Thử nghiệm khả năng kháng nấm phân lập từ trứng cá chép của một số chất hóa học và dịch chiết rút từ thảo dược

Để hoàn thành khoá học đào tạo Cử nhân Bệnh học Thuỷ sản, tôi đã đượcnhà trường, khoa và Bộ môn giao cho thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp với tiêu đề “Thử nghiệm khả năng kháng nấm p

MỞ ĐẦU

Tại Việt Nam có hàng nghìn trại sản xuất giống nhân tạo cá nước ngọt, phân

bố ở khắp nơi: Miền núi phía Bắc, Đồng bằng Bắc Bộ, miền Trung, Tây Nguyên vàĐồng bằng sông Cửu Long Có rất nhiều các đối tượng cá nước ngọt như: Cá chép,

cá trê, cá trôi, trắm, cá rô phi, cá tra, cá basa…Đã và đang được cho sản xuất nhântạo tại các trại này Có một loại bệnh vẫn thường xuyên xuất hiện và gây hại, ảnhhưởng lớn tới sự phát triển phôi của cá, gây chết phôi, chết cá ảnh hưởng lớn tớihiệu quả xuất

Từ trứng cá chép đã bị nhiễm nấm được thu gom từ trại thực nghiệm NinhPhụng –Ninh Hoà Đồng nghiệp của tôi -bạn Trịnh Thị Ngà đã phân lập được mộtgiống nấm và đã định danh là Saprolegnia

Để hoàn thành khoá học đào tạo Cử nhân Bệnh học Thuỷ sản, tôi đã đượcnhà trường, khoa và Bộ môn giao cho thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp với tiêu

đề “Thử nghiệm khả năng kháng nấm phân lập từ trứng cá chép của một số chất

hoá học và dịch chiết rút từ thảo d ược” Với các nội dung như sau:

1 Chiết rút chất kháng nấm từ một số cây cỏ phổ biến tại địa phương

2 Thử nghiệm khả năng kháng nấm của dịch chiết rút từ thảo dược trongcác dung môi khác nhau lên sự phát triển hệ sợi nấm

3 Thử nghiệm khả năng kháng nấm của dịch chiết rút từ thảo dược ở cácnồng độ khác nhau lên sự phát triển hệ sợi nấm

4 Thử nghiệm khả năng kháng nấm của một số hoá chất lên sự phát triểncủa hệ sợi nấm

Chúng tôi mong muốn rằng, kết quả nghiên cứu từ luận văn này có thể cungcấp các cơ sở khoa học để lựa chọn loại thuốc phòng và trị bệnh do nấm ký sinh ở

cá, trứng cá chép nói riêng và cá nước ngọt nói chung

Do thời gian và kinh phí nghiên cứu còn hạn hẹp, bản thân còn thiếu kinhnghiệm trong tổ chức nghiên cứu và viết báo cáo khoa học Do vậy luận văn này sẽ

không thể tránh được những thiếu sót Chúng tôi rất mong nhận được sự góp ý củathầy cô và bạn bè đồng nghiệp.

Nha Trang, tháng 6 năm 2009Sinh viên thực hiện:

Lê Thị Yến Mi

Phần 2: TỔNG QUAN

2.1 Đặc điểm chung của nấm

Nấm là nhóm sinh vật không có khả năng tự dưỡng như thực vật nên chúngthường có phương thức sống hoại sinh, cộng sinh hay kí sinh gây bệnh ở động vật

và thực vật [5]

Cấu tạo cơ thể là một tản (thallus) tức là cơ thể có bộ máy dinh dưỡng chưa

phân hoá thành các cơ quan riêng biệt Nấm gây bệnh ở động vật thuỷ sinh thường

có cấu tạo hình sợi phân nhánh, những nấm này sinh trưởng ở đầu mút sợi nấm và

phát triển rất nhanh tạo thành những đám rất chằn chịt gọi là hệ sợi nấm (mycelya) Từng sợi nấm gọi là khuẩn ty (hyphae) [2] Cấu tạo của nấm có thể là đơn bào hoặc

đa bào Ở nấm đa bào có hai loại, một loại giữa các tế bào không có vách ngăn, toàn

bộ sợi nấm như một tế bào khổng lồ đa hạch gọi là nấm bặc thấp, đại diện là nấmLagedinium, Saprolegnia, Achlya Một loại khác giữa các tế bào có vách ngăn gọi

là nấm bậc cao, đại diện là nấm Fusadium [5]

Hình thức sinh sản của nấm: có nhiều hình thức sinh sản khác nhau :

- Sinh sản sinh dưỡng tạo nên các phân sinh bào tử Đó là các tế bào sinhtrưởng ở đầu mút của khuẩn ty, có vách tế bào dày lên hình thành các tế bào màngdày, các hạch nấm Các tế bào màng dày này đứt ra khỏi cơ thể mẹ và phát triểnthành sợi nấm mới [5]

- Sinh sản vô tính: Các bào tử vô tính khác nhau ở hình thái và nguồn gốc phátsinh Căn cứ vào đặc điểm phát sinh người ta phân thành bào tử kín và bào tử trần.Một dạng bào tử vô tính khác không phải là dạng sinh sản được gọi là bào tử màngdày hay bào tử áo Chúng do một đoạn sợi nấm tích luỹ nhiều chất dinh dưỡng và

có thành tế bào dày lên mà tạo thành nhằm mục đích thích ứng với các điều kiện bấtlợi của môi trường Một kiểu bào tử vô tính khác đó là bào tử có roi có khả năng bơilội trong nước, người ta gọi là các bào tử động [2]

