Tìm hiểu một số đặc điểm sinh học của hai chủng vi khuẩn vibrio parahaemolyticus phân lập từ cá mú nhiễm bệnh lở loét và so sánh với chủng khuẩn ATCC 17802

Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn, nhiều nghiên cứu về bệnh lở loét trên cá mú đã được thực hiện và kết luận một vài tác nhân gây bệnh.. Vì vậy, đề tài “ Tìm hiểu một số đặc điểm sinh học

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu nhà trường Đại Học Nha Trang, các thầy cô khoa Nuôi Trồng Thủy Sản, giáo viên chủ nhiệm - thầy Phan Văn Út đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản III, cán bộ và các nhân viên của viện đã tạo mọi điều kiện thuận lợi

về thời gian và vật chất cho tôi trong suốt thời gian tôi thực tập ở đây

Nhân đây tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến sự chỉ dẫn tận tình, những góp ý quý báu, kịp thời của thầy giáo hướng dẫn TS Nguyễn Hữu Dũng Tôi cũng xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thị Thanh Thùy đã luôn bên cạnh hướng dẫn tận tình, chu đáo và cho phép tôi sử dụng một phần số liệu trong luận án tiến sĩ của cô Xin chân thành cảm ơn dự án NUFU đã cung cấp mọi điều kiện vật chất trong suốt quá trình thí nghiệm

Cảm ơn Ban cán sự, Ban chấp hành lớp 47BH, các bạn trong nhóm thực tập đã đoàn kết trong công việc góp phần không nhỏ vào thành công của đợt thực tập

Và cuối cùng tôi xin cảm ơn đến gia đình tôi luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc giúp tôi hoàn thành tốt mọi nhiệm vụ

Tôi xin chân thành cảm ơn

MỤC LỤC

Trang LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC BIỂU BẢNG, ĐỒ THỊ VÀ HÌNH ẢNH iv

MỞ ĐẦU 1

PHẦN I: TỔNG QUAN 3

1.1 Một vài đặc điểm về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 3

1.1.1 Hệ thống phân loại của Vibrio parahaemolyticus 3

1.1.2 Đặc điểm phân bố của Vibrio parahaemolyticus 3

1.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của Vibrio parahaemolyticus 4

1.1.4 Yếu tố gây độc của Vibrio parahaemolyticus 5

1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh lở loét ở cá mú trên thế giới 6

1.2.1 Tác nhân virus 6

1.2.2 Tác nhân vi khuẩn 7

1.2.3 Tác nhân ký sinh trùng 8

1.2.4 Tác nhân nấm 10

1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh lở loét trên cá mú ở Việt Nam 10

PHẦN II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Địa điểm, thời gian, đối tượng nghiên cứu 13

2.2 Phương pháp nghiên cứu 13

2.2.1 Phương pháp thu thập chủng 13

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa 13

2.2.3 Phương pháp phân tích protein của vi khuẩn 15

2.2.4 Nghiên cứu độc lực, LD50 của vi khuẩn 15

2.2.4.1 Xây dựng đường cong sinh trưởng vi khuẩn 15

2.2.4.2 Bố trí thí nghiệm 16

2.2.5 Phân lập lại vi khuẩn 18

PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20

3.1 Đặc điểm sinh hóa, hình thái của 3 chủng Vibrio parahaemolyticus 20

3.2 Kết quả phân tích protein vi khuẩn bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE 21

3.3 Đường cong sinh trưởng của 3 chủng Vibrio parahaemolyticus 23

3.4 Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm và LD50 25

3.4.1 Cá cảm nhiễm chủng vi khuẩn ATCC 25

3.4.2 Cá cảm nhiễm chủng vi khuẩn V1 26

3.4.3 Cá cảm nhiễm chủng vi khuẩn V2 27

3.5 Kết quả phân lập lại Vibrio parahaemolyticus 29

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 30

4.1 Kết luận 30

4.2 Đề xuất ý kiến 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BIỂU BẢNG, ĐỒ THỊ VÀ HÌNH ẢNH

Trang

Bảng 2.1 Ký hiệu, nguồn phân lập và nguồn gốc của đối tượng nghiên cứu 13

Bảng 3.1 Đặc điểm sinh hóa của 3 chủng V.parahaemolyticus 20

Bảng 3.2 Mật độ quang (OD) và mật độ tế bào (MĐTB, cfu/ml) của 3 chủng V.parahaemolyticus qua thời gian nuôi 23

B: ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1 Đường cong sinh trưởng của 3 chủng V.parahaemolyticus nuôi trong TSB 2% NaCl ở nhiệt độ phòng (32-35oC) 24

Đồ thị 3.2 Tỷ lệ chết tích lũy của cá cảm nhiễm chủng ATCC 26

Đồ thị 3.3 Tỷ lệ chết tích lũy của cá cảm nhiễm chủng V1 27

Đồ thị 3.4 Tỷ lệ chết tích lũy của cá cảm nhiễm chủng V2 28

C: HÌNH ẢNH Hình 3.1 V.parahaemolyticus trên môi trường TSA 2% NaCl và Gram âm (A chủng ATCC; B chủng V1; C chủng V2) 21

