinh sản của tôm sú là khoảng 200.000- 1.700.000 trứng

Hình 1.4 Quá trình giao vĩ của tôm sú (Penaeus monodon)

1.1.7 Tình hình nuôi trồng tôm sú ở thế giới

Nghề nuôi tôm trên thế giới đã xuất hiện cách đây vài thế kỷ nhưng mãi đến năm

1964 quy trình về sản xuất tôm bột mới được hình thành Tôm sú là loài có sản lượng đánh bắt và nuôi hàng đầu trên thế giới Theo thống kê của tổ chức Nông Lương thế giới (Food Agriculture Organization- FAO), sản lượng tôm sú chiếm 52% năm 1997 trên tổng số sản lượng tôm nuôi trên thế giới, Đông Nam Á là vùng dẫn đầu chiếm 53,7% tổng sản lượng tôm toàn thế giới trong số 54 quốc gia có ngành công nghiệp nuôi tôm phát triển

Do nhu cầu thị trường ngày càng cao nên nghề nuôi tôm ngày càng phát triển và được cải tiến Điều đó đã chứng tỏ rằng nuôi tôm sú công nghiệp đã mang lại hiệu quả cao cho người nuôi, tạo ra lượng tôm lớn cho nhu cầu xuất khẩu Hiện nay, trên thế giới có trên 60 quốc gia nuôi tôm tập trung thành 2 khu vực chính là Nam Mỹ (các nước Tây bán cầu) và Đông Nam Á (các nước Đông bán cầu) Các quốc gia Đông Nam Á với điều kiện thiên nhiên ưu đãi và ứng dụng nhanh về khoa học kỹ thuật vào sản xuất nên sản lượng tôm chiếm 80% tổng sản lượng tôm trên toàn thế giới Các nước có sản lượng lớn như Trung Quốc, Thái Lan (276.000 tấn), Ấn Độ (971.00 tấn), Banglades, Việt Nam (50.000 tấn) (theo thông tin chuyên đề, bộ Thủy sản số 4, 2003)

1.1.8 Tình hình nuôi trông tôm sú ở Việt Nam

Ở Việt Nam nghề nuôi tôm là truyền thống có từ lâu, nuôi tôm với hình thức quảng canh cổ truyền, bán thâm canh với con giống tự nhiên Theo Trần Ngọc Hải và Nguyễn Thanh Phương (2009) thì ở nước ta, nghiên cứu sinh sản nhân tạo các loài

tôm đầu tiên được tiến hành ở miền Bắc từ thập niên 70 với các loài tôm Penaeus

merguiensis, P penicilatus và P japonicus Từ năm 1984- 1985, tôm sú penaeus

monodon đã được sinh sản nhân tạo thành công ở Nha Trang và dần trở thành đối tượng chủ yếu trong sản xuất giống và nuôi tôm biển ở nước ta

Cho đến nay, thủy sản là một trong những ngành có tốc độ tăng trưởng xuất khẩu

lượng thủy sản 9 tháng đầu năm ước đạt 4,7 triệu tấn, tăng 4,9% so với cùng kì năm trước Trong đó, sản lượng cá đạt 3,4 triệu tấn, tăng 3,2%; tôm đạt 0,57 triệu tấn, tăng 14,8% Giá trị sản xuất thủy sản 9 tháng đầu năm 2014 (theo giá so sánh 2010) ước đạt 134.000 tỷ đồng, tăng 6,5% so với cùng kỳ năm ngoái Giá trị xuất khẩu đạt 5,7 tỷ USD tăng 23% Do tôm chân trắng có hiệu quả kinh tế cao và ổn định hơn nhiều so với tôm sú nên đã có sự dịch chuyển lớn về diện tích nuôi tôm chân trắng

và tôm sú Tổng diện tích thả nuôi lũy kế đạt 663 nghìn ha (tăng 5,2% so với cùng

kỳ năm 2013); trong đó diện tích tôm sú là 572 nghìn ha (giảm 1,8%), diện tích tôm chân trắng là 91 nghìn ha (tăng 91,8%) Tổng sản lượng thu hoạch lũy kế ước đạt 395 nghìn tấn (tăng 50%); trong đó sản lượng tôm sú là 180 nghìn tấn, tôm chân trắng là 215 nghìn tấn (www.tongcucthuysan.gov.vn)

1.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN

1.2.1 Đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền là tất cả các gen di truyền khác nhau của tất cả các cá thể thực vật, động vật, nấm, vi sinh vật Đa dạng di truyền tồn tại trong một loài và giữa các loài khác nhau