- Sinh sản theo hình thức hữu tính: Nấm hình thành các túi giao tử

(gamentagia) Túi giao tử đực gọi là hùng khí (antheridium), túi giao tử cái gọi là

noãn khí (oogonium) Trên khuẩn ty thường quan sát thấy những cơ quan sinh sảnđực và cái của nấm nằm vuông góc với sợi nấm Túi giao tử đực nhỏ, thường cóhình ống và túi giao tử cái thường là mép túi phình to dạnh hình cầu Một số giốngnấm sinh sản hữu tính theo hình thức tiếp hợp, túi giao tử đực uốn cong và bao lấytúi giao tử cái, giữa chúng xuất hiện cầu nối nguyên sinh chất Qua cầu nối này giao

tử đực và cái gặp nhau tạo thành hợp tử Hợp tử này nảy nầm phát triển thành sợinấm mới [5]

2.2 Một số thuốc và hoá chất phòng trị nấm thường dùng trong Nuôi trồng Thuỷ sản

2 Nhóm Griseophuvin (Fulcine, Fulgicin, Fungivin): phát hi ện 1939 từ nấm

Penicillium griseofulvum thuốc có hoạt tính ức chế sự phân b ào của nấm, tạo

thành những tế bào nhiều nhân mà không phân bào được Tác dụng mạnh ở tếbào còn non và đang ở giai đoạn chuyển hoá mạnh [8]

3 Nhóm Chidazol (Ketoconazol): Có kh ả năng dính vào các sterol làm thayđổi cấu trúc màng tế bào giống như nhóm polyen Làm thay đ ổi chuyển hoáDNA và RNA, làm tích t ụ các peroxyd gây độc cho tế bào [8]

2.2.2 Hoá chất trị nấm

Đã có rất nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu về các hoá chất phòng

và trị nấm Nó mang lại hiệu quả cao trong ph òng, trị bệnh cho cá đặc biệt l à trongquá trình sản xuất giống Như Malachite Green là m ột chất kháng nấm hiệu quả

MG có thể can thiệp vào quá trình sinh tổng hợp protein của c ơ thể sinh vật gâybệnh, và đi đến tiêu diệt chúng [8] Mặc dù có nhiều ưu điểm là chất rẻ tiền, dễ tìm

lại có kết quả điều trị tốt nh ưng trên thế giới hiện nay rất nhiều n ước đã cấm sửdụng trong đó có Việt Nam ( theo danh mục các chất cấm sử dụng của Bộ Thuỷ sảnViệt Nam trong sản xuất kinh doanh Thuỷ sản kí ngày 2/2/2005) do có ti ềm nănggây ung thư cho người [14] Vì vậy việc tìm ra những hoá chất thay thế l à một mốiquan tâm.

 Formalin ( Formadehyde 36-38%)

Formalin hay còn gọi là Formol có công thức phân tử CH2O, Công thức cấu tạo

H-CH= OFormol là chất lỏng dễ bay hơi, có mùi hắc, có tính khử rất mạnh, phổ diệt trùngmạnh là một chất thường được sử dụng để trị bệnh nấm trên trứng cá và cá nướcngọt và có hiệu quả rất cao, cơ chế tác dụng của chúng l à làm biến đổi cácaminoacid của sinh vật gây bệnh và tiêu diệt nó [8]

Dùng formol phun vào ao ở nồng độ 20-30 ppm có thể tiêu diệt rất tốt tácnhân gây bệnh vi khuẩn, nấm …[5]

 Xanh Methylen - Methylen Blue

Tên khác của xanh Methylen là Methylene Blue B; Methy lthiomin Chloride; UrolenBlue Xanh methylen có công th ức phân tử: C16H18N3SCl 3H2O Xanh Methylen cómàu xanh nước biển đậm, kết tinh hạt dạng h ình trụ sáng bóng, không có m ùi vị, để

ra không khí không bị biến đổi, dễ tan trong n ước và trong rượu

Methylen Blue có tính oxy hoá m ạnh làm mất hoạt tính của các men trong tếbào vi sinh vật và tiêu diệt nó [8]

Theo Đỗ Thị Hoà Methylen blue 2-3 ppm có thể phòng và trị bệnh nấm trên

cá và trứng cá [5]

 Hydrogen Peroxite (nư ớc oxy già)

[O] Có tính diệt trùng mạnh Dùng nước oxy già có thể làm tăng hàm lượngoxy hòa tan trong nước Cần tăng 1mg oxy/L thì cần 4ml/m3 H2O2 nồng độ 50%[8]

Theo Kishio Hatai (1997), nư ớc oxy già dùng để trị nấm với liều 1000 µg/lít

có thể diệt được hầu hết các loài nấm ký sinh gây bệnh ở ĐVTS trong điều kiện thínghiệm Khi dùng nước oxy già chữa bệnh nấm cho trứng cá hồi, với nồng độ 1000µg/ml, đã có tác dụng giảm 90% tỷ lệ trứng nhiễm nấm, tỷ lệ nở vẫn đạt gần 70%

 Khí Ozon (O3)

O3 → O2 + [O]

Dùng khí ozon với liều 0,5mg/l trong 15 -30 giây, hoặc 0,1 mg/l trong 60

giây đã giết được >99,9% các loại vi khuẩn Vibrio anguillarum, Aeromonas

salmonicida, A hydrrophila, Streptococcus sp và >99% Rhabdovirus Với một

số loại virus khác, cần dùng ozon có nồng độ cao hơn 0,5-1,0 mg/ml trong 1phút có thể diệt được >99%

Tuy vậy, những tác dụng phụ của loại khí n ày tới môi trường nuôi động vậtthủy sản vẫn chưa được nghiên cứu

 Chlorine

Chlorine có dạng bột màu trắng, sặc mùi clo, có khả năng oxy hóa rất mạnh,nên có tính diệt trùng cao, phổ diệt trùng rộng

Phản ứng hóa học xảy ra nh ư sau:

2 Ca(OCl)2+ 2 H20 = Ca(OH)2 + 2HOCl + CaCl2

HOCl → H+ + OCl

-HOCl có khả năng diệt vi khuẩn mạnh hơn OCl-, nó có thể oxy hoá và ứcchế men trong tế bào vi khuẩn làm cho trao đổi chất bị rối loạn, ức chế sinhtrưởng và sinh sản của vi khuẩn, Ca(OCl)2 làm ức chế nhiều loài vi khuẩn ở thểdinh dưỡng và nha bào