Hình 3.2 Kết quả điện di protein 3 chủng V.parahaemolyticus 22

Hình 3.3 Hệ thống bể bố trí thí nghiệm cảm nhiễm 25

Hình 3.4 Cá mú bị lở loét, lồi mắt sau thí nghiệm cảm nhiễm 29

Hình 3.5 Khuẩn lạc V.parahaemolyticus trên môi trường TCBS 29

MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển của đất nước, nuôi trồng thuỷ sản (NTTS) Việt Nam cũng không ngừng phát triển và trở thành một ngành kinh tế mũi nhọn Nhiều đối tượng thuỷ sản đã được chú trọng và đầu tư đặc biệt Trong đó, cá mú đang là loài có giá trị kinh tế cao, thành phần loài trong tự nhiên rất phong phú và có thể

xuất khẩu được Các loài cá nuôi phổ biến là Mú Đen ( Epinephelus tauvina), Mú

Đỏ (Epinephelus akaara), Mú Mè (Epinephelus bleekeri), … Tuy nhiên, do kỹ thuật

nuôi của ngư dân còn hạn chế, con giống hầu hết được khai thác từ tự nhiên, thu gom nhốt lâu ngày nên dịch bệnh thường xuyên xảy ra Ở Thái Lan, năm 1989 dịch bệnh trên cá mú, cá chẽm gây tổn thất 1.9 triệu USD Ở Nhật Bản, năm 1992 thiệt hại tới 114.4 triệu USD Một trong những căn bệnh gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi

cá mú hiện nay là bệnh xuất huyết lở loét Bệnh xảy ra gây chết cá từ rải rác đến hàng loạt và làm giảm năng suất nuôi tới 80-90% vào các tháng mùa hè (Đào Thị Huyền, 2003)

Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn, nhiều nghiên cứu về bệnh lở loét trên cá

mú đã được thực hiện và kết luận một vài tác nhân gây bệnh Các tác nhân có cả virus, vi khuẩn, ký sinh trùng, nấm,… Trong đó, nhóm gây bệnh chính là vi khuẩn,

và thường gặp là Vibrio

Vibrio parahaemolyticus là vi khuẩn có tần số bắt gặp cao trên những

mẫu cá mú bệnh lở loét (Nguyễn Thị Thanh Thùy, 2005) Vi khuẩn này gây bệnh ở hầu hết các giai đoạn phát triển của cá và còn là tác nhân gây nhiều bệnh nguy hiểm

cho các động vật thủy sản khác như tôm, cua, nhuyễn thể… Vì vậy, đề tài “ Tìm

hiểu một số đặc điểm sinh học của 2 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

phân lập từ cá mú nhiễm bệnh lở loét và so sánh với chủng chuẩn ATCC 17802” được đề xuất thực hiện nhằm góp phần hiểu rõ thêm về đặc điểm sinh lý,

sinh hóa cũng như so sánh độc tính giữa các chủng vi khuẩn từ các nguồn khác

nhau, làm cơ sở cho việc chọn lựa chủng vi khuẩn làm kháng nguyên trong sản xuất vaccine phòng bệnh lở loét ở cá mú

Đề tài được thực hiện với các nội dung sau:

1 Xác định các đặc điểm hình thái, sinh hoá của vi khuẩn phân lập từ cá mú nhiễm bệnh lở loét và so sánh với các đặc điểm tương ứng của chủng

Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802

2 Phân tích thành phần protein của các chủng vi khuẩn V parahaemolyticus

Sinh viên thực hiện

PHẦN I

TỔNG QUAN

1.1 Một vài đặc điểm về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

1.1.1 Hệ thống phân loại của Vibrio parahaemolyticus

1.1.2 Đặc điểm phân bố của Vibrio parahaemolyticus

V parahaemolyticus là một loài vi khuẩn ưa mặn và phân bố rộng, chúng

được phân lập từ nhiều đối tượng thuỷ sản như cá, cua, tôm, sò, điệp, hầu, trai Ngoài ra, còn phát hiện sự có mặt của vi khuẩn này trong nước biển, chất lắng, sinh

vật phù du ở vùng biển ven bờ Chúng được tìm thấy ở cả nước lợ, nước mặn và ở

các vùng biển ven bờ thuộc châu Á, châu Phi và Địa Trung Hải (Mahmud và cộng

sự, 2006)

Vi khuẩn này lần đầu tiên được phân lập từ một người bị viêm đường ruột sau khi ăn phải hải sản chưa được nấu kỹ, bệnh bùng nổ ở Nhật Bản vào năm