Đa dạng di truyền còn là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau, là sự đa dạng về gen có thể di truyền được trong cùng một quần thể hoặc giữa các quần thể Đa dạng di truyền biểu hiện sự đa dạng của các biến dị có thể di truyền trong một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã Xét cho cùng, đa dạng di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình

tự của bốn cặp base cơ bản, thành phần của acid nucleic, tạo thành mã di truyền Tập hợp các biến dị gen trong cùng một quần thể giao phối cùng loài có được nhờ chọn lọc Mức độ sống sót của các biến dị khác nhau dẫ đến tần suất khác nhau của các gen trong tập hợp gen Điều này cũng tuong tự như trong tiến hóa của quần thể Như vậy tầm quan trọng của biến dị gen là rất rõ ràng, nó tạo sự thay đổi tiến hóa tự nhiên cũng như chọn lọc nhân tạo

Di truyền quần thể là một lĩnh vực sinh học mà những nghiên cứu của nó tập trung vào thành phần di truyền của quần thể sinh học (tần suất phân bố của allen) và sự thay đổi của thành phần di truyền được bắt nguồn từ áp lực của sự tiến hóa, chọn lọc tự nhiên, xu hướng chuyển đổi kết cấu di truyền, đột biến và phân bố gen được quan tâm như những ảnh hưởng chủ đạo trong tần xuất phân bố allen trong cả quần thể nuôi gia hóa và quần thể tự nhiên Những ứng dụng chủ yếu của di truyền quần thể trong nghề nuôi tôm và nghề nuôi trồng thủy sản gồm sự mô hình hoá cấu trúc quần thể trong tự nhiên, xác định cá thể có đóng góp vào quá trình sinh sản, ước tính giả định khả năng sinh sản của kích thước quần thể hiệu quả, đánh giá tỷ lệ cận huyết và hệ thống hóa dữ liệu yếu tố biến dị di truyền trong quần thể khảo sát

1.2.2 Quần thể

Trong tiến hóa, cá thể không được xem là đơn vị thích hợp bởi vì kiểu gen của một

cá thể được giữ nguyên trong quãng đời của nó hơn nữa cá thể có tính tạm bợ (dù

có thể sống tới cả nghìn năm như cây tùng) Ngược lại, một quần thể thì có tính liên tục qua thời gian và mặt khác thành phần di truyền của nó có thể thay đổi tiến hóa qua các thế hệ Sự hình thành các quần thể địa phương tại những vùng lãnh thổ khác nhau chính là phương thức thích ứng của loài trước tự nhiên Quần thể được xem là đơn vị tiến hóa cơ sở

Đối với các loài sinh sản hữu tính, quần thể là tập hợp các cá thể cùng loài, trải qua nhiều thế hệ, cùng chung sống trong một khoảng không giai xác định, trong đó các

cá thể có thể giao phối tự do với nhau và được cách ly ở mức độ nhất định với các nhóm cá thể lân cận thuộc loài đó

Theo A.V.Yablokov (1986), quần thể là nhóm các cá thể cùng loài và có khả năng giao phối tự do với nhau, chiếm cứ một khu phân bố xác định và trải qua một thời gian tiến hóa lâu dài để hình thành nên hệ thống di truyền độc lập và một ổ sinh thái riêng

Nói cách khác, quần thể là một nhóm sinh vật có khả năng giao phối qua lại và cùng chia sẻ một vốn gen chung (Ridley 1993) Nó còn được gọi là quần thể Mendel mà tập hợp lớn nhất là loài (species)

Năm 1908, nhà toán học người Anh Godfrey H.Hardy và bác sĩ người Đức Wilhelm Weinberg đã độc lập chứng minh rằng có tồn tại một mối quan hệ đơn giản giữa các tần số allen và các tần số kiểu gen Nội dung của của nguyên lý: Trong một quẩn thể ngẫu phối kích thước lớn, nếu như không có áp lực của các quá trình đột biến, di nhập cư, biến động di truyền và chọn lọc, thì tần số các allen được duy trì ổn định từ thế hệ này sang thế hệ khác