 Thuốc tím- Potassium permanganate -KMnO4

Thuốc tím có dạng tinh thể nhỏ, m àu tím không có mùi vị, dễ tan trong nướcngọt và nước mặn

2KMnO4 + H2O = 2KOH + 2MnO2 +3O

KMnO4 + R-COH = MnO2 + KOH + CO2+ H2O

KMnO4 +H2S = MnO2+ K2SO4 + MnO + H2O + S

KMnO4 + Fe(HCO3)2+ H2O = MnO2 +Fe(OH)2 + KHCO3+ H2CO3

Là chất oxy hoá mạnh có phổ diệt tr ùng mạnh

Tuy nhiên việc quá lạm dụng các thuốc v à hoá chất để diệt nấm đã khiến tạo ranhiều chủng nấm kháng thuốc, đồng thời có một số tác dụng phụ gây độc cho vậtnuôi và người sử dụng cũng như ảnh hưởng đến môi trường Vì vậy hướng đi quay

về với những sản phẩm từ tự nhi ên ngày càng được quan tâm chú ý Một trongnhững sản phẩm đó là các chất kháng khuẩn, kháng nấm từ các thảo d ược

2.3 Một số chất kháng nấm có nguồn gốc từ thả o dược

Theo tác giả Maria José Abad 2007 [19] thông báo các hoạt chất kháng nấmtrong thực vật đã được nghiên cứu nhiều đặc biệt là những năm gần đây Tác giả đ ãtổng kết rằng trong thực vật có 5 hoạt chất th ường thấy là: Tinh dầu, terpenoid,saponines, các hỗn hợp phenolic, alkaloids

● Saponins

Theo Nguyễn Đức Minh đã viết trong cuốn “Thuốc chữa bệnh đường ruột từ

các cây cỏ trong nước” năm 1980 thì hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu

các chất saponin có hoạt tính sinh học Nhiều chất saponin được sử dụng trong cácđơn thuốc và một số saponin steroid l à nguyên liệu không thể thay thế đ ược để tổnghợp các chất hormon steroid có hoạt tính cao [15]

Saponin của rễ cây Hedera belix L có tác dụng với tụ cầu khuẩn v àng và một

số loài nấm Saponin steroid của Smilax regelie killip có tác dụng với Clavicep

purpurea, E coli, penicillium notatum, Micrococcus pyogenes var aureus, Aspergillus niger; các loài nấm men, phổ tác dụng kháng khuẩn v à nồng độ hoạt

tính của saponin phụ thuộc v ào cấu trúc hoá học của chúng Ví dụ: nhiều saponintriterpen và steroid có tác d ụng đối với Trichotecium róeum Link chất tomatin có

tác dụng kháng E coli, Penicillium notatum, Micrococcus pyogenes var aureus,

Aspergillus niger, các loài nấm men Chất solanin có tác dụng vớ i Fusarium solani, Corynebacterium sepedonium…

Cơ chế tác dụng chống nấm men của saponin phụ thuộc v ào sự có mặt củacác nhóm OH tự do trong phân tử của chúng, nếu đem acetyl hoá hay metyl hoá các

nhóm OH thì hoàn toàn m ất hoạt tính, đem thuỷ phân để giải phóng trở lại cácnhóm OH thì lại có hoạt tính [15].

Maria José Abad và ctv [19] đã trích dẫn nghiên cứu của Renault 2003 về

một triterpene saponin từ cây Capsicum frutescens L (Solanaceae) còn gọi là cây ớt

Cayen có tên là CAY -1 Trong điều kiện thí nghiệm CAY-1 có hoạt tính kháng với

16 chủng nấm khác nhau gồm Candida spp và Aspergillus fumigatus, và có hoạt tính đặc biệt mạnh đối với Cryptococcus neoformans Cụ thể là CAY-1 thể hiện

hoạt tính bằng cách phá vỡ m àng của tế bào nấm

Cũng theo Maria José Abad trích dẫn năm 2004 Sauton đã tách chiết từ thân

rễ của cây Dioscorea cayenensis Lam Holl (Dioscoreaceae), những steroid saponin với hoạt tính kháng nấm đối với nấm men gây bệnh tr ên người Candida albicans,

Candida glabrata và Candida tropicalis Đến 2005 Sauton lại tách chiết được 3

chất steroidal saponin kháng nấm mới từ rễ của cây Smilax medica L (Liliaceae)

[19]

● Alkaloids

Alkaloid là nhóm hợp chất nitơ dị vòng (gồm hơn 6000 chất) Có hoạt tínhsinh học do sự bắt chước (mimetisme) các hormon cũng như sự can thiệp của chúngtrong sự trao đổi chất quan trọng của tế bào Nhiều alkaloid có tác dụng ức chế thầnkinh trung ương như morphin, codein, scopolamin, reserpin… kích thích th ần kinhnhư Strychnin, cafein, lobelin [15] Những báo cáo về alkaloids kháng nấm từnhững loài cây thuốc cũng được tìm thấy trong nhiều tài liệu Một số cây trong số

đó đã được báo cáo là đã từng được sử dụng trong dược cổ truyền như một tác nhânkháng các bệnh truyền nhiễm [19]

Các alkaloid rất phổ biến trong giới thực vật (25% thực vật có chứaAlkaloid), ở một số thực vật nồng độ alkaloid có thể l ên tới 10% (trong hoa)

Hình 2.1 cấu trúc của berberine

Maria José Abad 2007 d ẫn theo nghiên cứu Slobodnikova 2004 d ịch chiết

thô từ vỏ thân cây của Mahonia aquifolium (Pursh) Nutt (Berberidaceae) và hai

protoberberine alkaloids chính c ủa nó, Berberine (Hình 4) và jatorrhizine, đã đượckiểm tra về hoạt tính kháng nấm trong điều kiện thí nghiệm Hai m ươi chủng

Candida spp phân lập từ bệnh vulvovaginal candidoses mãn tính được dùng để

kiểm tra độ nhạy cảm của chúng đối với dịch chiết th ô và 2 alkaloid đã được táchchiết Kết quả đưa ra cơ sở giải thích cho truyền thống sử dụng M aquifolium nh ưcác liệu pháp điều trị các Bệnh nấm da ở ng ười [1], [19]

● Các tinh dầu

Tinh dầu bao gồm các chất th ơm, dễ bay hơi chứa trong cây Từ xưa người ta

đã biết các dược liệu chứa tinh dầu đặc biệt l à các gia vị như hồ tiêu, gừng, nhụcđậu khấu, đinh hương v.v … Ngoài mùi v ị làm cho chúng có giá trị trong ngành ănuống và chế biến rượu với liều nhỏ, các gia vị n ày không những kích thích sự ănngon và tiêu hoá, mà chúng còn c ó tác dụng diệt khuẩn, diệt nấm [4]

Năm 1994 nhóm tác gi ả A Y Abdel-mallek; M M K Bagy; H A H.Hasan nghiên cứu hoạt tính kháng nấm của một số tinh dầu trong điều kiện thínghiệm Nghiên cứu đã thực hiện đánh giá hoạt tính của 12 tinh dầu có tr ên thị

trường đối với 5 chủng nấm Candida albicans, C stellatoidea, C tropicalis,

Torulopsis candida và T versitilis Kết quả nghiên cứu cho thấy trong 12 tinh dầu

được đưa vào thí nghiệm có 5 tinh dầu có khả năng kháng tất cả các nấm đ ược kiểm

tra đó là cinnamon (quế), clove (đinh hương), horseradish, marjoram (kinh giới ô)

và peppermint (bạc hà) Trong đó cinnamon có tác dụng tốt nhất [16].

Theo Erica A Soto-Mendivil và ctv 2006 trong c ỏ xạ hương (thymusvulgaris L.) có thành ph ần tinh dầu gồm có borneol (28.4%), thymol (16.6%),carvacrol methyl ether (9.6%), camphene (6.9%), -humulene (6.4%) và carvacrol

(5.0%) Các tinh dầu này có tác dụng kìm hãm sự phát triển của nấm Alternaria

citri ở nồng độ 1000 ppm [1].

● Terpenoid

T.R Govindachari và ctv năm 1998 [ 26] đã tiến hành tách chiết một số hợp

chất kháng nấm trong dầu hạt của lo ài Azadirachta indica Các tác giả này đã thu

được một số terpenoids chính như 6-deacetylnimbin, azadiradione, nimbin, salannin

và epoxyazadiradione Các terpenoid nguyên ch ất không có hoạt tính kháng nấm,nhưng khi trộn chúng thành hỗn hợp thì chúng thể hiện hoạt tính khá mạnh

● Những hỗn hợp Phenolic

Maria José Abad và ctv 2007 [ 19] cho biết trong vài năm gần đây, một sốlượng lớn các nghiên cứu đã được thực hiện về hoạt tính kháng nấm của những hợpchất phenolic có nguồn gốc tự nhi ên Những hợp chất phenolic đ ơn giản là,flavonoids và các glycosides liên quan đến flavonoid, anthraquinones, các coumarin

và các dẫn xuất của nó Một số flavonoid đ ược tìm ra từ các dịch chiết từ thảo d ược

và được đánh giá về hoạt tính kháng nấm

Nghiên cứu của Svetaz L tìm ra được 1 flavonoid từ dịch chiết methanolcủa loài cây Zuccagnia punctata Cav [ 1]

2.4 Những bệnh nấm thường xảy ra trên trứng cá, cá nước ngọt

Theo Đỗ Thị Hòa (2004) trên cá và trứng cá nước ngọt thường xảy ra cácbệnh: bệnh nấm hạt Dermocystidiosis, nấm tr ên mang Branchiomycosis, b ệnh nấmthuỷ my, hội chứng lở loét [5]

*Bệnh nấm hạt Dermocystidiosis

Do nấm hạt Dermocystidium spp Thường kí sinh trên vây, mang, da cá chép, cá

lóc, cá trắm [5] và tìm thấy những u hạt cả trong nội tạng của cá cảnh, cá rô phi, cáchép, cá hồi [14] Những chỗ bị bệnh sưng tấy màu hồng, hình dạng khác nhau(tròn, ovan hoặc hình dài), kích thước nấm hạt khác nhau từ 1 -2cm có khi lên tới

10cm Xung quanh chỗ xưng tấy có các đốm viêm nhỏ, chứa các bào tử Bệnh bùngphát lần đầu tiên vào mùa xuân 1991, gây ch ết 80 con cá bố mẹ ở Estonia [7] Vàbệnh không xảy ra ở Châu Phi [1 4] Bệnh không gây chết h àng loạt cho Động vậtThuỷ sản, nhưng khi bị nhiễm nấm hạt sẽ tạo điều kiện cho các tác nhân gây bệnhkhác dễ xâm nhập Bệnh thường xuất hiện vào mùa xuân [5].

*Hội chứng lở loét ở cá:

EUS là bệnh do hỗn hợp nhiều tác nhân gây ra nh ưng trong đó nấm

Aphanomyces invadans là tác nhân chính gây nh ững tổn thương nặng nề cho cơ thể

cá bệnh [5] Một số nấm bậc thấp nh ư Saprolegnia spp và Achlya cũng được tìm

thấy trên cơ thể cá bệnh EUS Cá bệnh da cá sẫm lại, có vết m òn màu xám hoặc cácđốm đỏ phát triển ở đầu, thân, các vây v à đuôi Những vết mòn lan rộng và sâuthành những vết loét, vẩy rụng xuất huyết v à viêm Các cơ quan n ội tạng rất bìnhthường Bệnh EUS được thông báo lần đầu tiên tại Úc vào tháng 3/1972 sau đóbệnh lây lan ra nhiều quốc gia khác nhau ở khu vực Đông Nam v à Nam Châu Á [5] Kết quả nghiên cứu ở Úc và Philippines cho thấy sự bùng phát EUS liên quantới pH thấp, nhiệt độ thấp kéo d ài và sự tồn tại của các loài cá nhạy cảm cá lóc, cá

trôi, cá trê…và sự có mặt của Aphanomyces invadan [5].

Nấm thuỷ my còn có thể kí sinh gây ung trứng cá Phần gốc của sợi nấm cắmsâu vào màng trứng, phần ngoài của sợi nấm lơ lửng trong nước tủa ra xung quanh,nhìn trứng cá bị nhiễm nấm giống như hoa gạo Trứng bị nhiễm nấm th ường chết(ung) với nhân trứng chuyển sang m àu trắng đục Trong bể ấp nấm thuỷ my th ườngphát triển đầu tiên ở trứng ung do không đ ược thụ tinh, sau lây qua các trứng khỏe

làm trứng bị chết Nếu không có tác động kịp thời có thể l àm giảm đáng kể tỷ lệ cábột, hoặc đôi khi phải xả bỏ ho àn toàn [5].

Bệnh thường xảy ra vào mùa xuân có nhiệt độ thấp 18-25oC Tuy vậy có một

số loài Achlya phát triển tốt ở nhiệt độ cao h ơn [5]

*Bệnh nấm mang ở cá

Gây bệnh nấm mang ở cá là một số loài thuộc giống Branchiomyces có cấu tạodạng sợi, thuộc nhóm nấm bậc thấp v à phân nhánh Trong khu v ực Châu Á thường

gặp 2 loài B sanguinis và B demigrans Các bào tử nấm bám vào mang và phân

nhánh luồn vào các mao huyết quản, phá hoại các tổ chức mang lấp kín các maohuyết quản làm mất tác dụng hô hấp của mang Mang chuyển m àu hồng nhạt hoặctrắng bạc cùng với sự phát triển của bệnh Khi bệnh nặng các khuẩn ty v à bào tửnấm theo mạch máu di chuyển đến tim v à một số bộ phận khác [5] Bệnh thườngxảy ra ở dạng cấp tính, l àm cá giống có thể chết hàng loạt Bệnh thường xảy ra trêncác loài cá nước ngọt như cá trắm, cá trôi, cá mè, cá diếc… Bệnh thường phát triểnvào mùa có nhiệt độ cao [5]

2.5 Tình hình nghiên cứu các hoá chất và thảo dược trị nấm ở ĐVTS trên thế giới và tại Việt Nam

2.5.1 Tình hình nghiên cứu các hoá chất trị nấm ở ĐVTS trên thế giới và Việt Nam

* Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Đã có nhiều công trình nghiên cứu về các hoá chất trị nấm tr ên ĐVTS Năm

2005 C M Gieseker và ctv đ ã sử dụng formalin với nồng độ 50, 100, 150 ppm trị

nấm trên trứng cá hồi vân nhiễm Saprolegnia parasitica và kết quả cho thấy tỷ lệ

chết khi điều trị lần lượt ở 3 nồng độ là 35%, 29%, 40% trong khi khôn g điều trị tỷ

lệ chết là 67% [20]

Kishio Hatai và ctv đ ã thử nghiệm hiệu quả kháng nấm của n ước oxy già ở tỷ

lệ hoạt tính là 31% trên trứng cá hồi Kết quả cho thấy ở nhiệt dộ 13oC, trong thờigian 60 phút, H2O2ở nồng độ ≤ 1000 ppm không gây hại cho trứng cá hồi Đặc biệt

là khi dùng ở nồng độ 250-1000 ppm có khả năng ức chế kiềm h ãm, tiêu diệt sự

phát triển của nấm Saprolegnia v à Achlya Vậy H2O2 là một loại hoá chất có tácdụng tiêu diệt nấm ở ĐVTS Tuy vậy tác giả cũng khẳng định tuỳ theo nhiệt độ m àlựa chọn nồng độ cho ph ù hợp [5].

Theo Kitancharoen và ctv (1997) n ếu bằng phương pháp ngâm trứng cá hồi(trong 1h, 2 lần trên tuần và có sục khí) thì với NaCl 25 ppt thì tỷ lệ trứng nở caonhất (78.7%), trứng bị nghiễm nấm ít nhất (chỉ 2.3%); c òn nếu ấp trứng bằng nướcvới nồng độ NaCl 3, 5, 7 ppt th ì đều có hiệu quả phòng, trị nấm nhưng hiệu quảnhất ở 7 ppt [14]

Nghiên cứu của Hatai và ctv (2005) cho rằng Saprolegnia sp có khả năng

phát triển ở khoảng nồng độ NaCl từ 0 -3 %, nhưng nấm có khả năng phát tiển mạnhnhất ở 0-0.5 %, >1.5 % nấm phát triển kém và hầu như không mọc ở 3 % [21].Thường trị nấm này trên trứng bằng cách tắm trứng trong NaCl 2 -3 % trong 5-15phút, tắm 2 lần trên ngày [5]

Năm 1998, Nilubol Kitancharoen, Atsushi Yamamoto và Kishio Hatai đ ã thửnghiệm về ảnh hưởng của NaCl, H2O2, và MG trên trứng cá hồi nhiễm nấm đ ã kếtluận không có sự khác biệt đáng kể trong nghi ên cứu giữa H2O2 1000 µl/mL và MG

2 µl/mL Đối với NaCl 25 ppt kém hiệu quả hơn MG 2 µl/mL [14]