1950 (Joseph và cộng sự, 1982) [trích theo Alcaide và cộng sự,1999] Người bệnh

có các triệu chứng: tiêu chảy, bụng co cứng, buồn nôn, ói mửa Bệnh này thường xảy ra ở các nước có mức tiêu thụ hải sản cao Alcaide (1999) cho biết: Wong và

cộng sự (1990); Yii và cộng sự (1997) đã phân lập được V parahaemolyticus trên

cá Mú (Epinephelus coioides) ở Đài Loan Nhưng họ cũng cho rằng vi khuẩn này là

tác nhân gây bệnh trên người nhiều hơn là trên cá

1.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của Vibrio parahaemolyticus

V parahaemolyticus là vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn (1-2 µm), các

tế bào tồn tại đơn lẻ, không hình thành bào tử, và là vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc

V parahaemolyticus có khả năng di động, dương tính với phản ứng Catalase và

Oxidase, có khả năng lên men đường Glucose, không lên men đường Sucrose (Mac Faddin, 1980)

Về hình thái khuẩn lạc: trên môi trường TCBS, V parahaemolyticus cho

khuẩn lạc màu xanh, bóng, tròn, hơi lồi Trên môi trường TSA 2% NaCl, khuẩn lạc

có màu trắng đục, mép tròn, bóng, hơi lồi, đường kính 1.5-1.8 mm

Khi nghiên cứu về đặc điểm sinh thái của V parahaemolyticus ở vịnh Chesapeake (United States), Kaneko và Colwell (1973) cho rằng có mối liên quan

chặt chẽ giữa vi khuẩn này với nhiệt độ nước Vào những tháng mùa đông, không thể phát hiện sự có mặt của chúng trong môi trường nước mặc dù chúng vẫn có mặt trong chất lắng Cuối mùa xuân đến đầu mùa hè, khi nhiệt độ nước khoảng 14-19oC, chúng sẽ thoát ra khỏi chất lắng, bám vào sinh vật nổi (zooplankton) và tăng sinh nhanh chóng về số lượng Trong khi đó, Matsuno và cộng sự (1961); Asakawa và

cộng sự (1966) đã phân lập được V parahaemolyticus từ cá và giáp xác trong thời

điểm mùa đông, khi nhiệt độ nước khoảng 6-7oC [trích theo Kaneko và Colwel, 1973]

Năm 1981, Kaper và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về sự phân bố của

V parahaemolyticus ở vịnh Chesapeake (United States) vào mùa hè Họ thu mẫu nước bề mặt và mẫu chất lắng tại 21 vị trí khác nhau của vịnh để phân lập V parahaemolyticus Kết quả cho thấy vi khuẩn này có mặt ở tất cả các vị trí thu mẫu

ứng với sự biến thiên độ mặn và nhiệt độ lần lượt là 0.1-20.1 ‰ và 21.2-28.9oC Nghiên cứu này đưa ra kết luận: độ mặn có liên quan chặt chẽ đến sự phân bố của

V parahaemolyticus, số lượng V parahaemolyticus tăng lên cùng với sự tăng lên

của độ mặn

Một yếu tố nữa cũng ảnh hưởng đến hoạt động của vi khuẩn, đó là pH của môi trường nuôi cấy Kazuyuki và cộng sự (1979) đã đưa ra kết quả thí nghiệm

20 chủng V parahaemolyticus đều phát triển được trên môi trường NB (Nutrient

Broth) + 2% NaCl với các giá trị pH của môi trường là 6.0, 7.0, 8.5 và 9.0 Trong nghiên cứu này, họ cũng đồng thời tiến hành kiểm tra khả năng tiết ra hemolysin và vận động roi của vi khuẩn này Kết quả cho thấy ở pH bằng 9.0 vi khuẩn không tiết

ra hemolysin, ở các pH khác đều có hiện tượng này Đồng thời, vận động roi trước của vi khuẩn bị ức chế ở điều kiện kiềm và không bị ảnh hưởng ở điều kiện trung tính và axit Chứng tỏ pH môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đến quá trình trao đổi

chất và vận động roi của V parahaemolyticus

1.1.4 Yếu tố gây độc của Vibrio parahaemolyticus

Mức tiêu thụ hải sản trên thế giới ngày càng tăng vì vậy nguy cơ bị bệnh

do loại vi khuẩn này gây ra ngày càng cao Và việc tìm hiểu về tác nhân gây bệnh này càng trở nên cần thiết Tuy nhiên, cơ chế gây độc của nó vẫn chưa được biết rõ

Theo nghiên cứu của Nishibuchi và cộng sự (1992) thì V parahaemolyticus

có khả năng tiết ra dung huyết tố trực tiếp bền nhiệt (Thermostable Direct Hemolysin

-TDH), chất này có tác dụng làm tiêu các tế bào hồng cầu Dung huyết tố này là yếu

tố gây độc của V parahaemolyticus Han và Chai (1992) cho rằng không phải tất cả các chủng vi khuẩn V parahaemolyticus đều gây bệnh 96.5% các chủng vi khuẩn

này phân lập từ các bệnh nhân là có thể làm tan hồng cầu trên môi trường thạch máu (hiện tượng Kanagawa dương tính), nhưng đến 99% các chủng phân lập từ môi trường tự nhiên không có hoạt động dung giải này (Kanagawa âm tính), và chúng thường không phải là tác nhân gây bệnh Theo Nishibuchi và cộng sự (1992) thì TDH

có quan hệ chặt chẽ với hiện tượng Kanagawa Khoảng 88-96% các chủng V parahaemolyticus được phân lập từ người có dấu hiệu bệnh lý và 1-2% các chủng

được phân lập từ người không có dấu hiệu bệnh lý đều có hiện tượng Kanagawa

Hiện nay, các nghiên cứu về yếu tố và cơ chế gây độc của V parahaemolyticus đang dần được chú ý đến ở trong và ngoài nước nhằm hạn chế

những thiệt hại do vi khuẩn này gây ra cho cả người và đối tượng thủy sản

1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh lở loét ở cá mú trên thế giới

Cá mú là loài có giá trị dinh dưỡng cao, lớn nhanh, thích hợp cho nuôi tăng sản, là đối tượng nuôi đem lại lợi nhuận cao ở nhiều nước trong khu vực như Trung Quốc, Indonesia, Malaysia, Thái Lan, Philipines Tuy nhiên cùng với sự phát triển nhanh chóng thì bệnh dịch bùng phát gây tổn thất kinh tế ở nhiều nước trong khu vực và trên thế giới Theo Somga và cộng sự (2001), có 88.3% trên 60 trại nuôi

cá mú ở Philippines bị tổn thất do dịch bệnh [trích theo Nguyễn Thị Thanh Thùy, 2005] Theo nghiên cứu của Chong (2001) thì ở Hồng Kông có đến 95% số hộ muôi

cá mú bị tổn thất do dịch bệnh, trong đó tác hại do bệnh lở loét chiếm 68% và gây

tỷ lệ tử vong đến 72%

Trước tình hình đó, các nhà nghiên cứu đã tập trung chú ý đến bệnh lỏ loét trên cá mú Nhiều công trình nghiên cứu về bệnh này đã được công bố với các tác nhân gây bệnh thuộc các nhóm sau:

1.2.2 Tác nhân vi khuẩn

Vi khuẩn có mặt khắp mọi nơi trong nước Đa số chúng chỉ gây bệnh khi

cá yếu, điều kiện môi trường xấu, thức ăn không đầy đủ và kỹ thuật quản lý kém Một số vi khuẩn có liên quan đến bệnh loét như sau:

Vibrio gây ra bệnh xuất huyết nhiễm trùng máu (vibriosis), bệnh này

thường gặp ở nhiều loài cá biển như cá Hồi (Oncorhynchus spp.), cá Tráp (Sparus aurata), cá Chẽm Châu Âu (Dicentrarchus labrax), cá Bơn (Scophthalmus maximus),…

Ở họ cá mú, nhóm Vibrio thường gây bệnh trên các loài như cá Mú Chấm Nâu, Mú Đen, Mú Chấm Cam và Mú Mè, làm thiệt hại kinh tế cho nghề nuôi cá mú ở Brunei, Darussalam, Malaysia, Đài Loan, Hồng Kông, Indonesia, Kuwait, Singapore, Philippines và Thái Lan Tác nhân gây bệnh thuộc nhóm Vibrio thường

là Vibrio parahaemolyticus, V alginolyticus, V vulnificus và V carchariae (Nash

và cộng sự, 1987) Dấu hiệu đầu tiên của bệnh là cá bỏ ăn, bơi lờ đờ, màu sắc thân đen dần Cá nhiễm nặng thường có hiện tượng mất thăng bằng, bơi ngửa bụng Trên thân có nhiều vết lở loét, xuất huyết, vây mòn cụt, mắt lồi đục Giải phẫu nội quan thấy các cơ quan nội tạng bị xuất huyết Đàn cá bị bệnh vibriosis thường có tỷ lệ tử vong đến 50% tuỳ thuộc vào kỹ thuật chăm sóc (Tendencia và Lavilla-Pitogo, 2004)

Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể thông qua những chỗ bị tổn thương do ký sinh trùng,

do vận chuyển hoặc hoạt động phân loại cá Biện pháp hạn chế tác hại của vibriosis

là tắm bằng nước ngọt trong 10-15 phút, tắm Prefuran 2 ppm trong 1 giờ, trộn oxalinic acid vào thức ăn 20 mg/kg thức ăn trong 5 ngày liên tục có thể cải thiện được bệnh

Bệnh Streptococcosis còn gọi là bệnh mụn đỏ trên thân thường xuất hiện cùng với vibriosis Tác nhân là cầu khuẩn Streptococcus spp., đường kính nhỏ hơn

2 µm, gram dương, thường kết thành cặp hoặc thành chuỗi Bệnh này thường gặp trên cá Mú Chấm Nâu và cá Mú Mè ở Brunei Darrussalam, Malaysia, Singapore, Thái Lan (Hamid, 2001; Kasornchandra, 2002) [trích theo Nguyễn Thị Thanh Thùy, 2005] Vi khuẩn này thường gây bệnh ở giai đoạn cá bột và cá giống với tỷ lệ chết

khoảng 10% nhưng chúng không gây chết ở cá trưởng thành Theo Tendencia và Lavilla-Pitogo (2004) thì có thể xử lý cá bị bệnh bằng cách trộn oxolinic acid vào thức ăn 20 mg/kg thức ăn và tắm perfuran 2 ppm trong 1 giờ

Zafran (1998) đã phát hiện Flexibacter maritimus kết hợp Vibrio sp gây

ra bệnh mòn vây xuất huyết trên cá Mú Chuột ở Indonesia, đàn cá nhiễm bệnh có tỷ

lệ tử vong đến 80% trong vài giờ nếu không được xử lý kịp thời

Nhóm vi khuẩn Pseudomonas như P chlororaphis, P anguilliseptica, P fluorescens, P putida, P plecoglossicida được xem là tác nhân gây bệnh nguy

hiểm nhất cho các loài cá nuôi (Austin 1999) Riêng đối với cá mú, đã bắt gặp vi khuẩn này trên cá Mú Đen nuôi lồng ở Malaysia Chúng gây bệnh ở hầu hết cá giai đoạn phát triển của cá mú Cá bị bệnh có biểu hiện xuất huyết lở loét trên thân, vây, đuôi, mắt lồi và đục Giải phẫu quan sát thấy gan có màu đỏ thẫm, màng thận dễ

rách Pseudomonas luôn có mặt trong nước nuôi, chỉ gây bệnh khi nhiệt độ thay đổi

đột ngột, nuôi ở mật độ dày, chất lượng nước xấu và dinh dưỡng kém Đàn cá nhiễm bệnh có thể chết đến 60% (Nash và cộng sự, 1987)

1.2.3 Tác nhân ký sinh trùng

Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy ký sinh trùng với cường độ nhiễm cao đã gây tác hại lớn đối với cá nuôi nói chung và cá mú nói riêng Nghiên cứu của Moller và Kiel năm 1986 về ký sinh trùng đã thống kê được khoảng 10000 loài ký sinh trùng sống trên cá Trong đó nội ký sinh chiếm 60%, ngoại ký sinh chiếm 40% [trích theo Đào Thị Huyền, 2003] Nhiều bọn ký sinh trùng đóng vai trò quan trọng trong việc mở đường cho các tác nhân khác xâm nhập gây bệnh như sán lá đơn chủ, giáp xác, đỉa cá, giun tròn…

Theo Zanfran và cộng sự (2000) thì ký sinh trùng Amyloodinium ocellatum gây bệnh trên cá mú Epinephelus spp giai đoạn cá giống ở Malaysia và Indonesia

[trích theo Nguyễn Thị Thanh Thùy, 2005] Cá nhiễm bệnh có các đốm trắng trên

da và mang, tiết nhiều nhớt, màu sắc cơ thể đen tối, vài chỗ xuất huyết trên da, mang nhợt nhạt, cường độ hô hấp tăng cao Cá bị nhiễm nặng có thể chết rải rác

đến hàng loạt Biện pháp sử lý hiệu quả là tắm nước ngọt với CuSO4 trong 3-5 ngày hoặc formalin 100 ppm trong 10-15 phút, sục khí mạnh

Trong nghiên cứu về bệnh bào tử trùng của Supamattaya và cộng sự

(1993), tỷ lệ nhiễm thích bào tử Sphaerospora epinepheli ở cá Mú Chấm Nâu tự

nhiên và cá nuôi ở Thái Lan lần lượt là 17% và 29% Cá nhiễm bệnh thường bơi mất thăng bằng , miệng và thân xuất huyết, vài trường hợp còn xuất huyết bóng hơi

và chướng bụng Bào tử của Myxosporeans còn xâm nhập phá huỷ gan, thận, mật lách và tế bào máu của ký chủ Vì vậy, cá nhiễm bệnh thường mẫn cảm với các tác nhân gây bệnh khác Đến nay vẫn chưa có biện pháp để chữa trị bệnh này, chủ yếu phòng bệnh qua việc xử lý kỹ ao lồng nuôi

Nhóm ký sinh trùng phổ biến nhất trên cá biển, đặc biệt là cá nuôi lồng

bè với mật độ cao là Monogenea Hầu hết chúng có kích thước hiển vi (sán lá ký

sinh ở mang như Pseudohabdosynochus spp., Diplectanum spp., Megalocotyloides

spp kích thước nhỏ hơn 1 mm, trừ một số bọn có kích thước lớn có thể nhìn thấy

bằng mắt thường như Benedenia spp., Neobenedenia spp dài 2-6 mm Chúng ký sinh hầu hết ở các loài cá nuôi, và ở nhiều loài cá mú như Epinephelus bleekeri, E coioides, E taurvina, E malabaricus, E fuscoguttatus, E lanceolatus và Cromileptes altivelis ở Brunei Darrussalam, Indonesia, Malayxia, Myanmar, Philippines, Kuwait,

Singapore, Thái Lan và Trung Quốc [trích theo Đào Thị Huyền, 2003] Cá bị nhiễm nặng sán đơn chủ có thể bị mù mắt, xuất huyết, tổn thương tơ mang ảnh hưởng đến

hô hấp hoặc gây lở loét trên da, mở đường cho các tác nhân khác xâm nhập gây bệnh Biện pháp tắm hydrogen peroxide 100 ppm hay formalin 100 ppm trong 10-

15 phút sục khí mạnh để xử lý bệnh rất có hiệu quả

Giáp xác ký sinh trên cá mú thường gặp nhóm giáp xác chân chèo

(Caligus sp., C epidemicus và Lepeophtheirus sp.) và Rhexanella sp Các báo cáo ở

Philippines, Indonesia, Malayxia, Thái Lan cho thấy bọn giáp xác này ký sinh trên

nhiều loài cá mú như E coioides, E malabaricus, E fuscoguttatus Chúng ký sinh ở

tất cả các giai đoạn phát triển của cá, gây tác hại nghiêm trọng nhất ở giai đoạn cá còn non Cá nhiễm nặng có biểu hiện bơi lội thất thường, ngứa ngáy, lở loét trên da,

mở đường cho các tác nhân khác xâm nhập gây bệnh Biện pháp tắm nước ngọt hoặc formalin 100-150 ppm trong 10-15 phút có thể hạn chế được chúng (Cruz-Lacierda và Gregoria, 2004)

1.2.4 Tác nhân nấm

Ở cá nước ngọt, bệnh do nấm đã được nghiên cứu rất nhiều cả trong và ngoài nước, tuy nhiên bệnh nấm trên cá biển nói chung và trên cá mú nói riêng vẫn chưa được quan tâm nhiều Các nghiên cứu về hội chứng lở loét (EUS- Epzootic Ulcerative Syndrome) cho thấy nhiều tác nhân đã gây ra bệnh này như virus, vi

khuẩn… Trong đó, nhiều báo cáo đã cho thấy nấm Aphanomyces invadans là một

trong những tác nhân chính gây triệu chứng lở loét cá ở Nhật, Úc và một số nước Châu Á

Bệnh do nấm hạt Ichthyphonus sp gây tác hại đáng kể cho nhiều loài cá

xương nước biển và nước ngọt Ở cá mú, chúng gây bệnh trên cá Mú Đỏ Chấm

Xanh (Plectroponus sp.) ở Singapore và cá Mú Chuột ở Indonesia [trích theo

Nguyễn Thị Thanh Thùy, 2005] Dấu hiệu bên ngoài của cá bệnh là các vết lở loét nhỏ và sâu trên thân, cơ quan nội tạng như gan, thận, lách thường bị trương phồng

lên và có nhiều đốm trắng Bệnh này hiện chưa có biện pháp phòng trị hữu hiệu 1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh lở loét trên cá mú ở Việt Nam

Ở Việt Nam, nghề nuôi cá mú chính thức phát triển vào năm 1988 (Edwards và cộng sự, 2004) khi người Trung Quốc đến Nha Trang đặt vấn đề mua bán cá mú sống [trích theo Lê Anh Tuấn, 2004] Nghề này đã phát triển từ Bắc vào Nam nhưng tập trung chủ yếu ở Quảng Ninh- Hải Phòng, Phú Yên- Khánh Hoà và gần đây là Vũng Tàu Nuôi cá mú đã phát triển một cách tự phát, trải qua nhiều bước thăng trầm, thường gặp phải những bệnh như chướng bụng, dị hình, xuất huyết lở loét …Trong đó, bệnh lở loét có ảnh hưởng nghiêm trọng nhất và gây thiệt hại về kinh tế rất lớn Bệnh xuất huyết lở loét thường xuất hiện vào những tháng mùa hè, khi lượng vi khuẩn tổng số trong môi trường nuôi tăng cao, nhiệt độ nước

cao, làm cho cá luôn ở trạng thái bị sốc Bên cạnh đó, tác nhân gây bệnh là giáp xác

ký sinh hay do tác động cơ học (bắt cá, vận chuyển cá,…) tạo nên những vết trầy trên cơ thể cá, tạo cơ hội cho các tác nhân là vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể cá gây bệnh Ở Việt Nam có một số công trình nghiên cứu về bệnh lở loét trên cá mú đã được công bố như sau:

Trong báo cáo “ Kỹ thuật ương cá hương lên cá giống 3 loài cá biển: cá

Mú Chấm Cam (E coioides), cá Giò (Rachycentron canadum) và cá Hồng Mỹ (Scyaenops ocellatus)” của Lê Xân, Viện Nghiên Cứu NTTS I cũng cho thấy vi khuẩn gây bệnh lở loét xuất huyết ở cá mú thường gặp là 2 loài V alginolyticus, V vulnificus và một loài Pseudomonas sp Phòng bệnh bằng tắm nước ngọt định kỳ, trị bệnh bằng cách

tắm Oxytetracylin 50-100 ppm liên tục 7-10 ngày, mỗi ngày tắm 1 giờ

Đề tài “ Nghiên cứu tác nhân gây bệnh lở loét ở một số loài cá mú (Serranidae) nuôi thương phẩm phổ biến tại Khánh Hoà và biện pháp phòng trị” do Nguyễn Thị Thanh Thùy thực hiện năm 2005 tiến hành trên 16 con cá mú bệnh lở loét Kết quả phân lập được 9 loài vi khuẩn thuộc 4 giống khác nhau Trong đó

Vibrio chiếm đa số với 55.6%, tần số bắt gặp cao nhất là V parahaemolyticus (56%), tiếp đến V alginolyticus (50%) và V carchariae( 25%) Đồng thời, đề tài

cũng tiến hành phân tích ký sinh trùng thì thu được 7 loài thuộc 4 ngành, 4 lớp, 5

bộ, 6 họ và 7 giống Trong đó sán đơn chủ có tỷ lệ nhiễm cao nhất (37.5%), thường

gặp nhất là loài Pseudorhabdosynochus epinepheli ký sinh ở mang và Benedenia sp

ký sinh trên da xung quanh vết loét Trùng bánh xe Trichodina sp cũng có tần số

bắt gặp tương đối cao 25% với cường độ cảm nhiễm 10-12 cá thể/lam kính Kết quả phân lập nấm: phân lập nấm từ những vết loét của các mẫu cá bệnh sau 48 giờ nuôi

cấy trên môi trường SA chỉ xuất hiện một dạng nấm thuộc giống Aspergillus với tần

số bắt gặp là 12.5%

Theo báo cáo “ Tổng quan về các bệnh nguy hiểm thường gặp trên động vật nuôi biển” của Nguyễn Văn Hảo và Nguyễn Ngọc Du thuộc viện Nghiên Cứu NTTS II (2007) thì một số tác nhân vi khuẩn có liên quan đến bệnh lở loét như: Vi

khuẩn V anguillarum, V ordalii, V salmonicida, V vulnificus gây bệnh trên cá mú,

cá chẽm khu vực Đông Nam Á với các dấu hiệu cơ thể bị xuất huyết, lở loét, có các

đốm đỏ, vây bị mòn cụt; Pseudomonas anguilliseptica là tác nhân chính gây ra bệnh

nhiễm trùng máu xuất huyết ở cá mú với các dấu hiệu thân bị lở loét, bụng chướng,

xuất huyết da, vây và đuôi mòn cụt, mắt lồi và đục; Flexibacter maritimus gây ra

bệnh mòn, lở loét hoặc thậm chí mất hẳn đuôi ở cá mú và một số cá biển khác

Nhìn chung, ở Việt Nam các công trình nghiên cứu về bệnh cá biển nói chung và bệnh lở loét trên cá mú nói riêng còn rất hạn chế về số lượng và mức độ đầu tư Nội dung các nghiên cứu chỉ mới điều tra thành phần ký sinh trùng, phát hiện tác nhân gây bệnh vi khuẩn, nấm Phần thực hiện gây nhiễm trở lại để có cơ sở khẳng định vai trò của các tác nhân gây bệnh phân lập từ cá bệnh cũng như đánh giá mức độ độc lực của chúng còn hạn chế Chính vì thế, trong đề tài này chúng tôi sẽ nghiên cứu sâu hơn về một trong những tác nhân gây bệnh lở loét trên cá mú, đó là

Vibrio parahaemolyticus Đặc điểm sinh hóa, phân tích protein và độc lực của vi

khuẩn này sẽ được trình bày trong đề tài này Đồng thời chúng tôi tiến hành so sánh

các đặc điểm đó với chủng Vibrio parahaemolyticus chuẩn ATCC 17802 để có thể

kết luận chắc chắn về vi khuẩn này

PHẦN II

2.1 Địa điểm, thời gian, đối tượng nghiên cứu:

Địa điểm thực hiện: Viện Nghiên Cứu NTTS III

Thời gian nghiên cứu: từ ngày 09/03/2009 đến ngày 13/06/2009

Đối tượng nghiên cứu: 3 chủng Vibrio parahaemolyticus

Bảng 2.1: Ký hiệu, nguồn phân lập và nguồn gốc của đối tượng nghiên cứu

1 ATCC 17802 ATCC Bệnh nhân ngộ độc thực

phẩm

Ngân hàng giống ATCC

2 V10505L V1 Cá mú bệnh lở loét Viện Nghiên Cứu

- Liên hệ với các phòng lưu giữ chủng ở các viện nghiên cứu I và II

- Mua chủng đối chứng từ ngân hàng chủng

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa:

Theo phương pháp truyền thống Gồm các đặc điểm sinh hóa sau:

- Nhuộm Gram để quan sát hình thái vi khuẩn theo phương pháp của Plumb & Bowser (bản dịch của Nguyễn Ngọc Nhiên,1992) Các bước tiến hành:

+ Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ môi trường nuôi cấy lỏng hay từ khuẩn lạc

+ Dùng que cấy phết , dàn một lớp mỏng trên tấm lam sạch

+ Để mẫu khô ở nhiệt độ phòng, sau đó hơ cao tấm lam trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn

+ Nhuộm Gram theo các bước sau:

 Nhỏ dung dịch tím Crystal lên tiêu bản, để 30-60 giây

 Rửa nước nhanh, vẩy khô nước

 Nhỏ dung dịch Lugol trong 1 phút

 Rửa nước nhanh, vẩy khô nước

 Nhỏ dung dịch Cồn- Aceton, nghiêng lam cho cồn chảy qua vi khuẩn để tẩy màu

 Rửa nhanh nước và vẩy cho khô

 Nhỏ dung dịch Fuchsin trong 1-2 phút

 Rửa nước, để khô tự nhiên (có thể dùng giấy thấm khô nhưng không làm xước mẫu)

 Dùng kính hiển vi có vật kính 100x để quan sát tiêu bản

 Vi khuẩn có màu xanh tím – Gram dương (+)

 Vi khuẩn có màu đỏ hồng – Gram âm (-)

- Phản ứng Decarboxylase: Gồm Ornithine, Lysine, Arginine

- Kiểm tra O/F

- Lên men đường: Glucose, Sucrose, Manitol, Lactose

- Thử khả năng chịu đựng muối: 0%, 3%, 5%, 7%, 10%

2.2.3 Phương pháp phân tích protein của vi khuẩn:

Sử dụng kỹ thuật điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) theo phương pháp của Laemmli (1970) và nhuộm protein bằng bạc theo phương pháp của Wray và cộng sự (1981)

Vi khuẩn được nuôi trên môi trường TSA 2% NaCl, sau 24 giờ lấy một ít

vi khuẩn hòa trong dung dịch PBS (Phosphate Buffered Saline) để đạt được độ đục khoảng 108 cfu/ml Đem ly tâm dung dịch vi khuẩn này với tốc độ 6000 vòng/phút trong thời gian 10 phút Sau khi hút bỏ phần dịch nổi, hòa lại vi khuẩn trong dung dịch Sample buffer Tiếp theo pha loãng 3 lần theo tỷ lệ 1:1 bằng dung dịch Sample buffer trên Cùng lúc, chuẩn bị protein chuẩn, cũng hòa vào dung dịch Sample buffer Các mẫu chuẩn bị được đem ủ ở 95oC trong 5 phút Cuối cùng, đổ mẫu vào các giếng trên bản gel và chạy điện di ở điện thế 200 V trong 40 phút

Gel sau khi điện di được nhuộm bạc theo phương pháp của Wray và cộng sự (1981) Sau khi các vạch protein hiện rõ, đặt gel lên tấm kính và đưa ra sáng quan sát và chụp hình

2.2.4 Nghiên cứu độc lực, LD 50 của vi khuẩn

2.2.4.1 Xây dựng đường cong sinh trưởng vi khuẩn

Để có sở để xác định thời điểm thu vi khuẩn và xác định độ đục phù hợp với mật độ vi khuẩn yêu cầu cho thí nghiệm

* Quá trình thực hiện:

 Đo độ đục :

Lấy vi khuẩn được giữ đông băng ở nhiệt độ -70oC để ở nhiệt độ phòng cho rả đông, lấy 0.2 ml dịch khuẩn nuôi trong bình tam giác 250 ml có chứa 100 ml

môi trường TSB 2% NaCl Sau đó đặt trên máy lắc với tốc độ lắc 150 vòng/ phút, ở nhiệt độ phòng Sau khoảng thời gian nhất định thu 1 ml mẫu đem ly tâm với tốc

độ 6000 vòng/phút ở 4oC trong thời gian 10 phút Hút bỏ phần dịch nổi, rồi hoà vi khuẩn vào nước muối sinh lý, đem đo độ đục bằng máy đo quang phổ ở bước sóng

600 nm, xác định mật độ quang của vi khuẩn

 Xác định mật độ tế bào vi khuẩn trên môi trường TCBS

+ Hệ thống pha loãng: hệ số pha loãng bằng 10

+ Lấy 0.5 ml nước mẫu ở 2 độ pha loãng cuối cùng, nuôi cấy trên môi trường TCBS Mỗi độ pha loãng nuôi cấy trên 3 hộp lồng

+ Nuôi cấy ở nhiệt độ 30-32oC, sau 24 giờ đem ra đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch, lấy giá trị trung bình của 3 đĩa hợp lồng có cùng

độ pha loãng

+ Số lượng vi khuẩn tính theo công thức:

X: Số lượng vi khuẩn/ml (CFU/ml)

A: Số khuẩn lạc trung bình ở một độ pha loãng

V: Thể tích mẫu đưa vào nuôi cấy (0.5 ml)

X =

A

V

x K