1.2.3 Nguyên nhân xuất hiện đa dạng di truyền trong quần thể

Trong quần thể ngẫu phối, bằng cách chọn lọc và lai các dạng được chọn với nhau

có thể tạo ra các dòng có mức độ biểu hiện tính trạng khác hẳn ở quần thể ban đầu Điều đó chứng tỏ tính bất đồng nhất về mặt di truyền trong quần thể Trong quần thể tự nhiên, các cá thể có cùng kiểu hình giống nhau nhưng kiểu gen thì rất đa dạng Sự đa dạng gen chủ yếu do đột biến tạo gen dị hợp tử và quá trình giao phối tái tổ hợp Trong đó biến dị tổ hợp và đột biến gen có ý nghĩa quan trọng nhất Biến dị tổ hợp là những tổ hợp sắp xếp gen mới mà đời con thu được khác với bố

mẹ do sự phân ly độc lập và sự trao đổi chéo của các gen khi chúng nằm trên các cặp nhiễm sắc thể khác nhau Các cá thể mang biến dị tổ hợp chỉ thừa hưởng nguyên gốc vật chất di truyền của thế hệ trước mà vật chất di truyền không hề bị biến đổi về mặt chất lượng

Đột biến là những biến đổi về cấu trúc, số lượng của DNA và NST Có ý nghĩa quan trọng trong sự hình thành loài, là nguyên liệu cho quá trình tiến hóa và chọn giống

Ngoài ra, đa dạng di truyền còn do hiện tượng di nhập gen, sự phiêu bạt gen, chọn lọc tự nhiên, chọn lọc nhân tạo…

1.2.4 Ý nghĩa của đa dạng di truyền trong nuôi trồng thủy sản

Trong nuôi trồng thủy sản các quần thể bố mẹ tương đối nhỏ thường được lưu giữ riêng biệt, đây là nguyên nhân làm cấu trúc di truyền của nguồn giống thủy sản nuôi

có thể thay đổi nhanh chóng theo thời gian chỉ qua vài thế hệ Vì khi quần thể quá nhỏ sẽ xảy ra hiện tượng phiêu bạt gen làm thay đổi cấu trúc di truyền của quần thể

do kích thước quần thể quá nhỏ, xu hướng bắt cặp lẫn nhau giữa các cá thể có quan

hệ huyết thống với nhau là không tránh khỏi Do đó nguy cơ mất dần những biến dị

di truyền sẽ xảy ra nhanh chóng vì không tích lũy đủ các biến dị di truyền để đáp ứng mọi thay đổi của điều kiện sống Hiện tượng sinh sản cùng dòng hay giao phối giữa các cá thể có quan hệ gần gũi là những tác nhân góp phần gia tăng cấp độ cần huyết dẫn tới suy thoái cận huyết Vì vậy, trong thực tiễn chiến lược phát triển nhằm duy trì nguồn vật liệu di truyền cơ bản và bền vững cho nuôi trồng rất được đưa vào quy chế và áp dụng rộng rãi

Đây là vấn đề then chốt trong nuôi trồng thủy sản, vì thành quả di truyền đạt được

từ một chương trình chọn giống sẽ phụ thuộc chủ yếu vào sự tích lũy đầy đủ đa dạng di truyền có mặt trong nguồn bố mẹ Mức độ biến dị di truyền hiện diện trong quần thể khảo sát sẽ được chi phối chủ yếu bởi cấp độ đa dạng của bố mẹ và hệ thống giao phối Biến dị di truyền là điều kiện tối cần thiết cho sự tồn tại của quần thể vì một quần thể có yếu tố đa dạng di truyền càng cao càng có tiềm năng thích nghi và cung cấp nguồn vật liệu tốt nhất cho chương trình chọn giống

Nghiên cứu đa dạng di truyền giúp nhà khoa học và người nuôi có được những giải pháp tốt hơn trong việc xử lý vấn đề hiện tại Do đó cách tiếp cận của cải tiến con giống truyền thống và di truyền hiện đại trong nuôi trồng thủy sản có thể được tận dụng từ giả thuyết và phương pháp luận trong di truyền quần thể nhằm định dạng, kiểm soát và bảo tồn đa dạng di truyền các dòng vật nuôi

1.3 KỸ THUẬT MICROSATELLITE

1.3.1 Khái niệm về kỹ thuật Microsatellite

Microsatellite (SSR marker) là một dạng của VNTR (variable number of tandem repeats), chuỗi mã di truyền lặp lại rất đơn giản thường xảy ra ngẫu nhiên trên hầu hết genom thực vật (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang 2005) Các đoạn lặp lại ngắn từ 2-6 bp và kích thước tại mỗi locus là 20 -100 bp, chúng được tìm thấy trong tất cả các cơ thể sống, đặc biệt là những cơ thể sống có bộ gen lớn và phân bố đều trên genom Một microsatellite điển hình có đơn vị lặp lại AC, xảy ra ở khoảng 100.000 vị trí khác nhau trong bộ genom động vật điển hình Ở bất kì một locus nào, thường xuyên có khoảng 5 – 7 allen khác nhau mà mỗi allen có thể nhận biết tùy thuộc vào số đơn vị lặp lại Những allen này co thể được phát hiện bởi kỹ thuật PCR, sử dụng primers được thiết kế từ một dãy đơn và cũng có trên cả mặt kia của microsatellite Khi sản phẩm PCR được chạy trên gel điện di, allen được ghi nhận khác biệt về độ dài trong giá trị đến kích cỡ của đơn vị lặp lại

Microsatellite là một DNA marker chuẩn, dễ dàng phát hiện bằng kỹ thuật PCR và chúng có khuynh hướng xác định vị tri bằng nhau từ đầu đến cuối của genom Hàng ngàn SSR đã được lập bản đồ trong nhiều loài khác nhau Ngày nay,thuật ngữ microsatellite được sử dụng phổ biến để miêu tả các trình tự lặp lại ngắn và ngẫu nhiên thay vì sử dụng thuật ngữ STR (short tadem repeats) hay VNTR (variable number of tandem repeats)

Microsatellite có tính đa hình rất cao, là những codominant-al hay al đồng trội (bao gồm 2 loại: allen đồng hợp và allen dị hợp), nó có các tính chất cần thiết cho một marker Tần số đột biến từ 104- 5.106, tuân theo định luật Mendel Vị trí của microsatellite trên nhiễm sắc thể có thể được xác định bằng PCR từ một lượng DNA rất nhỏ Xác định microsatellite PCR trên một loài nào đó thì có thể áp dụng trên những loài khác có quan hệ họ hàng

1.3.2 Tính chất

Những markers này thường hiện diện với mức độ cao của hiện tượng đa hình, đặc biệt khi số lần lặp lại lớn hơn hoặc bằng 10 Trình tự lặp lại thường đơn giản, bao gồm 2, 3 hoặc 4 nucleotides (tương ứng với việc lặp lại di-, tri, -tetranucleotide) và

có thể được lặp lại từ 10 đến 100 lần Sự lặp lại của nucleotide CA xảy ra rất thường xuyên trong bộ gen người và các loài khác, và được hiện diện trong khoảng vài ngàn bases pair Nhờ vậy có sự xuất hiện thường xuyên của nhiều allen tại vị trí microsatellite, kiểu gen trong phả hệ thường cung cấp đầy đủ thông tin về di truyền, trong đó allen đặc thù của tổ tiên có thể được nhận biết dễ dàng Bằng cách này, microsatellite là marker lý tưởng để xác định nguồn gốc, nghiên cứu di truyền quần thể và bản đồ tái tổ hợp Nó còn là marker phân tử dùng để cung cấp đầu mối về những allen có mối quan hệ gần nhau hơn

Microsatellite thường thay đổi với tỉ lệ đột biến tăng dần so với vùng trung tính khác của DNA Tỉ lệ đột biến cao này có thể được giải thích bởi sự bắt cặp sai trong

bộ phận trượt (slipped strand mispairing - sự giữ không đúng mục tiêu) trong suốt quá trình sao chép DNA trên một chuỗi đơn xoắn kép Sự đột biến cũng xảy ra suốt quá trình tái tổ hợp trong quá trình giảm phân Một vài lỗi sai mục tiêu được sửa bởi

cơ chế đọc và sửa trong nhân, thế nhưng một vài đột biến có thể không được sửa chữa Kích thước của đơn vị lặp lại, số lần lặp lại và sự hiện diện của sự lặp lại khác nhau là tất cả các yếu tố, cũng như là tính thường xuyên của sự dịch mã trong khu vực của DNA lặp lại Sự gián đoạn của microsatellites, có thể do đột biến, có thể là nguyên nhân trong việc giảm sự đa hình Tuy nhiên, cơ chế tương tự này thỉnh thoảng có thể dẫn đến sự khuếch đại không chính xác của microsatellites; nếu sự sai mục tiêu xảy ra sớm trong suốt quá trình PCR, thì chiều dài không chính xác của microsatellites có thể được khuếch đại

1.3.3 Ưu - nhược điểm của microsatellite

Ưu điểm:

Cặp mồi microsatellite được ứng dụng nhiều hơn cả vì nó đơn giản hơn, phân bố đều trên bộ gen, đặc hiệu, có độ chính xác cao, có khả năng nhân bản ổn định ứng dụng rộng rãi trong việc lập bản đồ bộ gen của các loài Giúp phân tích đặc điểm di truyền của các loài, dưới loài và các cá thể trong một loài phục vụ có hiệu quả cho công tác chọn giống trong chăn nuôi và trồng trọt, tìm hiểu về cấu trúc quần thể, phả hệ, khoa học hình sự, các gen liên quan đến năng suất và chất lượng, ngoài ra còn giúp tìm hiểu về nguồn gốc và phân lập các gen gây bệnh, từ đó nghiên cứu ra phương pháp điều trị phù hợp Chúng là chỉ thị di truyền hoàn hảo, chuyên biệt locus và đồng trội (co - dominant), cho phép xác định thể đồng và dị hợp tử và có khả năng lặp lại

Nhược điểm:

Tỉ tệ phần trăm vị trí di truyền được khuếch đại thành công có thể bị giảm bởi sự gia tăng khoảng cách di truyền Điểm đột biến trong vị trí bắt cặp của primer trong một loài nào đó có thể dẫn đến sự cố allen không giá trị (null alleles), nơi mà primer microsatellite không thể đáp ứng để khuếch đại trong thí nghiệm PCR Nếu có một

sự khác biệt lớn về kích cỡ giữa allen của cá thể, điều đó có thể làm tăng sự không bền vững trong sự tái tổ hợp ở quá trình giảm phân Trong tế bào khối u, nơi mà sự kiểm soát trên phiên mã bị phá hủy, microsatellite có thể tăng thêm hay mất đi thường xuyên ở tỉ lệ đặc biệt cao trong mỗi chu kỳ nguyên phân Do đó một dòng tế bào khối u có thể chỉ ra những đặc điểm khác biệt di truyền từ những mô kí chủ đó

1.3.4 Các loại Microsatellite

Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2-6 lần), phân loại microsatellite gồm:

• Mononucleotide SSR (A) AAAAAAAAAAA

• Dinucleotide SSR (GT)6 GTGTGTGTGTGT

• Trinucleotide SSR (CTG)4 CTGCTGCTGCTG

• Tetranucleotide SSR (ACTC)4 ACTCACTCACTCACTC

Trinucleotide SSR xuất hiện ít hơn dinucleotide SSR khoảng 10 lần, và tetranucleotide SSR còn hiếm hơn nữa

1.3.5 Cơ chế hình thành và vai trò của Microsatellite

1.3.5.1 Cơ chế hình thành Microsatellite

Cơ chế đột biến hình thành microsatellite vẫn chưa được hiểu biết một cách đầy đủ

Di truyền học và các nghiên cứu khác cho rằng cơ chế xuất hiện và hình thành microsatellite là do hai quá trình: quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân (unequal crossing- over during meiosis) hoặc quá trình trượt lỗi trong sao mã (replication slippage) Và quá trình trượt lỗi trong sao mã được coi là nguyên nhân chủ yếu trong việc hình thành các microsatellite, nó xảy ra trên mạch chậm (lagging strand) Quá trình này liên quan đến quá trình trượt lỗi của enzyme polymerase trên phân tử DNA mới tổng hợp từ đó tạo ra một chỗ phình nhất thời có thể bị loại bỏ trong quá trình sửa lỗi hoặc có thể kéo dài thêm ở mạch đối diện tạo thành một đoạn lặp lại dài hơn

1.3.5.2 Vai trò của Microsatellite

Rất nhiều microsatellite đã được tìm thấy ở vùng phía trên của các vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã Chức năng rõ rệt của những vùng như vậy vẫn còn chưa

rõ ràng, mặc dù người ta tìm thấy chúng tồn tại giữa các vùng exon và có liên quan tới các bệnh di truyền Microsatellite được dùng như một marker di truyền để nghiên cứu về di truyền quần thể, quan hệ tiến hóa, lập bản đồ gen Tuy nhiên có rất nhiều chứng cứ cho rằng trình tự microsatellite cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc nhân tố điều hòa Microsatellite được tìm thấy khắp nơi ở phần trước vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã, và một số đã được tìm thấy có quan hệ với vùng mã hoá Số lượng khác nhau của các đoạn lặp lại của microsatellite ở vùng mã hoá có quan hệ với sự biểu hiện của gen và chức năng của gen Ở một số trường hợp, sự thay đổi (mất hoặc thêm) các đơn vị lặp lại của microsatellite cũng làm thay đổi chức năng hoạt động của promotor Vị trí của microsatellite gần hay xa

microsatellite hoạt động như một nhân tố thúc đẩy quá trình phiên mã và những đột biến mất đoạn microsatellite đã làm giảm chức năng của gen Microsatellite cũng liên kết với các protein bám mà các protein này có chức năng bám dính vào các trình tự khởi động của gen, khi trình tự này được giải phóng thì gen được khởi động

và sao mã Điều này chỉ ra rằng microsatellite hoạt động như một yếu tố điều hòa trong quá trình sao mã, ảnh hưởng đến quá trình sao mã thông qua ảnh hưởng đến protein bám Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng ảnh hưởng thúc đẩy của microsatellite và protein bám dính của nó là một chức năng của các đoạn lặp lại trong một vùng microsatellite đặc biệt nào đó Như một trình tự mang mã, microsatellite đã được tìm thấy biểu hiện ở rất nhiều protein và sự khác nhau về số lần lặp lại của các trình tự trong microsatellite có thể dẫn đến sự khác nhau về chức năng của protein và hoạt động của gen, do đó có thể ảnh hưởng đến chức năng sinh

lý cũng như sự phát triển của cơ thể Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có

sự ảnh hưởng của chiều dài khác nhau của microsatellite đến hình thái và sự phát triển ở mức độ cơ quan được tổng kết lại như một yếu tố chức năng của hệ gen Những tính chất đặc biệt của microsatellite như sự đột biến điểm dẫn đến những giả thiết cho rằng microsatellite có thể là một nguồn chủ yếu tạo nên sự đa dạng về di truyền số lượng và quá trình tiến hóa thích nghi Nó cho phép một quần thể có thể khôi phục lại nguồn đa dạng di truyền đã bị mất trong quá trình chọn lọc, nó hoạt động như một “núm điều chỉnh” mà qua đó những gen đặc biệt có thể điều chỉnh nhanh chóng các phản ứng thay đổi ít hay nhiều trong quá trình đòi hỏi của tiến hóa

Do vậy microsatellite là một nguồn rất quan trọng trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền và làm cơ sở cho sự thay đổi của tiến hóa

1.3.6 Các phương pháp phát hiện Microsatellite

Có 3 phương pháp để phát hiện microsatellite: phương pháp lai, phương pháp PCR

và phương pháp dùng mồi microssatellite

1.3.6.1 Phương pháp lai

Phương pháp lai phân tử cho phép xác định chính xác kiểu microsatellite bằng cách chuyển qua màng lai, cùng một lúc có thể phát hiện nhiều kiểu microsatellite bằng các mẫu dò khác nhau Tuy nhiên xác định chiều dài của chúng còn bị hạn chế Trong phương pháp lai có hai cách: phương pháp phát hiện nhờ đồng vị phóng xạ

và phương pháp nhuộm bạc

Phương pháp phát hiện nhờ đồng vị phóng xạ

Phương pháp hiệu quả và được dùng đầu tiên là đồng vị phóng xạ Người ta có thể đánh dấu vào một đầu của primer (end-labelling) hoặc đánh dấu và trộn lẫn một trong bốn thành phần nucleotide A, T, G, C (incorporation-labelling) Nhưng ngày nay phương pháp dùng đồng vị phóng xạ rất ít được sử dụng vì nguy hiểm đến sức khỏe con người và đòi hỏi việc xử lí chất thải tốn kém

Phương pháp nhuộm bạc (phát hiện không dùng phóng xạ)

Phương pháp này rẻ, không hại, nhưng độ nhạy cao, đòi hỏi một số kỹ thuật rắc rối khi nhuộm

1.3.6.2 Phương pháp PCR

Phương pháp PCR sử dụng màu huỳnh quang để đánh dấu primer forward và sử dụng máy giải trình tự tự động Phương pháp này được phát triển cùng với sự phát triển của màng giải trình tự nucleotide để phát hiện sản phẩm PCR được đánh dấu bởi một chất nhuộm huỳnh quang (end-labelling primer hoặc incorporation) Khi kích thích bởi tia laser, các chất nhuộm màu này giải phóng ra một tín hiệu mà máy tính có thể phát hiện được bằng cách so sánh sự di chuyển của sản phẩm PCR với DNA chuẩn, chúng ta có thể có kích thước chính xác của đoạn DNA quan tâm Chất huỳnh quang này được gắn vào một đầu 5’ của cặp mồi, 40ng mồi loại này đủ dùng cho 10.000 phản ứng PCR Phương pháp này có hiệu quả rất cao và đang được sử dụng phổ biến trên các phòng thí nghiệm trên thế giới Người ta có thể đánh dấu

chạy cùng một giếng điện di, kể cả kích thước các đoạn bằng nhau nhưng chúng ta vẫn có thể xác định được nhờ màu huỳnh quang khác nhau Kết quả được thể hiện trên máy tính, nhờ đó chúng ta có thể xác định được chính xác kích thước của allen, loại trừ những băng lặp lại (stuter DNA) hoặc thêm một nucleotide

1.3.6.3 Phát hiện microsatellite bằng mồi microsatellite

Cách phổ biến nhất để phát hiện microsatellite là thiết kế mồi microsatellite đặc trưng cho một locus trong bộ gen Vì vậy một cặp mồi microsatellite có thể áp dụng cho mọi cá thể trong loài và cho những sản phẩm khuếch đại có kích thước khác nhau phụ thuộc vào chiều dài khác nhau của trình tự microsatellite

Ở hình 1.5, hai mồi của PCR (2 mũi tên màu xám) được thiết kế nằm ở vùng bảo toàn nằm 2 bên trình tự microsatellite Nếu không có đoạn lặp lại nào, sản phẩm PCR sẽ có chiều dài là 100 bp Vì vậy, dựa vào kích thước của sản phẩm PCR chúng ta có thể tính được số lần lặp lại của dinucleotide “CA” trong mỗi trình tự microsatellite (như trong ví dụ này “CA” có 8 lần lặp lại với chiều dài sản phẩm PCR là 116 bp)

Mồi microsatellite đặc trưng cho một loài sẽ giúp phát hiện sự đa hình ở những vị trí tương đồng (cùng locus trên mỗi allen) đối với từng cá thể trong loài Điều này

có thể thực hiện được là nhờ trình tự microsatellite và trình tự của vùng flanking (vùng sườn - vùng nằm ở 2 bên trình tự microsatellite để thiết kế mồi) được bảo tồn trong quá trình di truyền của loài Vùng sườn rất quan trọng vì nó giúp phát hiện trình tự microsatellite đặc trưng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể

Hình 1.5 Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số

Đề tài sử dụng 15 cặp mồi microsatellite (W2, W3, W4, W9, W10, L1, L3, L4, P1, P2, P4, P5, P7, N1, N2) của các tác giả đã công bố trong bài báo khoa học Cụ thể, nhóm thực hiện đề tài đã sử dụng các cặp mồi mang kí hiệu W2, W3, W4, W9, W10

trong nghiên cứu “Development of microsatellite markers in black tiger shrimp”

(Wuthisuthimethavee và ctv, 2003), được đăng trong tạp chí khoa học ngành thủy sản số 224 vào tháng 5/2003 Trong nghiên cứu của mình, các tác giả đã tổng hợp

được 30 cặp mồi microsatellite đặc hiệu cho loài tôm sú Penaeus monodon dựa trên

9 trình tự lặp lại (AG)10, (TG)10, (GAA)10, (GAC)10, (CAT)10, (TAC)10, (GACA)8, (GATA)8, và (TCAG)8 bằng các kĩ thuật sinh học phân tử (sử dụng 4 enzyme cắt

giới hạn: EcoRV, DraI, HaeIII, SmaI để cắt DNA, plasmid pBLUESCRIPT SK làm

vectơ chuyển gen ) Sau đó các tác giả tiến hành đánh giá đa dạng di truyền của quần đàn tôm sú hoang dã tại Thái Lan và cho kết quả chỉ số thông tin đa hình (PIC) dao động từ 0,4275 – 0,9264 Nhóm thực hiện đề tài nhận thấy sự ổn định và chất lượng cao của các cặp mồi nên đã chọn và sử dụng 5 cặp mồi microsatellite có chỉ

số PIC cao nhất cho đề tài này

Các cặp mồi có kí hiệu P1, P2, P4, P5, P7, nhóm thực hiện đồ án tham khảo từ báo

cáo khoa học “Isolation and characterization of 23 polymorphic microsatellite

markers for diversity and stock analysis in tiger shrimp (Penaeus monodon)” của

Hình 1.6 Vùng flanking (vùng sườn) ở 2 bên trình tự microsatellite

23 cặp mồi microsatellite dùng để đánh giá đa dạng di truyền của loài tôm sú

(penaeus monodon) Với việc sử dụng các công cụ gần giống như

Wuthisuthimethavee và ctv (2003), (dùng enzyme cắt giới hạn Sau3AI, plasmid

pUC18 ), các tác giả đã phân lập được 23 cặp mồi microsatellite đặc hiệu để phân

tích đa dạng di truyền trên 30 mẫu tôm sú (penaeus monodon) Kết quả cho thấy, số

allen dao động cao từ 15 – 31, số dị hợp tử mong đợi trung bình Ho= 0,936 và kết qua này được bảo vệ trước Hội đồng Học viện động vật học và phát triển khoa học

Đài Loan, đã đăng lên tạp chí Molecular Ecology Notes vào tháng 7/2004 Đồng thời, đề tài ”Microsatellite diversity and population genetic differentiation of the

tiger shrimp (penaeus monodon) in Indo-Pacific region” (En-Min You và ctv,

2005) Trong bài báo này, các tác giả đã sử dụng 10 cặp mồi microsatellite có số dị hợp tử mong đợi >0,92 của Pan và ctv (2004) để phân tích khác biệt di truyền của

330 cá thể tôm sú thuộc 2 vùng Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương Kết quả phân tích thông tin đa dạng di truyền cho thấy: số dị hợp tử quan sát được dao động từ 0,638 – 0,743 Vì thế, nhóm thực hiện đồ án đã chọn ra 5 cặp mồi có kết quả thông tin đa hình tốt nhất của Pan và ctv (2004) làm vật liệu cho đề tài này

Để có thêm nhiều vật liệu phục vụ cho đề tài và tăng độ tin cậy, nhóm đã tham khảo

và sử dụng thêm 3 cặp mồi mang kí hiệu L1, L3, L4 trong nghiên cứu“Development

of two microsatellite multiplex systems for black tiger shrimp Penaeus monodon and its application in genetic diversity study for two populations” ( Li và ctv, 2007)

và 2 cặp mồi kí hiệu N1, N2 trong “Genetic diversity of intensive cultured and wild

tiger shrimp Penaeus monodon (Fabricius) in Malaysia using microsatellite markers” của Nahavandi và ctv (2011) Trong nghiên cứu của mình, Li và ctv

(2007) đã sử dụng 90 trình tự gen của tôm sú có kích thước 100-350 bp từ ngân hàng gen và thiết kế 13 cặp mồi microsatellite đa thành phần bao gồm 3 và 4 đơn vị lặp lại bằng cách sử dụng PRIMER v.3 tham khảo từ Rozen và Skatetsky (2000) để đánh giá đa dạng di truyền của 2 quần đàn tôm sú ở Australia và Thái Lan Kết quả cho thấy, số allen của quần đàn tôm sú ở Australia khá cao dao động từ 7- 27, số dị

Lan số allen từ 6- 15, số dị hợp tử quan sát dao động lớn từ 0,09- 0,90 Báo cáo này

được đăng lên tạp chí Aquaculture vào 1/2007

Nahanvandi và ctv (2011) sử dụng 6 cặp mồi tham khảo trong báo cáo của Pongsomboom và ctv (2000) cũng cho kết quả đánh giá đa dạng di truyền quần đàn tôm sú hoang dã và nuôi tự nhiên ở Malaysia khả quan Tuy nhiên trong số 6 cặp mồi đó, nhóm thực hiện đồ án đã chọn 2 cặp mồi N1, N2 có chỉ số thông tin đa hình (PIC) tốt nhất là 0,7600 và 0,7511

Như vậy từ 4 bài báo khoa học tin cậy, nhóm thực hiện đồ án đã chọn ra 15 cặp mồi microsatellite tốt nhất nhằm đánh giá đa dạng di truyền của quần đàn tôm sú

(penaesus monodon) làm vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống

1.4 ĐỊNH LƯỢNG DNA BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ

Mỗi loại phân tử có một đỉnh hấp thụ (tại nơi đó chúng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất)

ở một độ dài sóng nhất định tùy thuộc vào cấu trúc của chúng Ví dụ đỉnh hấp thụ của các phân tử acid nucleotide là 260nm Sự hấp thụ này là do sự tương tác giữa các photon với các electron của vòng purine và pyrimidine Dựa vào sự hấp thụ này người ta có thể định lượng được hàm lượng DNA có trong mẫu ly trích

Sự hấp thụ ánh sáng ở đây được tính bằng đơn vị OD (Optical Density) Đối với DNA tinh khiết một đơn vị OD260nm tương ứng với: 50 g/ml DNA sợi đôi, 40 g/ml DNA sợi đơn Nồng độ DNA có thể xác định được nhờ sự đo OD (mật độ quang) ở

độ dài sóng 260nm Khi DNA tinh khiết, lượng DNA được tính theo công thức :

OD260nm = 50 ng/l (đối với DNA sợi kép)

OD260nm = 40 ng/l (đối với DNA sợi đơn)

Nếu mẫu ly trích có lẫn tạp protein thì kết quả tính toán sẽ không chính xác Do ngoài đỉnh hấp thụ là 280nm protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm như các acid nucleotide và vì thế sẽ làm sai lệch giá trị thật của nồng độ acid nucleotide trong dịch ly trích Để ước lượng độ tinh sạch của mẫu ly trích người ta tính tỷ lệ

OD260nm/OD280nm Nếu tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,8 -2 thì mẫu ly trích được xem

là sạch.Nếu mẫu bị nhiễm protein thì tỷ lệ này sẽ thấp hơn nhiều Tuy nhiên, việc