Năm 2003, Brian C Small và William R Wolters đ ã thử nghiệm sử dụng

H2O2 trong bể ấp trứng da trơn và kết quả nghiên cứu cho thấy những cải tiến quantrọng bằng việc sử dụng H2O2 như một chất có hiệu quả kinh tế trong việc gia tăng

tỷ lệ nở của trứng cá da tr ơn thay cho việc sử dụng formalin [14]

Đối với bệnh ở giáp xác cũng có nhiều nghi ên cứu về thử nghiệm hoá chất đểphòng và trị bệnh nấm Hatai (1974) đ ã thử nghiệm 40 loại hoá d ược khác nhautrong điều kiện thí nghiệm v à đã tìm được một số hoá chất có hiệu quả vớiFusarium nhưng lại không có thông tin về độc hại của hoá dược này [11]

Lightner & ctv (1979) c ũng đã thử nghiệm 21 loại hoá d ược để chống lại nấmtrong phòng thí nghiệm, đã xác định được một số hợp chất có hiệu quả diệt nấmFusarium nhưng chưa đư ợc áp dụng gì trong thực tế [11]

*Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam cũng có một số nghi ên cứu về các hoá chất trị nấm trên ĐVTS:

Năm 2006, Nguyễn Thị Huyền đã nghiên cứu “xác định nấm thuỷ mi nhiễm

trên trứng cá tra, cá basa và thử nghiệm hiệu quả phòng” Ngoài ra cũng trong năm

2006 trong hội thảo quốc tế Thuỷ sản tại Nha Trang, TS Lý Thị Thanh Loan đã báo

cáo kết quả khảo sát vòng đời của Achlya sp nhiễm trên trứng cá tra và basa, trong

hội thảo quốc tế Công nghệ sinh học Nông nghiệp, đ ã báo cáo kết quả thử nghiệm

sàng lọc một số loại hoá dược có khả năng ức chế sự phát triển của Achlya sp.

nhiễm trên trứng cá tra và basa Kết quả cho thấy H2O2 ở 500 ppm và GentianViolet 1.5 ppm có tác dụng kìm hãm sự phát triển của nấm nhất [14], [22]

Năm 2007 nghiên cứu của Nguyễn Thị Trang trong luận văn tốt nghiệp tr ườngĐại học Nha Trang đã sử dụng một số hoá chất trị nấm Helicostylum tr ên trứng cánàng hai và kết quả cho thấy H2O2 1000 ppm là có hiệu quả nhất, tiếp đến là Milian

100 ppm [14]

2.5.2 Tình hình nghiên cứu một số loại thảo d ược trị nấm ở ĐVTS trên thế giới và Việt Nam

*Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Theo xu hướng hiện nay trên thế giới, để đảm bảo vệ sinh an to àn thực phẩm,hầu hết kháng sinh đều bị cấm hoặc hạn chế sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản V ìvậy việc nghiên cứu tìm ra thuốc có nguồn gốc thảo d ược để phòng trị bệnh cho đốitượng thuỷ sản thay thế cho các loại kháng sinh v à hoá chất bị cấm và hạn chế sửdụng là vấn đề được quan tâm

Trên thế giới đã có những nghiên cứu về các loài thảo dược về hoạt tínhkháng nấm của nó trên ĐVTS Tuy nhiên v ẫn chưa nhiều

Pareeya Udomkusonsri [23] đ ã thực hiện nghiên cứu hoạt tính kháng nấmcủa dịch chiết nghệ bằng ethanol đối với nấm gây bệnh tr ên cá trong điều kiện thínghiệm Kết quả thu được cho thấy đối với nghi ên cứu kháng nấm, sự phát triển của

Saprolegnia diclina, Saprolegnia parasitica H2, Achlya channae và Aphanomyces piscicida giảm có ý nghĩa với các dịch chi ết có nồng độ tương ứng 500, 500, 500 và

40 μg/ml so với hai nghiệm thức đối chứng (môi tr ường và DMSO 1%) Nồng độ

nhỏ nhất của dịch chiết có tác dụng ức chế ho àn toàn sự phát triển của S diclina, S.

parasitica H2, A channae, A piscicida lần lượt là 2.500, 2.500, 1.250 và 62.5

μg/ml Đối với nghiên cứu diệt nấm, các chủng S diclina, S parasitica H2 và A.

Channae bị tiêu diệt sau khi ngâm trong dịch chiết có nồng độ 5.000 μg/ml Dịch

chiết có nồng độ 62.5 μg/ml cũng có tác dụng diệt đối với A piscicida

F Macchioni 1999 [24] nghiên cứu khả năng kháng lại nấm Saprolegnia

ferax của loài cây Artemisia verlotorum (ngải cứu), và Santolina etrusca Kết quả

nồng độ thấp nhất của dịch chiết bằng dung môi n ước có khả năng ức chế nấm

Saprolegnia ferax là 1%, và của dịch chiết bằng dung môi l à ethanol là 0.25%.

Trong họ Liliaceae, những báo cáo về hoạt tính kháng nấm chủ yếu li ên quanđến giống Allium Masoomeh Shams Ghahfarokhi v à ctv năm 2003 thực hiệnnghiên cứu hiệu quả của dịch chiết h ành và tỏi trong việc ức chế sự phát triển v à

hoạt tính của enzyme kitinase của lo ài nấm Trichophyton mentagrophytes Sự phát triển của T mentagrophytes bị ức chế bởi dịch chiết tỏi ở tất cả các nồng độ thí

nghiệm Đây là báo cáo đầu tiên về khả năng ức chế hoạt tính của enzym e kitinasecủa hai dịch chiết hành và dịch chiết tỏi [25]

*Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Việt Nam có nguồn d ược liệu phong phú và đa dạng, theo số liệu điều tra từnăm 1961 đến nay đã ghi nhận được 3948 loài cây thuốc thuộc 307 họ thực vật vànấm Mặt khác Việt Nam cũng đã có kinh nghiệm sử dụng cây thuốc từ lâu đời đểchữa bệnh trong y học cổ truyền do đó xu h ướng đi sâu nghiên cứu để xác minh cáckinh nghiệm của y học cổ truyền v à tìm kiếm các hợp chất tự nhi ên có hoạt tínhsinh học cao từ dược liệu để làm thuốc ngày càng được quan tâm

