Sàng lọc và định danh một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm phytophthora SP gây bệnh trên cây có múi ( luận văn thạc sĩ chuyên ngành công nghệ sinh học)

Sàng lọc và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm Phytophthora sp gây bệnh trên cây có múi .... Kết quả sàng lọc và nghiên cứu một

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ DIỆU HƯƠNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo

vệ lấy bất kì học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 24 tháng 09 năm 2019

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Diệu Hương

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, em đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn

bè và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép em được bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc tới TS Phạm Hồng Hiển và TS Nguyễn Xuân Cảnh đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các cán bộ tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Vi sinh, toàn thể các anh, chị, bạn bè và các em đang thực tập và nghiên cứu tại phòng thí nghiệm đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp

Và cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, em xin gửi lời cảm

ơn sâu sắc tới bố mẹ và những người thân của em đã nuôi nấng, động viên và luôn tạo động lực cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 24 tháng 09 năm 2019

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Diệu Hương

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

Trích yếu luận văn x

Thesis abstract xii

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Mục đích nghiên cứu của đề tài 2

1.2 Yêu cầu của đề tài 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Tổng quan tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi 3

2.1.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi trên thế giới 3

2.1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi ở Việt Nam 4

2.2 Sâu bệnh hại trên cây có múi 4

2.3 Giới thiệu nấm Phytophthora gây bệnh trên cây có múi 6

2.3.1 Nấm Phytophthora 7

2.3.2 Cơ chế gây bệnh 11

2.3.3 Biện pháp phòng trừ 12

2.3.4 Ứng dụng vi sinh vật vào đối kháng bệnh hại thực vật 13

2.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài trong và ngoài nước 15

2.4.1 Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài ở ngoài nước 15

2.4.2 Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài ở trong nước 17

Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 19

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 19

3.2 Vật liệu 19

3.3 Môi trường nghiên cứu 19

3.4 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất sử dụng 20

3.4.1 Dụng cụ 20

3.4.2 Thiết bị 20

3.4.3 Hoá chất 20

3.5 Phương pháp nghiên cứu 20

3.5.1 Giữ giống vi sinh vật 20

3.5.2 Phương pháp phân lập mẫu nấm bệnh 20

3.5.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của chủng nấm 22

3.5.4 Phương pháp tái lây nhiễm 23

3.5.5 Đánh giá dặc điểm sinh học 23

3.5.6 Phương pháp xác định hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh của các chủng vi sinh vật 24

3.5.7 Khảo sát một số đặc điểm hình thái và sinh học của chủng vi sinh vật 25

3.5.8 Định danh chủng nấm bệnh, xạ khuẩn, vi khuẩn 27

Phần 4 Kết quả và thảo luận 31

4.1 Phân lập và xác định chủng nấm Phytophthora sp gây bệnh trên cây có múi 31

4.1.1 Phân lập 31

4.1.2 Lây nhiễm nhân tạo 33

4.1.3 Đặc điểm hình thái 34

4.1.4 Một số đặc điểm sinh học của chủng HDB và DB5 35

4.1.5 Định danh chủng nấm DB5 37

4.2 Sàng lọc và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm Phytophthora sp gây bệnh trên cây có múi 39

4.2.1 Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng 39

4.2.2 Một số đặc điểm sinh học và phân loại chủng xạ khuẩn 38 40

4.2.3 Định danh chủng xạ khuẩn 38 43

4.2.4 Một số đặc điểm sinh học và phân loại hai chủng vi khuẩn VK1 và VK2 45

4.2.5 Định danh 2 chủng vi khuẩn VK1 và VK2 48

4.4 Thảo luận 50

4.4.1 Kết quả phân lập và xác định chủng nấm Phytophthora sp gây bệnh trên cây 51

4.4.2 Kết quả sàng lọc và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm Phytophthora sp gây bệnh trên cây có múi 52

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 54

5.1 Kết luận 54

5.2 Kiến nghị 54

Tài liệu tham khảo 55

Phụ lục 58

DNA Deoxyribonucleic acid

EDTA Ethylene Diamine Tetracetic Acid EtBr Ethidium bromide

FAO Food and Agriculture Organization of

the United Nations FCOJ Frozen Concentrate Orange Juice

PDA Potato D-glucose agar

RNA Ribonucleic acid

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Một số đặc điểm hình thái của các chủng nấm phân lập được 32

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Một số bệnh điển hình trên cây có múi do nấm Phytophthora gây ra 7 Hình 2.2 Hình thái nấm Phytophthora 8 Hình 2.3 Chu kì sống của Phytophthora 9

Hình 4.1 Một số dấu hiệu bệnh ở những cây thu mẫu (A) rễ; (B) (C) (D) thân;

(E) (F) (G) lá; (H) quả 31 Hình 4.2 Phân lập bằng phương pháp bẫy bằng cánh hoa hồng 31 Hình 4.3 Tái lây nhiễm trên quả chanh sau 1 tuần 34 Hình 4.4 Đặc điểm hình thái của 2 chủng nấm HDB và DB5 quan sát qua kính

hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần 34 Hình 4.5 Khả năng sinh enzyme cellulase của 2 chủng nấm HDB và DB5 36 Hình 4.6 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của 2 chủng

nấm HDB và DB5 sau 2 ngày nuôi 37 Hình 4.7 Cây phân loại của chủng DB5 được xây dựng bằng phần mềm

MEGA7 38 Hình 4.8 Hoạt tính đối kháng của một số chủng vi khuẩn và xạ khuẩn với 2 chủng

nấm bệnh HDB và DB5 trên môi trường PGA sau 3 ngày nuôi cấy 39 Hình 4.9 Quan sát hình thái chủng xạ khuẩn 38 40 Hình 4.10 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sinh trưởng, phát triển của chủng

xạ khuẩn 38 sau 4 ngày nuôi cấy 41 Hình 4.11 Khả năng sinh sắc tố Melanin của chủng xạ khuẩn 38 trên môi trường

ISP6 ở 37oC sau 5 ngày nuôi cấy 42 Hình 4.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của chủng xạ khuẩn

38 trên môi trường Gause-I sau 5 ngày nuôi cấy 43 Hình 4.13 Cây phân loại của chủng 38 được xây dựng bằng phần mềm MEGA7 44 Hình 4.14 Đặc điểm hình thái của 2 chủng vi khuẩn VK1 và VK2 trên môi

trường LB ở 30oC sau 2 ngày nuôi cấy 45 Hình 4.15 Khả năng di động của hai chủng vi khuẩn VK1 và VK2 nuôi cấy trên

môi trường LB ở 30°C sau 2 ngày nuôi 46 Hình 4.16 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của chủng vi

khuẩn VK1 trên môi trường LB sau 2 ngày nuôi cấy 47

Hình 4.17 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn

VK2 trên môi trường LB sau 2 ngày nuôi cấy 47 Hình 4.18 Cây phân loại của chủng VK1 được xây dựng bằng phần mềm MEGA7 49 Hình 4.19 Cây phân loại của chủng VK2 được xây dựng bằng phần mềm MEGA7 50

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Nguyễn Thị Diệu Hương

Tên luận văn: Sàng lọc và định danh một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng

nấm Phytophthora sp gây bệnh trên cây có múi

Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 8420201

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu: Sàng lọc và định danh một số chủng vi sinh vật có khả năng đối

kháng nấm Phytophthora sp gây bệnh trên cây có múi

Phương pháp nghiên cứu:

Tất cả thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện invitro với đầy đủ thiết bị, máy

móc, hóa chất cần thiết

Các mẫu thu thập được từ rễ, thân, lá và quả ở cây cam, chanh, bưởi với đặc điểm: thối rễ, tàn lụi lá, thân xì mủ, thối quả Mẫu thu tại các vùng Thái Bình, Hà Nội, Phú Thọ, Yên Bái Tiến hành phân lập nấm bệnh từ các mẫu đã thu thập Các chủng nấm phân lập được đem lây nhiễm nhân tạo để xác định một số chủng nấm gây bệnh trên cây có múi Kết hợp các đặc điểm sinh học và phương pháp sinh học phân tử tiến hành định danh chủng nấm gây bệnh

Phương pháp hoạt hóa, nuôi cấy, thử khả năng đối kháng của xạ khuẩn và vi

khuẩn với nấm Phytophthora sp gây bệnh bằng phương pháp đồng nuôi cấy Nghiên

cứu ảnh hưởng tới sinh trưởng của xạ khuẩn, vi khuẩn qua các yếu tố: môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, khả năng chịu muối, khả năng sinh melanin Phương pháp tách chiết DNA

và định danh chủng vi khuẩn, xạ khuẩn đối kháng với các chủng nấm nghiên cứu

Kết quả chính và kết luận:

1 Phân lập được 5 chủng nấm DB1, HDB, HQC, RB, DB5 trong đó hai chủng nấm DB5, HDB có khả năng gây bệnh cây trên cây có múi Cả 2 chủng nấm nghiên cứu đều không có khả năng sinh enzyme cellulase, phát triển tốt ở môi trường giàu dinh dưỡng

2 Chủng HDB có hệ sợi phân nhánh, không có vách ngăn, chuỗi bào tử hình chùm, bào tử hình tròn Chủng DB5 có hệ sợi phân nhánh, không có vách ngăn, chuỗi bào tử hình chùm, bào tử hình quả chanh Kết hợp các đặc điểm sinh học và phương

pháp sinh học phân tử, đặt tên cho chủng DB5 là Phytophthora colocasiae DB5

3 Tuyển chọn được 1 chủng xạ khuẩn số 38 và 2 chủng vi khuẩn VK1, VK2 đối kháng với nấm HDB và DB5 Chủng 38 có khuẩn lạc hình tròn, tâm lồi Màu trắng

xám Sau 7 ngày nuôi cấy, màu sắc khuẩn lạc chuyển sang màu xám Sau 24h đã xuất hiện hệ sợi, hệ sợi phân nhánh, xuất hiện cuống sinh bào tử dạng xoắn Sau 36h, cuống sinh bào tử dần duỗi thẳng, xuất hiện bào tử Chủng vi khuẩn VK1 có khuẩn lạc tròn, nhỏ, mép trơn, bề mặt nhày là trực khuẩn Gram âm Chủng vi khuẩn VK2 khuẩn lạc tròn, nhỏ, mép trơn, bề mặt khô, trực khuẩn Gram dương

4 Kết hợp các đặc điểm sinh học và phương pháp sinh học phân tử, đặt tên cho

chủng vi khuẩn VK1 là Pseudomonas aeruginosa VK1, chủng vi khuẩn VK2 là Bacillus

velezensis VK2, chủng xạ khuẩn 38 là Streptomyces mutabilis 38

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Nguyen Thi Dieu Huong

Thesis title: Screening and identification of microorganism strains resistant to pathogenic

Phytophthora sp fungi on citrus

Major: Biotechnology Code: 8420201

Educational organnization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives: Screening and identification of microorganism strains resistant to

pathogenic Phytophthora sp fungi on citrus

Material and methods:

Experiments were carried out under in-vitro conditions with sufficient equipment, machines, chemicals, and isolation rooms, from 4-9 2019

The samples (18 samples) were collected from roots, stems, leaves and fruits of orange, lemon, and grapefruit trees with the characteristics: root rot, leaf blight, pus-*- stem, fruit rot Conduct isolation of fungal pathogens from collected samples Isolates of fungal pathogens are artificially infected to identify some pathogenic fungi in citrus Combining biological characteristics and molecular biology methods to identify pathogenic fungi

Activation method, culture, testing the antagonistic ability of actinomycetes and

bacteria with pathogenic Phytophthora fungi by co-culture method The study affects

the growth of actinomycetes, bacteria through factors: culture medium, temperature, salt tolerance, melanin production Methods of DNA extraction and identification of bacteria strains, actinomycetes with antifungal strains studied

Main findings and conclusions:

1 Isolation of 5 strains of fungi DB1, HDB, HQC, RB, DB5 in which two strains of fungi DB5, HDB are capable of causing citrus diseases Both fungal strains are unable to produce cellulase enzyme, growing well in a nutrient-rich environment

2 HDB strain has branched filament, no septum, spore-shaped spore chains, round spores Strain DB5 has a branched filament, no septum, spore-shaped spores, and lemon-shaped colonies Combining biological characteristics and molecular biology

methods, naming the DB5 strain is Phytophthora colocasiae DB5

3 Selection of actinomycetes 38 and 2 strains bacteria VK1 and VK2 against HDB and DB5 fungi Strains 38 have round and convex colonies Gray white After 7 days of culture, the colony color becomes gray After 24h, there appeared a fiber

system, branched fiber system, and a spore-like stem cell appeared After 36 hours, the spore stem gradually stretched out, appearing a spore VK1 strain has round, small, smooth edges and the surface is gram-negative bacilli Colony of VK2 bacteria are round, small, smooth edges, dry surface, gram-positive bacilli

4 Combining biological characteristics and molecular biology methods, naming

the VK1 strain is Pseudomonas aeruginosa VK1, the VK2 bacterial strain is Bacillus

velezensis VK2, the bacteriological strain 38 is Streptomyces mutabilis 38.

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

Gần đây, diễn biến dịch bệnh trên cây có múi vẫn rất phức tạp mà nguyên nhân không phải là do bệnh mới Trong những năm gần đây từ năm 2015, thế giới sản xuất 1.938 triệu tấn nước cam (chuyển đổi sang FCOJ), tỉ lệ này ngày càng giảm

chủ yếu do dịch bệnh Theo nghiên cứu dịch bệnh chủ yếu do nấm Phytophthora sp

gây ra là một trong những yếu tố quan trọng và nguy hiểm bậc nhất làm giảm sút sản lượng của cây có múi Bệnh thường xuất hiện và tấn công ở các vườn trồng trên nền đất thấp, kém thoát nước Triệu chứng lúc đầu là vỏ của thân cây bị sũng nước ở xung quanh gốc hay ở chản hai, chản ba của cây, sau đó vỏ cây bị thối có màu nâu hợp thành những vùng bất dạng, kèm theo là ứ nhựa ra màu nâu đen và có mùi hôi

Nhiều biện pháp đã được đưa ra để hạn chế bệnh dịch trên cây có múi nhưng chỉ dừng lại ở phòng bệnh là chính Tuy nhiên, trong những trường hợp bệnh hại nặng có thể dùng một số loại thuốc phun để tăng cường sức đề kháng cho cây và hạn chế bệnh lây lan như: Aliette, Ridomil, Phosacide Do tác nhân gây bệnh tồn tại chủ yếu trong đất, xâm nhiễm gây hại ở bộ phận rễ, cổ rễ thân sát mặt đất nên hiệu quả của các loại thuốc này còn thấp Bên cạnh đó việc sử dụng thuốc hóa học để phòng hay trừ bệnh không những không đạt kết quả như mong đợi, chúng còn gây ra ảnh hưởng không tốt với sức khỏe con người, môi trường và các sinh vật sống khác

Do những tác động bất lợi kể trên của thuốc hóa học, việc sử dụng vi sinh vật thay thế các loại thuốc hóa học được coi là sự thay thế bền vững để kiểm soát

sâu bệnh và mầm bệnh thực vật (Chandler et al., 2011) Kiểm soát sinh học bằng

cách sử dụng các vi sinh vật đã và đang trở thành mục tiêu quan trọng đối với ngành công nghiệp sinh học trên con đường tìm kiếm và sản xuất các loại thuốc mới, các hoạt chất kháng khuẩn mới, an toàn và thân thiện hơn

Hơn nữa, tình hình biến động của chủng nấm cũng như bệnh dịch ngày một gia tăng Đặc biệt ở nước vùng nhiệt đới như ở Việt Nam thì bệnh dịch ngày một lan rộng Trước tình hình gây bệnh trên họ cam chanh của nấm

Phytophthora sp chúng tôi tiến hành thực hiện nghiên cứu đề tài: “Sàng lọc và

định danh một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm Phytophthora

sp gây bệnh trên cây có múi”

1.1 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

Sàng lọc và định danh một số chủng vi sinh vật đối kháng với nấm

Phytophthora sp gây bệnh trên cây có múi

1.2 YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI

Phân lập một số chủng nấm Phytophthora sp có khả năng gây bệnh cây

trên cây có múi

Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái và sinh học của chủng nấm đã phân lập được

Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với chủng nấm phân lập được

Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng vi sinh vật đối kháng với nấm gây bệnh

Định danh một số chủng nấm bệnh và một số chủng vi sinh vật đối kháng với nấm gây bệnh trên cây có múi

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ TIÊU THỤ QUẢ CÓ MÚI 2.1.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi trên thế giới

Sản xuất quả có múi trên thế giới vẫn tăng do giá trị kinh tế, giá trị dinh dưỡng cao và do tăng trưởng thu nhập của các nền kinh tế mới nổi Tổng sản lượng quả có múi hàng năm trên thế giới dao động vào khoảng 123 - 131 triệu tấn trong giai đoạn 5 năm từ 2011 đến 2016 (FAO, 2017), trong đó cam chiếm trên 50% tổng sản lượng Sản xuất quả có múi vẫn đang tiếp tục tăng do thu nhập của người dân ở một số quốc gia tăng nhanh như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nga,

Ấn Độ, các nước Đông Âu, các nước ASEAN

Theo FAO, sản lượng quả có múi toàn cầu vào khoảng 131 triệu tấn năm

2015 và 124 triệu tấn năm 2016, bình quân đầu người khoảng 18kg năm 2016 Tiêu thụ bình quân ở các nước phát triển Tây Âu và Bắc Mỹ đạt trên 40 kg/người (Tổng cục Thống kê: Tình hình kinh tế - xã hội năm 2017; FAO, 2017) Trong đó

có Mexico là một cường quốc sản xuất và xuất khẩu quả có múi; nằm ở vĩ độ Bắc

10o - 24o, có vị trí địa lý, khí hậu thích hợp với việc trồng cây có múi Sản lượng quả có múi của Mexico năm 2016 là 6,634 triệu tấn; với dân số xấp xỉ 130 triệu người Bình quân sản lượng quả có múi vào khoảng 51,0 kg/người Diện tích trồng cam cả nước không thay đổi trong 10 năm (2000 - 2010), tổng diện tích là 342.000ha, sản xuất mỗi năm khoảng 4,1 triệu tấn cam; chỉ sau Brazil, Trung Quốc, Ấn Độ và Mỹ Niên vụ 2016/2017, Mexico sản xuất khoảng 4,3 triệu tấn cam, năng suất trung bình toàn quốc khoảng 14,3 tấn/ha Bên cạnh cây cam, Mexico còn đứng đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu chanh Theo Bộ Nông nghiệp Mỹ, niên vụ 2016/2017, sản xuất chanh toàn cầu đạt 7,3 triệu tấn, riêng Mexico đã chiếm 2,4 triệu tấn

Ở Trung Quốc, diện tích và sản lượng quả có múi liên tục tăng trong suốt 40 năm qua Năm 2008, tổng sản lượng quả có múi ở Trung Quốc lục địa là khoảng 21,7 triệu tấn, 5 năm sau (2013) sản lượng tăng lên 34,3 triệu tấn; năm 2016 đạt khoảng 32,7 triệu tấn (trong đó chủ yếu là quýt) Bình quân khoảng 23,7 kg/người với dân số 2016 vào khoảng 1,379 tỷ người (FAO, 2017)

2.1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi ở Việt Nam

Tình hình trồng các loại cây ăn quả đặc biệt là cây có múi trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng đang phát triển rất mạnh mẽ Nước ta nằm ở trung tâm phát sinh cây ăn quả có múi, có vị trí địa lý thuận lợi, ở vùng thích hợp cho phát sinh và phát triển của nhiều loài quả có múi Từ Quảng Nam trở vào là diện tích vùng nóng đối với cây có múi Bưởi, cam sành và chanh thường phát triển tốt hơn ở vùng này do chịu được nhiệt Khi nhiệt độ cao quanh năm, cây có múi có thể ra hoa vài lần trong năm Cây thuộc họ cam chanh là những cây mang giá trị thương mại cao

Theo Bộ NN-PTNT, diện tích cây ăn quả nước ta tăng mạnh đặc biệt là ở các tỉnh phía bắc Năm 2017 đã tăng 52000ha so với năm 2016, trong đó diện tích cam tăng 10000ha, diện tích bưởi tăng 13000ha Trong đó, phần lớn cam chiếm diện tích trồng và sản lượng thu hoạch lớn Theo Tổng cục thống kê, năm

2017 sản lượng cam đạt 772,6 nghìn tấn, tăng 20,4% so với năm trước; quýt đạt 175,5 nghìn tấn, tăng 6,3%; bưởi đạt 571,3 nghìn tấn, tăng 13,4% Năm 2018, nhóm cây ăn quả nói chung và cây ăn quả có múi nói riêng đạt sản lượng thu hoạch khá do nhiều cây trồng tăng về diện tích và có thị trường tiêu thụ ổn định, tiếp tục tăng mạnh Sản lượng cam, quýt, bưởi đạt 1697,9 nghìn tấn tăng 10,9% so với năm trước

Tuy nhiên, cùng với sự thâm canh hóa và gia tăng về diện tích trồng họ cam chanh thì dịch bệnh đang là mối đe dọa nghiêm trọng đến năng suất và sự phát triển bền vững của nghề trồng

2.2 Sâu bệnh hại trên cây có múi

Sâu đục cành

Đặc tính sâu bệnh hại: Đây là bệnh phổ biến nhất trên nhóm cây có múi

Sâu đục cành có màu vàng dài khoảng 50mm Chúng một khi xâm nhập được vào cây sẽ khoét lỗ và làm tổ trong cành khiến cành bị úa vàng, sinh trưởng kém rồi dần dần héo và chết Sâu trưởng thành đẻ trứng rải rác khắp nách lá và trên vỏ thân cây Cứ thế khiến cây bị suy kiệt khô héo mà chết

Cách phòng và trị: tăng cường biện pháp đốn tỉa cây giúp cây được thông

thoáng hơn Để hạn chế việc xâm nhập của sâu, cần quét vôi lên trên thân cây Loại bỏ những cành bị sâu bệnh tấn công để chúng không lan rộng ra cả cây Ngoài ra nếu có quá nhiều thì có thể phun xịt một số loại thuốc kháng sâu bệnh

Sâu vẽ bùa

Đặc tính sâu bệnh: Loại sâu này đẻ trứng trên thân cây và khi sâu non nở

chúng sẽ tấn công lá ăn hết lớp biểu bì trên bề mặt lá và khiến lá quang hợp kém Cây từ đó mà phát triển kém hơn đồng thời làm cho cây còi cọc chậm lớn Loại sâu vẽ bùa này được hình thành nhiều nhất sau các đợt mưa dài ngày

Cách phòng và trị: Cần theo dõi chặt chẽ những đợt ra lộc của cây Vì thời

điểm này sâu vẽ bùa phát triển khá mạnh sau đợt mưa hoặc khi tưới nước Cần sử dụng một số loại thuốc phun đều lên cây như Sumicidin 50EC 0,2%, Polytrin 50EC 0,2% Chia làm 2 lần phun mỗi lần cách nhau khoảng 10 ngày Nếu thấy thuyên giảm thì ngừng phun

Theo cẩm nang bệnh cây Texas các nhà khoa học cũng đã lập danh sách các bệnh trên cây có múi

Bệnh thối đen

Nguyên nhân: Bệnh do nấm Alternaria citri xảy ra trên trái cam

Triệu chứng: Ban đầu xuất hiện những đốm nhỏ màu nâu, sau đó vết bệnh

phát triển rất nhanh và chuyển dần sang màu đen Quả bị nhiễm bệnh sẽ đổi màu

và có thể rụng sớm

Bệnh vàng lá gân xanh

Nguyên nhân: Do vi khuẩn

Triệu chứng: Bệnh xảy ra trên cây còn nhỏ gây ra triệu chứng đốm vàng,

loang lổ trên lá làm phiến là chuyển màu vàng chỉ còn gân lá màu xanh Khi bệnh nặng cây không phát triển, tán lá không đều, các lá mọc thẳng đứng, cứng Còn cây lớn bị mắc bệnh vàng lá trái nhỏ, méo mó, khi bổ dọc trái thấy tâm trái

bị lệch hẳn sang một bên và hạt bị hỏng có màu nâu

Bệnh do nấm Phytophthora

Nguyên nhân: bệnh do nấm Phytophthora citrophthora, P parasitica và

các loại Phytophthora sp khác

Triệu chứng:

Thối nâu: Trái cây mọc gần mặt đất bị nhiễm bệnh đầu tiên và sau đó sẽ

lây đến những quả mọc cao hơn trên cây Xuất hiện các vết đốm nâu nhỏ trên

quả, sau đó lan rộng thành một vùng Quả bị nhiễm bệnh có mùi hăng, ôi Nếu nhiễm qua rễ cây, xâm nhập vào qua vỏ rễ, lan mạnh khắp cây Cây bị nhiễm bệnh làm giảm năng xuất và chất lượng quả

Thối gốc chảy mủ: Với loại bệnh này rễ sẽ có biểu hiện như bị thối cả phần

lông hút và phần vỏ rễ Cây sẽ không hấp thụ được chất dinh dưỡng và nguồn nước nên còi cọc kém phát triển dần dần nặng sẽ bị chết Trên thân và cành cây còn có những vết nứt và kèm theo chảy nhựa Càng về sau bệnh càng nặng và thân sẽ bị thối Với những cây non thì cây sẽ thường bị chết chỉ sau một tuần nhiễm bệnh Trời nóng ẩm mưa nhiều là điều kiện thuận lợi cho nấm này sinh sôi

2.3 GIỚI THIỆU NẤM PHYTOPHTHORA GÂY BỆNH TRÊN CÂY CÓ MÚI

Các loài Phytophthora tấn công một phạm vi thực vật rộng lớn và là tác

nhân gây một số dịch bệnh nghiêm trọng trên thế giới - điển hình như bệnh mốc sương mai (hay tàn lụi muộn) trên khoai tây đã gây ra nạn đói ở Châu Âu những

năm 1840, nguyên nhân do nấm P infestans (Bourke, 1964) Bệnh Phytophthora

đã được nghiên cứu sâu tại Châu Âu Tuy nhiên, bệnh khá phổ biến ở vùng nhiệt đới ẩm và gây nhiều nguy hiểm làm mất mùa ở nhiều loại cây ăn quả quan trọng

ở những vùng này; như bệnh thối rễ, thối cổ rễ, loét thân, tàn lụi lá và thối trái

Nấm P palmivora đã gây rất nhiều bệnh trên nhiều loại cây trồng khác nhau: đen

vỏ cacao; thân và trái đu đủ; thối rễ và tàn lụi trên cam quýt; thối chồi trên cọ; sọc đen trên cao su; thối rễ loét thân sầu riêng; chết nhanh trên tiêu Trên cây tiêu

dòng nấm Phytophthora gây hại được xác định là nấm Phytophthora capsici gây

hại chủ yếu trong mùa mưa, nhất là vào cuối mùa mưa khi có khí hậu ấm và ẩm

Nấm Phytophthora sp có thể tấn công riêng lẻ nhưng đa số có sự kết hợp với các nấm khác như Fusarium, Pythium và Rhizoctonia

Có thể nói Phytophthora là một nhóm lớn có mặt khắp mọi nơi trên thế giới và có hơn 1000 cây ký chủ, một vài loài của Phytophthora đã trở thành dịch hại (Gregory, 1983) Trong khi P cinnamomi được tìm thấy ở vùng nhiệt đới thì

P palmivora, P paracitica (P nicotianae) và P citrophthora là đặc trưng ở

vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới; P infestans, P syringae và P fragariae xuất

hiện phổ biến ở vùng ôn đới

nh thối rễ trên bưởi

nh thối nhũn trên quả chanh và cam

nh đốm lá do nấm Phytophthora palmivora gây ra

phthora

phân bố

: Chromalveolata ylum) : Heterokontophyta

: Oomycetes

ó múi do

(Nguồn: Internet)

đó có Việt Nam vào n

Capcasi tấn công trên

bào tử vô tính hay còn

(Zoosporangia) Túi bào

môi trường giảm Chúng

roi không đều nhau (Het

: Pernoporales : Pythiacea

: Phytophthora

Heinrich Anton de Bary mô tả đầu tiên năm thora được xem là một tác nhân gây bệnh

á mãnh liệt của nó Nó gây ra những căn bệnh

lá, thối quả và đặc biệt nguy hiểm với bệnh trên

ora này đặc biệt phát triển ở những nước vùng

vào những mùa mưa Bệnh héo nhanh do n trên cây tiêu thường xảy ra trong mùa mưa,

y ra trên những vườn thoát nước kém, đất bcho nấm phát triển

Hình 2.2 Hình thái nấm Phytophthora

phytophthora thora sp được nuôi cấy trong môi trường thíc

ó phát triển rất nhanh Dưới điều kiện ẩm ướt chú

y còn được gọi là túi bào tử (Sporangia) hoặ

úi bào tử này nảy mầm trong môi trường nước hChúng phóng thích ra những bào tử động (Zoosp

u (Heterokont flagella) Những bào tử động sau

năm 1875 )

nh nguy hiểm cho

nh như: thối cổ rễ,

nh trên họ cam chanh

c vùng nhiệt đới trong

thích sẽ bơi lội hàng gi

Sau một thời gian chúng

kén hay nang (Cyst) Bào

một cấu trúc nghỉ vô tính

bộ phận sinh sản đực) v

giảm phân hình thành nê

trong vòng đời của Phyto

suốt chu kì sống của chú

của giao tử đực vào noã

thích hợp tùy thuộc vào

Giống Phytophthora bao

hình thái sau (A Drenth

Hình thái túi bào

gai của túi, tính rụng s

tăng sinh của túi bào tử

Một số loài Phytophtho

nhiều loài khác cần đư

ng giờ liền và cuối cùng ngừng bơi lội để cuộn t chúng hình thành vách tế bào Ở giai đoạn này, bt) Bào tử vách dày (Chlamydospore) ở dạng hình

vô tính Cấu trúc hữu tính bao gồm túi giao tử đc) và túi noãn (Oogonium - bộ phận sinh sành nên túi giao tử đực và túi noãn Đây chỉ là g

hytophthora Giai đoạn lưỡng bội đóng vai tr

a chúng Các vòi thụ tinh từ túi giao tử đực sẽ

ào noãn Hợp tử sau khi được thụ tinh sẽ nảy m

c vào sự kết hợp của trứng với một hay nhiều bao gồm một số loài nấm dị tản (Heterothallic

n như Phytophthora infestans Số còn lại là allic) bao gồm cả Phytophthora porri

Hình 2.3 Chu kì sống của Phytophthora

Nguồn:

SI-ái của Phytophthora

xác định một số loài Phytophthora thông qua m

Drenth và B Sendall, 2004):

túi bào tử (hình dạng, kích thước, chiều dài, ch

ng sớm của chúng Chiều dài của cuống trên

ử Nhánh của cuống túi bào tử mà trên đó tú

phthora tạo ra bào tử ngay trên môi trường

n được nuôi cấy trong nước, dung dịch muố

n tròn hay kết kén này, bào tử được gọi là

ng hình cầu hay oval, là đực (Antheridium - inh sản cái) Quá trình

là giai đoạn đơn bội vai trò quyết định trong

ẽ thoát vị đưa nhân

y mầm ở điều kiện

u ống giao tử đực othallic) (có hai kiểu lai

i là những loài nấm

-AMMOUR (2002)

qua một số đặc điểm

dài, chiều rộng,…), hệ

ng trên túi bào tử Sự

n đó túi bào tử sinh ra

ng agar, trong khi

ối khoáng và dịch

trích từ đất pha loãng trước khi chúng tạo ra bào tử Điều quan trọng hơn là sự

tạo ra bào tử trên Phytophthora phụ thuộc vào điều kiện ánh sáng

Chlamydospore và sự trương phồng sợi nấm: Chlamydospore là một bào

tử vách dày có chức năng như một bào tử nghỉ Chúng có thể chỉ là một đốt (nằm giữa sợi nấm) hoặc ở tận cùng (nằm ở cuối sợi nấm) Hình thái của

chlamydospore không khác biệt nhiều giữa các loài Tuy nhiên sự hiện diện (trên

Phytophthora palmivora) hay sự vắng mặt (trên Phytophthora hevae) của

chlamydospore có thể xác định ở mức độ loài

Cấu trúc sinh sản hữu tính: Khoảng một nửa các loài Phytophthora ở dạng

đồng tản (homothallic) chúng sẽ sản xuất bộ phận sinh sản đực, bộ phận sinh sản cái và bào tử động trên cùng một môi trường Phần còn lại là dạng dị tản (heterothallic) với hai kiểu lai A1 và A2 Dạng dị tản tạo ra túi giao tử (túi giao

tử đực và túi noãn) chỉ khi có sự hiện diện của một dòng 7 phân lập mọc đối trên cùng môi trường Việc xác định loài nấm thuộc nhóm đồng tản hay dị tản phụ thuộc vào túi bào tử đực của chúng là amphigynuos (túi giao tử đực nằm quanh thân túi noãn) hay paragynuos (túi giao tử đực nằm tiếp theo túi noãn)

Ngoài ra sinh sản vô tính (Textbook of Fungi do Sharma 1998 biên soạn)

Hệ khuẩn ty bên trong thông thường đi ra ngoài qua khí khổng ở dạng chùm; cọng mang túi bào tử (sporangiophore) cũng có thể đi ra ngoài bằng cách chọc thủng lớp biểu bì lá, củ, thân hay chổ có thương tích và cọng bào tử trong suốt, phân nhánh tự do và không giới hạn, sự sinh sản tùy thuộc vào độ ẩm cao hay thấp, túi bào tử (sporangium) phát triển ở đầu chóp của mỗi nhánh thể mang bọc bào tử, bọc bào tử có vách dày, trong suốt, đa nhân có hình hạt đậu hay quả

lê và chứa nhủ (papilla) ở giai đoạn cuối, nhủ là lớp tế bào nối liền túi bào tử với

cọng bào tử và khi mưa hay gió lớn thì lớp nhủ này phân tán để cho túi bào tử phát tán theo gió vào không khí…nếu không gặp ký chủ thì chúng sẽ chết sau vài giờ tồn tại trong không khí

Sự nảy chồi của túi bào tử hay bọc bào tử bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và độ

ẩm; túi bào tử cho thấy sự mọc mầm gián tiếp ở nhiệt độ thấp và điều kiện ẩm ướt

do những bào tử động tạo ra đầu tiên, chúng được phóng thích nhanh và nhiễm vào vật chủ Nhưng ở nhiệt độ cao và điều kiện khô ráo, bọc bào tử cho thấy sự mọc mầm trực tiếp ớ điều kiện này, bọc bào tử bắt đầu hoạt động như bào tử riêng lẻ và nảy chồi nhanh bằng cách tạo ra ống phôi thâm nhập vào vật chủ

d Đặc điểm sinh học của nấm Phytophthora

Đặc điểm chung: Phytophthora (Gr Phyton: Thực vật; phthora: phá hoại),

được đặt tên bởi Bary (1876) Nấm Phytophthora là loại nấm khá phổ biến của

lớp Oomycetes thuộc họ Pythiacea, bộ Pernoporales, sợi nấm không màu, không vách ngăn, đơn bào, kích thước không đều, túi bào tử có hình trứng và hình quả chanh, trên đầu có nuốm hoặc không có nuốm, không màu, trong suốt Bào tử hình cầu hoặc hình thận có hai lông roi, di chuyển rất nhanh trong nước Nấm

Phytophthora sống trong đất dưới hình thức các sợi nấm (mycelium) hoặc các

bào tử có vách dày gọi là noãn bào tử (oospores), các noãn bào tử tồn tại hàng

năm trong đất

Theo tài liệu của Bary (1876), Phytophthora có các khoảng chịu đựng

cũng như các khoảng tối ưu cho sự sinh trưởng như sau:

Nhiệt độ tối ưu: 25-30 oC

pH tối ưu: 6-7

2.3.2 Cơ chế gây bệnh

Các loài Phytophthora tấn công một phạm vi thực vật rộng lớn và là tác nhân gây một số dịch bệnh nghiêm trọng trên thế giới Bệnh Phytophthora đã

được nghiên cứu sâu tại Châu Âu Tuy nhiên, bệnh khá phổ biến ở vùng nhiệt đới

ẩm và gây nhiều nguy hiểm làm mất mùa ở nhiều loại cây ăn quả quan trọng ở những vùng này; như bệnh thối rễ, thối cổ rễ, loét thân, tàn lụi lá và thối trái

Nấm Phytophthora sp có thể tấn công riêng lẻ nhưng đa số có sự kết hợp với các

nấm khác như Fusarium, Pythium và Rhizoctonia

Có thể nói Phytophthora là một nhóm lớn có mặt khắp mọi nơi trên thế giới và có hơn 1000 cây ký chủ, một vài loài của Phytophthora đã trở thành dịch hại (Gregory, 1983) Bệnh héo nhanh do nấm Phytophthora sp tấn công trên cây

tiêu thường xảy ra trong mùa mưa, khi có khí hậu nóng và ẩm Bệnh xảy ra trên những vườn thoát nước kém, đất bị úng nước hoàn toàn là điều kiện cho nấm phát

triển Nấm Phytophthora sống trong đất dưới hình thức các sợi nấm (mycelium)

hoặc các bào tử có vách dày gọi là noãn bào tử (oospores), các noãn bào tử tồn tại hàng năm trong đất Khi đất ẩm, các noãn bào tử nảy mầm cho ra các sợi nấm (mycelia), các sợi nấm sinh ra các bào tử nang (sporangia), các bào tử nang chứa các cá thể gây bệnh gọi là động bào tử (zoospores) Các động bào tử chỉ phóng thích ra ngoài bào tử nang để đi gây bệnh khi đất bị úng nước hoàn toàn Khi ra

ngoài các động bào tử dùng roi (flagella) bơi tới các rễ cây để gây bệnh hay bơi theo dòng nước mưa để tới các nơi khác trong vườn, làm bệnh lây lan rất nhanh Vườn bị ngập úng nước càng lâu thì áp lực bệnh càng lớn Ngoài ra tuyến trùng cũng tạo điều kiện thuận lợi cho nấm phát triển, tuyến trùng xâm nhập vào rễ tạo vết thương hở cho nấm xâm nhập vào gây bệnh (Trần Văn Hòa, 2001)

2.3.3 Biện pháp phòng trừ

Trước tình hình dịch bệnh ngày càng tăng đã có một số biện pháp phòng trừ như sau:

Biện pháp canh tác:

Vệ sinh đồng ruộng: Sau thu hoạch hoặc trước khi canh tác cần thu dọn, tiêu

hủy tàn dư thực vật và làm sạch cỏ dại vì đây là nguồn lưu tồn và lây lan quan trọng nhất Thu nhổ và tiêu hủy các cây rau đã biểu hiện triệu chứng nhiễm bệnh

Làm đất: Đất trồng phải tiêu thoát nước tốt, đất tơi và xốp Khi đất quá ẩm

hãy đào rãnh quanh để nước thoát xuống mương Biện pháp này sẽ giúp làm chậm quá trình lây bệnh sang các cây khác trong vườn

Trong mùa mưa nếu lứa cây trước đó đã nhiễm bệnh trước khi trồng từ 15-20 ngày nên đặt những tấm nhựa lên đất sau đó bón vôi vào đất và cuốc lật phơi đất thêm vài ngày để ánh sáng sẽ làm nóng đất và nhiệt độ cao sẽ giết chết nhiều vi sinh vật trong đó có cả những tác nhân gây bệnh ở tầng đất bề mặt

Về giống: Luân canh cây trồng khác họ Sử dụng giống kháng Không

dùng hạt giống có mầm bệnh (lấy ở ruộng có cây bị bệnh) Xử lý hạt giống bằng nước nóng 500C trong 25 phút

Mật độ trồng: Vừa phải không quá dày để tránh bớt ẩm độ khi lá giao tán Phân bón: Nên bón lót phân hữu cơ vi sinh hoặc phân chuồng đã ủ cho

cây Sử dụng cân đối N-P-K, không bón nhiều phân đạm cho cây Ngưng bón phân đạm khi bệnh đang phát triển Bón vôi trước khi trồng và xử lý đất trước khi xuống giống bằng các loại thuốc gốc đồng Dùng phân hữu cơ mục, có nhiều vi sinh vật đối kháng làm hạn chế nguồn bệnh Bón phân cân đối hợp lý, tránh bón đạm quá nhiều

Biện pháp cơ giới vật lý: Nhổ bỏ cây bị bệnh kịp thời, phải hạn chế tưới

nước, tránh bệnh lây lan trên ruộng Tránh gây tổn thương rễ trong quá trình trồng trọt, chăm sóc

Biện pháp sinh học: Sử dụng các chế phẩm từ nấm Trichoderma bón vào

đất trước khi trồng

Biện pháp hóa học: Biện pháp hóa học thường có hiệu quả thấp do tác

nhân gây bệnh tồn tại chủ yếu trong đất, xâm nhiễm gây hại ở bộ phận rễ, cổ rễ thân sát mặt đất Tuy nhiên, trong những trường hợp bệnh hại nặng có thể dùng một số loại thuốc phun để tăng cường sức đề kháng cho cây và hạn chế bệnh lây

lan như: Aliette, Ridomil, Phosacide đối với bệnh do nấm Phytophthora gây ra

2.3.4 Ứng dụng vi sinh vật vào đối kháng bệnh hại thực vật

Xạ khuẩn

Xạ khuẩn được biết đến là vi sinh vật có khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học như: các loại kháng sinh, các tác nhân chống ung thư, ức chế miễn dịch… Trong đó, các nhà khoa học đặc biệt quan tâm đến khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn Xạ khuẩn sản sinh một lượng lớn kháng sinh với những cấu trúc hóa học đa dạng Tuy nhiên, không phải tất cả các chủng xạ khuẩn đều có khả năng sinh kháng sinh và vai trò của kháng sinh trong chu trình sống của xạ khuẩn cũng chưa được hiểu rõ Kháng sinh là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa, được tích lũy bên trong tế bào hay được phóng thích ra ngoài môi

trường (Nguyễn Văn Cách, 2004)

Chi Streptomyces của xạ khuẩn-chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất, chiếm hơn 2/3 các kháng sinh tự nhiên đã phát hiện được (Watve et al., 2001),

trong đó nhiều kháng sinh đã được ứng dụng và có vai trò quan trọng trong điều trị bệnh như aminoglycosides, anthracyclines, chloramphenicol, beta-lactams, macrolides và tetracyclines

Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên, chủ yếu là trong đất, nước và chúng đóng vai trò rất quan trọng trong nhiều lĩnh vực: trong bảo vệ thực vật, trong y học, trong nông nghiệp, trong sản xuất…

Cơ chế tác động của xạ khuẩn đối kháng:

Xạ khuẩn có khả năng sinh enzyme kháng nấm

Thành tế bào của nấm được cấu tạo bằng các sợi chitin, và thành phần cellulose Enzyme chitinase đóng vai trò quan trọng về mặt dinh dưỡng, rất linh hoạt trong quá trình phát triển và sự phát sinh hình thái nấm Theo nghiên cứu, một số loại enzyme cũng có khả năng phân giải thành tế bào của vi sinh vật, trong đó enzyme cellulase và chitinase được tách chiết từ xạ khuẩn có vai trò rất

quan trọng trong việc sản xuất các chế phẩm kháng nấm gây bệnh Chúng có ý nghĩa lớn đến sự phân giải thành cellulose và chitin của nấm để tác động đến khả năng gây bệnh trên cây trồng

Sinh chất kháng sinh kháng nấm

Sự đối kháng giữa các VSV trong đất là cơ sở của biện pháp sinh học phòng chống bệnh cây Các nghiên cứu cho thấy cơ chế cơ bản và quan trọng nhất của sự đối kháng VSV đối với mầm bệnh là do sản sinh các chất kháng sinh

Sự có mặt của xạ khuẩn đối kháng trong đất làm giảm rõ rệt tỷ lệ bệnh cây Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh Và trong số 8000 chất kháng sinh hiện nay thì trên thế giới có trên

80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn, chủ yếu từ các chủng thuộc chi Streptomyces

Đa số chất kháng sinh từ xạ khuẩn đều có phổ kháng sinh rộng, kìm hãm và ức chế sự sinh trưởng, phát triển của nhiều loài VSV khác nhau Một loại xạ khuẩn đối kháng có thể ức chế một vài loại nấm gây bệnh nhưng có những loài hoạt động rộng có khả năng ức chế nhiều loại tác nhân gây bệnh

Ngoài việc sinh chất kháng sinh dùng trong y học thì xạ khuẩn còn sinh ra các chất đối kháng VSV gây bệnh hại cây trồng (như vi khuẩn héo lá, nấm thực vật, nấm đạo ôn, nấm gây thối) Đã có nhiều nhà nghiên cứu ứng dụng xạ khuẩn vào việc phòng trừ bệnh cây trồng như: Lê Thị Hiền và cs (2014), …

Sự hình thành và các con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh: Chất kháng sinh được tổng hợp từ một, hai, ba chất trao đổi bậc một khác nhau, hay bằng cách polymer hóa các chất trao đổi bậc 1, sau đó có thể tiếp tục biến đỏi qua nhiều phản ứng enzyme khác để tạo thành các dạng chất kháng sinh khác nhau Chất kháng sinh còn là chất tham gia cạnh tranh của xạ khuẩn trong môi trường tự nhiên Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng đồng thời hai hay nhiều CKS có cấu trúc hóa học

và tác dụng giống nhau Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gen, ngoài các gen chịu trách nhiệm tổng hợp chất kháng sinh còn

có cả gen chịu trách nhiệm tổng hợp tiềm chất, enzyme và cofactor

Vi khuẩn

Vi khuẩn có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ một cách đáng kinh ngạc Ví dụ, sự phân giải cellulose, một trong những thành phần chiếm

đa số trong mô thực vật, được thực hiện chủ yếu bởi các vi khuẩn hiếu khí

thuộc chi Cytophaga

Chế tạo phân bón thuốc trừ sâu từ vi sinh vật trong đó có vi khuẩn Vi khuẩn có khả năng cố dịnh đạm cho cây trồng chẳng hạng như vi khuẩn cố định đạm trên nốt sần của các cay thuộc họ đậu

Các vi khuẩn đối kháng đều thuộc hệ vi sinh vật sống ở cùng rễ cây hoặc sống hoại sinh trong đất (Schlegel, 1981) Trên thế giới đã có nhiều tác giả nghiên cứu về hiệu lực đối kháng của vi khuẩn đối với các tác nhân gây hại (nấm, vi khuẩn) Kết quả cho thấy loài vi khuẩn đối kháng có thể bảo vệ cây trồng, chống lại vi sinh vật nhân gây bệnh đồng thời giúp cây sinh trưởng và phát triển tốt (Weller, 1988; Défago et Haas, 1990; Kloepper, 1993)

Cơ chế tác động của vi khuẩn đối kháng:

Vi khuẩn đối kháng có khả năng cạnh tranh nguyên tố dinh dưỡng sắt (Fe) (Scher, 1986)

Vi khuẩn đối kháng có khả năng sản sinh ra cyanide, quy nạp (làm tăng) tính chống chịu của cây, sản sinh ra chất kích thích sinh trưởng và có

khả năng phân giải độc tố do vi sinh vật gây bệnh tiết ra (Utsumi et al., 1988; Toyoda et al., 1988)

Vi khuẩn đối kháng có khả năng cạnh tranh, chiếm chỗ rất thuận lợi ở

vùng rễ (Bull et al., 1991; Paker, 1990)

2.4 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC ĐỀ TÀI TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

2.4.1 Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài ở ngoài nước

Kết quả của Burgess (2008) cho rằng Phytophthora thuộc lớp nấm trứng,

không phải nấm thực và sinh sản ra du động bào tử Do vậy việc phòng trừ nấm này khác với việc phòng trừ do nấm khác gây ra và các thuốc dùng trong phòng trừ cũng khác Theo tác giả các bệnh do nấm này gây ra có hại trong lâu năm gây thiệt hại đáng kể ở các vùng Đông Nam Á

Ivana Plisi et al., (2017) đã công bố kết quả tìm ra hai loài nấm

phytophthora mới liên quan đến bệnh thối nâu của trái bưởi ở tỉnh Vĩnh

Long, khu vực đồng bằng sông Cửu Long, miền nam Việt Nam Kết quả

nghiên cứu cho thấy các loài nấm Phytophthora xuất hiện phổ biến trong khu

vực trồng cây có múi này

Sau những công bố về nguyên nhân gây ra bệnh trên cây có múi do nấm

Phytophthora sp gây ra thì các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu nhằm

tìm ra các phương pháp để phòng loại bệnh gây hại này

Stephan Olson et al., (2010) trường đại học Florida của Mỹ đã ứng dụng

một số chủng VSV đối kháng để hạn chế bệnh trên cây cà chua như các chủng PGPR Bacillus pumilus SE 34, EQTY, và Pseudomonas putida 89B61 được thông báo hạn chế các nguồn bệnh: nấm, vi khuẩn, virus thực vật trên cà chua và dưa chuột để giảm tỉ lệ gây bệnh héo xanh vi khuẩn từ 10-25% so với đối chứng Kết quả khi sử dụng dịch chiết của cây bạc hà, bạch lý hương, cây kinh giới, cây

sả và chế phẩm B.subtilis có hiệu quả phòng trừ nấm Phytophthora Infestans gây

bệnh mốc sương trên cây khoai tây và cà chua ở Châu Âu

Năm 2012, Dhanasekaran D và cộng sự đã tìm ra các chủng vi khuẩn

Actinobacteria được phân lập từ nước biển có khả năng kháng nấm mạnh và

nghiên cứu ra được 30 hợp chất thứ cấp diệt nấm được sản xuất bởi chúng

(Dhanasekaran D et al., 2012) Cũng trong năm 2012, Mee Kyung Sang và cộng

sự đã nghiên cứu và đưa ra một quy trình sàng lọc sửa đổi để lựa chọn các chủng

vi khuẩn kiểm soát sinh học hiệu quả chống lại Phytophthora capsici hoàn thiện

và có hiệu quả cao hơn quy trình trước đó

Năm 2016, Charu Singh đã phân lập được tổng cộng có 80 chủng actinomycetes được phân lập từ đất của các môi trường sống khác nhau của vùng Chambal, Madhya Pradesh Toàn bộ các chủng phân lập đã được sàng lọc đối với nấm mốc kháng nấm của chúng bằng phương pháp tốt chống nấm phytopathogenic Sau khi sàng lọc, trong số này, chỉ có một chủng là Actinomycetae ACITM-1 cho

thấy kháng sinh chống nấm chống lại M phaseolina, F oxysporum, R solani, và C

truncatum (Singh et al., 2016)

Năm 2018, Sharifah Farhana Syed-Ab-Rahman và cộng sự đã phân lập được

48 chủng vi khuẩn từ đất Ba trong số 48 chủng đã phân lập biểu hiện sự ức chế

hơn 65% đối với tất cả các loài Phytophthora được thử nghiệm và được chọn để

nghiên cứu thêm Không chỉ có tác dụng ức chế nấm gây bệnh chúng còn có khả năng thúc đẩy sự sinh trưởng của cây trồng Công trình này cho thấy tiềm năng

của các chủng vi khuẩn để kiểm soát nhiễm Phytophthora và thúc đẩy sự phát

triển của thực vật Do đó, chúng có thể được coi là phân bón sinh học và thuốc trừ sâu sinh học

2.4.2 Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài ở trong nước

Trước những thiệt hại do nấm Phytophthora gây ra, tại Việt Nam đã có

những biện pháp nhằm ngăn chặn dịch bệnh do nấm này gây ra, trong đó có những công trình nghiên cứu tìm ra loài nấm gây bệnh này Tuy nhiên, các

nghiên cứu chủ yếu tập trung vào đối tượng nấm Phytophthora trên từng loại cây khác nhau như ca cao, hồ tiêu, chưa có nhiều nghiên cứu về nấm Phytophthora

gây ra trên cây có múi một trong những loại cây trồng chiếm diện tích và sản d lập được nấm gây bệnh, nghiên cứu đặc điểm hình thái và sinh học của nấm, tìm được một số vi sinh vật đối kháng sử dụng trong phòng trừ bệnh

Tô Thị Nhã Trầm (2007) khảo sát ảnh hưởng của dịch nấm Phytophthora

Capcasi và tác nhân hóa lý ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và khả năng tạo đợt

biến trên cây tiêu (Piper nigrum L.) nuôi cấy mô Kết quả thu được ảnh hưởng của dịch nấm Phytophthora capsici đến sinh trưởng phát triển và khả năng tạo

đột biến của mô sẹo ở nồng độ dịch nấm 30% và 40% thì mô sẹo bị chết hoàn toàn Nồng độ 20% tạo nhiều tế bào bất thường, mô vẫn còn khả năng sống sót

và ở nồng độ này cho kết quả đột biến tế bào mô nhiều hơn Ảnh huởng của chất kích thích sinh truởng đến sinh truởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo nồng độ 10mg/l BA kết hợp với 1mg/l IBA và 20mg/l BA với 1mg/l IBA cho kết quả tạo chồi cao trong đó tối iu nhất vẫn là BA sử dụng ở nồng độ 10mg/l kết hợp với 1mg/l IBA Mặt khác, nồng độ 20mg/l IBA kết hợp với 1mg/l BA và 1mg/l IBA kết hợp với 2mg/l TDZ lại cho kết quả đột biến cao Ảnh hưởng của tia phóng xạ gamma đến sinh trưởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô tiêu ở liều xạ 20Gy thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của mô sẹo hơn nhưng để tạo đột biến thì ở liều xạ 40Gy cho tỉ lệ biến dị cao hơn Trên chồi thì liều xạ 20Gy kích thích tạo sẹo nhiều và cả mô xốp nhưng ở liều xạ 40 và 60Gy cho nhiều thể đột biến hơn vì tạo được nhiều mô bất thường và cấu trúc tế bào thay đổi nhiều

Bên cạnh nghiên cứu tác nhân gây bệnh, việc áp dụng nghiên cứu vi sinh vật trong việc giải quyết lại các bệnh trên cây trồng đang là mục tiêu hàng đầu

Sự có mặt của chúng làm giảm rõ rệt các tỷ lệ mắc bệnh trên cây trồng, xạ khuẩn

có thể kháng lại một hay nhiều chủng nấm hay vi khuẩn Hiện nay có rất nhiều

đề tài đang được nghiên cứu về vấn đề này

Năm 2008, Bùi Thị Hà đã phân lập được 80 chủng xạ khuẩn thuộc chi

Streptomyces, trong đó sàng lọc và đánh giá được 30 chủng có hoạt tính kháng

nấm gây bệnh trên chè Trong đó đã tuyển chọn được 2 chủng xạ khuẩn có hoạt tính mạnh nhất là chủng Đ1 và R2, kháng được cả 2 chủng nấm gây bệnh trên chè là chủng CT -2E và CT-5X Dựa trên kết quả định danh có thể nhận định

chủng R2 có thể là loài Streptomyces misawaensis, chủng Đ1 có thể là loài

Actinomyces brunneofungus

Năm 2015, Nguyễn Thị Phong Lan và cộng sự đã phân lập từ 510 mẫu đất

từ 10 tỉnh trồng lúa vùng Đồng bằng sông Cửu Long, thu được 1050 chủng vi

sinh vật Qua đánh giá khả năng ức chế với nấm P grisea đã có 395 chủng xạ

khuẩn và 336 chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng Tiếp tục tiến hành đánh giá các đặc điểm sinh học, đường kính đối kháng đã chọn ra 1 số chủng có hoạt tính mạnh nhất và đã được định danh để tiến hành phát triển thành các dạng chế phẩm

sinh học phục vụ cho sản xuất như: Streptomyces cavourensis S27, Streptomyces

xiamenensis S257, Streptomyces viriabilis S28, Streptomyces iakyrus S233, Streptomyces scopuliridis S136, Streptomyces fulvissimus S30

Còn rất nhiều đề tài liên quan đến lĩnh vực nghiên cứu vi sinh vật trong việc đối kháng nấm bệnh trên cây trồng Tuy nhiên việc áp dụng thành tựu nghiên cứu thu được vào thực tế còn gặp rất nhiều khó khăn Hiệu quả đạt được còn thấp và chưa được người dân biết đến cũng như do thói quen canh tác và trồng trọt trong một thời gian dài

PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Công nghệ Vi sinh - Khoa Công nghệ Sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, từ tháng 4/2019 đến tháng 9/2019

3.2 VẬT LIỆU

Các mẫu (18 mẫu) thu thập được bao gồm ở rễ, thân, lá và quả ở cây cam, chanh, bưởi với đặc điểm: thối rễ, tàn lụi lá, thân xì mủ, thối quả Mẫu thu tại các vùng ở Thái Bình, Hà Nội, Phú Thọ, Yên Bái

Các chủng xạ khuẩn, vi khuẩn (80 chủng xạ khuẩn và 30 chủng vi khuẩn) được cung cấp từ Bộ môn Công nghệ Vi sinh - Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam

3.3 MÔI TRƯỜNG NGHIÊN CỨU

Môi trường nuôi cấy Vi sinh vật gây bệnh

Môi trường PDA (Potato Glucose Agar) (w/v): 200g khoai tây; 20

D-Glucose; nước 1 lít; pH 5.8; với môi trường đặc bổ sung 2% agar

Môi trường WA (Water Agar): Agar 20g; nước 1 lít; pH = 7-7,4

Môi trường Czapek (g/l): Saccharose 30g; NaNO3 3g; K2HO4 1g; MgSO4

Môi trường hoạt hóa và nghiên cứu vi sinh vật có hoạt tính kháng

Môi trường Gause-I (w/v): 2% Tinh bột tan; 0.05% K2HPO4; 0.05% MgSO4.7H2O; 0.05% NaCl; 0.05% KNO3; 0.001% FeSO4; 2% Agar; pH 7.0-7.4

Môi trường ISPII (w/v): 0.4% cao nấm men; 1% cao malt; 0.4% D-glucose;

2% agar; pH 7-7.2

Môi trường LB (Luria Bertani) (w/v): 1% peptone; 0.5% cao nấm men;

1% NaCl; pH 7.0; với môi trường đặc bổ sung 2% agar

cân điện tử, tủ lạnh (Sanyo, Nhật bản), và một số thiết bị khác

3.4.3 Hoá chất

HCl 5%,NaOH 5%

Cồn 70%, cồn 90%

Các hóa chất pha môi trường

Hóa chất nghiên cứu một số đặc điểm sinh hóa của các chủng vi sinh vật Hóa chất để tách chiết DNA, PCR, điện di

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Giữ giống vi sinh vật

Giữ giống trên môi trường thạch nghiêng: Các chủng vi khuẩn sau đi

được làm thuần thì sẽ được cấy trên môi trường thạch nghiêm trong ống nghiệm

để giữ giống (Lương Đức Phẩm, 2004) Các chủng được cấy trên bề mặt thạch nghiêng và nuôi ở 300C trong 2 ngày Ống giống được bảo quản ở 40C, cấy

chuyển hàng tháng và được hoạt hóa trước khi nhân giống

3.5.2 Phương pháp phân lập mẫu nấm bệnh

Thu mẫu:

Quy trình thu mẫu được thực hiện tại các tỉnh Thái Bình, Hà Nội, Phú Thọ

và Yên Bái Qua 2 ngày thu mẫu thì thu được 18 mẫu trong đó có 8 mẫu đất, 2 mẫu lá, 2 mẫu thân, 2 mẫu quả, 4 mẫu rễ từ cây chanh và bưởi

Lựa chọn cây có khả năng đang ủ bệnh, các cây có dấu hiệu như thối rễ, tàn lụi lá, thân xì mủ, thối quả, ngoài ra khi đào thử đất xung quanh lên thấy có mùi hơi thối

Mẫu đất, rễ được lấy theo hình chiếu tán cây xuống, tán cây đến đâu thì lấy mẫu đến đó Sau khi lựa chọn được vị trí thích hợp, dùng cuốc gạt đi lớp đất

bề mặt cũng như tàn dư thực vật phía trên (khoảng 10cm), đất và rễ được lấy ở tầng đất 10-30cm, lấy mẫu đất không lấy quá khô hay quá ướt Mỗi mẫu đất lấy ở

2 địa điểm khác nhau trên cùng 1 cây và trộn với nhau, khoảng 200g đất và 100g rễ/mẫu Ghi rõ thông tin mẫu

Phân lập nấm Phytophthora

Bẫy nấm bằng cánh hoa hồng

Sau khi thu mẫu từ nơi bị bệnh, cân 100g đất cho vào cốc nhựa sau đó đổ nước vào sao cho khoảng cách giữa đất và nước là 7cm, khuấy nhẹ đất trong cốc, vớt bọt và các vật khác nổi lên trên bề mặt, để yên một lúc Sau đó lấy từng cánh hoa hồng cho vào trên bề mặt cốc sao cho cánh hoa hồng chỉ tiếp xúc với bề mặt chứ không chìm trong dung dịch

Làm tương tự với các mẫu còn lại (rễ, thân và lá) Để cốc ở nơi thoáng mát và quan sát 3 ngày

Nếu cánh hoa hồng chuyển từ màu đỏ sang màu nâu cánh gián thì đó là nấm

Phytophthora, còn lại cánh hoa hồng không đổi màu thì đó không phải là nấm Phytophthora

Phân lập nấm Phytopthora

 Phân lập từ mẫu trực tiếp

Đối với mẫu đất:

1.Trước hết các mẫu đất phải được xử lý trước khi phân lập bằng cách phơi khô ở nhiệt độ phòng 2-3 ngày, sau đó dùng rây qua sàng có kích thước 2- 3mm

2 Cân 1g đất đã xử lý cho vào 9ml nước cất khử trùng, sử dụng máy vortex để trộn đều mẫu

3 Pha loãng mẫu ở các nồng độ pha loãng khác nhau: 10-4, 10-5 để phân lập nấm trong đất

4 Hút 0,5 ml dịch pha loãng ở 2 nồng độ trên nhỏ lên đĩa Petri chứa môi trường phân lập (môi trường PDA) Dùng que gạt trang đều dịch trên bề mặt thạch Quan sát đĩa sau 3-4 ngày

Đối với mẫu thân, rễ, lá

Mẫu rễ, thân, lá sau khi mang về thì rửa sạch sau đó khử trùng bằng nước Javen 5% trong vòng 10 phút sau đó để ráo và đặt trên đĩa thạch chứa môi trường PDA

Đặt đĩa thạch trong tủ 30°C Quan sát đĩa sau 3-4 ngày

 Phân lập từ cách hoa hồng

Môi trường dùng để phân lập là PDA

Chọn lựa những cánh hoa hồng đã chuyển từ màu đỏ sang màu nâu cánh, sau đó cắt nhỏ cánh hoa những chỗ đã xỉn màu sau đó đặt lên trên đĩa petri có chứa môi trường PDA

Đặt đĩa thạch trong tủ 30°C Quan sát đĩa sau 3-4 ngày

3.5.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của chủng nấm

Quan sát hình thái của nấm sau khi nuôi cấy chúng ở nhiệt độ 30°C sau 24h nuôi cấy Quan sát đặc điểm sinh học của nấm

Các đặc điểm hình thái đặc trưng cần quan sát: Hình dạng bào tử, đặc điểm cuống sinh bào tử, bào tử

Bước 1: Làm tiêu bản trên lam kính, lam kính cần rửa sạch, lamen bọc giấy hấp khử trùng ở 121°C trong 45 phút

Bước 2: Làm trong điều kiện tủ cấy vô trùng, dùng que cấy lấy sợi nấm đặt trên lam kính sau đó từ từ đậy lamen lên một cách nhẹ nhàng nghiêng từ 45° xuống

Bước 3: Để thấy rõ đặc điểm hình thái cần sử dụng thuốc nhuộm Cách sử dụng thuốc nhuộm:

Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm không hoặc ít độc với vi sinh vật

và được pha loãng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm màu

Cách nhuộm :

Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh metylen 0,001% lên phiến kính

Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm

Đậy lá kính lên giọt dịch Có thể nhỏ thêm dầu kính để soi rõ hơn

Quan sát tiêu bản ở vật kính khác nhau

Ghi rõ đặc điểm hình thái, thời gian, quan sát sau 8h/lần

3.5.4 Phương pháp tái lây nhiễm

Sau khi phân lập thu được chủng nấm thuần nuôi ở 30°C trên môi trường PDA rồi tiến hành tái lây nhiễm

Các bước thực hiện quá trình tái lây nhiễm:

 Bước 1: Pha môi trường PDA lỏng (môi trường không bổ sung thêm agar), sau khi pha được môi trường chuẩn bị ống nghiệm đã được hấp khử trùng

ở 121°C trong 45 phút

 Bước 2: Hút mỗi ống nghiệm 5-7ml sau đó bịt chặt đầu ống nghiệm lại bằng nút bông, sau khi xong mang ống nghiệm đi hấp khử trùng ở 121°C trong 45 phút

 Bước 3: Làm trong điều kiện tủ cấy vô trùng, dùng dao cắt nhỏ từng chủng nấm, dùng que cấy cho vào từng ống nghiệm, nút bông chặt lại Ghi rõ tên chủng, thời gian ở thành ống nghiệm

 Bước 4: Nuôi lắc ở 30°C trong 7 ngày

 Bước 5: Lây nhiễm nhân tạo trên quả chanh qua vết thương trên quả Tạo một vết cắt (dài 3-4 mm) trên vỏ mỗi quả bằng một dao mổ Tưới dịch nấm

đã được chuẩn bị và đắp trực tiếp sợi nấm lên vết cắt Trên quả chanh làm đối chứng, thực hiện tương tự, thay dịch nấm bằng nước cất và không đắp sợi nấm lên vết cắt Quan sát quả chanh sau 1 tuần, nếu quả chanh đổi từ màu vàng sang

màu nâu là dấu hiệu của quả bị nhiễm nấm và ngược lại

 Qúa trình lây nhiễm nhân tạo là một trong những bước đặc biệt quan trọng để xác định được các chủng nấm gây bệnh cho cây Phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo

3.5.5 Đánh giá dặc điểm sinh học

a Khả năng sinh enzyme cellulase

 Cách thu dịch:

Nấm được nuôi cấy trong môi trường PDA lỏng, lắc 200 vòng/phút sau 36-48h tiến hành thu dịch lỏng Dịch lỏng mang đi ly tâm, dùng pipet hút dịch lỏng nhỏ vào lỗ trên đĩa thạch sao cho dịch không tràn ra ngoài

 Phương pháp thử khả năng sinh enzyme ngoại bào của nấm (enzyme cellulase)

Phương pháp đục lỗ trên thạch: môi trường gồm agar (18g/l) + nước cất + 1% cơ chất tương ứng với từng loại enzyme được hấp khử trùng, đổ vào đĩa petri