Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Tách và xác định một số độc tố nhóm alkaloids trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

Luận văn góp phần kiểm soát các nguy cơ tiềm ẩn để đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng và giúp cơ quan chức năng quản lý đưa ra các khuyến cáo nhằm giảm nguy cơ ngộ độc do sử dụng các thực phẩm chức năng có ngồn gốc thảo dược.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

ĐỖ THỊ THU HẰNG

TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ NHÓM ALKALOID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

LỎNG KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

ĐỖ THỊ THU HẰNG

TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘC TỐ NHÓM ALKALOID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

LỎNG KHỐI PHỔ

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã Số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người Hướng Dẫn Khoa Học: PGS TS Lê Thị Hồng Hảo

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Lê Thị Hồng Hảo, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia – Bộ Y tế đã tận tình hướng dẫn, đóng góp những ý kiến quý báu và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá học, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân Tích, đã cho em những kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm

An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi được học tập và hoàn thành đề tài này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các đồng nghiệp tại labo Hóa – Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình làm thực nghiệm

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi

Hà Nội, năm 2015

Học viên

Đỗ Thị Thu Hằng

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về nhóm alkaloid 3

1.1.1 Lịch sử phát hiện 3

1.1.2 Khái quát về nhóm alkaloid 3

1.1.3 Cấu tạo của một số alkaloid độc 6

1.1.4 Tác dụng và độc tính của một số alkaloid 7

1.2 Các phương pháp xác định 13

1.2.1 Phương pháp điện di mao quản 13

1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng với detector UV 14

1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng với detector khối phổ 16

1.3 Sắc ký lỏng khối phổ 18

1.3.1 Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng 18

1.3.2 Detector khối phổ (Mass spectrometry – MS) 18

1.3.2.4 Bộ phận phát hiện 22

1.3.3 Phân tích định tính và định lượng bằng LC-MS/MS 22

1.4 Lấy mẫu 23

1.5 Đánh giá phương pháp phân tích 23

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu 27

2.3.1 Thiết bị 27

2.3.2 Dụng cụ 27

2.3.3 Chất chuẩn 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Tối ưu điều kiện tách và xác định các alkaloid trên thiết bị LC/MS/MS 30

3.1.1 Tối ưu các điều kiện của detector khối phổ (MS/MS) 30

3.1.2 Tối ưu các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 33

3.2 Tối ưu quá trình xử lý mẫu 42

3.2.1 Khảo sát dung môi chiết 43

3.2.2 Khảo sát dung dịch kiềm hóa 45

3.2.3 Khảo sát thể tích dung dịch kiềm hóa 46

3.3 Đánh giá phương pháp phân tích 48

3.3.1 Tính đặc hiệu/chọn lọc 48

3.3.2 Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn 49

3.3.3 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp 51

3.3.4 Đánh giá độ lặp lại và độ thu hồi 52

3.4 Phân tích mẫu thực 57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

KẾT LUẬN 59

KIẾN NGHỊ 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

PHỤ LỤC 65

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Cấu trúc hoá học của một số alkaloid độc được xác định trong đề tài 6

Bảng 1.2 Các giá trị LD50 của các chất phân tích 8

Bảng3.1: Các mảnh ion định lượng và định tính của các alkaloid 30

Bảng 3.2: Các thông số tối ưu MS/MS đối với chế độ ion dương 33

Bảng 3.3: Các hệ dung môi pha động khảo sát 34

Bảng 3.4: Diện tích các alkaloid khi sử dụng các hệ dung môi khác nhau 36

Bảng3.5: Các chương trình gradient khảo sát 37

Bảng3.6: Ảnh hưởng nồng độ amoniacetat tới diện tích píc các alkaloid 41

Bảng 3.7 : Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hiệu suất chiết các alkaloid 44

Bảng 3.8 : Ảnh hưởng của dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết các alkaloid 45

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của thể tích dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết các alkaloid 46

Bảng 3.10: Đường chuẩn các alkaloid 50

Bảng 3.11: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của các alkaloid 51

Bảng 3.12: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của các Alkaloid trên nền mẫu thực phẩm chức năng tại nồng độ 50-500 µg/kg (0,05-0,5 mg/kg) 53

Bảng 3.13: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của các Alkaloid trên nền mẫu thực phẩm chức năng tại nồng độ 0,1-1 mg/kg 54

Bảng 3.14: Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của các Alkaloid trên nền mẫu thực phẩm chức năng tại nồng độ 0,2-2 mg/kg 55

Bảng 3.15: Bảng kết quả phân tích mẫu thực 57

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Chế độ ion hóa phun điện tử ESI 19

Hình 1.2: Cấu tạo của bộ phân tích khối tứ cực chập ba 21

Hình 3.1: Sắc đồ tỷ lệ các ion của koumin và atropin 31

Hình 3.2: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng hệ dung môi pha động 1 34

Hình 3.3: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng hệ dung môi pha động 2 35

Hình 3.4: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng hệ dung môi pha động 3 35

Hình 3.5: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng hệ dung môi pha động 4 35

Hình 3.7: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng chương trình gradient 2 37

Hình 3.8: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng chương trình gradient 3 38

Hình 3.9: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng chương trình gradient 4 38

Hình 3.10: Sắc đồ ion tổng khi sử dụng chương trình gradient 5 38

Hình 3.11: Sắc đồ ion tổng tại tốc độ dòng 0,6 mL/phút 40

Hình 3.13: Sắc đồ ion tổng tại tốc độ dòng 0,4 mL/phút 40

Hình 3.14: Biểu đồ sự phụ thuộc diện tích píc của các alkaloid vào nồng độ amoniacetat trong pha động 42

Hình 3.15: Sơ đồ quy trình chiết mẫu dự kiến 43

Hình 3.16 : Biểu đồ ảnh hưởng của dung môi chiết đến hiệu suất chiết các alkaloid 44

Hình 3.17 : Biểu đồ ảnh hưởng của dung dịch kiềm hóa đến hiệu suất chiết các alkaloid 46

Hình 3.18 : Quy trình chiết mẫu tối ưu 47

Hình 3.19 : Sắc đồ chuẩn alkaloid, mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn 48

Hình 3.20: Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ Atropin trong khoảng 0,5-100 ng/mL 49

Hình 3.21: Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ aconitin trong khoảng 5-1000 ng/mL 49

Hình 3.22: Đường chuẩn Scopolamin (R2 = 0,9999) 50

Hình 3.23: Sắc đồ của nicotin tại giới hạn phát hiện LOD 1,0 µg/kg (S/N = 3,6) 51

Hình 3.24: Sắc đồ của Brucin tại giới hạn định lƣợng LOQ 10 µg/kg (S/N = 11,5) 52

Hình 3.26: Sắc đồ atropin trong mẫu thực phẩm chức năng thêm chuẩn tại mức nồng độ 0,1 mg/kg 55

Hình 3.27: Sắc đồ scopolamin trong mẫu thực phẩm chức năng thêm chuẩn tại mức nồng độ 0,2 mg/kg 56

Hình 3.28: Sắc đồ mẫu phát hiện brucin 58

Hình 3.29: Sắc đồ mẫu phát hiện strychnin 58

BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

APCI Atmospheric pressure chemical

ionization

Chế độ ion hóa ở áp suất khí quyển

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IUPAC International Union of Pure and