Theo Đỗ Thị Hoà và ctv (2004) một số bệnh nấm được biết đến ở ĐVTS nh ư :bệnh EUS, bệnh nấm hạt, bệnh nấm thuỷ my, bệnh nấm mang ở cá, bệnh nấm ấutrùng ở giáp xác, bệnh nấm ở giáp xác tr ưởng thành Tuy nhiên các công trìnhnghiên cứu về các thảo dược trong phòng và trị các bệnh này vẫn chưa nhiều Một

số nghiên cứu chủ yếu trong trị các bệnh nhiễm khuẩn

Theo Đỗ Thị Hoà (2004) một số thuốc từ thảo d ược dùng trong nuôi trồngthủy sản đã có như KN-04-12 của Hà Ký năm 1990 – 1995 Thành phần thuốc gồmcác cây chứa chất kháng khuẩn nh ư: tỏi, sài đất, nhọ nồi, cỏ sữa, chó đẻ răng c ưa…,thuốc có tác dụng trị bệnh nhiễm khuẩn: xuất huy êt đốm đỏ, thối mang, viêm ruột ở

cá thương phẩm nuôi lồng bè, trong ao tăng sản và cá bố mẹ Bên cạnh đó còn cóSaponin chế biến từ rễ dây thuốc cá, hạt ch è dại, hạt bồ hòn, được dùng để diệt cátạp trong ao nuôi giáp xác De -Odoase cũng là sản phẩm chiết rút từ thảo d ược cótên Yucca schidigera và thành ph ần chiết rút từ sự lên men của vi khuẩn có lợiBacillus subtilis có tác d ụng khử amoniac và các khí độc khác trong ao nuôi [5].Cũng theo Đỗ Thị Hoà (1990) và Bùi Quang Tề (1997) đã đưa ra 13 cây thuốcnam có tác dụng phòng và trị bệnh cho cá Như Cây sở, sòi, tỏi, cỏ sữa lá nhỏ,xuyên tâm liên, sài đất, chó đẻ răng cưa, nhọ nồi, xoan

Dựa vào nghiên cứu của Nguyễn Thị Bạch Li ên (1997) cho thấy đã chiết được

thành phần hỗn hợp có trong cây chó đẻ răng c ưa (Phyllanthus urinaria) và đặt tên

là Coderaxin có tác dụng diệt khuẩn vá nấm rất tốt ở nồng độ 0.5% [12]

Năm 2008 Nguyễn Thị Mai Anh trong luận văn tốt nghiệp Đại học Nha

Trang “Đánh giá tác động kháng nấm phân lập từ trứng cá n àng hai (Chilata

ornata Gray, 1831) của một số dịch chiết từ cây cỏ ” và kết quả cho thấy dịch chiết

tỏi từ dung môi methanol và dịch ép nghệ trực tiếp có tác dụng k ìm hãm nấmHelicostylum nhất

Gần đây có báo cáo của L ê Văn Yên, viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản IIInghiên cứu về thảo dược trị nấm Fusarium gây bệnh đen mang tr ên cua xanh Kếtquả cho thấy dịch chiết củ tỏi, cây chó đẻ răng cưa và lá mồng trầu có thể trị bệnhđen mang ở cua xanh trong đó dịch chiết tỏi 60ppm có hiệu quả tốt nhất [12]

Ngoài ra cũng có một luận văn tốt nghiệp đại học Nha Trang của Trần ThịThu Huyền năm 2007 tìm hiểu hiệu quả trị bệnh đen mang và đốm vỏ trên cua biển.Tác giả kết luận tỏi, thảo quyết minh v à cây chó đẻ răng cưa đều có tác dụng khángnấm Trong đó tỏi có tác dụng mạnh nhất sau đó đến thảo qu yết minh và cây chó đẻrăng cưa [10]

2.6 Một số tìm hiểu về các thảo dược đã được chọn nghiên cứu

☺ Củ tỏi (Allium sativum L.)

Thuộc họ Hành Alliaceae, còn có tên khác là Đại toán

Đặc điểm hình thái: Lá hình cuống nhỏ, dài 15 – 20 cm Củ tỏi cónhiều nhánh mọc dưới mặt đất và có màu trắng đục

Đặc điểm phân bố: Th ường gặp ở vùng đất cát, cát pha sét, được trồngphổ biến trong nước

Một số hoạt chất: Trong tỏi có một ít iot, v à tinh dầu (100kg tỏi chứachừng 60g đến 200g tinh dầu) Th ành phần chủ yếu của tỏi là chất alixin

C6H10OS2, một hợp chất hữu cơ chứa lưu huỳnh có tác dụng diệt khuẩn mạnh[15] Một nghiên cứu gần đây tìm thấy rằng trong tỏi còn có một hoạt chất cótác dụng kháng nấm có tên là Ajoene [23]

☺ Nghệ (Curcuma longa L)

Thuộc họ gừng: Zingiberaceae

Đặc điểm hình thái: Nghệ là một loài cây cỏ cao 0.6 – 1m Thân rễthành củ hình trụ hơi dẹt, lá hình trái xoan thon nhọn ở hai đầu, hai mặt đềunhẵn

Đặc điểm phân bố: Đ ược trồng nhiều ở khắp n ước ta, còn mọc hoang

và được trồng ở các nước Ấn Độ, Indonexia, Campuchia, L ào, Trung Quốc

và các nước nhiệt đới

Một số hoạt chất: Trong nghệ ng ười ta phân tích được: chất màucurcumin 0.3%, tinh th ể màu nâu đỏ, ánh tím, ete, clorofoc, dung dịch cóhuỳnh quang màu xanh lục; tinh dầu 1 – 5% màu vàng nhạt, thơm; ngoài racòn có tinh bột, canxi oxalat, chất béo Tinh dầu trong nghệ có tác dụng diệtnấm sát khuẩn [27]

☺ Lá cà chua (Lycopersicon esculentum Mill), thuộc họ cà Solanaceae.

Phân bố: Mọc hàng năm

Đặc điểm hình thái: Cây thảo hằng năm, có khi mọc dại cao khoảng 1m hayhơn Thân mọng nước có lông mềm dính Lá có cuống mọc so le xếp lông

chim không đều hay kép lông chim 2 lần dài 10-40cm Lá chét thay đổi hìnhtrứng hay hình trứng mũi mác mép có răng Hoa thành chùm xim ở nách lá.

Một số hoạt chất: Theo GS Đỗ Tất Lợi trình bày trong cuốn “Những

cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” Trong lá cà chua có chất tomatin là chất

kháng khuẩn chống nấm

Phần 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU

3.1 Thời gian, đối tượng và địa điểm nghiên cứu

 Thời gian: Đề tài được thực hiện từ 2/3/2009 đến ngày 30/6/2009

 Đối tượng: Tính kháng nấm của một số hoá chất và thảo dược

 Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bệnh học Thuỷ sản, trường Đại học NhaTrang

3.2 Sơ đồ khối nghiên cứu của đề tài

Hình 3.1 Sơ đồ khối nghiên cứu của đề tài

TN5 Nghệ TN4 Tỏi

Nấm gây bệnh ở trứng cáchép -Saprolegnia

3.3 Vật liệu dùng cho nghiên cứu:

- Hộp lồng, bình nón được hấp tiệt trùng ở 180oC Đèn cồn, pank

3.3.2 Hoá chất, nấm và loại thảo dược

Các hoá chất trị nấm :

- Hydrogen peroxide (oxy già)

- Gryseofuvyl

- Methylen Blue

Nấm Saprolegnia phân lập trên trứng cá chép (Cyrinus capio Linnaeus)

Ba loại thảo dược được lựa chọn:

Bảng 3.1 Các thảo dược được lựa chọn nghiên cứu

STT Tên thảo dược Tên khoa học

Lour)

3 Lá cà chua Lycopersicon esculentum Mill

3.3.3 Môi trường nuôi cấy nấm

Sử dụng môi trường tổng hợp bán ngoài thị trường là PDA (Potato 10%Dextrose 51% Agar 39%) để nuôi cấy nấm Đỗ môi trường theo hướng dẫn trên

nhãn, bổ xung thêm kháng sinh (Ampicilin và Streptomycin 0.5g/L mỗi loại), vớipH=7.5.

3.4 Bố trí thí nghiệm nghi ên cứu ảnh hưởng của một số hoá chất l ên sự sinh

trưởng của hệ sợi nấm trong ph òng thí nghiệm

Với mục đích tìm ra một số chất có hiệu quả kìm hãm, tiêu diệt nấm thí nghiệmđược bố trí như sau:

Hình 3.2 Sơ đồ mô tả thí nghiệm ảnh h ưởng của các loại hoá chất đến hệ sợi nấm.

- Môi trưòng PDA

- Nuôi ở nhiệt độ 30oC-Ảnh hưởng của hoá chất,lên sự sinh trưởng của hệsợi nấm

3.5 Tách chiết dịch thô của các loại thảo dược

3.5.1 Cơ sở lựa chọn các thảo d ược.

 Dựa vào một số nghiên cứu về thảo dược trị nấm trên thế giới và ViệtNam

 Dựa vào kinh nghiệm lâu đời của nhân dân trong việc sử dụng thảodược trị bệnh cho người và động vật được ghi chép trong một số t àiliệu như:

+ Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam của GS.TS Đỗ TấtLợi

+ Tính kháng khuẩn của cây thuốc Việt Nam của Nguyễn ĐứcMinh

3.5.2 Phương pháp thu mẫu, chiết rút dịch thô của thảo d ược

Vật liệu:

 Thảo dược: gồm tỏi, nghệ, lá cà chua

 Dung môi: gồm Ethanol và Acetone

Thu mua thảo dược: Thảo dược được thu mua ngoài chợ, được đem rửa sạch

để khô nước để chuẩn bị cho việc chiết rút

Phương pháp chiết rút dược chất:

Dụng cụ chiết rút: Máy xay sinh tố, cối, ch ày sứ, dao, thớt, khăn vải m àn, lọthuỷ tinh, hộp lồng sạch

Các bước tiến hành:

- Các thảo dược cắt nhỏ được xay nát bằng máy xa y sinh tố Sau đóđược giã nhuyễn bằng cối, chày sứ

- Cho dung môi chiết rút theo tỉ lệ 1g thảo d ược : 1ml dung môi

- Để hỗn hợp thảo dược và dung môi ở nhiệt độ phòng, cứ 10 phúttrộn đều một lần để tăng khả năng khuyếch tán của các hoạt chấtvào dung môi, sau 4h vắt lấy dịch chiết

- Loại bỏ dung môi bằng cách cho dịch chiết v ào hộp lồng miệngrộng để dung môi bay h ơi ở nhiệt độ phòng trong 24h

- Dịch chiết được sử dụng ngay sau khi đ ã cho bay hơi hết dungmôi.

3.6 Phương pháp xác đ ịnh tác dụng kháng nấm của các dịch chiết thảo d ược với các dung môi khác nhau

Vật liệu:

 9 loại dịch chiết từ 3 loại thảo dược và các cách chiết (ép trực tiếp

và dùng dung môi chiết rút ethanol, aceton)

 Dung dịch ethanol và aceton còn lại sau khi để bay hơi sau 24hgiống như dịch chiết

 Nấm phân lập từ trứng cá chép Saprolegnia

 Môi trường nuôi cấy: PDA Các bước tiến hành: Thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ sau: