kết quả thực hành thí nghiệm hóa sinh căn bản

Ở ba ống 1, 2, 3: thờigian từ 0 đến 10 phút màu còn tối là vì lượng tinh bột chưa được thủy phân hết, cònnhiều nên khi cho Iốt tác dụng với tinh bột cho ra màu nhạt dần từ tím đến nâu..

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DUY TÂN

Thành viên : 1/ Nguyễn Hữu Đan

2/ Nguyễn Thị Thu Loan 3/ Đoàn Thị Ngọc Ly 4/ Lê Thị Mười 5/ Dương Thị Mai

Năm 2014 – 2015

MỤC LỤCBÀI 1: KHẢO SÁT ENZYME

BÀI 2: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CỦA ENZYME

BÀI 3: SACCHARIDE

BÀI 4: LIPID

BÀI 5: AMINO ACID VÀ PROTEIN

BÀI 6: TÌM NHỮNG CHẤT BẤT THƯỜNG TRONG NƯỚC TIỂU

BÀI 1:

KHẢO SÁT ENZYME I/ MỤC TIÊU:

1 Nắm được cơ chế hoạt động của enzyme

2 Biết được một số enzyme thủy phân cơ bản và những cơ chất tương ứng được

thủy phân bởi các enzyme đó

II/ THỰC HÀNH:

1 Thí nghiệm 1: Thủy phân tinh bột bằng Amylase

a.

Nguyên tắc:

- Tinh bột khi có mặt của Amylase bị thủy phân thành các dextrin

- Thời gian thủy phân càng kéo dài thì càng tạo các dextrin với phân tử lượng

càng nhỏ và cuối cùng là maltose

- Các sản phẩm tạo thành ở mức độ thủy phân khác nhau từ tinh bột tạo thành

màu khác nhau với dung dịch Iốt

- Ống 2: có màu tím than nhưng nhạt hơn ống 1

- Ống 3: có màu nhạt hơn ống 2 (màu nâu)

Lắc đều

1 ml nước bọt

Dung dịch nướcbọt 1/20

Ống 5: 20pỐng 4: 15pỐng 3: 10p

Ống 1: 0pSau thời

gian

Nhỏ 1 giọt

dd Iốt 1%

3, ống sẽ có màu nhạt hơn ống 2 (dần chuyển qua màu nâu) Ở ba ống 1, 2, 3: thờigian từ 0 đến 10 phút màu còn tối là vì lượng tinh bột chưa được thủy phân hết, cònnhiều nên khi cho Iốt tác dụng với tinh bột cho ra màu nhạt dần từ tím đến nâu Vẫn như vậy, sau 5 phút, khi sang ống 4, ống sẽ có màu vàng cam, sự chuyển đổimàu rõ rệt hơn vì lượng tinh bột đã bị thủy phân gần hết Cuối cùng là ống 5, lượngtinh bột đã bị thủy phân hết nên có màu vàng nhạt.

1.5 ml dd phenolphthalein 1%

 Giải thích:

Ở ống 1, khi cho 1.5 ml dd Urê 10% và 2 giọt dd Phenolphthalein 1% tác dụngvới nhau thì ta thấy xuất hiện mà phớt hồng là bởi vì Urê có tính kiềm yếu nên khicho phenolphthalein vào sẽ có màu như vậy

Ở ống 2, vẫn với lượng dd Urê 10% và dd Phenolphthalein 1% như ống 1, vàthêm 0.5g bột đậu nành thì ta thấy sự tách lớp, vì Urê đã bị thủy phân bởi bột đậunành tạo ra NH3(môi trường kiềm) Khi cho phenolphthalein vào thì dd sẽ có màuhồng bị vẩn đục ở lớp trên, lớp dưới sẽ có màu vàng là do bột đậu nành chưa tanhết

- Ống nghiệm - Dd sữa nhũ tương

Trong sữa nhũ tương có lipid nên khi cho phenolphthalein vado thì cả hai ốngđều không đổi màu Đến khi nhỏ từ từ Na2CO3 vào hai ống dd bắt màu hồng (vì

Na2CO3có môi trường kiềm)

Tiếp theo khi cho nước cất vào ống 1 và dịch tụy vào ống 2, thì dd trong ống 1vẫn không đổi màu, còn ống 2: vì trong dịch tụy có enzyme thủy phân lipid thànhglycerol và acid béo (môi trường acid), acid sẽ tác dụng với base tạo ra muối (môitrường trung tính) nên sẽ làm mất màu hồng

HÌNH ẢNH CẢ BA THÍ NGHIỆM

BÀI 2:

XÁC ĐINH HỌAT ĐỘ ENZYME I/ MỤC TIÊU:

1 Nắm được phương pháp đo quan và ứng dụng

2 Định lượng sGOT, sGPT, amylase

II/ THỰC HÀNH:

CÁCH VẬN HÀNH MÁY SH PRIETEST TOUCH

Ở bài thí nghiệm này thì cả 3 thí nghiệm đều có những bước tiến hành giốngnhau, chỉ khác ở tỉ lệ pha mẫu thử:

- Đối với thí nghiệm xác định hoát độ sGOT, sGPT:

Bước 1: Khởi động máy

 Vệ sinh máy, kiểm tra dây cáp điện, ống dẫn hóa chất… đã sẵn sàng

 Bật công tắt nguồn

 Hệ thống khởi đông xong màn hình chính hiển thị MENU

 Rửa máy: đưa nước cất đến vị trí hút mẫu, chọn WASH ( tương tự lặp lại 3lần)

Bước 2: Chạy mẫu thử bệnh nhân

 Chuẩn bị mẫu bệnh nhân (hút hóa chất, huyết tương, ủ)

 Trên màn hình chính MENU di chuyển con trỏ đến xét nghiệm cần làm(sGOT, sGPT, Amylase) sau đó chọn ENTER chọn SEL chọn RUN

 Chờ màn hình hiển thị “Press ASP Switch to sip”

 Đưa nước cất đến vị trí hút mẫu, nhấn nút bên dưới ống hút

Sau đó tùy loại xét nghiệm màn hình sẽ hiển thị một trong hai trường hợp sau:

TH1:

 Màn hình hiển thị “Use stored result?”, chọn Yes

 Chờ màn hình hiển thị “Use blank stored result?” chọn Yes

 Chờ màn hình hiển thị “Read sample”, đưa mẫu bệnh nhân đến vị trí hútmẫu, nhấn nút bên dưới ống hút

 Kết quả sẽ hiện ra trong 3 phút.

- ASAT (GOT) được xác định dựa trên phản ứng:

L-Aspartate + α-Ketoglutarate Oxaloacetate + L-Glutamate

Oxaloacetate + NADHH+L-Malate + NAD+

 MDH – Malate dehydrogenase

- ALAT (GPT) được xác định dựa trên phản ứng :

Alanine + α-Ketoglutarate Pyruvate + L-Glutamate

Pyruvate + NADHH L-Latate + NAD

 LDH – Latate dehydrogenase

b.

Dụng cụ và hóa chất:

 Hóa chất

- Huyết tương được li tâm thành huyết thanh

- Thuốc thử Sgot và sgop

 Dụng cụ

- Ống nghiệm thủy tinh

- Ông hút thuốc thử và huyết thanh

- Máy đo quang

c.

Tiến hành:

 Định lượng hoạt độ sGOT trong huyết thanh.

- Đo bước sóng 340nm (334 – 365nm)

- Nhiệt độ : 30 – 37ºC

- Đọc đối chiếu với nước cất

- Trong ống nghiệm cho vào:

+ Thuốc thử : 500 µl

+ Huyết thanh : 50 µl

- Trộn đều và sau khi ủ 1 phút, đọc giá trị

 Định lượng hoạt độ sGPT trong huyết thanh

- Đo bước sóng 340nm (334 – 365nm)

- Nhiệt độ : 30 – 37ºC

- Đọc đối chiếu với nước cất

- Trong ống nghiệm cho vào:

- Kiều My : 22,43 U/L.

*Biện luận :

- Đối với Vũ Đức Anh, trị số 30,48 U/L là bình thường vì trị số sGOTbình thường đối với nam là từ 13-46 U/L Nếu sGOT nhỏ hơn 13 U/Lhoặc lớn hơn 46 U/L thì trị số sGOT là không bình thường

- Đối với Kiều My, trị số 22,43 U/L là bình thường vì trị số sGOT bìnhthường đối với nữ là từ 11-39 U/L Nếu sGOT nhỏ hơn 11U/L hoắc lớnhơn 39 U/L thì trị số sGOT là không bình thường

 Định lượng hoạt độ sGPT trong huyết thanh:

- Đối với Kiều My, trị số 15,44 U/L là bình thường vì trị số sGPT bìnhthường đối với nữ là từ 9-37 U/L Nếu trị số sGPT nhỏ hơn 9 U/L hoặclớn hơn 37 U/L là không bình thường

Từ két quả tên ta có được tỉ số Deritis (ASAT/ALAT)

- Trong một số trường hợp sgop và sgtp tăng quá cao, quá thấp hoặc 2 trị

số chênh lệch nhau quá nhiều thì có thể mắc 1 số bệnh như : viêm gancấp tính, viêm gan mãn, xơ gan, nhồi máu cơ tim, tăng trọng lượng dưởng

cơ xương, viêm xương, tiêu myglobin

* Những yếu tố ảnh hưởng đến trị số sGOT và sGPT trong huyết thanh

- Yếu tố gây giảm: thiếu vitamin B6

- Yếu tố gây tăng: thuốc điều trị tiểu đường, giảm đau, chống thốngphong,trợ tim, chống động kinh, ngừa thai

- Ống nghiệm thủy tinh

- Ông hút thuốc thử và huyết thanh

- Máy đo quang

c.

Tiến hành:

α amylase

- Thuốc thử: dung dịch RGT đã pha sẵn

- Mẫu thử: huyết thanh

- Bước sóng đo:400 – 410 nm

- Nhiệt độ : 25ºC - 37ºC

- Đọc đối chiếu với nước cất

- Trong ống nghiệm cho vào:

- Giá trị bình thường: Amylase huyết thanh, huyết tương <220U/L.

- Huyết thanh, huyết tăng có thể nhận định kết quả là:

+ Suy thận tiến triển: thường tăng, thậm chí cả khí không có viêm tụy.+ Tăng tiết amylase

+ Loét dạ dày tá tràng thủng vào tủy

- Amylase giảm khi tụy bị hoại tử lan rộng, ngoài ra nó còn giảm trongmột số bệnh lý như:

+ Viêm tụy mạn tính

+ Viêm tụy mạn tính tiến triển

+ Xơ hóa ống dẫn tụy tiến triển

BÀI 3:

XÁC ĐINH HỌAT ĐỘ ENZYME I/ MỤC TIÊU:

1 Khảo sát các tính chất hóa học cơ bản của saccharide

2 Định lượng saccharide bằng phương pháp enzyme

- Fructose 5% - Máy cách thủy

Thêm vào mỗi ống nghệm

Ống nghiệm Hóa chất Lượng

dung dịch không đổi

- Sau khi thêm vào mỗi ống nghiệm 1, 2, 3, 4, 5 lần lượt là 0.5 Glucose 5%,

0.5 ml Fructose 5%, 0.5 ml Lactose 5%, 0.5 ml Saccarose 5%, 0.5 ml Formol 5%

thì màu dd không đổi

0.5 ml Fehling A + 0.5 ml

Fehling B

Đun cách thủy 5phútTrộn đều

5 4

3 2

1

- Sau khi đun cách thủy lần 2 màu dung dịch lần lượt là:

+ Ống 1: Ban đầu dd phớt đỏ, để một thời gian thì có màu hơi xanh, kết tủagạch đỏ

+ Ống 2: Lớp trên có màu phớt đỏ, phía dưới có màu xanh, sau một thời gian

dd có màu xanh đậm hơn ống 1

+ Ống 3: Lớp trên màu vàng nhạt, phía dưới có màu xanh Sau một thời gian

có kết tủa đỏ gạch

+ Ống 4: Có màu xanh, sau một thời gian có kết tủa đỏ gạch

+ Ống 5: Có màu xanh, sau một thời gian có kết tủa đỏ gạch nhưng ít hơnống 4

Giải thích:

Các chất glucose, fructose, lactose, saccarose, formol đều có tính khử, tuynhiên tính khử của các chất giảm dần từ glucose > fructose > lactose >saccarose > formol nên khi hử Cu2+có trong Fehling thành Cu+màu đậm dần từống 1 đến 5

Sau khi đun nóng CuOH tạo thành Cu2O có màu đỏ gạch

R-CHO + 2 Cu(OH)2R-COOH + 2CuOH + 2H2O

- Những chất thu được này là dẫn xuất của furfural, với sự cómặt của polyphenol tạo thành phức hợp có màu đặc trưng khácnhau

b Dụng cụ và hóa chất:

Trước khi cho axit:

Sau khi cho axit:

- Ống Glucose: chia thành 2 lớp, ở giữa có 1 vòng màu tímnhạt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng, lớp dưới màu phớt tím, lớptrên không màu

Trước khi cho axit:

Sau khi cho axit:

- Ống Fructose: chia thành 2 lớp, lớp trên không màu, lớp dướixanh tím

Trước khi cho axit:

Sau khi cho axit:

- Ống Lactose: ở giữa có 1 vòng màu tím ở bề mặt phân cách 2lớp chất lỏng, lớp trên màu

Trước khi cho axit:

Sau khi cho axit:

Giải thích:

- Khi cho H2SO4 thì các nhóm OH rượu bậc 2 của glucose,fructose, lactose, saccarose, formol sẽ bi khử nước tạo thànhfurfural hoặc chuyển hóa chất furfural

- Furfural phản ứng với các polyphenol (Molish) cho ra nhũngmàu đặc trưng theo từng loại đường

d Kết quả và bàn luận:

Khi cho Iốt vào tinh bột có màu tím than, sau khi đun sôi dung dịch mất màu,dung dịch keo làm lạnh dưới vòi nước thì dd lại có màu tím than, nhưng nhạthơn lúc ban đầu

Ban đầu:

Sau khi đun cách thủy:

Làm lạnh dưới vòi nước:

Giải thích:

- Trong tinh bột có amylose và amylosepectin, amylose sẽ bắt màu xanh vớiIốt, amylosepectin bắt màu tím với Iốt nên dung dịch có màu tím than

- Mặt khác, khi đun nóng thì amylose bị mất màu vì tan trong nước nóng, tạokeo vì amylosepectin không tan trong nước nóng, và khi nguội thì amylose sẽhiện màu trở lại.

- Ống nghiệm thủy tinh

- Ông hút thuốc thử và huyết thanh

- Máy đo quang

- Có thể do nhịn đói lâu ngày

- Giảm trong thiểu năng tuyến yên, tuyến thượng thận, dùng nhiều insulin

BÀI 4 + 5:

LIPID, AMINO ACID VÀ PROTEIN I/ MỤC TIÊU:

1 Khảo sát tính hòa tan của Lipid trong các dung môi khác nhau

2 Nắm được tính chất hóa học của amino acid, protein

3 Hiểu rõ và tiến hành được phương pháp định lượng protein, creatinine

2H2O2 + 4-amoniantipyrin + phenol Đỏ quinone + 4H2O

Peroxydase

LDL 45% 10% 20% 25% (98% Apo B)

A1, 22% Apo A2)

 Các thể vi chất (Chymomocrom)

 VLDL: Lipoprotein có tỷ trọng rất thấp [Very Low Density Lipoprotein]

 LDL: Lipoprotein có tỷ trọng thấp [Low Density Lipoprotein]

 HDL: Lipoprotein có tỷ trọng cao [High Density Lipoprotein]

Nhận định kết quả:

Loại mỡ trong máu Trị số bình thường Trị số không tốt gây hại cho

sức khỏe Cholesterol toàn phần <200 mg/dL

(<5,2 mmol/L)

>240 mg/dL(>6,2 mmol/L)

LDL – Cholesterol <130 mg/dL

(<3,3 mmol/L)

>160 mg/dL(>4,1 mmol/L)

Triglyceride <160 mg/dL

(<2,2 mmol/L)

>200md/dL(2,3 mmol/L)

HDL – Cholesterol >50 mg/dL

>1,3 mmol/L)

<40 mg/dL(<1 mmol/L)

 Bình thường: Triglyceride < 2,2 mmol/L

 Triglyceride máu tăng vừa (3 – 4 mmol/L) có thể thấy trong các trường hợpsau: đái đường,cường hoặc thiểu năng tuyến thượng thận, bệnh thống phong(gút), những bệnh về gan (ứ mật,xơ gan), viêm tụy cấp và mạn, hội chứngthận hư, suy thận, Cushing

 Triglyceride máu tăng vượt qua 11,3 mmol/L có thể dẫn đến viêm tụy cấp vàlàm tăng thiểu năngmạch máu ngoại biên

 Cũng có khả năng tăng triglyceride sau khi dùng thuốc cordicoid kéo dàihoặc ở phụ nữ dùngthuốc tránh thai có hormon sinh dục nữ

2 Thí nghiệm 2: Định lượng Cholesterol TP trong huyết thanh

 Cholestetol là một alcol vòng 27C có nhóm –OH ở vị trí C3 Khi alcol + acidbéo cholesteride

 Cholesterol trong cơ thểnội sinh và ngoại sinh

 Nội sinh acetyl CoA

 Cơ quan tổng hợp chủ yếu là gan, thận, tinh hoàn, buồng trứng,…

 Ngoại sinh cholesterol từ bên ngoài vào qua thức ăn

 Cholesterol có vai trò rất quan trọng vì nó tham gia cấu tạo nên màng TB, lànguyên liệu tổnghợp nên các hormon có bản chất steroid, và là một trong bathành phần của dung dịch mật Tuynhiên nồng độ Cholesterol tăng cao trongmáu lại là nguyên nhân dẫn đến xơ vữa động mạch

a Nguyên tắc:

 Cholesterol TP trong huyết thanh gồm cholesterol tự do và cholesterol estehóa Để định lượngcholesterol TP, trước hết phải dùng phản ứng thủy phâncắt đứt liên kết este, biến cholesteroleste thành cholesterol tự do

 Cholesterol este + H2O cholesterol tự do + acid béo

 Cholesterol tự do + O2 Cholesten-4 + H2O2

 H2O2 + 4Aminoantipyrin + phenol Quinonemin + 4H2O

Độ đậm màu của phức hồng cánh sen tỷ lệ thuận với nồng độ cholesterol toànphần trong huyếtthanh và được xác định ở bước sóng 546nm bằng phép đo điểmcuối

b.

Tiến hành:

 Mẫu thử: huyết thanh

 Thuốc thử: bộ kit hóa chất gồm: reagent A – cholesterol và standard –cholesterol (cholesterolmẫu có nồng độ 5,18 mmol/L)

Cholesterol esterase

Cholesterol oxydase

POD

Lượng cholesterol TP: 60.10 (mg/DL) x 0.026 = 1.5626 (mmol/l)

Lượng cholesterol TP trong huyết thanh thắp so với trị số bình thường

 Tăng cholesterol máu khi trên 2,6 g/L

 Tăng cholesterol máu tiền phát: bệnh gia đình, thường gặp nhất trong cácbệnh lipid di truyền,cholesterol máu có thể 8 – 10 g/L

 Vàng da tắt mật: trong sỏi mật (Cholesterol máu có thể đạt 4 g/L);Carcinoma ống dẫn mật, xơgan viêm tiểu quản mật

 Bệnh Von Gierke, viêm gan nhiễm độc (As)

 Bệnh thận, viêm thận mạn tăng urea trong máu; thận hư (do viêm thận mạn,huyết khối TMthận, thoái hóa dạng tinh bột, luput ban đỏ toàn thân, viêmquanh động mạch, xơ cầu thận, tiểuđường) Trong thận nhiễm mỡ cholesterolmáu có thể đạt tới 5 g/L

 Bệnh tụy tạng: tiểu đường (cùng tăng với lipid, nhất là triglyceride), cắt tụytoàn phần, viêm tụymạn

 Suy tuyến giáp tiên phát hay thứ phát: cholesterol máu có thể quá 6 g/L,trong phù niêm donhược giáp, không có tuyến giáp bẩm sinh, rối loạn tổnghợp hormon giáp bẩm sinh; cholesterolmáu tăng ít hoặc không tăng trongphù niêm do suy tuyến yên (suy tuyến giáp) trong phù niêmdo thiếu iod…

 Xơ mỡ động mạch (XMĐM): các loại tăng LP máu có nguy cơ gây XMĐMnhất đều có cholesterolmáu cao, các mảng XMĐM chứa 7 – 20 lầncholesterol hơn động mạch chủ

 Các rối loạn chuyển hóa lipid khác: vữa ĐM, mập, tích lipid,…

 Giảm cholesterol máu khi dưới 1,5 g/L

 Thiếu dinh dưỡng: đói, ung thư giai đoạn cuối, tăng urea máu, kém hấp thụtrong tiêu chảy mỡ,viêm trực đại tràng, cắt dạ dày, viêm tụy

 Gan bị tổn thương nặng: do hóa chất, thuốc, viêm gan

 Xơ gan, trong đó có xơ gan do nghiện rượu: nếu cholesterol máu giảm dưới 1g/L và tỉ số CE/CTPdưới 30% thì tiền lượng xấu

 Cường giáp, tăng aldosterol, cường cận giáp,…

 Thiếu máu mạn: thiếu máu ác tính tái phát, thiếu máu tan huyết bẩm sinh,thiếu máu nhược sắcrõ

 Điều trị bằng ACTH và cortisol; điều trị hôn mê tiểu đường bằng insulin;dùng thuốc lợi tiểu

 Sốt và nhiễm khuẩn: viêm phổi, bạch hầu, thương hàn,…

 Giảm cholesterol máu tự phát: bệnh di truyền hiếm, vô beta lipoprotein

3 Thí nghiệm 3: Hóa học amino và protein

 Phản ứng của amino acid

 Tác dụng với Ninhydrin

a.

Nguyên tắc:

- Do tác dụng đồng thơi của 2 nhóm –COOH và –NH2, amino acid tác dụngvới Ninhydrin cho phứcchất màu xanh tím

- Phản ứng dùng để phát hiện amino acid, ứng dụng quan trọng trong phươngpháp sắc ký aminoacid

- Riêng proline và hydroxyproline cho với Ninhydrin phức chất màu vàng

b.

Tiến hành:

Lấy 3 ống nghiệm:

Hóa chất Ống nghiệm, µl