Applied Chemistry

Liên minh quốc tế về hóa học

cơ bản và ứng dụng

UPLC-MS/MS

Ultral performance liquid

chromatography tandem mass

spectrometry

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết nối khối phổ

MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, rất thuận lợi cho sự phát triển của thực vật và đây được coi là một kho tàng vô giá về nguồn cây thuốc và dược liệu quý Trong đó alkaloid là những thành phần hoạt tính chính của nhiều cây thuốc Alkaloid là amin nguồn gốc tự nhiên do thực vật tạo ra, nhưng các amin do động vật và nấm tạo ra cũng được gọi là các alkaloid Cấu trúc bao gồm carbon, hydro, nitơ, và thường có oxy Các alkaloid là bazơ hữu cơ tương tự như kiềm (bazơ

vô cơ); tên có nghĩa là như kiềm Alkaloid xuất hiện chủ yếu trong các chi khác nhau của thực vật có hạt, chẳng hạn như cây thuốc phiện và cây thuốc lá, mã tiền… Chúng có thể được tìm thấy trong hầu hết các bộ phận của các loại thực vật này, bao gồm cả lá, rễ, hạt, và vỏ cây Mỗi một phần của thực vật thường có chứa một số chất hóa học liên quan đến alkaloid Chức năng của alkaloids trong chuyển hóa thực vật chưa được biết, nhưng hầu hết các alkaloid có ảnh hưởng rõ rệt đến hệ thống thần kinh của người và động vật khác Trong số hàng trăm alkaloid được tìm thấy trong tự nhiên, chỉ có khoảng 30 chất được sử dụng thương mại Một số alkaloid, chẳng hạn như nicotin, được sử dụng trong thuốc trừ sâu, và một số khác được sử dụng làm thuốc thử hóa học Tuy nhiên, các alkaloid được sử dụng chủ yếu trong y học, bởi vì chúng có thể tác động một cách nhanh chóng trên các khu vực cụ thể của

hệ thần kinh Alkaloid là những thành phần hoạt tính chính của nhiều thuốc gây mê, thuốc an thần, các chất kích thích và thuốc an thần Chúng được dùng bằng đường uống và tiêm Ngoại trừ dưới sự giám sát của bác sĩ, sử dụng các alkaloid là nguy hiểm, bởi vì hầu hết hình thành thói quen (ví dụ, gần như tất cả các chất ma tuý là alkaloid) và dùng liều lượng lớn có thể là độc hại

Trong dân gian ta thường sử dụng các cây thảo dược như cà độc dược, mã tiền, củ ấu tàu… dùng để chữa bệnh nhưng trong các loại cây này có chứa một hàm

năng có nguồn gốc thảo dược cũng sử dụng các loại cây này hoặc có thành phần được chiết xuất từ cây thuốc có các hoạt chất như các alkaloid, terpenoid, phenolic… được biết đến như là các hợp chất thứ cấp Sử dụng các loại thực phẩm chức năng này có thể là con dao hai lưỡi, dùng với liều lượng vừa phải có tác dụng chữa một số bệnh song dùng không đúng cách hoặc quá liều có thể dẫn đến ngộ độc hoặc các biến chứng Vì vậy sử dụng những thực phẩm chức năng có chứa các alkaloid độc này phải cẩn trọng và phải được sự quản lý và cho phép của các cơ quan chức năng Tuy nhiên, ở Việt Nam việc xác định đồng thời các alkaloid đô ̣c trong thực phẩm chức năng vẫn chưa được nghiên cứu Do vậy, để góp phần kiểm soát các nguy cơ tiềm ẩn để đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng và giúp cơ quan chức năng quản lý đưa ra các khuyến cáo nhằm giảm nguy cơ ngộ độc do sử dụng

các thực phẩm chức năng có ngồn gốc thảo dược Chúng tôi đã tiến hành đề tài:

“Tách và xác định một số độc tố nhóm alkaloids trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ ”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1.1 Lịch sử phát hiện

Năm 1804- 1805, các nhà hóa học Pháp và Đức đã phân lập được morphin

và điều chế được dạng muối của nó Đồng thời đã chứng minh được morphin là hoạt chất chính của cây thuốc phiện có tác dụng sinh lý rõ rệt Năm 1980, từ vỏ cây canhkina, đã chiết và kết tinh được một chất đặt tên là “cinchonino” sau đó hai nhà hóa học Pháp đã xác định cinchonino là hỗn hợp của hai alkaloid là quinin và cinchonin Năm 1918, phát hiện ra alkaloid của hạt mã tiền là strychnin và brucin; phát hiện ra cafein trong chè, cà phê Sau đó tiếp tục phát hiện ra nicotin trong thuốc

lá, atropin trong cà độc dược, theobromin trong cacao, codein trong thuốc phiện, cocain trong lá coca Giữa năm 1973, người ta đã xác định được 4959 alkaloid khác nhau trong đó có 3293 chất đã xác định được công thức hóa học Hiện nay đã phát hiện ra được rất nhiều alkaloid và cũng đã được đưa vào ứng dụng trong y học ngày một tăng [15]

1.1.2 Khái quát về nhóm alkaloid

1.1.2.1 Khái niệm

Alkaloid có nguồn gốc từ chữ: alcali tiếng Ả rập là kiềm Alkaloid là:

- Những hợp chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, có tính bazơ thường gặp ở trong nhiều loài thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài động vật

- Có phản ứng kiềm cho các muối với acid và các muối này dễ kết tinh

- Có hoạt tính sinh học rất quan trọng

- Có một số phản ứng chung là tạo “tủa“ cần thiết cho sự xác định chúng Chúng là một nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng về nhiều mặt Đặc biệt trong lĩnh vực y học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao và độc đáo [15] [16]

1.1.2.2 Cấu tạo hóa học

Về mặt hóa học, sự phong phú và đa dạng của alkaloid đã trở thành một

chuyên nghành, chiếm một vị trí quan trọng trong lĩnh vực nghiên cứu và trong tạp chí thông tin về hóa học Đối với việc nghiên cứu alkaloid còn quan trọng hơn bởi

vì chúng có trong hệ thực vật nhiệt đới phong phú là nguồn cung cấp alkaloid chủ yếu Về mặt cấu trúc hóa học, chúng có ít nhất 1 nguyên tử N trong phân tử, chủ yếu nằm trong vòng Sự có mặt của nguyên tử của N trong cấu trúc quyết định tính bazơ của alkaloid và là chỗ dựa rất quan trọng cho các nhà hóa học trong nghiên cứu alkaloid [15]

1.1.2.3 Phân loại

Các alkaloid đã biết có đến trên 250 dạng cấu trúc khác nhau với hơn 5.500

hợp chất alkaloid trong tự nhiên Vì vậy cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ bản trước đây (khoảng 20 nhóm cấu trúc) chưa đáp ứng được nên ngày càng có xu hướng chia chúng thành những nhóm nhỏ: nhóm alkaloid Ecgotamia, Harmin, Yohimbin, Strychnin, Echitamin Nhóm alkaloid có nhân isoquinolin được chia

Benzophenanthridin…Có ý kiến xếp các hợp chất có N ngoài vòng như Colchicin, Hordenin, là các protoalkaloid [15] [27]

1.1.2.4 Sự phân bố

Cromwell (1995) ước tính alkaloid phân bố trong khoảng 1 phần 7 loài thực

vật có hoa Một ước tính khác (Hegnauer, 1963) cho rằng alkaloid có từ 12%-20% trong tổng số cây có nhựa Còn Willaman và Schubert (1955) thì cho rằng trong hơn

300 họ của nghành hạt kín thì 1/3 họ có chứa alkaloid Nhiều tổng kết cho thấy đại

đa số cây có chứa alkaloid là cây hai lá mầm Chỉ có một số ít cây chứa alkaloid là cây 1 lá mầm và nghành hạt trần Theo thống kê đến nay thì cây thuộc thảo và cây bụi có nhiều alkaloid hơn cây gỗ, và trọng lượng phân tử của alkaloid trong cây gỗ thường bé hơn trọng lượng phân tử cây thuộc thảo Cây một năm có nhiều alkaloid hơn cây lưu niên (Levin, 1976) Alkaloid không có trong loài sống ở nước ngoại trừ

họ sen (Nympheaceae) (Mc.Nair.1943) Thực ra rất nhiều loài có alkaloid nhưng chỉ

ở mức độ dạng vết hoặc ở tỷ lệ phần vạn, mười vạn Để giới hạn với ý nghĩa thực tiễn, một cây được xem là có alkaloid phải chứa ít nhất là 0.05% alkaloid so với dược liệu khô Mối liên quan giữa alkaloid với các chất khác trong 1 cây cũng đã được nghiên cứu Cây có chứa alkaloid đều vắng mặt tinh dầu và ngược lại (Trelibs,1955) [27]

1.1.2.5 Tính chất

Alkaloid là các bazơ yếu, do sự có mặt của nguyên tử N Nhưng độ kiềm

của alkaloid không giống nhau do ảnh hưởng khác nhau của lớp điện tích nguyên tử

N gây ra và ảnh hưởng của các nhóm chức khác Nói chung tính bazơ giảm dần theo thứ tự amoni bậc 4, amoni bậc 1, amoni bậc 2, amoni bậc 3

Hầu hết các alkaloid bazơ thực tế không tan trong nước nhưng tan trong các dung môi hữu cơ như CHCl3, eter và các ancol bậc thấp (methanol, ethanol, butanol) Một số nhóm alkaloid có thêm các nhóm phân cực nên tan được một phần trong nước hoặc trong kiềm Ví dụ: Morphine, Cephalin, do có nhóm OH phenol nên tan trong dung dịch kiềm và các bazơ của chúng thì gần như là không tan trong eter Ngược lại với bazơ, các muối alkaloid nói chung tan được trong nước và cồn nhưng hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như: CHCl3, eter, benzene Có một số trường hợp ngoại lệ như Ephedrin, Cochicin, Ecgovonin, các bazơ của chúng tan được trong nước nhưng cũng khá tan trong dung môi hữu cơ và các muối của chúng thì ngược lại Alkaloid có N – Bậc 4 và N – oxide bazơ của alkaloid có N – Bậc 4 và N – oxide khác tan trong nước và trong kiềm ít tan trong dung môi hữu

cơ Các muối của chúng có độ hòa tan khác nhau tùy thuộc vào gốc acid tạo ra chúng Vì vậy có thể chiết chúng bằng dung dịch kiềm và kết tủa dưới dạng muối có

độ hòa tan thấp nhất Đối với các alkaloid N – oxide thì dùng phản ứng khử Oxy bằng bột kẽm trong môi trường HCl để chúng chuyển thành alkaloid dạng thường sau đó kết tủa bằng kiềm và chiết bằng dung môi hữu cơ [14]

1.1.3 Cấu tạo của một số alkaloid độc

Bảng 1.1 Cấu trúc hoá học của một số alkaloid độc đƣợc xác định trong đề tài

STT

Alkaloid Công thức

phân tử

Khối lƣợng phân tử (g/mol)

pK a Công thức cấu tạo

1

Brucin

Dimethoxystrychnine

Bảng 1.2 Các giá trị LD50 của các chất phân tích

Brucin và strychnin đều là alkaloid đắng, brucin có liên quan chặt chẽ với

strychnin Hai chất này xuất hiện ở một số loài thực vật, được biết đến nhiều nhất là alkaloid chính trong vỏ, lá, hạt cây mã tiền được tìm thấy ở Đông Nam Á Hạt chứa khoảng 1,5% strychnin, còn hoa khô chứa khoảng 1,023 %, ngay cả vỏ cây cũng chứa các hợp chất độc, bao gồm cả brucin [5] Strychnin là một alkaloid không màu, ít tan trong dầu lửa và trong nước, không tan trong ethyl eter Strychnin trích

từ hạt cây mã tiền hay nhân, rất độc, chất strychnin được ghi vào bảng A của các dược điển

Trong y học dân gian, mã tiền dùng như thuốc bổ lành bệnh và kích thích sự thèm ăn và là một loại thuốc vi lượng đồng căn, được dùng cho những vấn đề tiêu hóa thông thường, nhạy cảm với nhiệt độ lạnh, cáu kỉnh khó chịu và sử dụng như thuốc bổ cho hệ thống tuần hoàn trường hợp bị chứng suy tim

Strychnin dạng tinh thể sử dụng làm thuốc trừ sâu, đặc biệt là để giết chết động vật có xương sống nhỏ như các loài chim và động vật gặm nhấm Strychnin gây co giật cơ bắp và cuối cùng chết vì ngạt

Đứng trên quan điểm dược lý, strychnin là một chất kích thích chủ yếu vào tủy sống, đây là hệ thống thần kinh trung ương Nó làm tăng cảm nhận giác quan như: vị giác, khứu giác, thị giác Với lượng vừa phải trung bình, hoạt động tác dụng vào trung tâm hô hấp nằm trong hành tủy ( bulle rachidien ) và gia tăng biên độ hô hấp Chất strychnin được sử dụng trong chữa trị những chứng rối loạn chức năng cơ vòng ( sphinctériens ) nhất định, sự suy hô hấp và viêm đa thần kinh nghiện rượu Khi dùng với một liều rất nhỏ, theo Stille ( Système de Madica et thérapeutique,

1864 ): dùng trong rối loạn tiêu hóa, để gia tăng bài tiết dịch vị ở dạ dày, ở miệng ở gan và ở tụy tạng Nhưng khi dùng quá liều có thể dẫn đến ngộ độc Khi ngộ độc strychnin, được thể hiện bởi những cơn động kinh co giật và đôi khi đưa đến tử vong vì ngạt thở.Vì vậy, strychnin không còn sử dụng trong y học hiện đại, mặc dù

nó đã được sử dụng rộng rãi trong y học thời trước thế chiến thứ hai Liều dùng làm thuốc của strychnin sulfat là 1 mg/mL [12] [13]

Chất brucin gần giống như strychnin trong chức năng, nhưng nhẹ hơn, ít độc hơn, nó chỉ làm tê liệt hệ thần kinh vận động ngoại vi Cho mục đích y tế, brucin được sử dụng chủ yếu trong việc điều tiết huyết áp cao và bệnh tim tương đối lành tính khác Brucin không phải là chất độc hại nhưng một người tiêu thụ hơn 2 mg brucin tinh khiết gần như chắc chắn sẽ bị các triệu chứng tương tự như ngộ độc strychnin và có thể gây tử vong ở liều lượng lớn [16] [27] [31]

1.1.4.2 Aconitin

Aconitin là một alkaloid độc có trong củ ấu tàu, còn gọi là củ gấu tàu, là rễ

củ của cây ô đầu Việt Nam, tên khoa học là Aconitum fortunei Cây thường mọc

hoang ở các vùng núi cao biên giới phía Bắc nước ta: Lào Cai, Tuyên Quang, Hà Giang Ô đầu được xếp vào loại thuốc rất độc (bảng A) Độc tính của aconitin rất mạnh: Chỉ cần một liều từ 0,02 - 0,05 mg cho 1kg thể trọng là có thể gây chết người Ở nhiệt độ cao, aconitin bị phân hủy thành benzoylaconin và sau đó là aconin kém độc hơn aconitin khoảng 1.000 đến 2.000 lần Loại độc tố này thường

Trong Đông y, ấu tàu được dùng ngâm rượu để xoa bóp khi bị đau nhức, tê mỏi chân tay Tây y dùng làm thuốc ho, chữa chứng ra mồ hôi nhiều Thường chỉ dùng làm thuốc uống khi đã qua chế biến cẩn thận và được dùng với liều nhỏ, có sự chỉ định và theo dõi thận trọng của thầy thuốc

Củ ấu tàu ngâm rượu chỉ dùng để xoa bóp Nguy cơ bị ngộ độc thường là trong những trường hợp uống nhầm tưởng là rượu thuốc, để trong tầm với của trẻ, khi dùng quá liều chỉ định của thầy thuốc Ở một số tỉnh vùng cao như Lào Cai, Hà Giang,… người dân thường nấu cháo củ ấu tàu dùng như món đặc sản vùng cao Tuy nhiên nếu ăn những món ăn có củ ấu tàu chế biến chưa đúng cách sẽ gây ngộ độc Biểu hiện của ngộ độc : Sau khi ăn, aconitin ngấm rất nhanh qua niêm mạc dạ dày, ruột để vào máu gây nên các triệu chứng như tê miệng lưỡi, nói khó, tê mỏi chân tay, chuột rút, đau đầu, nhìn mờ, buồn nôn, nôn, ỉa chảy, nặng hơn có thể liệt cơ hô hấp, loạn nhịp tim,… Nếu không được điều trị kịp thời bệnh nhân sẽ tử vong [16] [17]

1.1.4.3 Atropin

Atropin là một alkaloid tự nhiên chiết xuất từ cây ba ̣ch anh (Atropa belladonna), cây cà độc dươ ̣c (Datura meterl), giống cây độc (Mandragora officinarum) và các bộ phận của cây họ cà (Solanaceae) Atropin làm giãn đồng tử, tăng nhịp tim, và làm giảm tiết nước bọt và dịch tiết khác Atropin được xếp vào thuốc độc bảng A, liều độc atropin tác động lên não làm say có khi phát điên, hô hấp tăng, sốt, cuối cùng thần kinh trung ương bị ức chế và tê liệt

Atropin là một trong các alkaloid chính trong cây cà độc dược có ở Việt Nam, với hàm lượng cao nhất ở lá và hột Hàm lượng toàn phần các alkaloid từ 0,2-0,5%, chủ yếu là scopolamin, hyoscyamin, atropin và các saponin, flavonoid, tanin Tác dụng dược lý của cà độc dược chủ yếu là do các alkaloid: làm giãn phế quản, giãn đồng tử, giảm nhu động ruột và bao tử nếu những cơ quan này co thắt, làm khô nước bọt, dịch vị, mồ hôi Theo Đông y, hoa cà độc dược có vị cay, tính

ôn, có độc, có tác dụng ngừa suyễn, giảm ho, chống đau, chống co giật, phong thấp đau nhức Lá là vị thuốc ngừa cơn hen, giảm đau bao tử, chống say tàu xe Ngoài ra còn điều trị phong tê thấp, đau dây thần kinh toạ, đau răng Người ta thường dùng

lá cuộn thành điếu hay thái nhỏ vấn thành điếu thuốc để hút (chữa ho, hen suyễn), dùng lá hơ nóng đắp điều trị đau nhức, tê thấp, hoặc phơi khô tán bột mịn.Vì cây có độc tính cao nên chỉ dùng theo sự hướng dẫn của thầy thuốc Khi bị ngộ độc, có hiện tượng giãn đồng tử, mờ mắt, tim đập nhanh, giãn phế quản, môi miệng khô, khô cổ đến mức không nuốt và không nói được Chất độc tác động vào hệ thần kinh trung ương, có thể gây tử vong do hôn mê [27] [31]

Atropin là alkaloid kháng thụ thể đối giao cảm M (Muscarin), tác dụng lên cả trung ương và ngoại biên Atropin được dùng để ức chế tác dụng của hệ thần kinh đối giao cảm Với liều điều trị, Atropin có tác dụng yếu lên thụ thể Nicotin [12] [13]

1.1.4.4 Scopolamin

Scopolamin hay còn gọi là “hơi thở của quỷ” hoặc gọi tên khác là

Burundanga là một loại ma túy hay ma dược được bào chế từ cây Borrachero ở Colombia và có tác dụng gây mê đồng thời có khả năng làm mất

đi thần trí của con người và đưa con người vào trạng thái bị thôi miên Cây Borrachero thuộc họ cà độc dược và gần giống với cây loa kèn trắng Scopolamin

có đặc điểm là không màu, không mùi và không vị nhưng lại có khả năng tạo ra những giấc mơ kỳ lạ cho con người khi hít phải thuốc này Do cấu trúc hoá học, thuốc có thể gây ra tình trạng hoang tưởng ảo giác rất mạnh Đặc biệt, Scopolamin

sẽ ngăn chặn ngay từ giai đoạn đầu, không để kí ức được hình thành, những sự kiện xảy ra trong thời gian thuốc ảnh hưởng tới thần kinh con người sẽ không được ghi lại đến khi thuốc hết tác dụng, người ta vẫn không tài nào nhớ nổi chuyện gì đã xảy

ra, nó có thể gây ra tình trạng mất trí nhớ ở mức độ tương tự như thuốc an thần diazepam Nếu sử dụng với liều cao thì có thể gây chết người, Scopolamin còn làm con tim đập nhanh hơn và gây ra tình trạng kích động Scopolamin có thể biến người ta thành dạng không có nhận thức giống như các thây ma sống/xác sốngnên người chịu ảnh hưởng của thuốc không thể nhớ chuyện gì đã xảy ra [12] [13] [31]

Scopolamin là một loại thuốc kháng cholinergic Scopolamin có nhiều tác

nở con ngươi Scopolamin được sử dụng để làm giảm buồn nôn, nôn, chóng mặt

và liên quan đến say tàu xe và phục hồi từ gây mê sau phẫu thuật Scopolamin cũng có thể được sử dụng trong điều trị bệnh Parkinson, hội chứng ruột kích thích, viêm túi thừa [27]

1.1.4.5 Koumin

Koumin là một trong các alkaloid độc được tìm thấy trong lá ngón.Độc

tính của lá ngón là do các alkaloid chứa trong toàn bộ cây, trật tự độc giảm từ rễ,

lá, hoa, quả và thân cây Tới 17 đơn phân alkaloid đã được chiết ra từ lá ngón trong đó hàm lượng koumin là cao nhất Người bị ngộ độc lá ngón có các triệu chứng khát nước, đau họng, chóng mặt, hoa mắt, buồn nôn… sau đó bị mỏi cơ, thân nhiệt hạ, huyết áp hạ, răng cắn chặt, sùi bọt mép, đau bụng dữ dội, tim đập yếu, khó thở, đồng tử giãn và chết rất nhanh do ngừng hô hấp Tại Trung Quốc, nó được sử dụng để điều trị eczema, bệnh trĩ, nhiễm trùng răng, phong (hủi), nhọt ngoài da, chống tổn thương và co thắt, nhưng do độc tính cao nên chỉ hạn chế trong các ứng dụng ngoài da [5] [27] [31]

1.1.4.6 Colchicin

Colchicin là chất độc tự nhiên được chiết xuất từ thực vật thuộc chi

Colchicum (nghệ tây) và từ cây tỏi độc Nó được sử dụng để điều trị các bệnh thấp khớp, đặc biệt là bệnh gút.Ngoài bệnh gút, colchicin được sử dụng để điều trị sốt, viêm màng ngoài tim Hiện nay người ta thấy conchicin gây hạ nhiệt, tăng huyết áp, tăng nhu động một cách thái quá Trên điểm nối thần kinh cơ (jonction neuro-musculaire), conchicin gây nghẽn biểu hiện bằng tê liệt và nếu kéo dài biểu hiện teo

cơ xương Do tác dụng củacolchicin nên dùng tỏi độc có thể có những hiện tượng ngộ độc như: nôn mửa, đi lỏng, đau bụng Liều chết trung bình là 0.03mg đối với kg thể trọng, 1centigam đã gây cho người những hiện tượng ngộ độc, sự bài tiết chất độc của conchicin chậm do đó những người viêm thận hay thiểu năng thận không nên dùng Liều dù ng làm thuốc của colchicin là 1 mg, khi tiêm hàng ngày liều cao hơn 1 mg thì colchicin sẽ tích tu ̣ ở mô và có thể dẫn đến ngô ̣ đô ̣c

Colchicin được hấp thu ở ống tiêu hóa và đi vào vòng tuần hoàn ruột-gan Nồng độ đỉnh huyết tương xuất hiện sau khi uống 2 giờ Colchicin ngấm vào các

mô, nhất là niêm mạc ruột, gan, thận, lách, trừ cơ tim, cơ vân và phổi Colchicin được đào thải chủ yếu theo phân và nước tiểu (10-20%) Khi tiêm hàng ngày liều cao hơn 1 mg thì colchicin sẽ tích tụ ở mô và có thể dẫn đến ngộ độc

Colchicin có nhiều tác dụng: chống bệnh gout, chống viêm không đặc hiệu, chống phân bào, làm tăng sức bền mao mạch, kích thích tuyến vỏ thương thận, phân hủy tế bào lympho, ức chế phó giao cảm, kích thích giao cảm, chống ngứa, gây ỉa chảy, ức chế in vitro khả năng ngưng tập kết tập tiểu cầu [27] [31]

1.1.4.7 Nicotin

Nicotin là một alkaloid được tìm thấy trong các họ cây bạch anh , cây họ Cà (Solanaceae), chủ yếu là trong cây thuốc lá, và với hàm lượng thấp hơn trong cà chua, khoai tây, cà tím, và tiêu xanh Nicotin được tạo ra trong rễ và tích tụ trong lá của cây Nó chiếm khoảng 0,6-3,0% trọng lượng khô của cây thuốc lá Nó có chức năng như một chất độc thần kinh rất mạnh với ảnh hưởng rõ rệt đến các loài côn trùng, do đó nicotin được sử dụng rộng rãi như một loại thuốc trừ sâu Các chất tương tự nicotin như imidacloprid hiện đang sử dụng rộng rãi làm thuốc bảo vệ thực vật Với liều lượng nhỏ hơn (trung bình khoảng 1 mg nicotin hấp thụ), chất này hoạt động như một chất kích thích trong động vật có vú, trong khi lượng cao (30-60 mg) có thể gây tử vong Hiệu ứng kích thích nàycó thể là một yếu tố chính đóng góp vào các thuộc tính phụ thuộc hình thành của người hút thuốc lá (gây nghiện).Theo Hiệp hội tim mạch Mỹ, nghiện thuốc lá có lịch sử là một trong những thói nghiện ngập khó khăn nhất để phá vỡ, các đặc điểm dược lý và hành vi để xác định nghiện thuốc lá cũng tương tự như nghiện heroin và cocain [24] [27] [31]

1.2 Các phương pháp xác định

1.2.1 Phương pháp điện di mao quản

đầy dung dịch đệm, đặt trong điện trường Do độ linh động điện di của các ion khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

xác định 5 alkaloid độc trong hai loại thuốc thảo dược phổ biến bằng phương pháp điện di mao quản Các chất aconitin, mesaconitin, hypaconitin, benzoylaconin, benzoylmesaconin được phân tích chỉ trong 15 phút bằng đệm có chứa amonium acetat 40 mM và acid acetic 0,1% acid trong methanol 80% Khoảng tuyến tính từ

2 ÷ 200 mg/L Giới hạn phát hiện của phương pháp từ 0,85 đến 1,90 mg/L Độ thu hồi trong khoảng 95 ÷ 108,8% [22]

Cũng sử dụng phương pháp điện di mao quản để phân tích alkaloid nhưng với kỹ thuật sắc ký điện động micell (micellar electrokinetic chromatography, MEKC) Đây là phương pháp điện di trong đó các chất được tách ra bởi sự phân bố khác nhau của chúng trong các micell (được xem như là một pha tĩnh giả) và dung dịch đệm (pha động) Trong MEKC, các chất hoạt động bề mặt được thêm vào dung dịch đệm ở nồng độ lớn hơn nồng độ micell tới hạn Trong phần lớn trường hợp, MEKC được tiên hành trong môi trường kiềm Natri dodecyl sulfat (SDS) là chất hoạt động bề mặt thường sử dụng nhất

Nhóm tác giả Yu L, Xu Y, Feng H đã xây dựng phương pháp xác định các độc

tố alkaloid nhóm pyrrolizidin trong thuốc thảo dược truyền thống Trung Quốc Các chất senkirkin, senecionin, retrorsin và seneciphyllin được tách bằng dung dịch đệm

có chứa borat 20 mM, SDS 30 mM và methanol 20 % ở pH 9,1 Giới hạn phát hiện của các chất trong khoảng 1,19 ÷ 2,70 µg/mL; giá trị RSD đều nhỏ hơn 5 %.[34]

1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng với detector UV

Phương pháp sắc ký lỏng rất phù hợp cho việc xác định các alkaloid nên nó được sử dụng rộng rãi Các tác giả nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký lỏng trên nhiều loại detector khác nhau trong đó có detector UV Nguyên lý: chất phân tích sau khi tách khỏi cột sắc ký bằng hệ pha động được dẫn vào flowcell đo được chiếu

bởi một chùm tử ngoại Sự hấp thụ tia bức xạ bởi các chất tan tuân theo định luật Lambert-Beer

Nhóm nghiên cứu Trần Quốc Bình và Đỗ Thị Oanh thuộc bệnh viện Y học

cổ truyền Trung ương đã nghiên cứu thành phần cà độc dược trong chế phẩm Camat ứng dụng trong hỗ trợ cắt cơn nghiện ma túy Nhóm tác giả đã định tính atropin và

tráng sẵn của Merck và dung môi khai triển là ethylacetat – methanol – amoniac đậm đặc (17:2:1) Định lượng alkaloid toàn phần trong mỗi bộ phận cây cà độc dược tính theo scopolamin bằng phương pháp acid-bazơ Định lượng scopolamin bằng phương pháp HPLC sử dụng cột Bondapak C18 (150 x 4,6 mm; 5µm), pha động gồm có: tetrabutylamonium hydrogensulfat, acetonitril và đệm acetat Detector UV bước sóng 257 nm [1]

Nhóm tác giả Lương Thị Phấn, Nguyễn Tiến Vững, Nguyễn Thị Thuận trường Đại học Dược Hà Nội đã nghiên cứu định lượng đồng thời strychnin và brucin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC Quy trình xử lý mẫu 2 mL mẫu huyết tương thêm 400 µL acid percloric 1N và 50 µL dung dịch NaOH 1M, lắc xoáy trong 15 giây, ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút Lọc dịch thu được qua màng 0,45 µm Sử dụng cột tách Acclaim C18 (4,6x150; 5µm), pha động ACN :

bước sóng 257 nm [7]

Tác giả Xie Y và các cộng sự đã phát triển phương pháp xác định 6 hợp chất alkaloid nhóm aconitum thành phần trong thuốc Trung Quốc bằng HPLC với detector DAD Các hợp chất aconitin, mesaconitin, hypaconitin, benzoylaconin, benzoylmesaconin và benzoylhypaconin được tách trên cột ODS với chương trình gradient Pha động gồm acetonitril và đệm amoni bicacbonat (pH 10,0 ± 0,2) Hiệu suất thu hồi trong khoảng 90 ÷ 103 %, giá trị RSD nhỏ hơn 3,28%.[32]

1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng với detector khối phổ

Đây là một phương pháp nhanh, nhạy để xác định đồng thời các alkaloid Sau khi qua cột tách, chất phân tích được hóa hơi, các hợp chất hữu cơ trung hoà bị ion hoá thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân tử mang điện dương hoặc âm, các gốc tự do Sau đó, các ion đựơc đưa sang bộ phận tách theo khối lượng Từ các tín hiệu thu được, dựa vào khối lượng ion phân tử, dựa vào đồng vị, dựa vào các mảnh ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ liệu các ion và mảnh ion, người ta định tính và định lượng được chất phân tích một cách chính xác

Nhóm tác giả Trần Thị Văn Thi và Trần Thanh Minh thuộc trường Đại học Khoa học, Đại học Huế đã tiến hành nghiên cứu phân lập và nhận dạng cấu trúc alkaloid trong dịch chiết từ lá vông nem Alkaloid toàn phần được chiết bằng ethanol 960 và NH4OH 12,5% và chiết ngâm kiệt bằng ethanol 960 Dịch chiết được cất loại dung môi, hòa tan cặn bằng H2SO4 2%, lọc lấy dịch lọc (các alkaloid lúc này ở dạng muối, không tan được trong CHCl3) Đem dịch lọc loại tạp bằng CHCl3, rồi đưa về pH = 9-10 bằng NH4OH đậm đặc (các alkaloid lúc này ở dạng bazơ tự

do, tan được trong CHCl3) và chiết lấy alkaloid bằng CHCl3 Lọc dịch chiết CHCl3

hơi CHCl3 (cô khô ở 50 0 C) thu được alkaloid toàn phần Sử dụng các phương pháp: chiết phân đoạn trong các môi trường pH khác nhau, chiết phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau, sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng để phân lập các cấu tử alkaloid từ cặn alkaloid toàn phần Xác định độ tinh khiết và định tính bằng sắc ký lỏng - khối phổ (LC-MS); điều kiện sắc ký: dung môi methanol - nước (85:15), thời gian 35 phút, tốc độ dòng 1 ml/phút, cột ODS-C18, detector DAD, bước sóng 284 nm; điều kiện ghi phổ khối: Nguồn ion EFI, khí làm khô N2 (nhiệt độ khí 350 o C, áp suất 30 psi, lưu lượng khí 15 lít/phút) Chân không 2,5.10-5 mmbar Điện thế (năng lượng detector) 1118 V [11]

Tác giả Peihong Qiu và cộng sự đã phát triển phương pháp xác định đồng

thời 5 alkaloid trong nước tiểu và máu bằng sắc ký lỏng khối phổ Trong đó có các hợp chất brucin, strychnin, aconitin và colchicin Quy trình xử lý mẫu: 200 µL mẫu

máu và nước tiểu được trộn với 300 µL dung dịch 1 % acid trifluoroacetic trong acetonitril, vortex trong 2 phút và rung siêu âm trong 10 phút Mẫu sau đó được làm sạch bằng SPE với cột Oasis MCX và đem đi phân tích trên hệ thống LC-MS/MS với chế độ ion dương nguồn ESI Cột tách XBridge C18 (5 µm×3.0 mm×250mm), pha động: acetonitril (kênh A), amoni bicacbonat 10 mM chỉnh pH 10,5 (kênh B) theo chương trình gradient Giới hạn định lượng lần lượt là: brucin: 0,03 ng/mL, strychnin: 0,05 ng/mL, ephedrin: 0,20 ng/mL, aconitin: 0,05 ng/mL và colchicin: 0,01 ng/mL Hiệu suất thu hồi trên nền nước tiểu từ 96 ÷ 110 % và trên nền máu là

94 ÷ 113 %.[28]

Tác giả Huiqin và các cộng sự tại trung tâm nghiên cứu Quốc gia Trung Quốc đã phát triển phương pháp xác định đồng thời 17 alkaloid độc trong dịch cơ thể người bằng LC-MS với nguồn ESI dương chế độ MRM Trong đó có 7 alkaloid trong đề tài là : koumin, atropin, scopolamin, brucin, strychnin, aconitin và colchicin Mẫu máu được chiết lỏng – lỏng như sau: 0,5 mL mẫu được thêm 1 mL dung dịch đệm borat pH 9, thêm 6 mL chloroform và vortex trong 5 phút, ly tâm ở

400 vòng/phút trong 10 phút Lấy phần dung dịch phía dưới, phần dung dịch phía trên được chiết tiếp băng 12 mL hỗn hợp chloroform : ether (2:1, v/v) Gộp dịch

phân tích bằng LC-MS Sử dụng cột tách Ultimate XB-C18 (4,6 x 250 mm, 5µm) chương trình rửa giải gradient hai kênh A (dung dịch acid focmic 0,2 %), kênh B (methanol); tốc độ dòng 0,6 mL/phút Khoảng tuyến tính của các chất trong khoảng 0,5 ÷ 50 µg/L và 0,5 ÷ 500 µg/L, LOD trong khoảng 0,1 ÷ 1 µg/L Hiệu suất thu hồi

từ 81,7 ÷ 102,3%, giá trị RSD nhỏ hơn 10 % và 15 %.[23]

Nhận xét: Các phương pháp: sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (detector

UV); điện di (CE) thường khá phức tạp và kém chính xác do ảnh hưởng của nền mẫu Việc tách và xác định đồng thời 8 chất trong đối tượng thực phẩm chức năng

có nền mẫu phức tạp là khó khăn nên chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng 8

alkaloid độc này bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) Đây là phương pháp hiện đại, có độ nhạy, độ chọn lọc và độ chính xác cao

1.3 Sắc ký lỏng khối phổ

1.3.1 Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn hoặc chất lỏng và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn, lỏng-lỏng) Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [6] Sau đó các chất phân tích được đưa vào

bộ phận phát hiện và ghi nhận thành tín hiệu sắc ký detector Có rất nhiều loại detector như UV, RF, khối phổ…

Hiện nay, detector có thể cung cấp thông tin định tính, định lượng và cấu trúc của các chất phân tích là detector khối phổ

1.3.2 Detector khối phổ (Mass spectrometry – MS)

1.3.2.1 Nguyên tắc

Khối phổ (Mass spectrometry – MS) là dựa vào chất nghiên cứu được ion hóa trong pha khí hoặc pha ngưng tụ dưới chân không cao, tạo thành các ion có số khối khác nhau, các ion này được phân tách thành các mảnh theo tỉ số khối trên điện tích (m/z)[29] Các ion này có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích như loại

bỏ electron, proton hóa Các ion tạo thành theo tỉ số m/z và phát hiện từ đó cho thông tin về khối lượng hay cấu trúc phân tử của hợp chất

Cấu tạo của thiết bị khối phổ gồm 3 bộ phận chính: nguồn ion, thiết bị phân tích và detector Các mẫu được ion hóa trong nguồn ion sau đó đưa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z, các tín hiệu thu được sẽ chuyển vào máy tính xử lý và lưu trữ

1.3.2.2 Bộ nguồn ion (Ion sources)

Chất phân tích ra khỏi cột sắc ký ở dạng lỏng, khó khăn lớn nhất ở đây là

phải chuyển chất phân tích từ pha lỏng sang pha hơi Theo kỹ thuật ion hoá của LC/MS, năng lượng của máy trực tiếp tác động vào pha lỏng hoặc rắn để tạo thành ion ở thể hơi Có nhiều kỹ thuật ion hóa khác nhau nhưng hai kỹ thuật hay được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ bao gồm:

a) Chế độ ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization - ESI)

Kĩ thuật ion hóa phun điện tử bao gồm ba quá trình cơ bản sau:

- Tạo thành các giọt mang điện tích

- Làm giảm kích thước của các hạt, và phân nhỏ các hạt

- Quá trình hình thành pha hơi các ion

Hình 1.1: Chế độ ion hóa phun điện tử ESI Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu bắn với chế

độ ion dương (+) hoặc ion âm (-) Kiểu bắn phá chế độ ion dương thường cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên được dùng phổ biến hơn

- Loại hình thành ion dương

o Phù hợp nhất cho phân tích các loại chất phân tích có tính bazơ

ESI là kĩ thuật ion hóa mềm, có độ nhạy cao, ESI - MS thích hợp cho cả phân tử có phân tử khối nhỏ (khoảng 100-150 amu) cũng như phân tử khối lớn của các phân tử sinh học, các hợp chất khó bay hơi, không bền nhiệt, phân cực và không phân cực

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật ion hoá phun điện tử (ESI) bắn phá với chế độ ion dương [29]

b) Chế độ ion hóa hóa học áp suất khí quyển (Atmospheric Presure Chemical Ionization-APCI)

Sự ion hóa trong APCI phụ thuộc vào sự va chạm của dòng ion dương hay âm với phân tử, mẫu bị ion hóa bởi phản ứng với các ion được tạo ra từ các chất khí như methan (ở dạng CH5+), amoniac (ở dạng NH4+)

1.3.2.3 Bộ phân tích khối phổ (analyser)

Bộ phân tích khối phổ có nhiệm vụ tách các ion có trị số m/z khác nhau

thành từng phần riêng biệt Sau khi đã được ion hoá, các ion được đưa đến bộ phân tích khối nhằm loại bỏ những ion không cần thiết, lựa chọn các ion phân tử, thực hiện bắn pha thêm để thu được các ion con Một số bộ phân tích khối phổ :

Bộ phân tích bẫy ion

Bộ phân tích thời gian bay

Bộ phân tích tứ cực

a) Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole analyser)

Nguyên tắc: tạo ra một trường tần số vô tuyến biến đổi (trường tứ cực).Bộ phân tích tứ cực bao gồm 2 loại: Bộ phân tích tứ cực đơn, bộ phân tích tứ cực chập ba

 Bộ phân tích tứ cực đơn (Single focusing magnetic analyser): Có 4 cực bằng kim loại đặt song song và theo hướng của chùm ion Trường tĩnh điện được tạo ra

do thế một chiều (DC) và tần số radio (RF) được đặt vào các thanh Các tứ cực như

bộ lọc khối, khi có điện trường thì ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào tỉ số m/z và từ trường RF Chỉ những ion phù hợp mới đi qua bộ lọc này

 Bộ phân tích tứ cực chập ba (Triplequad mass spectometry): Bộ phân tích khối bao gồm ba bộ tứ cực ghép nối với nhau Trong đó, tứ cực thứ nhất (Q1) có nhiệm

vụ tách các ion, lựa chọn ion mẹ với m/z nhất định từ nguồn ion chuyển đến để chuyển đến Q2 Ở tứ cực thứ hai (Q2) các ion phân tử mẹ bị phân li do va chạm với khí trơ có mặt như khí N2, Ar, He, bị phân mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con Q2 không đóng vai trò là bộ lọc ion mà nó chấp nhận tất cả các ion do Q1 chuyển đến Sau đó tất cả các ion con được chuyển qua bộ tách Q3 Bộ tứ cực thứ

ba (Q3) làm nhiệm vụ tách các ion được chuyển từ Q2 để đi tới bộ phận phát hiện

Hình 1.2: Cấu tạo của bộ phân tích khối tứ cực chập ba

Kỹ thuật MS một lần có nhược điểm là không nghiên cứu được cơ chế phân mảnh, sự khác biệt giữa các đồng phân, chịu ảnh hưởng rõ rệt của nền mẫu chất phân tích, trên phổ đồ chỉ cho thấy ion phân tử Kỹ thuật MS/MS không chỉ khắc phục được những nhược điểm trên mà còn tăng độ nhạy phân tích tới hàm lượng femtogram, tăng độ chính xác của kết quả phân tích, loại bỏ ảnh hưởng của nền mẫu Hệ MS/MS là hệ hai máy khối phổ độc lập được nối với nhau cách nhau buồng va chạm (Collision Cell) [29]

Các ion ra khỏi buồng ion hoá được gia tốc nhờ thế 10-20 kV bay qua một ống phân tích (không có trường điện từ) có chiều dài đến 2m với cùng động năng Tuy nhiên, tùy thuộc vào tỉ số m/z mà các ion có tốc độ khác nhau tới detector Thời gian bay hết ống này đến detector tỷ lệ thuận với m z của các ion Các ion sẽ được phát hiện ở các thời điểm khác nhau Bộ phân tách này cho phổ tuyến tính với thang m/z

c) Bộ phân tích tứ cực bẫy ion (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser)

Bẫy tứ cực hoạt động theo nguyên lý bộ phân tích khối tứ cực, chỉ có một điểm khác là các ion được lưu giữ và đưa dần ra khỏi bẫy Bằng cách thay đổi thế xoay chiều áp vào các cực các ion có tỷ số m/z khác nhau có thể vượt qua khoảng không để đến detector Các ion này cũng có thể bị bắn phá trong bẫy để thu được các ion con Về nguyên tắc, loại phân tích khối phổ bẫy ion có thể làm đến MS nhiều lần

Bộ phân tích khối ba tứ cực được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật MS/MS và đây chính là kỹ thuật được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này

LC-1.3.2.4 Bộ phận phát hiện

Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối, các ion được đưa tới phần cuối của

thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo

ra một tín hiệu của các ion tương ứng từ các electron thứ cấp đã được khuếch đại hoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển Có hai loại bộ phận phát hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron và bộ phận phát hiện nhân quang

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bộ phận phát hiện nhân electron

1.3.3 Phân tích định tính và định lượng bằng LC-MS/MS

Đại lượng đặc trưng cho sự tách sắc ký là thời gian lưu của các chất do vậy

dựa vào thời gian lưu của chất phân tích và sự phân mảnh phổ có thể định tính từng chất trong hỗn hợp Dùng phương pháp đường chuẩn và thêm chuẩn để định lượng chất phân tích trong mẫu, đồng thời kiểm soát độ thu hồi của phương pháp

tích do các hiện tượng tương tác hóa học, tự phân hủy chất [30]

1.5 Đánh giá phương pháp phân tích

Có nhiều cách xác định tính đặc hiệu, tính chọn lọc, trong nghiên cứu này do thiết bị sắc ký có kết nối detercter MS nên chúng tôi sử dụng các phương pháp:

mẫu thêm chuẩn Mẫu trắng không được lên tín hiệu chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng thời gian lưu trên mẫu chuẩn

nhận dạng IP (identification point) đối với kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ 2 lần (LC-MS/MS) là 4, tức là cần 1 ion mẹ bắn phá ra 2 ion con

 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu

có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được

Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu

thử mà ta có thể định lượng và cho kết quả có độ chụm mong muốn

Xác định LOD, LOQ dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu đường (S/N): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích (n=4) Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio)

LOD là nồng độ mà tại đó S/N = 3, LOQ là nồng độ mà tại đó S/N = 10 Trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đường nền

 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Khoảng tuyến tính của một phương pháp: là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ

thuộc tuyến tính giữa đại lượng được đo và nồng độ các chất phân tích

Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng

được đo và nồng độ các chất phân tích

Để xác định khoảng tuyến tính người ta thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Sau đó vẽ đường cong sự phụ thuộc giữa diện tích pic thu được vào nồng độ, quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính [10][18]

Có thể xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực, nhằm mục đích loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích

Hệ số hồi quy tuyến tính (R): Chỉ số đầu tiên của một đường chuẩn đạt yêu cầu và hệ số tương quan hồi quy (Coefficient of corelation), giá trị R phải đạt yêu cầu sau: 0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R2 ≤1

 Độ lặp lại và độ thu hồi

Độ lặp lại (đánh giá độ chụm) là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại và được biểu diễn bằng độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD (%):

.100 C

С

(3)

Trong đó:

R: độ thu hồi (%)

Cf : Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng xác định đƣợc (ng/ml)

Ca : Nồng độ chuẩn thêm vào mẫu trắng (ng/ml)

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu

Nguy cơ tiềm ẩn ngộ độc do các alkaloid độc trong thực phẩm chức năng có

nguồn gốc thảo dược đang đặt ra cho cơ quan thanh tra, kiểm tra thực phẩm cần có phương pháp xác định chính xác các alkaloid độc để quản lý và cảnh báo đảm bảo

an toàn và sức khỏe người tiêu dùng Phù hợp với thực tiễn, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng một số alkaloid độc bao gồm (Brucin, Strychnin, Aconitin, Colchicin, Atropin, Scopolamin, Nicotin, Koumin) trong thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dược bằng sắc ký lỏng ghép nối khối phổ LC-MS/MS

 Tối ưu các điều kiện chạy máy LC-MS/MS để tách và xác định đồng thời các alkaloid

 Khảo sát, tối ưu hóa quá trình xử lý mẫu

 Thẩm định phương pháp phân tích

 Ứng dung phương pháp để phân tích trên một số mẫu thực tế

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu của luận văn này bao gồm:

Qua tham khảo các nghiên cứu ở trên chúng tôi lựa phương pháp chiết lỏng – lỏng Mẫu được thêm dung dịch kiềm để chuyển các alkaloid về dạng bazơ sau đó các alkaloid được chiết vào pha dung môi hữu cơ

Mẫu sau khi tách chiết được đem đi phân tích trên hệ thống LC-MS/MS với chế độ ion dương nguồn ESI, cơ sở lý thuyết đã được nêu trong phần tổng quan Các kết quả được tính toán tự động theo phần mềm phân tích của thiết bị (phần mềm Analyst 1.5.1, ABSciex)

 Phương pháp thẩm định:

Để đánh giá phương pháp chúng tôi tiến hành theo quy định của AOAC Phương pháp thẩm định bao gồm:

- Tính đặc hiệu, tính chọn lọc

- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

- Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

- Độ lặp lại và độ thu hồi

Đối tượng mẫu: Một số thực phẩm chức năng có nguồn gốc thảo dược

Phương pháp lấy mẫu: Ngẫu nhiên

Địa điểm: Một số hiệu thuốc trên địa bàn nội thành Hà Nội

2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu

2.3.1 Thiết bị

+ Máy sắc ký lỏng của Shimadzu Model 20 AD-UFLC

+ Máy khối phổ Model AB sciex Triplequard 5500

2.3.2 Dụng cụ

- Các chất chuẩn: Nicotin đƣợc cung cấp bởi hãng Sigma – Aldrich ở dạng rắn

độ tinh khiết 98,7 % lọ 1 g; Koumin cung cấp bởi hãng Chengdu Biopurify ở dạng rắn độ tinh khiết 99,72 % lọ 10 mg; Atropin đƣợc cung cấp bởi hãng Sigma – Aldrich ở dạng rắn độ tinh khiết 99 % lọ 1 g; Scopolamin cung cấp bởi hãng Sigma – Aldrich ở dạng rắn độ tinh khiết 99,3 % lọ 1 g; Brucin và Strychnin cung cấp bởi hãng Sigma – Aldrich ở dạng rắn độ tinh khiết 98%

lọ 5g; Aconitin cung cấp bởi hãng Sigma – Aldrich ở dạng rắn độ tinh khiết

95 % lọ 5 mg; Colchicin cung cấp bởi hãng Sigma – Aldrich ở dạng rắn độ tinh khiết 95 % lọ 100 mg

- Dung dịch chuẩn gốc 100 µg/mL: cân chính xác 0,01g từng chất chuẩn trên cân phân tích có độ đọc 0,0001g, hòa tan và định mức 100 mL bằng methanol Bảo quản trong tủ lạnh 40C, sử dụng trong 1 năm

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian của nicotin, scopolamin và atropin (10 µg/mL): hút 1 mL dung dịch chuẩn gốc của mỗi chất vào bình định mức 10

mL, pha loãng và định mức đến vạch bằng methanol Bảo quản trong tủ lạnh

40C, sử dụng trong 1 tháng

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian (1-10 µg/mL): hút 1 mL dung dịch chuẩn gốc của brucin, strychnin, koumin, aconitin, colchicin và 1 mL dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian của nicotin, scopolamin, atropin (10 µg/mL) vào bình định mức 10 mL, pha loãng và định mức đến vạch bằng methanol Bảo quản trong tủ lạnh 40C, sử dụng trong 1 tuần

- Pha loãng dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 1-10 µg/mL trong methanol

để thu được các dung dịch chuẩn làm việc nồng độ 0,5-5; 1-10; 2-20; 5-50; 10-100; 20-200; 50-500; 100-1000; 200-2000; 500-5000 ng/mL

2.3.4 Các loại hóa chất, dung môi khác

- Methanol (Merck 99,9%), Acetonitril (Merck 99,9%), acid formic (Merck 98%), acid acetic băng (Merck), amoniacetat (Merck), ethylacetat (Merck), ether (Merck), chloroform (Merck), NaOH (Merck), acid boric, …

- Dung dịch đệm borat pH 9: Cân 3,09 g acid boric hòa tan hòa tan bằng 500

mL dung dịch KCl 0,1M Thêm tiếp 210 mL dung dịch NaOH 0,1M

mL và định mức đến vạch bằng nước cất

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tối ưu điều kiện tách và xác định các alkaloid trên thiết bị LC/MS/MS

3.1.1 Tối ưu các điều kiện của detector khối phổ (MS/MS)

3.1.1.1 Khảo sát ion mẹ và ion con

Qua tham khảo tài liệu chúng tôi tiến hành khảo sát xác định các alkaloid

bằng kĩ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn phá ion dương Để tối ưu hóa điều kiện khối phổ, dùng kim bơm hỗn hợp các chất chuẩn 50 ng/mL tiêm trực tiếp vào detector khối phổ để khảo sát Chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng chất

để chọn được ion mẹ, ion con dùng để định lượng và định tính đối với từng chất và các điều kiện bắn phá tương ứng của từng mảnh như trong bảng :

Bảng3.1: Các mảnh ion định lượng và định tính của các alkaloid

Tên chất phân

tích

Mảnh mẹ (m/z)