Xác định sự hiện diện của gen quy định protein điều chỉnh miễn dịch trong nấm hoàng linh chi (ganoderma colossum donk) ở việt nam

i TÓM TẮT Đề tài “Xác định sự hiện diện của gen quy định protein điều chỉnh miễn dịch trong nấm Hoàng chi Ganoderma colossum Donk ở Việt Nam” bao gồm việc đánh giá một s điều kiện nhiệ

i

TÓM TẮT

Đề tài “Xác định sự hiện diện của gen quy định protein điều chỉnh miễn dịch

trong nấm Hoàng chi (Ganoderma colossum Donk) ở Việt Nam” bao gồm việc

đánh giá một s điều kiện nhiệt độ và p nh hưởng đến quá tr nh nu i cấy dịch th

thu nhận sinh kh i nấm oàng chi Ganoderma colossum onk ; xác định sự hiện

diện củ gen quy định protein điều chỉnh miễn dịch P gene c trong nấm oàng chi; xác định kh i lư ng củ protein P và th nghiệm ho t t nh kh máu củ n

ết qu cho thấy r ng điều kiện t i ưu cho việc nu i cấy dịch th đ thu nhận sinh kh i nấm là nhiệt độ ở 28oC và p b n đầu là v i lư ng sinh kh i đ t đư c sau 7 ngày và 14 ngày nuôi cấy lần lư t là 450 ± 2,45 mg và 630 ± 2,62 mg Kết

qu PCR và gi i trình tự DNA cho thấy có hiện diện củ đo n gen quy định P ở nấm oàng chi c k ch thư c bp Các ph n t ch protein trong nghi n cứu cho thấy protein P trong nấm oàng chi c kh i lư ng là 13,114 kD ph h p v i

kh i lư ng củ các P đ đư c nghi n cứu trư c đ y n m trong kho ng t – 15

k và protein FIP củ nấm oàng chi c ho t t nh làm t n đ i v i máu ngư i ở c

nh m máu và O nhưng g y ngưng kết đ i v i máu c u

Kết qu thu đư c t đề tài này đư c thực hiện và báo cáo đầu tiên trên nấm

Hoàng chi (Ganoderma colossum Donk), làm nền t ng cho những thí nghiệm tiếp

theo nh m xác định đầy đủ trình tự bộ gen của một lo i nấm quý hiếm ở Việt Nam,

và phát tri n công nghệ s n xuất protein FIP ứng dụng trong y học hiện nay

ii

ABSTRACT

Our project n med s “ etermining the presence of the gene that codes for an

immunomodulatory protein in Ganoderma colossum Donk in Việt N m” w s

carried out from July-2014 to July-2015, at Laboratory of Biology of Thu Dau Mot

university, Binh Duong province

We studied the liquid culture condition of G colossum’s myceli to get living

mass of fungus by estimating the influence of temperature and pH degree on culture environment; determined the presence of fungal immunomodulatory protein (FIP)

in G colossum by PCR method and gene sequencing Otherwise, we isolated FIP,

measured its mass and also tested the ability of hemaglutination of FIP

Our results showed that at the optimal temperature of myceli ’s culture w s

28oC, with beginning culture environment pH degree was 5, the living mass of fungus could get high rate of 450 ± 2,45 mg and 630 ± 2,62 mg at day 7 and day 14 post-culture, simultaneouly The results of PCR and gene sequencing showed that

the isolated fragment of FIP gene in G colossum was 312 bp Protein analysis

demonstr ted th t P’s molecul r weight w s 13,114 kD, definitely appropriated in

range of 11 - 15 kD of FIPs found in orther Ganodermataceace Especially,

aggregation was observed from sheep red blood cells in the presence of purified FIP

of G colossum However, no aggregation was seen for any type of human red blood

cells

Here, we firstly studied the sequence of FIP gene and protein, as well as its

property in hemaglutination in Ganoderma colossum Donk This research served as

a foundation for further experiments of sequencing this fungal DNA genome and manufacturing immunomodulatory protein for medical use

iii

Tổng qu n về nấm oàng chi 3

1.1.1 Tình hình nghiên cứu về nấm oàng chi 3

1.1.2 Gi i thiệu chung về nấm oàng chi 6

1.1.3 Vai trò của nấm oàng chi 111

ọ protein điều chỉnh miễn dịch Ps 144

2.1 Nội dung nghiên cứu 210

2.2 Vật liệu h chất th nghiệm 210

2.2 Chủng nấm nghi n cứu 210

2.2.2 Hóa chất 210

2.3 Phương pháp nghi n cứu 253

2.3.1 Nghiên cứu sự nh hưởng điều kiện nhiệt độ và độ pH lên sự sinh trưởng củ hệ s i nấm oàng chi trong m i trư ng dịch th 253

2.3.2 Xác định gen quy định protein P t nấm oàng Chi 264

2.3.3 Thu nhận protein P t nấm oàng chi và th nghiệm ho t t nh P 286

2.4 Sơ đồ quy trình thí nghiệm 351

MỤC LỤC Tóm tắt i

Abstract ii

Mục lục iiiii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh sách các b ng viii

Danh sách các hình viii

MỞ ĐẦU 1

Chương TỔN QU N T U 1

Chương NỘ UN V P ƯƠN P ÁP N ÊN CỨU 210

iv

2.5 Phương pháp x lý s liệu 352

3.1 nh hưởng củ điều kiện nhiệt độ p l n sự sinh trưởng củ hệ s i nấm oàng chi trong m i trư ng nu i cấy dịch th 363

Nu i cấy hệ s i nấm oàng chi thu nhận sinh kh i 363

nh hưởng củ điều kiện nhiệt độ p l n sự sinh trưởng củ hệ s i nấm oàng chi trong m i trư ng nu i cấy dịch th 374

3.2 Xác định gen quy định protein P t nấm oàng Chi 39

3.2.1 Hiệu qu ly trích DNA 39

3.2.2 Khuếch đ i đo n gen FIP 39

3.3 Thu nhận protein FIP t nấm hoàng chi th nghiệm ho t t nh FIP 472

Xác định Protein P t nấm oàng chi 472

Th nghiệm ho t t nh protein P t nấm oàng chi 494

Kết luận 5247

Đề nghị 47

Chương ẾT QU VÀ TH O LUẬN 363

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47

TÀI LI U THAM KH O 48

PHỤ LỤC 53

EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid

FIP Fungal immunomodulatory protein

GMI G microsporum immunomodulatory protein

IL Interleukin

PCR Polymerase Chain Reaction

TERT Telomerase reverse transcriptase

TNF Tumor necrosis factor

vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.5 Các nghiệm thức kh o sát điều kiện nuôi cấy s i nấm Hoàng chi 24

Bảng 3.1 Sự tăng trưởng sinh kh i theo th i gian của hệ s i nấm Hoàng chi trong m i trư ng dịch th t i nhiệt độ 200 C, 240C, 280C và 0C đơn vị mg) 2436

Bảng 3.2 T lệ tăng sinh kh i hệ s i nấm oàng chi trong m i trư ng dịch th s u ngày so v i ngày nu i cấy 38

Bảng 1.1 Đặc t nh cơ b n củ một s protein Ps 165

Bảng 2.1 Các môi trư ng dùng nu i cấy hệ s i nấm oàng chi 210

Bảng 2.2 Hóa chất dùng ly tr ch DNA nấm oàng chi 221

Bảng 2.3 Hóa chất dùng trong phân tích PCR 221

ản Thành phần các protein chu n s dụng làm th ng chu n S S-PAGE 243

vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH

n Chu kỳ sinh trưởng và phát tri n củ nấm Đ m 8

n Th qu T colossus tự nhiên t i Q.1- Tp Hồ Chí Minh 99

Hình 1.3 Ganoderma colossum mọc tr n m n cư 9

Hình 1.4 Th qu Ganoderma colossum tự nhiên ở Cát Tiên 10

Hình 1.5 Trình tự amino acid của một s FIP 15

Hình 1.6 Trình tự cấu trúc amino acid và cấu trúc bậc hai của FIP-gts 176

Hình 1.7 ư c đồ minh họ cơ chế điều hoà củ P theo con đư ng cytokines 187

Hình 2.1 ệ th ng sắc ký lọc gel 29

n ệ th ng điện di protein SDS-PAGE 341

n ệ s i nấm s u ngày nu i cấy trong m i trư ng P tr n đ petri 364 n ệ s i nấm oàng chi G colosum đư c nu i cấy tr n m i trư ng dịch th trong máy lắc ổn nhiệt 375

n nh hưởng củ nhiệt độ và p m i trư ng lên sự sinh trưởng của hệ s i nấm oàng chi trong m i trư ng lỏng s u ngày và ngày nu i cấy 36

n T lệ tăng sinh kh i hệ s i nấm oàng chi trong m i trư ng dịch th s u ngày so v i ngày nu i cấy 38

Hình 3.5 Kết qu điện di đo n gen nấm oàng chi đư c khuếch đ i bởi cặp mồi LZ8 41

Hình 3.6 Kết qu gi i trình tự đo n gen đư c xác định là quy định protein FIP t nấm oàng chi đư c khuếch đ i bởi cặp mồi Z 41

viii

Hình 3.7 Kết qu tra cứu và so sánh b ng công cụ BLAST SEARCH các

nucleotide trình tự đo n gen xác định đƣ c v i ngân hàng Genbank 42

Hình 3.8 Kết qu tra cứu và so sánh b ng công cụ BLAST SEARCH trình tự acid

amin protein FIP t nấm Hoàng chi 42

n Sắc k đồ thu nhận protein P 484 Hình 3.10 Kết qu điện di protein nấm oàng chi 495 Hình 3.11 Kết qu th ho t t nh protein P thu nhận đƣ c t nấm oàng chi v i

ph n ứng kh máu 5046

1

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài

ọ nấm inh chi (Ganodermataceae) hiện biết c hơn loài Trong đ nhiều loài quý hiếm như inh chi chu n Ganoderma lucidum r rst đ đư c

s dụng trong l nh vực y dư c ở Phương Đ ng hơn năm n y nh m điều trị nhiều lo i bệnh khác nh u ở ngư i như bệnh vi m g n m n t nh c o huyết áp cholesterol hoá m ch máu ti u đư ng tắc nghẽn động m ch vành hen suyễn vi m loét d dày

iện n y đ xác định đư c trong nấm inh chi c kho ng 9 lo i triterpens

và nhiều lo i polys cch ride c giá trị như -D glucan đ ng đư c xem là yếu t

m i c tác dụng ch ng ung thư Các nghi n cứu củ rcm r và cộng sự 999

Zh ng và cộng sự T ng và cộng sự 6 Qin và cộng sự …cho thấy các ho t chất triterpens polys cch rides và protein c nguồn g c t th qu nấm inh chi đều c m i tương qu n dương t nh v i các đáp ứng miễn dịch cơ th Ngoài r đáng k đến là họ protein điều chỉnh miễn dịch Ps fung l immunomodul tory protein đ ng đư c gi i kho học hết sức chú trong việc nghi n cứu s dụng điều trị các bệnh hi m nghèo P đư c phát hiện lần đầu ti n

năm 9 9 ở loài inh chi chu n ino và cộng sự 9 9 v i t n gọi Z-8 (FIP-glu)

và cũng là P đư c nghi n cứu kỹ nhất v i v i trò như một lo i protein ch ng dị ứng phổ rộng và điều hoà miễn dịch Qin và cộng sự đ chứng minh v i hàm

lư ng µg/ml protein Z- đ c th làm tế bào lách chuột tăng sinh t i 9% còn

v i hàm lư ng µg/ml th protein này đ ch ng đư c ph n ứng ngưng kết máu ở ngư i Cho t i n y P đ đư c t m thấy ở nhiều loài nấm khác nh u t nấm dư c liệu như inh chi đến nấm ăn như im ch m h y nấm Rơm v i c ng một phương pháp cổ đi n như đ phát hiện r Z- thực hiện ph n ứng PCR v i cặp mồi đ t m

ra LZ-8)

Nấm oàng chi Ganoderma colosum Donk) là một loài nấm quý hiếm của

Việt N m đ đư c nhiều công trình chứng minh có thành phần ho t chất đ d ng

2

v i ho t tính sinh học rất c o như kháng khu n (Ofodile và cộng sự, 2005), kháng HIV tuýp I (Dine và cộng sự, 2008), ức chế tế bào ung thư g n Weng và cộng sự, 2010) Mặc dù v i thành phần ho t chất đư c biết khá đ d ng, song các nghiên cứu hiện nay chủ yếu m i tập trung vào các triterpenoid như colossol ctones -G) (Kleinwacher và cộng sự, 2001; Dine và cộng sự, 2008), phenolic (Dine và cộng sự, 2009) còn các thành phần khác v n đ đư c biết có vai trò rất quan trọng trong họ inh chi noderm t ce e như polys cch ride h y protein th vẫn còn rất ít thông

tin đề cập, chẳng h n ở các nấm đặc thù t i Việt N m như Ganoderma colossum

V i mục đ ch t m hi u protein và vai trò của nó t nấm Hoàng chi, chúng tôi chọn đề tài: “Xác định sự hiện diện của gen quy định protein điều chỉnh miễn dịch

trong nấm Hoàng chi (Ganoderma colossum Donk) ở Việt N m”

Tính mới của đề tài:

Đ y là kết qu đầu ti n chư đư c nghi n cứu c ng b trong nư c và tr n thế

gi i thực hiện tr n đ i tư ng nấm oàng Chi củ Việt N m

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Đánh giá điều kiện nhiệt độ độ p nh hưởng l n sự sinh trưởng củ hệ s i nấm oàng chi trong m i trư ng dịch th

- Xác định gen quy định protein P t nấm oàng chi

- Thu nhận protein P t nấm oàng chi th nghiệm ho t t nh kh máu

Các lo i nấm l n, bao gồm nấm ăn và nấm dư c liệu đ gắn liền v i cuộc

s ng củ con ngư i t rất lâu Nấm không chỉ cung cấp dinh dưỡng như một lo i thực ph m giàu protein, không cholesterol mà còn là nguyên liệu s n xuất nhiều lo i

dư c ph m Các loài nấm dư c liệu đ ng đư c qu n t m nghi n cứu nhiều như nấm inh chi Đ ng tr ng h th o Nấm Linh chi có chứa một lư ng l n Germanium hữu cơ Polys cch rides và Triterpenes Những thành phần này đ đư c chứng minh là t t cho hệ miễn dịch và c i thiện hệ miễn dịch [30]

Hiện nay, việc nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học nói chung và công nghệ sinh học trong nông nghiệp n i ri ng đ ng là một trong các vấn đề đư c nhiều

nư c trên thế gi i quan tâm Công nghệ lên men, cụ th là phương pháp l n men

ch m đ ng đư c ứng dụng rộng rãi nh m thu sinh kh i và các s n ph m tr o đổi chất của các loài cây thu c quí hiếm, các lo i nấm dư c liệu… đ s n xuất thực

ph m chức năng hỗ tr điều trị bệnh hoặc s n xuất thu c có tác dụng tăng cư ng và điều hòa miễn dịch nh m chữa trị và phòng ch ng một s bệnh li n qu n đến miễn dịch như V ung thư…

Gi ng nấm dịch th là lo i gi ng đư c nuôi cấy trong m i trư ng lỏng đ m

b o các điều kiện về dinh dưỡng, nhiệt độ, th i gian nuôi Công nghệ này cho phép thu đư c một lư ng l n sinh kh i s i nấm d ng đ s n xuất thu c, thực ph m chức năng …

Trong những năm gần đ y Trung Qu c, Hàn Qu c, Nhật B n Đài o n và Đức là những nư c có ngành công nghiệp s n xuất nấm ăn và nấm dư c liệu rất phát tri n; đặc biệt có những bu c tiến đáng k nhân gi ng nấm trong m i trư ng dịch th Việc s dụng phương pháp cấy gi ng dịch th đ s n xuất gi ng nấm ăn và nấm dư c liệu đ đ t đư c thành công v i nhiều gi ng nấm khác nhau, t kết qu

4

thí nghiệm t i các phòng thí nghiệm cho thấy đ s các hệ s i nấm đều phát tri n

t t trong điều kiện m i trư ng dịch th thích h p [16]

Các nghi n cứu cho thấy các ho t chất triterpens polys cch rides và protein

c nguồn g c t th qu nấm inh chi đều c m i tương qu n dương t nh v i các đáp ứng miễn dịch cơ th [25, 39] T ng và cộng sự 6 đ chứng minh cid ganoderic T (AG-T một lo i l nost ne triterpenoid ở loài inh chi chu n v i hàm

lư ng µg/ml đ c th g y ức chế dòng tế bào ung thư phổi 9 th ng qu cơ chế poptosis và g y n n sự nghỉ hoá chu kỳ tế bào chỉ s u - h trong nghi n cứu này tác gi còn c ng b -T c kh năng điều chỉnh mức bi u hiện củ p và

x h i protein qu n trọng th m gi ki m soát các đi m gi i h n trong chu kỳ tế bào) [40]; h y bij nic và cộng sự đ chứng minh hiệu qu điều chỉnh miễn dịch củ polys cch ride cũng t tơ s i inh chi đỏ thu đư c b ng phương pháp nu i cấy ch m l n kh năng tăng sinh một s dòng cytokine TN -α và N -γ [15]

Nwanneka (2011) nghiên cứu nh hưởng của s i nấm Ganoderma lucidum

nuôi cấy dịch th lên vi khu n gây bệnh cho ngư i, kết qu cho thấy s i nấm trong

nuôi cấy dịch th đ tác động ch ng l i tất c các sinh vật th nghiệm: Escherichia

coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa

Các vi khu n Escherichia coli cho thấy tính mẫn c m cao nhất v i các s i nấm ở

gi i đo n 6 mm vào ngày đầu tiên nuôi cấy Đ y c th là một dấu hiệu cho thấy

Ganoderma lucidum cần đư c s dụng trong điều trị các bệnh gây ra bởi những

sinh vật này cũng như biện pháp phòng ng a ch ng l i chúng [34]

Ngoài r đáng k đến là họ protein điều chỉnh miễn dịch Ps fung l immunomodul tory protein đ ng đư c gi i kho học hết sức chú trong việc nghi n cứu s dụng điều trị các bệnh hi m nghèo P đư c phát hiện lần đầu ti n

năm 9 9 ở loài inh chi chu n v i t n gọi Z-8 (FIP-glu và cũng là P đư c

nghi n cứu kỹ nhất v i v i trò như một lo i protein ch ng dị ứng phổ rộng và điều hoà miễn dịch [22] Qin và cộng sự đ chứng minh v i hàm lư ng µg/ml

Dine và cộng sự (2008) phát hiện b n h p chất triterpenes lanostane m i là

colossolactone V (1), colossolactone VI (2), colossolactone VII (3), và

colossolactone VIII (4) đư c phân tách t qu th của nấm Hoàng chi (Ganoderma

colossum) nguồn g c t Việt Nam, cùng v i h p chất nổi tiếng colossolactone E

(5) Cấu trúc của các chất 1-4 trên đư c xác định cơ sở các b ng chứng quang phổ, hình d ng tuyệt đ i của chúng đư c xác định b ng quang phổ CD và phương pháp ester Mosher, đư c đánh giá ức chế HIV-1 protease, v i giá trị IC50 cho các h p chất m nh nhất trong kho ng 5-13 mg/ml [13]

Nấm oàng chi Ganoderma colosum Donk là một loài nấm quý hiếm của Việt

N m đ đư c nhiều công trình chứng minh có thành phần ho t chất đ d ng v i

ho t tính sinh học rất c o như kháng khu n [34], kháng HIV tuýp I [12], ức chế tế bào ung thư g n [ ] Mặc dù v i thành phần ho t chất đư c biết khá đ d ng, song các nghiên cứu hiện nay chủ yếu m i tập trung vào các triterpenoid như colossolactones (A-G) [13, 20], phenolic [13]

T n n n n cứu nấm o n c ở V t Nam

Nấm inh chi đ đư c s dụng t hàng ngàn năm ở Việt N m Năm 9 inh chi đư c nghiên cứu trong phòng thí nghiệm T năm 99 inh chi đ đư c trồng th nghiệm t i thành ph Hồ Chí Minh T năm 99 các nhà kho học Việt

đ thức hơn về giá trị sinh học và y học của nấm Linh chi, vì vậy nó đư c trồng ở nhiều nơi ở Việt Nam, ví dụ như à Nội, Thành ph Hồ Chí Minh, Hòa Bình,

kl k Pleiku m Đồng, Qu ng Bình và nhiều tỉnh khác

Các nhà khoa học tiêu bi u trong l nh vực này là TS Xu n Thám

S TS Trịnh T m iệt TS Ng nh và một s nhà khoa học khác Họ đ c

6

gắng nghiên cứu đặc đi m sinh học và y học của Linh chi t r ng Việt N m đ s n xuất và áp dụng n trong điều trị nhiều bệnh hi m nghèo TS Xu n Thám đ xuất b n: "Nấm Linh chi – Nguồn dư c liệu có giá trị t i Việt N m” iáo sư Nguyễn Thị Chính chủ trì dự án Việt Nam - Hàn Qu c "Phát tri n các kỹ thuật canh tác nấm dư c liệu, ứng dụng trong việc c i thiện sức khỏe con ngư i"; Ngô Anh và Trịnh Tam Kiệt công b 7 h p chất m i triterpenoid (colossolactones; 1-7 đư c

phân lập t qu th của một loài nấm Ganoderma colossum Donk phát hiện t i Huế,

cấu trúc của chúng đ đư c xác định b ng phương pháp MS và NMR chúng c tác dụng g y độc tế bào đ i v i L-929, K-562, và những tế bào HeLa v i IC50 giá trị

d o động 15-35 mg/ml [20]

ớ t u c un về nấm o n c

N uồn ốc, vị trí p ân loạ

ọ nấm inh chi noderm t ce e hiện biết c hơn loài v i nhiều loài quý hiếm như inh chi chu n Ganoderma lucidum r rst đ đư c s dụng

trong l nh vực y dư c ở Phương Đ ng hơn năm n y [37]

Theo công trình nghiên cứu “Phát triển sản xuất nấm trên cơ sở điều tra xây

dựng bảo tàng nấm ở Vườn quốc gia Cát Tiên ” do TS Xu n Thám và cộng sự

thực hiện năm 007 – 2010, các gi ng nấm đư c phát hiện trong quá trình kh o sát khu hệ nấm l n củ Vư n qu c gia Cát Tiên hiện đ ng đư c lưu giữ ở phòng thí

nghiệm nấm Cát Tiên (55 gi ng trong đ c loài oàng chi: Tomophagus

colossus (Hoàng chi Sài Gòn), Tomophagus cattienensis (Hoàng chi Cát Tiên), loài

m i khoa học Tomophagus sp1 [5]

Công trình nghiên cứu của Moncalvo và Ryvarden (1998) công b vào năm

1998, trên thực tế đ c kho ng 150- loài đư c mô t thuộc gi ng Ganoderma

trên toàn thế gi i [ ] Trong khi đ ở Việt Nam có kho ng 60 loài trong s này đ

đư c tìm thấy [4]

Theo Monc lvo và cộng sự t i Đ i hội Nấm học Qu c tế ở Vancouver, Canada (1994) Kết qu phân tích cấu trúc DNA của gen ribosom (các vùng ITS1, ITS2 và vùng phân hoá D2 của ti u đơn vị l n của ribosom LSU-D2) của gần 30 loài

7

Ganoderma cho thấy các loài Ganoderma khác n m r i rác gần loài Linh chi chu n

G lucidum Đáng lưu là G colossum tách biệt v i các loài Ganoderma khác

Monc lvo 99 đ chỉ ra r ng G colossum có m i quan hệ xa v i các loài

Ganoderma khác Kho ng cách bậc phân lo i giữa G colossum v i các nhóm Ganoderma khác là l n hơn h i lần so v i giữa các nhóm Ganoderma Vì vậy, dựa

vào các đặc đi m khác biệt về hình thái học thì nên tách G colossum ra thành

Tomophagus colossus (Fr.) Murr [33]

Nhưng ong và Jung đ ph n t ch phát sinh chủng lo i dựa trên kết qu của luận án tiến s năm 999 Trong nghi n cứu này đ đư r các kết qu về m i quan

hệ phát sinh chủng lo i của các loài, chi Tomophagus đư c coi là đồng ngh v i chi Ganoderma bởi vì sự khác nhau chủ yếu giữa hai chi này bị h n chế về các đặc

đi m h nh thái đ i th [14] Chúng l i gần nhau về thành phần ho t chất nhóm

Triterpene [12, 20] Những ph n t ch này đều lấy mẫu nguyên liệu G colossum t

Việt Nam [17]

Tuy nhiên cho t i nay vẫn chư c kiến th ng nhất xếp Hoàng chi vào Chi

Tomophagus hay chi Ganoderma việc sắp xếp Ganoderma colossum vào nhóm

oàng chi là đề xuất của Việt nam

Theo Lê Xuân Thám (2008), Nấm Hoàng chi có vị trí phân lo i như s u [ ]:

Nấm Hoàng chi, thuộc họ Linh chi (Ganoderma)

Tên khoa học: Ganoderma colossum

Chu trình s ng của nấm oàng chi cũng như các loài nấm đ m khác, bắt đầu

t đ m bào t hữu tính, n y mầm cho hệ s i tơ dinh dưỡng, kết thúc b ng việc hình thành cơ qu n sinh s n là tai nấm Tai nấm sinh r các đ m bào t và chu trình l i tiếp tục, bào t đ m gặp điều kiện thuận l i sẽ n y mầm, hình thành s i sơ cấp v i các tế bào đơn nh n đơn bội (n) S i sơ cấp tồn t i ngắn trong chu trình s ng Sau

đ chúng m u ch ng tiếp xúc v i s i khác tính, dung h p tế bào chất, t o ra s i

song nh n đơn bội S i thứ cấp phát tri n rất m nh và tồn t i lâu dài trong chu trình

s ng [8]

n 1.1 Chu kỳ sinh trưởng và phát tri n củ nấm Đ m [ ]

9

Đ c đ m n t nấm o n c

Cũng gi ng các lo i Linh chi khác, Nấm Hoàng Chi gồm 2 phần cu ng nấm

và mũ nấm Cu ng nấm dài hoặc ngắn, cu ng nấm t ph n nhánh đ i khi c u n khúc cong queo L p vỏ cu ng màu đỏ n u đỏ n u đen b ng kh ng c l ng phủ

su t lên mặt tán nấm Tai nấm hoá gỗ, hình qu t hoặc thận Đặc đi m khác biệt là oàng chi c v n đồng t m b ng láng màu vàng c m cho đến vàng ở mặt tr n mũ Theo các nhà khoa học Việt Nam, mẫu nấm oàng chi thu đư c ở vùng Th a Thiên Huế có các đặc tính hình thái sau: Thuộc nh m thư ng niên đư ng kính tai nấm l n đến 35 cm, độ dày 5-8 cm; cấu trúc thịt x p, trắng khi tươi giòn

khi sấy khô; bào t hình trứng, màu vàng, cấu trúc không gian có m ng lư i rõ ràng; k ch thư c bào t 9-17 × 14- … [ ]

Mẫu thu đư c t i Th a Thiên Huế và t i Tp Hồ Chí Minh (6/2008) (Hình 1.2)

đư c GS Moncalvo xác nhận phù h p v i các tác gi khác: cấu t o mềm nhũn của

mô thịt nấm và l p vỏ láng vàng ch nh Đặc đi m khác biệt là Hoàng chi có vân đồng t m b ng láng màu vàng c m cho đến vàng ở mặt tr n mũ [6]

Nh n chung theo tư liệu của nhiều tác gi G colossus đư c mô t trong chi

Tomophagus Murrill, phân biệt khá rõ v i các loài Ganoderma khác do có l p thịt

nấm rất dày, trắng mềm nhũn khi tươi và x p nhẹ khi kh hơi vàng bào t đ m

l n

ư i đ y là h nh nh một s lo i Hoàng chi:

n Th qu T colossus tự nhiên t i Q.1 Tp Hồ Chí Minh [6]

11

trư ng lỏng thu nhận hệ s i myceli Việc nu i th qu là phổ biến hơn một phần

v kỹ thuật tương đ i đơn gi n n n dễ dàng chuy n gi o và áp dụng rộng r i mặt khác th qu thu đư c m ng t nh th m mỹ c o dễ dàng thương m i hoá các y u cần b o qu n tương đ i đơn gi n tuy nhi n v i phương pháp này việc chủ động điều chỉnh thành phần ho t chất cũng như kỹ thuật tr ch ly gặp nhiều kh khăn Trong khi đ kỹ thuật nu i cấy huyền ph tế bào cho phép những ưu thế giúp gi i quyết vấn đề củ th qu như c th chủ động điều chỉnh thành phần m i trư ng theo mu n đ thu nhận ho t chất các kỹ thuật tách chiết tương đ i đơn gi n tuy nhi n điều kiện nu i cấy y u cầu tương đ i c o chỉ c th tiến hành trong phòng th nghiệm mà kh phổ biến trong nh n d n mặt khác s n ph m thu đư c kh ng th trưng bày như th qu

iện n y việc xác định điều kiện nu i cấy dịch th cho nấm Ganoderma cũng

đ đư c nghi n cứu nhiều nh m tiến t i x y dựng quy tr nh khép k n cho việc nu i cấy cũng như tách chiết cho ri ng t ng ho t chất

Y ng và cộng sự đ thăm dò sự nh hưởng củ một s điều kiện nu i cấy

huyền ph l n sự tăng trưởng sinh kh i loài G lucidum kết qu cho thấy sinh kh i

hệ s i phụ thuộc vào rất nhiều yếu t t chủng nấm đến các điều kiện p nhiệt độ

độ thoáng bề mặt t c độ lắc k ch thư c hệ nu i cấy…v i các điều kiện đư c rút r

b o gồm: p b n đầu ph h p trong d i - trong m i trư ng P bổ sung glucose-NH4Cl; nhiệt độ nu i cấy t i ưu trong kho ng -350C; độ thoáng bề mặt

t t nhất ở các b nh t m giác ml; và t c độ lắc cho kết qu t t nhất ở rpm

V i m i trư ng t i ưu này sinh kh i c o nhất đ thu đư c là mg/ ml [ 6] Một nghi n cứu khác củ Ch nd n và cộng sự chỉ r các điều kiện

nu i cấy ph h p cho sinh kh i G lucidum ở nhiệt độ -300C p = m i trư ng

P c bổ sung mmonium cet te glycine rginin và c lcium nitr t

Va tr của nấm o n c

1.1.3.1 Thành phần hóa học

Theo Xu n Thám thành phần h học củ oàng chi gồm:

- Polysaccharides

ơn polys cch ride đ đƣ c phân tích t qu th và s i nấm của

Ganoderma trong đ → -β-D-glucan là phân lập t bào t của Ganoderma colossum Sở Y tế dự phòng Nhật n đ nghi n cứu chỉ r các polys cch rides c

t nh ch ng kh i u k ch th ch miễn dịch ch ng vi m tr tim và thuộc t nh h

đƣ ng huyết nopoly là một polys cch ride phần dịch chiết xuất t G lucidum

đƣ c cấp b ng sáng chế kỹ thuật sinh h về s n ph m điều trị đ i v i các bệnh

m n t nh nhƣ ung thƣ và bệnh g n ở nhiều nƣ c ch u Á

- Hợp chất đắng Triterpenoids

13

Triterpenes là một chất đư c tìm thấy trong gi ng Ganoderma,cũng đư c gọi là

axit ganoderic Trong năm 9 các nhà kho học Nhật B n nhận biết 100 triterpenes trong nấm Linh chi Các h p chất này thư ng đư c phân tách t qu th hoặc bào t Triterpenes v i hương vị khá đắng Triterpenes đầu tiên (axit ganoderic đư c tách biệt vào năm 9 và k t đ 137 lanostane lo i triterpenoids

đ đư c xác định [26]

Các nghiên cứu đ chỉ ra r ng những axit ganoderic ho t động gi ng như một chất ch ng dị ứng (hist mine và do đ rất t t cho các bệnh dị ứng Triterpenes là steroid có tác dụng ức chế phát tri n của tế bào, b o vệ gan Chúng nh hưởng đến kết tập ti u cầu; và ức chế enzyme angiotensionconverting (ACE) và phóng thích

histamin

- Germanium (Ge)

Germanium trong G lucidum có th tăng hấp thụ oxy bởi máu l n đến 1,5 lần;

có th thúc đ y sự tr o đổi chất; ngăn ng a sự thoái hóa mô Theo Kazuhiko Asai,

Ganoderma chứa 800 -2000 ppm của germanium Nhiều hơn -6 lần so v i nhân

sâm

trị dược ọc

Trong nấm Linh chi nói chung, có nhiều nhóm ho t chất như polys cch ride protein mà tiêu bi u lo i protein lingzhi-8 là tác nhân ch ng dị ứng phổ rộng và tăng cư ng tính miễn dịch rất hữu hiệu đồng th i duy trì các kháng th ch ng

kháng nguyên viêm gan B [16] Theo một s công trình gần đ y cho biết, loài G

lucidum còn có các ho t chất sinh học có b n chất protein có ho t tính kháng sinh,

ức chế vi khu n Salmonella typhi, Staphylococcus aureus [6]

Về thành phần ho t chất của nấm Hoàng chi, ho t chất đầu ti n đư c nghiên cứu là họ triterpenoid v i 7 lo i colossolactones (A- đ đư c công b v i ho t

t nh kháng độc tế bào, kháng dòng tế bào HeLa, kháng viêm (thông qua kh năng

ức chế enzyme α-hydroxysterol dehydrogenase) [20]

14

Ho t chất các colossolactone ly trích t Hoàng chi bi u hiện kh năng kháng dòng HIV tuýp 1 thông qua ho t tính ức chế enzyme HIV-1 protease (một enzyme quan trọng trong tái b n của HIV) [21] Hai phenolic là Ganomycin B và Ganomycin I có kh năng ức chế sự Dimer hoá và tâm ho t động củ enzyme V-

1 protease chỉ v i hàm lư ng 1, 0-7, 5 µg/ml

Một nghiên cứu khác củ Đoàn Suy Ngh và Nguyễn Thị Thủy cho thấy trong nấm Hoàng chi trồng t i Th Thi n uế có chứa một s thành phần flavonoid (chiếm % đư ng kh (chiếm 5, 33%), vitamin C (chiếm 0, 089%) và c ba

nh m này đều có ho t tính kháng khu n m nh đ i v i c nh m vi khu n + (B

pumilus, B cereus, B subtilis, S aureus và vi khu n - (E coli, S typhi, V

parahaemaliticus) [2]

Dịch chiết nấm Hoàng chi nuôi trồng ở nồng độ 3,67% có kh năng b o vệ tế

bào nấm men S cerevisiae v i t lệ s ng sót t 22 - 53% khi bị chiếu tia cực tím ở

bư c s ng λ = nm trong th i gian chiếu t 2 - 10 giây [1]

Mặc dù thành phần hoá học và ho t chất của nấm Hoàng Chi là rất đ d ng,

song còn nhiều ho t chất rất quan trọng đ đư c biết trong họ Ganodermataceae

như polys cch ride và protein vẫn rất t th ng tin đề cập trong đ c họ protein

điều chỉnh miễn dịch Ps

ọ prote n đ ều c n m n dịc Ps

Một họ protein FIPs (family of fungal immunomodulatory protein) có vai trò quan trọng trong điều chỉnh miễn dịch đ đư c phát hiện gần đ y ở nhiều loài nấm khác nh u Cho đến n y đ c tất c 7 protein trong họ Ps đư c tìm thấy ở các

loài nấm khác nhau bao gồm LZ-8 (FIP-glu) trên loài Ganoderma lucidum [21], FIP-gts trên loài Ganoderma tsugae [35], FIP-fve trên loài Flammulina velutipes [23], FIP-vvo trên loài Volvariella volvacea [18], FIP-gja (AY987805) trên loài

Ganoderma japonicum, FIP-gmi trên loài Ganoderma microsporum [44], và FIP-gsi

trên loài Ganoderma sinensis [48] Các protein trong họ Ps đư c tìm thấy có sự

tương đồng rất cao về mặt cấu trúc và t nh năng

15

Cấu trúc

Các protein Ps tương tự v i vùng biến đổi trong chuỗi nặng của Globulin miễn dịch [11, 39] Trong mỗi phân t protein P đều có một đo n xoắn α α-helix) bao gồm 10 amino acids t i đầu N có vai trò quan trọng nhất trong các đáp ứng miễn dịch v i các amino acid quyết định là Leu-5, Phe-7 và Leu-9 [30, 31] Có một sự tương đồng cao về s lư ng và thành phần amino acid giữa các FIPs: Tổng

s amino acid trong mỗi phân t P đều vào kho ng 110-114 (FIP-glu có 110 aa; FIP-gsi có 111 aa; FIP-fve có 114 aa; FIP-vvo c ;… v i t lệ c o hơn của

lysine so v i rginine tương đ i giàu sp r gine và v line nhưng kh ng c sự hiện diện của 3 amino acid histidine, cysteine và methyonine Các FIP có kh i lư ng trung bình t 11kDa - 15kDa [44]; ngoài cấu phần α-helix tương đồng giữa các FIPs thì các phần còn l i trong chuỗi polypeptide cũng c sự trùng lặp cao về thành phần amino acid (B ng 1.1)

16

Bảng 1.1 Đặc t nh cơ b n củ một s protein Ps

Loại FIP

Khối lượng (kD)

m lượng đường (%)

Hình 1.5 Trình tự amino acid của một s FIP [27]

Trong tự nhiên, protein FIP tồn t i ở d ng cấu trúc cấp hai (secondary

structure đến cấp đ i v i FIP-gmi đi n hình v i kh năng nhị trùng hoá

(dimerization) hình thành cấu trúc homodimer nh cấu phần xoắn α t i đầu N,

nh vậy FIP có kh năng li n kết v i các thụ th trên bề mặt tế bào giúp thực hiện các ph n ứng điều chỉnh miễn dịch đặc hiệu [31]

Các th nghiệm l m sàng đ chứng minh tất c các protein P đều có những

t nh năng tương tự nhau:

- Đều có kh năng thực hiện các ph n ứng ngưng kết hồng cầu đ i v i máu

c u, chuột nhưng kh ng bi u hiện đ i v i ngư i, ngoài ra sự có hay không liên kết

v i các g c đư ng (mono hoặc dis cch rides đều không nh hưởng đến ho t tính điều chỉnh miễn dịch [18, 23, 27]

- FIP có kh năng điều chỉnh các đáp ứng miễn dịch cơ th thông qua một s

cơ chế quan trọng:

+ Tác động đến cơ qu n ympho ngo i vi b ng các ph n ứng g y tăng sinh tế bào lách spleen cells th ng qu tăng cư ng ho t tính của enzym DNA polymerase + Ức chế các ph n ứng quá mẫn củ cơ th (anaphylaxis reaction) thông qua

18

cơ chế ngăn chặn sự s n sinh kháng th b ng cách ức chế tế bào mast s n sinh histamine, tuy nhiên mức độ ức chế ph n ứng quá mẫn có sự khác biệt giữa các FIP

(FIP-vvo kém hơn P-glu và FIP-fve)

+ B ng con đư ng điều hoà Cytokine, các FIP có kh năng k ch th ch cơ th tự

s n sinh các interleukin: FIP-glu k ch th ch cơ th sinh m nh các IL-2, IL-8,

interferon gamma -INF-γ yếu t gây ho t t kh i u TNF- α tumor necrosis f ctor

alpha), và IL-2 receptor (IL- R điều chỉnh sự cân b ng IL-2/IL-4 [27]; FIP-gts giúp tăng cư ng tăng sinh -2 [19]; FIP-fve kích thích sự s n sinh IL-2, IFN-γ và TNF- α [ 6]; P-vvo k ch th ch cơ th nâng cao sự bi u hiện IL-2, IL-4, TNF- α IFN-γ lymphotoxin (LT), và IL-2R [18]; FIP-gsi kích thích tế bào lách tăng cư ng

kh năng bi u hiện đ i v i IL-2, IL-3, IL-4, IFN-γ và TN – α và - R [ ]…

t đ điều chỉnh các cơ chế miễn dịch cơ th

Hình 1.7 ư c đồ minh họ cơ chế điều hoà của FIP theo con đư ng cytokine [27]

T ếp cận l u p p c ữa trị un t ư dựa tr n Ps

Trong m i trư ng in vivo, tế bào động vật thư ng phát tri n các chương tr nh

điều hoà nh m đ m b o sự duy trì ổn định các tr o đổi sinh hoá dẫn đến việc chủ động ki m soát quá trình phân bào theo một quỹ đ o nhất định Nếu các quá trình sinh hoá diễn ra bất ổn nguy cơ mất ki m soát phân bào diễn ra thì lập tức tế bào đ

sẽ đư c kích ho t một hệ th ng s a chữa hoặc đ y tế bào đ r khỏi chu kỳ chung của sự phân bào (nếu không th s a chữ và đi vào ph l o hoá hoặc là chết theo chương tr nh nh m tránh cho cơ th phát sinh ung thư Một khi tế bào b nh thư ng

đ bị apoptosis hay lão hoá thì sẽ không th quay trở l i chu kỳ tế bào nhưng điều

19

này hoàn toàn không x y ra ở tế bào ung thư Ch nh v vậy, b ng cách nào đ đư tế bào ung thư r khỏi quỹ đ o đư c ki m soát chặt chẽ bởi tế bào g c ung thư là một vấn đề kh và các hư ng tiếp cận hiện n y cũng chỉ m i đ t đư c những thành công nhất định

Các khám phá gần đ y ngày càng cho thấy vai trò quan trọng của họ protein điều chỉnh miễn dịch (FIPs) trong việc tiếp cận gần hơn đến chu kỳ tế bào ung thư

* Vai trò chốn tăn s n v â apoptos s c c tế b o un t ư của FIP

Lin JW và cộng sự đ xác định ho t tính ch ng tăng sinh dòng tế bào eukemi N ung thư b ch cầu) b ng h i phương pháp MTT và flow cytometry (FCM), kết qu cho thấy v i hàm lư ng 32µg/ml LZ- đ c kh năng g y apoptosis Leukemia NB4 t i % [ 9] th m vào đ i ng và cộng sự cho r ng kh năng g y poptosis của LZ- đ i v i dòng tế bào này c li n qu n đến nhân tế bào

[28] Mặc d cơ chế còn chư rõ song kh năng ức chế ung thư của FIP-gts đ đư c

chứng minh qua nhiều công trình nghiên cứu: kh năng kháng dòng tế bào ung thư phổi A549 thông qua sự gây nghỉ hoá chu kỳ tế bào t i pha G1 và có th đ y dòng tế bào này vào apoptosis [29, 38], Liao và cộng sự đ đư r kết qu dòng tế bào A549

đ bị ức chế tăng sinh bởi FIP-gts t 20% - 40% sau 48 gi và đ t cao nhất 60% sau

72 gi v i hàm lư ng s dụng 4- µg/ml hàm lư ng 4-8 µg/ml FIP-gts có kh năng

ngăn chặn sự di căn củ ung thư nh sự ức chế enzyme mettalloproteinase-2 2)- một enzyme quan trọng trong sự di căn tế bào [29] Nghiên cứu trên dòng tế bào ung thư cổ t cung Si và C ski đ đư c chuy n gen nm23-H1 (nometastatic

(MMP-clone 23 type 1- một gen ức chế ung thư kết qu cho thấy FIP-gts gây nên sự gi m

phân chia của c hai dòng tế bào này nh kh năng n ng c o sự bi u hiện của gen nm23- đồng th i ức chế enzyme MMP-2 [42]

Khi s dụng FIP-fve lư ng kháng th đặc biệt dành cho kh i u ở chuột đ tăng lên 386, 6% [24] FIP-fve có kh năng k ch th ch các tế bào ruột non s n sinh m nh

TNF-α và NO n ng c o kh năng giết các tế bào ung thư [ ]

Kh năng ức chế xâm lấn và di căn của tế bào ung thư phổi bởi FIP-gmi bởi sự

20

ức chế yếu t sinh trưởng bi u mô (epidermal growth factor- EGF)- yếu t quan trọng trong sự xâm lấn và di căn tế bào ung thư phổi [32]

* Vai trò gây lão hoá tế b o un t ư

Một hư ng tiếp cận khác đ i v i các tế bào ung thư là dựa trên FIP gây nên sự lão hoá tế bào th ng qu h i cơ chế chính: Sự lão hoá tái b n nh kh năng ức chế

ho t tính enzyme telomerase khiến NST tế bào ung thư sẽ ngắn đi s u mỗi lần phân chi và đi vào ph l o hoá theo chương tr nh đúng diễn ra ở tế bào b nh thư ng

Có nhiều cách đ thăm dò kh năng ức chế ho t tính telomerase ở tế bào ung thư và P đ đư c th nghiệm kh năng ức chế ho t tính của một s yếu t kích

ho t phiên mã Liao và cộng sự đ c ng b kh năng ức chế hoàn toàn của FIP-gts

lên sự tương tác của vùng E-box (CACGTG) trên hTERT promoter v i yếu t kích

ho t phiên mã c-myc trong dòng tế bào ung thư phổi A549 t đ mà làm gi m kh

năng điều hoà của telomerase[29] Các tác gi đ s dụng reFIP-gts đ nghiên cứu

kh năng g y stress oxy hoá l n dòng tế bào ung thư phổi A549 và CaLu-1, kết qu

t lệ enzyme SA-β-g l ctosid se đ tăng l n đáng k trong các công thức nghiên cứu và đ t cao nhất sau 96 gi là % đ i v i 9 và % đ i v i CaLu-1 Bên

c nh đ kết qu còn cho thấy hàm lư ng các ti u th lysosome tăng lên t 22, 3% - % và đặc biệt là việc protein p tăng l n một cách đáng k đ l gi i sự nghỉ hoá chu kỳ tế bào cũng như l o hoá tế bào tiền trưởng thành (p27 là yếu t ức chế cdk2 và có liên quan chặt chẽ v i sự nghỉ hoá chu kỳ tế bào cũng như l o hoá tế bào tiền trưởng thành [10]

21

C ươn

NỘ DUN VÀ P ƯƠN P ÁP N ÊN CỨU

2.1 Nộ dun n n cứu

- Nghi n cứu điều kiện nhiệt độ độ p nh hưởng l n sự sinh trưởng củ hệ

s i nấm oàng chi trong m i trư ng dịch th

- Xác định đo n gen quy định protein điều chỉnh miễn dịch P t nấm oàng chi

- Thu nhận protein P t nấm oàng chi th nghiệm ho t tính ch ng ngưng kết máu của FIP

Vật l u, a c ất t í n m

C ủn nấm n n cứu

Chủng nấm oàng chi (G colossum ở hệ s i đư c cung cấp bởi phòng th

nghiệm bộ môn Sinh học Trư ng Đ i học Thủ ầu Một tỉnh nh ương C nguồn g c t Phòng Th nghiệm Nuôi trồng nấm, Bộ môn Thực vật, Khoa Sinh học, Trư ng Đ i học Khoa học Huế)

7,

0

ịch th PD 35g/l sucrose, 5g/l peptone, 2, 5g/l yeast 6,

22

extract, 0, 5g/l MgSO4, 1g/l KH2PO4, 0, 05g/l vitamin B1

- Agarose, TAE 1X, DNA ladder 1 kb (BioNEBs)

- Dung dịch nhuộm DNA

- Ethidium bromide 10 mg/l

2.2 a c ất d n tron sắc k lọc el, đ n d protein

a c ất d n tron sắc k lọc el

- Coomassie Brilliant Blue (CBB): 0,001g

- Eth nol tuyệt đ i: g

24

- Thang protein chu n S S-PAGE (Bio-Rad)

ản Thành phần các protein chu n s dụng làm th ng chu n S S-PAGE

- Sodium Dodecyl Sulfate [SDS]

- Ammonium persulfate [(NH4)2S2O8][APS]

- Coomassie Brilliant Blue G 250 (Bio-Rad)

- Sodium dodecyl sulfate (SDS) 10%

- ung dịch đệm gel ph n tách s p r ting gel buffer Tris-Cl 1,5M, pH8,8 – 0.4% SDS

- ung dịch đệm gel gom st cking gel buffer Tris – Cl 0,5M, pH 6,8 – 0.4% SDS

25

- Ammoniumpersufate 10%

- ung dịch đệm điện di Tris-glycine pH 8.3

- ung dịch n p mẫu X X tre tment buffer

- 0,2ml mercaptoethanol

- ung dịch nhuộm gel: Coom ssie lue eth nol tuyệt đ i cid cetic

- ung dịch gi i nhuộm: meth nol xit cetic

ệ s i nấm oàng chi đư c nu i cấy tăng sinh kh i theo phương pháp củ Nguyễn á Tư [9]

- S i nấm đư c nu i cấy trong m i trư ng P c i tiến chứ g/l kho i tây, 20g/l dextrose, 1, 5g/l MgSO4.7H2O, 2, 5g/l KH2PO4, 10mg/l vitamin g/l

S u đ p m i trư ng dịch th đư c điều chỉnh ở các d i 6 và v i việc thêm 1N NaOH hoặc Cl và nu i trong ngày và ngày ở các nhiệt độ 200C,

240C, 280C và 320C trong điều kiện t i Thu s n ph m ở ngày thứ và ngày thứ đem ly t m v i t c độ 3000 vòng/phút trong 10 phút, lấy phần đáy r a ba lần v i

nư c cất s u đ sấy khô và cân trọng lư ng, các thí nghiệm đư c lặp l i 3 lần

Bảng 2.5 Các nghiệm thức kh o sát điều kiện nuôi cấy s i nấm

S nghiệm thức: 4, s lần lặp l i: tổng s mẫu th nghiệm: 96

27

- Chuy n bột s ng ng nghiệm chứ μl dung dịch đệm chiết đ đƣ c ủ

ấm t trƣ c chứ % S S mmol/l N c p mmol/l E T p mmol/l N Cl p và lắc nhẹ nhàng

- Hỗn h p đƣ c ủ trong máy điều nhiệt kho ng 30 phút,

- Ly tâm hỗn h p ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút

- Chiết lấy dịch lỏng ở l p trên sang một ng nghiệm chứa kho ng 2/3 dung tích dung dịch KAc 2,5mol/l (pH 4,8)

- Lắc nhẹ, ủ ở 0oC trong 30 phút

- Ly tâm 10.000 vòng/phút ở 4oC trong vòng phút đ lo i bỏ protein

- Chiết lấy dịch lỏng ở l p trên sang một ng nghiệm m i chứa 2/3 dung tích isopropanol l nh

- Ủ kho ng 16 gi ở 4oC

- Ly tâm, r a phần kết tủa v i ethanol 70%

- Làm khô và t o huyền phù v i μl dung dịch đệm TE

- N đƣ c b o qu n ở -20oC

2.3.2.2 uếc đạ đoạn en qu địn prote n P bằn p ản ứn PCR

Mồi củ ph n ứng PCR đƣ c x y dựng theo mồi Z [32]

- Mồi Z xu i: ’-TCCGACACTGCCTTGATCTTC- ’

- Mồi Z ngƣ c: ’-GTTCCACTGGGCGATGATG- ’

Thiết lập chu trình ph n ứng PCR trên máy PTC-100TM nhƣ s u [ 7 ]:

Đánh giá nồng độ và độ tinh s ch củ mẫu N b ng máy qu ng phổ

Nồng độ N đƣ c xác định s dụng máy đo qu ng phổ N nodrop Thermo Scientific ấy μl mẫu N cho vào máy đo S liệu O 260, OD280

đƣ c đánh giá và quy về nồng độ củ N mg/ml Độ tinh s ch củ N th hiện qu t lệ O 260/OD280

2.3.2.4 Đ n d trên gel agarose

Chất lƣ ng N đƣ c ki m tra b ng điện di: Lấy μl của mỗi mẫu DNA cho vào giếng trên gel agarose 0,8%, tiến hành điện di trong dung dịch đệm TAE 1X ở điện áp 80 V trong 50 phút Nhuộm gel b ng ethidium bromide và quan sát

Hệ s i đƣ c thu nhận t dịch lỏng, nghiền nhỏ và r a nhiều lần v i PBS

mM s u đ đem ly t m vòng/phút trong kho ng 10 phút

Thu dung dịch và đ ng c trong điều kiện l nh thăng ho làm giàu protein

Ch y sắc ký lọc gel xác định ph n đo n trong kho ng 11 – 15 KD

A N u n tắc

29

ỹ thuật sắc k lọc gel d ng đ tách những ph n t c k ch thƣ c trọng lƣ ng

ph n t khác nh u b ng cách cho chúng đi qu cột gel Những ph n t c k ch thƣ c đủ nhỏ đ lọt vào b n trong lỗ gel sẽ bị tr ho n và di chuy n chậm qu cột trong khi những ph n t l n hơn di chuy n b n ngoài các h t gel n n sẽ di chuy n

C n g gel “ iogel P ” kh cho bột gel t t vào dung dịch đệm Tris-HCl

mM p đựng trong c c ng dung dịch đệm Tris- Cl mM p nhiều gấp lần so v i th t ch l p nền gel cần cho trong cột t nhất x = 6 ml dung dịch đệm

Bio-Gel P- cần gi ở oC đ hydr te h hoặc gi nếu bắt đầu ở

100oC S u khi th huyền ph đồng nhất củ các h t gel h nh thành đ ổn định trong su t quá tr nh hydr te h

S u khi quá tr nh hydr te x y r hoàn toàn g n l p nổi tr n bề mặt Chuy n dung dịch vào một b nh hút ch n kh ng c gắn v i vòi hút ch n kh ng h kh củ dung dịch trong kho ng t - phút thỉnh tho ng lắc nhẹ xo y b nh

Th m dung dịch đệm kh kh v i th t ch gấp h i lần th t ch l p nền 6 ml

và lắc nhẹ Đ gel ổn định cho đến khi 9 - 9 % s h t ổn định n hoặc lo i l p

hi cột đ đƣ c n p đầy gel kh đầu r outlet củ cột và gắn flow d ptor

Mở kh đầu r củ cột và cho dung dịch đệm v i th t ch gấp h i lần th t ch l p nền 6 ml ch y qu cột lúc điều khi n t c độ ch y

Đ ng đầu r củ cột và điều chỉnh flow d ptor xu ng đến l p nền gel N p mẫu vào tr n bề mặt l p nền b ng cách bơm hoặc ti m mẫu vào tr n l p nền gel qu flow d ptor Nếu ti m mẫu th t c độ dòng ti m kh ng n n vƣ t quá t c độ dòng tách đề nghị

= nm ở mỗi ph n đo n ghi nhận các pe k t o thành Các ng c sự hiện diện sẽ

đƣ c dồn l i t ng pe k đ đem đi xác định hàm lƣ ng Theo kết qu tr n t nh hiệu suất hàm lƣ ng protein thu đƣ c qu lọc gel

31

Hình 2.1 ệ th ng sắc ký lọc gel 2.3 Đ n d prote n D -PAGE

A Nguyên tắc

SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) là một k thuật điện di tr n gel poly cryl mide khi c sự hiện diện củ S S đ y là một tác nh n làm biến t nh và m t nh h các ph n t protein Trong k thuật này protein đư c x l v i chất t y S S và tác nh n kh cầu n i disulfite là merc ptoeth nol hoặc dithiotheitol TT V i các tác nh n này protein t cấu trúc bậc đư c biến đổi thành chuỗi polypeptide bậc và tất c các protein đều

đư c t ch điện m Nh đ sự di chuy n trong gel củ các ph n t protein chỉ phụ thuộc vào k ch thư c những ph n t c k ch thư c l n sẽ di chuy n chậm hơn những ph n t c k ch thư c nhỏ khi đi qu một lỗ gel c k ch thư c nhất định

ư i tác dụng củ điện trư ng các ph n t t ch điện m sẽ di chuy n về cực dương

và các phân t t ch điện dương sẽ di chuy n về cực m củ điện trư ng

32

- Gel phân tách (separating gel):

+ Cho các thành phần s u theo thứ tự vào becher ml s ch :

- Gel gom (Stacking gel):

+ Cho các thành phần s u theo thứ tự vào một echer ml khác: