XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP điêu CHế CAO KHÔ và PHÂN lập PUERARIN từ sán dây

Vì vậy nếu có thể nghiên cứu chiết xuất thành công isoflavonoid và puerarin từ rễ củ sẵn dây song song với việc chế tinh bột có thê giúp chủ động về nguồn nguyên liệu isoflavonoid cũng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo TS Nguyễn Văn Hân, là người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn các thầy cô và anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Công nghiệp Dược đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi về mọi mặt trong quá trình nghiên cứu hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin gửi tới Ban giám hiệu, phòng đảo tạo sau đại học, các thầy

cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội lòng biết ơn về sự quan tâm, giúp đỡ

trong thời gian học tập và nghiên cứu tại trường

Cuôi cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên, hỗ trợ tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội, tháng Ø7 năm 2014

Học viên

Phạm Thị Phương Dung

1.3 Cao thuốc eeeseerrrEHHHHHH HH HHHHHgirirrrrrsdee 20

N s5 ha e 20

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP

PIN HA 1T h5 e 23

"4 MwW*: Š.ẽn se 23

PP KH 4.8 .a 23

2.2 Nội dung nghiên CỨU c5 G2 << S3 9.9 9.04 9H 0 00406 044606096 24 2.2.1 Chiết xuất isoflavonoid từ nguyên liệu khô -cecce- 24 2.2.2 Chiết xuất isoflavonoid từ nguyên liệu tươi -© ©ccccccce- 24 "5U, Tra số na 25

VN L l6 0) àa 1 nne 25

2.3 Phương pháp nghiền CứU << << < <5Ă< 26 4366 584.5304.530 5804 5894.589 0460466 25 2.3.1 Phương pháp định lượng isoflavonoid toàn phần và puerarin 25

2.3.2 Phương pháp định tính các isoflavonoid bằng sắc ký lớp mỏng 29

2.3.3 Phương pháp chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây khô - 30

2.3.4 Phương pháp chiết isoflavonoid từ sắn đây tươi 30

2.3.5 Phương pháp tinh chế dịch chiết sắn đây tươi . - 31

2.3.6 Phương pháp điêu chế cao khô 5ccSccccxscsecserreerseee 32 2.3.7 Phương pháp phân lập puerarim và dqidšiH -ec<eceeces 35 2.3.8 Phương pháp xác định cấu trúc puerarin và daidsin - 35

2.3.9 Phương pháp xác định khối lượng cắn trong dịch chiết 35

2.3.10 Phương pháp xác định mắt khối lượng do làm khô - 36

Chương 3 KÉT QUẢ NGHIÊN CỨU -2-©22+222SEE2EE2+E22EE22E2EEEEEcEErrec 37 3.1 Định lượng isoflavonoid toàn phần trong nguyên liệu 37

3.1.1 Đường chuẩn isoflavonoid S- 5c SecceEercrrrereea 37 3.1.2 Định lượng isoflavonoid trong nguyên liệu 38

3.3.1 Khảo sát các dung môi chiẾt -©-scs+cssccscsecsererrrerreccee 40

3.4 Chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây tươi s -s-ec5s<ccsecsssesscsses 45

3.5 Điều chế cao khô từ dịch chiết sắn dây tươi s-ss-s-sscsses 47

“ANH 1516 n 40 SA T50) n 53

3.6.2.1 Tiến hàànhh -+Ss+-S+ES2EE222212211122122122111111122121112212121 1 xe 53

4.2 Về phương pháp bào chế cao khô .-e-s-s<ssssss<ssessssssssssessee 57

KÉT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤTT -2©-22©EE+EE2+E+EE2212712211 211.2111121 si 60

2004000007557 - Ô.Ôô 6l TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AMPK

High-density lipoprotein High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

High Speed Counter Current Chromatography (Sắc ký ngược dòng tốc độ cao)

Interleukin Infrared (Hồng ngoại) Low-density lipoprotein Lipopolysaccharid mammalian Target of Rapamycin (Đích tác dụng trên động vật có vú của RapamycIn) Mitogen-activated-protein-kinase

Nuclear magnetic resonanc (Cộng hưởng từ hạt nhân) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13

Pueraria ølycosid

Relative standard deviation

Tumor necrosis factors (Yếu tố hoại tử khối u) Ultraviolet

(Tử ngoại)

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIÊU Bảng 1.1 Công thức cầu tạo của một số isoflavonoid thường gặp trong sẵn dây 3 Bảng 1.2 So sánh ba phương pháp chiết xuất sắn dây thường dùng 9

Bảng 3.1 Mật độ quang của dãy dung dịch chất đối chiếu tại bước sóng 250 nm .37 Bảng 3.2 Kết quả định lượng isoflavonoid trong nguyên liệu . 39

Bảng 3.4 Hàm lượng puerarin trong nguyên liệu thu mua ở Phú Thọ 40 Bảng 3.5 Kết quả khảo sát các dung môi ethanol có nồng độ khác nhau 41 Bảng 3.6 Kết quả khảo sát chiết isoflavonoid từ sắn dây khô bằng dung môi nước 1 T11 11 110111111 TT TH HT HT Tà HH HT TH TH TH TT TH TH TT TT Tà nh 43

Bảng 3.8 Kết quả chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi -2-©2257xcccsccsec 45 Bảng 3.9 Hiệu suất và hàm lượng cao đặc sau tinh chế (thu được từ 500 ml dịch

Bảng 3.10 Dịch tỉnh chế đem vào phun sấy -. 2-©52©5222S+22£22S22xzzxxz+scee 47 Bảng 3.11 Một số chỉ tiêu chất lượng của cao khô phun sấy - 48

Bảng 3.13 Kết quả đo phổ khối lượng (ESI-MS) của đaiđzin -5- 52 Bảng 3.14 Kết quả đo phô NMR của daidzin 5-552522525222S22xszzssscee 52

Bảng 3.15 Kết quả đo phố hồng ngoại của puerarin -2-©2+©5222++2s++55+2 354 Bảng 3.16 Kết quả đo phố khối lượng (ESI-MS) của puerarin - 354

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐÔ THỊ

20 0N) 0 -‹£‹-ädjăx,,) HH , 2

Hình 2.1 Sơ đồ chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi 2 5¿©2z+cx+2xescse¿ 31

Hình 3.1 Phổ UV-VIS của dung dịch chất đối chiếu -2-5555+555+¿ 37

Hình 3.2 Đường chuẩn biêu thị mối tương quan giữa nồng độ puerarin và mật độ

50 5 38 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ puerarin và diện tích pic

Hình 3.4 Biêu đồ so sánh lượng isoflavonoid chiết được bởi các dung môi ethanol

Hình 3.6 Hình ảnh sắc ký lớp mỏng dưới đèn tử ngoại 254 nm của dịch chiết 49

Hình 3.8 Hình ảnh sắc ký lớp mỏng dưới đèn tử ngoại 254nm của đaidzin 31 Hình 3.9 Công thức cấu tạo của đaiđzin 2©252©2222++2x2E2EEezExsrkerrerrkee 5 Hình 3.10 Hình ảnh sắc ký lớp mỏng dưới đèn tử ngoại 254nm của puerarin 33 Hình 3.11 Công thức cấu tạo của puerarin -¿-s2sz+z++2x+2xxszxezxerrerrseee 35

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sắẵn dây từ lâu đã được sử dụng trong dân gian Theo y học cô truyền, rễ sắn

dây là một vị thuốc mát, có tác dụng giải nhiệt, sinh tân, chống khát, làm ra mô hôi,

dễ tiêu, chỉ tả, chữa các chứng sốt nóng, nhức đầu, mân ngửa, rôm sảy, viêm ruột,

đau đạ dày Gần đây trên thê giới đã có khá nhiều công trình khoa học chứng minh

tác dụng của dịch chiết rễ sắn dây: chữa đau đầu [34] chống oxy hóa [9], [13], giải

rượu [23] Thành phần isoflavonoid trong rễ được cho là chất có tác dụng Trong số các isoflavonoid sẵn dây, puerarin là chất có hàm lượng lớn và được cho là thành phần có tác dụng chủ đạo Hiện nay ở Trung Quốc puerarin đã được chiết xuất và phân lập thành công từ rễ sắn dây phục vụ cho cho việc bào chế các dạng thuốc quy

ước (viên nén, viên nang, thuốc tiêm) đê chữa bệnh

Tại Việt Nam, sẵn dây được trồng khá phổ biến nhưng chủ yếu nhằm chế tỉnh bột Vai trò của sắn dây trong chiết xuất isoflavonoid chưa được quan tâm đầy

đủ Hiện nay, isoflavonoid nguyên liệu và puerarin vẫn phải nhập chủ yêu từ Trung

Quốc với giá thành cao Vì vậy nếu có thể nghiên cứu chiết xuất thành công

isoflavonoid và puerarin từ rễ củ sẵn dây song song với việc chế tinh bột có thê giúp chủ động về nguồn nguyên liệu isoflavonoid cũng như puerarin trong sản xuất và tận dụng được phế phâm của quá trình sản xuất tinh bột sắn

Nhằm góp phần tìm ra phương pháp chiết xuất isoflavonoid từ rễ sắn dây

phù hợp với điều kiện thực tiễn ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Xây dựng phương pháp điều chế cao khô và phân lập puerarin từ sắn dây”

với hai mục tiêu chính sau:

Chương 1 TỎNG QUAN

1.1 Vài nét về cây sắn dây

1IL.I Dặc điểm thực vật và phân bố của cây sắn dây

Sẵắn dây có tên khoa học là Pưeraria thomsomii

Benth., họ Đậu — Fabaceae Một số tài liệu Trung Quốc

ghỉ loài Pueraria lobafta (WIHd) Ohwil hoặc P

pseudohirsufa Tang et Wang [3] Dược điển Trung Quốc

ghi nhận cả hai loài Pueraria lobata và Pueraria

thomsonii [32] Sắẵn dây là một loại dây leo, dài có thê đến 10m, lá I

hai bên ngắn Lá chét có thể phân thành 2-3 thùy Về mùa

hạ trổ hoa màu xanh tím, mọc thành chùm ở kẽ lá Quả loại đậu có nhiều lông Củ đài to nặng có thể tới 20kg, nhiều xơ

Muốn trồng người ta đào các hỗ sâu 50cm, đồ rác và mùn rồi lấp đất xóp lại Đến tháng 1-2 giâm cành vào các hỗ đó Nhiều nơi ở nước ta thường kết hợp làm giàn lấy bóng mát Cũng có những vùng chuyên trồng để chế tinh bột ví dụ làng Cao Xá thuộc huyện Châu Thành, tỉnh Tây Ninh mỗi năm sản xuất khoảng 20 tấn tĩnh bột [3]

Rễ củ thu hoạch từ tháng 10 đến tháng 3-4 năm sau Ở Trung Quốc, người ta thường thu hoạch sắn dây vào mùa thu và mùa đông [32] Đề chế vị Cát Căn thì rửa

sạch, bóc bỏ lớp vỏ dày bên ngoài, cắt thành khúc dài 10-15 cm Nếu củ to thì bổ

dọc đê có những thanh dày khoảng Icm, sau đó xông diêm sinh rồi phơi hoặc sấy

khô Loại trắng ít xơ là loại tốt Muốn chế tỉnh bột sắn dây thì bóc vỏ, đem giã nhỏ

hoặc mài trên tắm sắt tây có đục thủng lỗ, hoặc xay bằng máy, cho thêm nước rồi nhào lọc qua rây thưa, loại bã, sau đó lọc lại 1 lần nữa qua rây dày hơn, để lắng gạn

lây tinh bột rồi đem phơi hoặc sây khô [3]

112 Thành phần hóa học của rỄ củ sẵn dây

Rễ củ các loài Pueraria đều chứa tinh bột, tỷ lệ khoảng 12-15% theo tươi [3] đến 40% theo khô [4] Ngoài ra còn có saponin [4], [20] và các flavonoid thuộc

nhóm isoflavonoid Từ loài Pueraria lobafa người ta đã phân lập được các 1soflavonoid sau: puerarin (l), daidzin (2), daidzein (3), formonetin (4) Năm 1987 các nhà nghiên cứu Nhật đã phát hiện thêm 13 chất mới, trong đó có genistein và các glycosid của daidzein, genistein [20] Các nghiên cứu sau này đều chỉ ra rằng puerarin, daidzin, daidzein, genistein và genistin là các isoflavonoid chiếm tỷ lệ lớn

trong rễ củ các loài sẵn dây, và cho các tác dụng sinh học đáng chú ý [46], [11],

Pueraria [44] Trong đó Pueraria lobafa là loài có hàm lượng flavones cao nhất và

có nhiều flavones được phân lập nhất (36 chất) [44]

Hàm lượng isoflavone trong rễ củ sẵn dây phụ thuộc nhiều vào loài, vùng trồng trọt [44] và thời gian thu hái [11] Hàm lượng flavone trung bình ở loài Pueraria lobafa là 7,125 trong khi hàm lượng flavone trung bình ở loài Pueraria

thomsornii chỉ có 0,93% [44] Hàm lượng flavone ở loài Pueraria lobata trồng tại

Shanxi lên tới 10,4% trong khi hàm lượng này khi trồng tại Jiangxi chỉ đạt 3,3% [44] Tuôi và thời gian thu hái cũng là yêu tổ ảnh hưởng đáng kê tới hàm lượng isoflavone của loài Pueraria lobafa trồng tại Huoshan Rễ củ 3 năm tuôi thu hái vào khoảng tháng Giêng sẽ cho nồng độ isoflavone cao nhất, đạt 7,26% Tuổi cao hơn

hoặc thời gian thu hái trước tháng Giêng đều làm giảm nồng độ isoflavone của sẵn đây [11]

Tiêm tĩnh mạch với liều 5-30 mg trên chó, mèo có tác dụng hạ huyết áp Cao

sẵn dây với liều 750 mg/kg tiêm tĩnh mạch có khả năng đối kháng với tác dụng kích

thích tim của isoprenalin, ngoài ra còn làm giảm nhịp tim và gây hạ huyết áp [8] 1.1.3.3 Tác dụng chống loạn nhịp tìm

So sánh tác dụng chống loạn nhịp tim của puerarin, daidzein và dạng chiết cồn từ sắn dây trên chuột cống trắng và chuột nhắt trắng cho thấy tác dụng của daidzein tương đối mạnh, cho hiệu quả rõ rệt Dạng chiết cồn có tác dụng giống với daidzein; điều này chứng tỏ daidzein là thành phần chủ yêu có tác dụng chống loạn nhịp tim Puerarin với liều tương đương có tác dụng kháng rõ rệt với loạn nhịp tim

do aconitin và bari clorid gây nên, giảm nhẹ mức độ loạn nhịp do thiếu máu cơ tim, tác dụng đối kháng với rung thất không bằng daidzein [8]

1.1.3.4 Tác dụng đối với tuần hoàn não

Thử nghiệm trên chó gây mê, flavon toàn phần của sắn dây bằng đường tiêm động mạch cảnh với liều 0,1-5.0 mg/kg làm lưu lượng máu qua não tăng §7,7- 134%, nêu cho thuốc bằng đường tiêm tĩnh mạch flavon toàn phần với liều 10-30 mg/kg chỉ làm lưu lượng máu qua não tăng 20% Trên bệnh nhân cao huyết áp,

flavon toàn phần tiêm bắp với liều 200 mg giúp cái thiện tuần hoàn não cho 53%

bệnh nhân, làm giảm trợ lực mạch máu não [8]

1.1.3.5 Tác dụng đối với hệ thần kinh

Dịch chiết sẵn dây với liều 2 ø/kg cho thẳng vào đạ dày trên thỏ gây sốt bằng

vaccin thương hàn có tác dụng hạ nhiệt, bột sắn dây có tác dụng tương tự Nước sắn

dây với liều 6 g/kg cho thăng vào đạ dày trên chuột nhắt trắng, có tác dụng cải thiện hiện tượng trí nhớ bị tôn thương do scopolamin gây nên [8]

1.1.3.6 Tác dụng đôi với cơ trơn

Trong các dịch chiết bằng aceton, methanol và nước từ sẵn dây thì dạng PA3, PA4 có tác dụng ức chế co bóp hồi tràng cô lập chuột lang kiểu papaverin, dạng PMI, PM3 lại có tác dụng gây co thắt Daidzein có tác dụng giải co thắt đối với ruột non đã cô lập của chuột nhất trắng, tác dụng này bằng khoảng 1/3 tác dụng của papaverin [8]

1.1.3.7 Tác dung hạ đường huyết và lipid huyết

Nước sắc sắn dây với liều 6-§ g/kg cho thăng vào dạ dày thỏ bình thường có tác dụng hạ đường huyết nhưng không thê đối kháng với hiện tượng đường huyết tăng cao do adrenalin gây nên Puerain với liều 500 mg/kg hoặc dùng liều thấp phối hợp với aspirin 100 mg/kg dùng liên tục trong 9 ngày qua đường dạ dày, có tác dụng làm giảm cholesterol huyết thanh của chuột nhất trắng đã được gây tăng cholesterol bằng alloxan Aspirin dùng đơn độc không có tác dụng hạ đường huyết

hay lipid huyết [8]

1.1.3.8 Tác dụng chống ung thư

Dịch chiết cồn từ sẵn dây với liều 10 g/kg trên động vật thí nghiệm có tác

dụng ức chế nhất định sự phát triển của tế bào sarcom 180, u báng Ehrlich và tế bào

ung thư phổi Lewis Daidzein với nồng độ I4ug/ml có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư máu HL-60 (promyeloeytic leukemia) [§]

1.1.3.9 Tác dụng chống oxy hóa

Thí nghiệm trên chuột gây tiểu đường bằng cách tiêm phúc mạc strep(tozotocin Thí nghiệm sử dụng cao sắn dây chứa khoảng 10,42% puerarin và một vài chất liên quan, với liều 500 mpg/kg, dùng đường uống trong 3 tuần, kết quả

cho thấy nồng độ malondialdehyd trong huyết tương-được sử dụng như một dấu

hiệu của chất béo bị oxy hóa, đã giảm xuống mức tương tự như ở chuột khỏe mạnh,

và giống như trong nhóm được điều trị tích cực hàng ngày bằng tocopherol acetat

với liều 50 mg/kg [8],[9]

1.1.3.10 Các tác dụng khác:

Dung dịch puerarin 0,2-1,6% với liều 0,2 ml tiêm dưới da chuột lang theo dõi phản ứng giác mạc và da cho thấy tác dụng gây mê cục bộ Thí nghiệm trên chuột hamster, cao sắn dây có tác dụng chống nghiện rượu, trên chuột công trắng, daidzein có tác dụng hạ thấp lượng rượu trong máu và rút ngắn thời gian ngủ do rượu gây nên Đối với gan của chuột nhắt trắng gây nhiễm độc bằng CCI¿,

isoflavonoid chiết từ cát căn với liều 250 mg/kg có tác dụng ức chế 30,7% hoạt độ men GƠT [8]

Nghiên cứu của Đỗ Thị Hoa Viên đã chứng minh rằng cao chiết isoflavonoid

từ củ sắn dây Pưeraria thomsonii Benth có hoạt tính nội tiết kiểu estrogen trên 51,5% chuột nhắt trắng cái với liều uống 150 mg/con/ngày Điều này cho thấy hoạt

tính estrogen của hỗn hợp 1soflavonoid chiết xuất từ củ sắn dây là khá rõ rệt [7]

1.1.4 Công dụng

Theo y học cô truyền, cát căn là một vị thuốc chữa sốt nhức đầu, khát nước,

kiết ly, ban sởi Cát căn đã được phi vào dược điên Việt Nam Tinh bột sẵn dây pha

với nước thêm đường uống để giải khát [3] Ngoài ra trong y học cô truyền còn dùng hoa của dây sắn dây với tên “Cát hoa” để làm thuốc giã rượu [3]

Theo Dược điền Trung Quốc, sắn dây có tác dụng hạ sốt, kích thích tiết dịch

cơ thể, cầm ia chảy Do vậy, sắn dây được sử dụng để điều trị sốt, đau đầu, khát nước, tiêu đường, ban sởi, kiết ly hoặc ia chảy cấp, cứng gáy và đau trong tăng

huyết áp [32]

1.1.5 Các nghiên cứu chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây

Mặc dù với sự phát triển của khoa học kỹ thuật hiện đại đã có rất nhiều

phương pháp chiết hiệu quả được đưa vào ứng dụng nhưng chiết xuất theo kiêu

truyền thống vẫn được nghĩ đến đầu tiên khi nghiên cứu về các dược liệu mới Chỉ có hiểu rõ đặc điểm chiết các dược liệu này theo phương pháp hồi lưu đơn giản mới có thể áp dụng các biện pháp cải tiến để nâng cao hiệu suất cũng như chất lượng sản phẩm chiết Cũng vì thế, trong rất nhiều nghiên cứu chiết sẵn dây

đã được thực hiện trên thế giới, phương pháp chiết hồi lưu vẫn được các nhà khoa

học quan tâm thực hiện Mục tiêu của các nghiên cứu này hầu hết là đề tìm ra được loại dung môi, nhiệt độ, thời gian tối ưu cho việc chiết isoflavonoid từ

sẵn dây

Ngay từ năm 1998, L¡ Wehong và cộng sự đã xác định được giữa hai dung

môi nước và cồn, dung môi cồn cho hiệu suất chiết cao hơn và dễ tinh chế sản phâm hơn Cũng từ đó, nhóm nguyên cứu đã tìm ra được điều kiện chiết xuất tối

ưu cho sắn dây là chiết bằng ethanol 60% trong 6 giờ ở 60°C [25]

Đến năm 2007, Han lian và cộng sự vẫn tiếp tục nghiên cứu chiết

isoflavonoid từ sẵn dây bằng phương pháp truyền thống nhưng sử dụng dung môi chiết là nước Mặc dù không phải là một dung môi được đánh giá cao trong nhiều nghiên cứu song nếu tiến hành theo phương pháp của Han Jian vẫn có thể chiết được lượng lớn puerarin từ sắn dây Chiết nước ở điều kiện tối ưu là chiết 2 lần,

mỗi lần với 10 lần thê tích nước, thời gian chiết lần lượt là 1,5 giờ và 1 giờ [14]

Đề nâng cao hiệu suất chiết người ta đã tiến hành thay đôi dung môi chiết,

sử dụng hệ dung môi thay vì các dung môi đơn thông thường Đáng kê đến là chuỗi nghiên cứu của Hua-Neng Xu và cộng sự Đầu tiên, nhóm nghiên cứu đã tìm ra hệ dung môi hai pha n-butanol/nước ty lệ 1:1 (v/v) không những dùng được cho quá trình chiết rắn — lỏng và tỉnh chế lỏng-lỏng mà còn giúp chiết được daidzein và isoflavonoid toàn phân với hiệu suất cao hơn nhiều so với dung môi

chiết một pha thông thường [15] Với hệ dung môi hai pha như trên, daidzein dễ

đàng được tách và tính chế từ pha n-butanol [15] Puerarin được tính chế từ phần

pha nước bằng cách điều chỉnh pH và lắc với n-butanol Quá trình tinh chế tương

đối đơn giản nhưng lại cho ra sản phâm tinh chế sạch khi phân tích sắc ký [16]

Với những kết quả thu được, các tác giả đã tiễn hành tiếp những đánh giá toàn diện hơn về các yêu tô có thê ảnh hưởng đên quá trình chiết isoflavonoid từ sẵn

dây bằng hệ dung môi hai pha n-butanol/nước Cuối cùng, rút ra những kết luận như sau: thành phần của hệ dung môi hai pha và nhiệt độ chiết là những yếu tố chính ảnh hưởng tới tốc độ và hiệu suất chiết isoflavonoid toàn phần; hệ dung

môi n-butanol/nước với tỷ lệ 1:1 là có hiệu quả hơn cả; hiệu suất chiết và hệ số

phân bố tăng lên ở tất cả các hệ dung môi đã khảo sát khi tăng nhiệt độ; những

kết quả tính toán được từ mô hình là hoàn toàn phù hợp với dữ liệu thực nghiệm

[171

Tại Việt Nam, năm 2009 Dược sĩ Lê Thùy Linh đã nghiên cứu chiết

isoflavonoid từ sắn dây bằng dung môi phân cực theo phương pháp chiết hồi lưu Khảo sát ba dung môi chiết là ethanol 90°, methanol và ethyl acetat Dựa vào tỷ

lệ phần trăm hàm lượng cắn thu được và kết quả định tính isoflavonoid trong dịch

chiết tác giả chọn ethanol 90° là dung môi sử dụng để chiết isoflavonoid từ sắn dây [5]

1.1.5.2 Chiết dưới áp suất cao

So với phương pháp chiết hồi lưu, chiết dưới áp suất cao cho hiệu suất chiết cao hơn hắn Khi sử dụng cùng dung môi chiết là ethanol 95%, chiết dưới

áp suất cao giúp chiết được lượng puerarin cao gấp 1,8 - 2,4 lần, lượng daidzin cao gấp 1,4 — 1,8 lần và lượng daidzein cao gấp 2,6 — 3,7 lần so với phương pháp

hồi lưu [31]

Người ta cũng nhận thấy rằng, hiệu suất chiết isoflavonoid phụ thuộc vào

nhiệt độ chiết khi chiết dưới áp suất cao Hiệu suất chiết tăng khi tăng nhiệt độ

[31]

1.1.5.3 Chiết bằng siêu âm

Khi so sánh phương pháp chiết bằng siêu âm với phương pháp chiết truyền thống, Yang Hu và cộng sự nhận thấy rằng sử dụng siêu âm có thê rút ngắn thời gian chiết xuống 20 lần so với phương pháp chiết hồi lưu Hiệu suất chiết của phương pháp chiết bằng siêu âm đạt 19% sau 20 phút, trong khi hiệu suất chiết của phương pháp chiết hồi lưu chỉ đạt được 14,3% và 16,5% sau 1 và 2 giờ Chiết bằng siêu âm đạt được hiệu suất này sau 5 phút Mặt khác, siêu âm không làm phân hủy tới các thành phần hoạt chất có trong dịch chiết [45]

Cũng trong nghiên cứu này, Yang Hu và cộng sự đã chứng minh rằng,

hiệu suất chiết khi sử dụng siêu âm bị ảnh hưởng bởi dung môi chiết [45], tỷ lệ

dung môi và năng lượng siêu âm [31] Trong các dung môi chiết: nước, methanol, ethanol và ethyl acetat người ta nhận thấy dung môi chiết tối ưu là ethanol : nước tỷ lệ 7:3 Mặc dù nước là dung môi chiết cho hiệu suất cao nhưng lại hòa tan nhiều tinh bột trong dịch chiết gây khó khăn cho quá trình lọc, dịch

chiết thu được không trong và cao dẻo dính khó thu hồi [45]

Không chỉ có hiệu quả hơn phương pháp chiết hồi lưu truyền thống, Mei- Hwa và cộng sự còn chứng minh được rằng, chiết bằng siêu âm còn cho hiệu suất chiết cao hơn phương pháp chiết dưới áp suất cao [31] Dưới đây là bảng so sánh

ba phương pháp chiết hồi lưu truyền thống, áp suất cao và siêu âm:

Bảng 1.2 So sánh ba phương pháp chiết xuất sắn dây thường dùng

Năm 2007, Xu Huaneng và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu chiết

isoflavonoid từ rễ Pweraria lobafa bằng siêu âm (20kHz, điện năng đầu vào thay

đôi từ 0-650W) Tác giả nhận thấy điện năng đầu vào và thời gian chiết là các yêu tố chính ảnh hưởng tới hiệu suất chiết khi sử dụng dung môi chiết là nước, n-

butanol, ethanol 96% và ethanol 50% Dung môi chiết là ethanol 50% và nước

cho hiệu suất chiết cao ethanol 95% và n-butanol Tốc độ chiết và hiệu suất chiết

tăng lên rõ rệt khi phối hợp thêm siêu âm với tất cả các dung môi chiết kể trên Năng lượng điện đầu vào càng lớn trong khoảng 0-650W thì hiệu suất chiết đạt

được càng cao Đồng thời, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng hiệu suất chiết

1sofÏavonoid toàn phần cao hơn khi sử dụng siêu âm [41]

1.1.5.4 Chiết bằng vi sóng

Năm 2001, Zhenku €uo và cộng sự đã tiễn hành chiết isoflavonoid từ sắn

dây bằng vi sóng Kết quả gây bất ngờ khi thời gian chiết của phương pháp chỉ kéo dài 1 phút, ngắn hơn rất nhiều so với các phương pháp chiết truyền thống Nhóm nghiên cứu cũng nhận thấy rằng dung môi chiết, thời gian chiết, nhiệt độ

và áp suất chiết là những yếu tổ ảnh hưởng đáng kế tới hiệu suất chiết của phương pháp Trong số các dung môi thử nghiệm, ethanol 70% cho là dung môi hiệu suất chiết isoflavonoid cao nhất, song đề chiết puerarin thì nước lại là dung

môi tốt hơn [47]

Vi sóng không chỉ giúp rút ngắn thời gian chiết mà còn làm cho quá trình cô

cao trở nên nhanh chóng hơn rất nhiều Yang Hu và cộng sự đã chứng minh được

rằng, sử dụng vi sóng có thê rút ngắn thời gian sấy khô dịch chiết xuống 10 lần

so với phương pháp cất thu hồi dung môi thông thường [45] Hơn nữa, sóng viba không gây ra những tác động nào làm ảnh hưởng tới cấu trúc và thành phần các

chất trong dịch chiết sắn đây thu được [45]

1.1.5.5 Chiết bằng dung môi siêu tới hạn

Trong những năm gần đây chiết xuất bằng dung môi tới hạn đã được áp dụng

rộng rãi trong thực phâm và y học CO siêu tới hạn là dung môi chủ yếu được sử

dụng trong phương pháp này Ưu điểm của CO; siêu tới hạn là không độc, không gây cháy nô, giá thành rẻ và đễ loại khỏi sản phẩm cuối

Nghiên cứu chiết puerarin từ rễ củ sắn dây Peraria lobara, Lingzhao Wang

và cộng sự nhận thấy bốn yếu tô chính ảnh hưởng tới hiệu suất chiết puerarin từ

tễ củ Pueraria lobara là áp suất, nhiệt độ, thời gian chiết và thể tích đồng dung

môi Ở áp suất 20 Mpa hiệu suất chiết đạt được là 5,8 + 0,3 mg/ø, áp suất cao hơn

và thấp hơn đều làm giảm hiệu suất chiết puerarin Tương tự như vậy, chiết ở

nhiệt độ 50°C sẽ cho hiệu suất chiết cao nhất, nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn đều

làm giảm hiệu suất Thời gian chiết càng lớn, khả năng chiết kiệt puerarin càng cao, đặc biệt là trong khoảng thời gian dưới 100 phút Hiệu suất chiết puerarin

tăng lên không rõ rệt khi kéo dài thời gian hơn 100 phút Điều này có thê giải

thích do độ tan của puerarin trong dung môi tới hạn và tốc độ chuyên khối đều là các yếu tốt phụ thuộc vào thời gian Do vậy, thời gian chiết xuất càng lớn sẽ giúp

hòa tan được nhiều dược chất vào dung môi chiết hơn, và do đó tăng hiệu suất

chiết lên Đồng dung môi được sử dụng là ethanol tuyệt đối Người ta thấy rằng

hiệu suất chiết puerarin sẽ đạt giá trị tối đa khi thêm một lượng xác định ethanol

(120 g) [26]

Từ những kết quả kề trên, các tác giả đã thực hiện tối ưu hóa và tìm được

điều kiện chiết puerarin tối ưu từ rễ củ P„eraria lobafa bằng dung môi siêu tới

hạn ở 20,04 Mpa, 50,24°C và thể tích đồng dung môi sử dụng là 181,24 ml

ethanol trong tổng khoảng thời gian chiết là 90 phút [27]

1.1.5.6 Chiết bằng dung môi ion

Dung môi ion lỏng là dạng muối nóng chảy do trong thành của nó có cả cation và anion ở dạng không phân ly Phần cation thường là các cation hữu cơ [381]

Dung môi ion lỏng có nhiệt độ nóng chảy khá thấp, thường là dưới 100°C và thường ở dạng lỏng ở nhiệt độ phòng [38]

Trong chiết xuất hiện đại, dung môi ion lỏng được sử dụng thay thế cho các dung môi hữu cơ thông thường nhờ tính chọn lọc cao hơn các dung môi phân cực như nước, methanol; chiết được các phân tử hữu cơ phức tạp như cyclodextrins, glycolipid, kháng sinh, artermisinin và alkaloid .: dễ dàng rửa sạch hoặc loại đi

khỏi sản phâm chiết cuối [38]

Tuy nhiên, dung môi ion lỏng có nhược điểm là trong quá trình chiết xuất, một lượng lớn dung môi ion lỏng ky nước có thể bị lẫn nước tạo thành hệ hai pha dung môi ion/nước làm thay đổi độ nhớt, tỷ trọng, giảm dung lượng chiết và tính chọn lọc của dung môi trong quá trình chiết [18], [ 38] Đề hạn chế nhược điểm này, Jie-Ping Pan và cộng sự đã tạo ra các hệ dung môi hai pha thân nước đề chiết puerarin từ rễ Pweraria lobafae từ các dung môi ion 1-carboxymethyl-3-

methylimdazioliun tertrafluoroborat ([CaOHMIM| BE¿), 1-butyl-3-

methylimidazolium hydroxid ({BMIM]OH) và 1-butyl-3-methylimidazolium

bromua ([BMIM]Br) với các muối vô cơ KạCOa, Na;COa, K;HPO,, (NH/);SO¿, Na;SO¿, NaCL, NaH;POx Trong các hệ hai pha dung môi lon khảo sát, hệ K;HPO¿ 0,30-0,42 g/mL, [BMIM|Br 0,30-0,36 g/ml và 1,0 mÏl dung dịch gốc puerarin, cho hiệu suất chiết puerarin cao nhất đạt trên hơn 99% với một lần chiết

duy nhất [18]

Lợi dụng ưu điểm của phương pháp chiết bằng siêu âm và phương pháp chiết bằng dung môi ion, Jie-Ping Pan và cộng sự tiếp tục nghiên cứu chiết puerarin từ rễ củ sấy khô Pweraria lobata với các dung môi ion [BMIMI]Br, [BMIMJ|BE¿, [CạOHMIMICI, [C:OHMIM]BE¿, [COOHMIM]|BE¿ kèm siêu âm

Sử dụng phương pháp phân tích mặt đáp để đánh giá các yêu tô ảnh hưởng tới hiệu suất chiết puerarin và tối ưu hóa các điều kiện chiết xuất Kết quả chiết xuất tối ưu thu được với 0,43g dược liệu trong 10ml dung môi ion [BMIM]Br 1,06 mol/L, siêu âm trong 27,43 phút ở 480W [19]

1.2 Puerarin

1.2.1 Công thức hóa học

—_ Công thức phân tứ [33]: C›¡H›soÖÒo

—_ Tên khoa học: 7-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-8-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3,4,

1.2.2.1 Lý tính: Puerarin là một isoflavonoid tự nhiên, được tìm thấy trong rễ sẵn dây Pueraria lobata và Pueraria thomsonii Về độ tan, puerarin:

[39]

lượng nhỏ dung dịch CO; siêu tới hạn vào dung dịch ethanol sẽ làm tăng

độ tan của puerarm Song khi vượt qua giới hạn này, việc thêm CO; siêu

tới hạn lại làm độ tan của puerarin giảm mạnh [28] Độ tan của puerarin trong hỗn hợp ethanol + CO: siêu tới hạn tăng lên khi tăng nhiệt độ [28]

—_ Tan được trong hỗn hợp methanol — acid acetic, độ tan phụ thuộc vào

nhiệt độ và tỷ lệ của acid acetic trong hỗn hợp Tăng nhiệt độ làm tăng độ tan, ngược lại tăng thê tích acid acetic trong hỗn hợp làm giảm độ tan của puerarin trong hỗn hợp dung môi [ 12]

(=C=O) và 6 nhóm hydroxyl (—OH) trong đó có 2 nhóm hydroxyl phenol nên puerarin có thể

— Tạo liên kết hydro với các hợp chất có nhóm carbonyl và hydroxyl khác

— _ Thể hiện tính acid của 2 nhóm —OH phenol

Vì vậy, puerarIn có thê tan trong các dung dịch kiềm và acid mạnh [18]

1.2.3 Kỹ thuật phân tích

Năm 2007, để xác định hàm lượng isoflavonoid toàn phần trong rễ củ sẵn dây nhanh chóng, chính xác Chen Sibao và cộng sự đã tiến hành đánh giá và so sánh độ chính xác của phương pháp đo UV với phương pháp HPLC Quét phổ dung dịch chuẩn của 7 loại isoflavonoid thường gặp và chiếm hàm lượng lớn trong rễ sẵn dây, các tác giả nhận thấy rằng chỉ trừ genistin có cực đại hấp thụ ở 260nm còn 6

isoflavonoid còn lại đều có cực đại hấp thụ tại 250nm Nông độ isoflavonoid toàn

phần trong dịch chiết rễ củ sắn dây tươi được định lượng theo phương pháp đo UV bằng cách so sánh với mật độ quang của dãy dung dịch chuẩn puerarin có nồng độ

từ 4/77 — 12,72ug/ml Kết quả cho thấy, hệ số tương quan khi định lượng

isoflavonoid toàn phần bằng phương pháp đo quang với khi định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao là 0,975 Điều này chứng tỏ, kết quả định lượng isoflavonoid toàn phần bằng phương pháp đo quang ở 250nm là tương quan với kết quả khi định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [11]

Cùng thời gian này, Xu Huaneng và cộng sự cũng sử dụng phương pháp đo quang ở 250nm đề định lượng hàm lượng isoflavonoid toàn phần trong dịch chiết rễ

củ sẵn dây nhờ tác dụng của siêu âm Hàm lượng isoflavonoid trong mẫu thử được ngoại suy từ đường chuẩn của dung dịch puerarin [41]

Năm 2008, trong nghiên cứu so sánh khả năng chiết isoflavonoid từ sẵn dây bằng cách sử dụng siêu âm và bằng cách dùng vi sóng Yang Hu và cộng sự cũng sử dụng phương pháp đo quang ở 250nm để định lượng isoflavonoid trong các dịch chiết thu được Dịch chiết isoflavonoid toàn phần được pha loãng đến nồng độ thích hợp rồi đo quang ở 250nm Nông độ isoflavonoid trong mẫu thử được tính toán từ đường chuẩn puerarin [45]

Như vậy, để định lượng isoflavonoid toàn phần từ dịch chiết hoặc trong

nguyên liệu có thê sử dụng phương pháp đo quang ở 250nm, so sánh với đường chuân của dung dịch puerarin Kết quả định lượng bằng phương pháp này có độ chính xác cao, phương pháp tiên hành nhanh chóng đơn giản

Đề định lượng riêng từng hoạt chất hoặc đánh giá kết quả của quá trình tinh chế, phương pháp UV không còn có thê sử dụng được, lúc này HPLC là phương pháp thích hợp hơn cả

Năm 2001 Chen Bin và cộng sự đã tiễn hành nghiên cứu xây dựng hương pháp HPLC đơn giản, nhanh chóng và có độ nhạy cao dùng đề định lượng puerarin

và daidzin trong Pueraria lobaia Isoflavonoid toàn phần chiết được từ P.lobata bằng ethanol 70%, vi sóng trong 2 phút Phân lập bằng cột Symmetry 18 Thời gian lưu của puerarin và daidzin là 4,38 phút và 8,15 phút Đường chuẩn trong khoảng 0,115 ~ 1,38ug/ml có R=0,9991 đối với puerarin và trong khoảng 0,12 ~ 1,44 ug/ml

có R=0,9998 đối với daidzin Phần trăm tìm lại trung bình khoảng 103,31% với hệ

số phân tán CV=1,37% puerarin và 98,73% với CV=2,43% daidzin [10]

Đề tách và định lượng puerarin, daidzin và daidzein trong thân và lá của Pueraria thomsonii, Zhou Hong-Ying và cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc ký pha đảo RP-HPLC với cột Diamosil TM C18 (4,6 mm x 150 mm, 5um) và gradient rửa giải, pha động là methanol - 1% dung dịch acid acetic băng Tốc độ dòng

Iml/phút Bước sóng phát hiện ở 250nm, nhiệt độ cột 25°C Các tác giả nhận thấy

rằng cả ba hợp chất đều có đường chuẩn với hệ số tương quan tốt (r > 0.9995) và

phần trăm tìm lại trong khoảng 99,0% - 101,6% Hàm lượng puerarin, daidzin và

daidzein trong thân cao hơn trong lá Nghiên cứu đã chứng minh được rằng phương pháp sắc ký pha đảo xây dựng được có độ nhạy cao và có thê sử dụng để sử dụng đề định lượng puerarin, daidzin và daidzein trong thân và lá của Pueraria thomsonii [48]

Năm 2008, Man Chen và cộng sự đã xây dựng được phương pháp HPLC khá đơn giản và chính xác đề xác định hàm lượng puerarin trong rễ Pueraria lobata Sử dụng cột sắc ký C18, pha động là methanol/nước (25:75), detector UV ở bước sóng 250nm Kết quả cho thấy mối quan hệ tương quan chặt chẽ giữa nồng độ puerarin

và mật độ quang trong khoảng 20 ~ 140ug/ml (r=0,9999) Phần trăm tìm lại là 97,40%, RSD = 3,0% [29]

1.2.4 Tác dụng sinh học của puerarin

1.2.4.1 Tác dụng trên tìm mạch

Gần đây có rất nhiều báo cáo đã xác minh tác dụng giãn mạch của puerarin trên

chuột Tác dụng giãn mạch của puerarm trên động mạch chủ ngực của chuột do

hoạt hóa điện áp dẫn lớn và kênh kali canxi kích hoạt đóng vai trò quan trọng trong

điều hòa nhịp tim Hoạt động của kênh kali canxi kích hoạt gây ra hiện tượng ưu

phân cực trên màng tế bào

Tác dụng thư giãn nội mạc nguyên vẹn của vòng động mạch chủ ở chuột đã bị

làm hẹp trước đó bởi phenylephrine (10 — 10) hoặc KCI (10 — 100 mM) của

puerarin (50, 150 và 450uM) không phụ thuộc vào nồng độ Tuy nhiên, tác dụng thư giãn này không quan sát thấy ở vòng động mạch chủ của chuột đã bị loại bỏ lớp

nội mạc, điều này chỉ ra rằng tác dụng giãn mạch của puerarin phụ thuộc vào hoạt động của lớp nội mạc Ngoài ra, tác dụng chống co mạch của puerarin đối với

phenylephrine hoàn toàn bị vô hiệu hóa bởi dung dịch Ca”” tự do Điều này có nghĩa

là tác dụng chống co mạch của puerarin liên quan đến việc kích hoạt dòng Ca” từ

ngoại bảo đi vào nội mô [43]

Puerarin bảo vệ tim mạch qua kênh natri và calci dạng L ở chuột lang và tế bào

cơ tâm thất ở chuột Tác dụng bảo vệ tim mạch của puerarin chống lại các tổn thương do thiếu máu cục bộ và tái tưới máu ở tế bào cơ tâm thất ,¡m/thông qua

việc hoạt hóa các kênh kali nhạy cảm ATP ở tỉ thể và ức chế việc mở kênh vận

chuyên trên màng ti thể Ở tim chuột cô lập đã được sử dụng puerarin (0,24

mmol/L) trước khi gây thiểu máu cục bộ, việc sản xuất formazan được tăng cường

và giảm giải phóng lactat dehydrogenase Tuy nhiên tác dụng này bị mắt khi điều trị

paxilline 1hmol/L (tác nhần block kênh kali canxi hoạt hóa) [43]

Puerarin có thể làm phục hồi sự biểu hiện mRNA của yếu tổ tăng trưởng biến

đổi tìm B1 và SMAD3 đồng thời giảm sự biểu hiện mRNA ở SMAD? tim trên

chuột tăng huyết áp tự phát Các SMAD là các protein nội bào vận chuyên tín hiệu

từ yếu tô tăng trưởng biến đổi B trong tế bào, SMAD3 là loại SMAD kiêu receptor

còn SMAD7 là SMAD đối kháng Các thay đôi biểu hiện gen này sẽ giúp cải thiện

phì đại và xơ hóa cơ tim, đó có thể là cơ chế bảo vệ cơ tim của puerarin [43]

1.2.4.2 Giảm đau, hạ sốt

Tiêm màng bụng cho chuột dung dịch puerarin (25-200HM) làm giảm nhiệt độ

cơ thể và nông độ IL-1P, TNE-œ IL-6, prostaglandin E¿ và NO, và chặn sự hoạt hóa

NFE-kB và sự phosphoryl hóa MAPKs gây ra bởi LPS 100 hg/kg) ở chuột, chứng tỏ rằng tác dụng hạ sốt của puerarin liên quan tới việc điều chỉnh hoạt động tổng hợp

và giải phóng các chất gây sốt nội sinh thông qua ức chế hoạt động của NF-kB và con đường MAPK [43]

Đặc tính chống viêm của puerarin đã được xác minh trên mô hình tai chuột phù

và một vài mô hình tế bào viêm Puerarin tác dụng không phụ thuộc liều ngăn chặn quá trình phosphoryl hóa và giáng hóa của inhibitor-B và chuyển vị của hạt nhân NF-B p6Š subunit, làm ngăn cản quá trình biểu hiện protein và mRNA của protein phản ứng C với LPS kích thích tế bảo máu đơn nhân ngoại biên Puerarin ngăn chặn

sự biêu hiện của protein phản ứng C, ¡NOS, và cyclooxygenase-2, ức chế đường tín

hiệu NF-kB ở tế bào RAW2641,7 có LPS hoạt động và ngăn chặn rõ rệt sự biến đôi

hình thái của lipopolysaccharid ở tế bào RAW264,7 Ngoài ra, sự biểu hiện mRNA

ở NF-kB p65 trong tế bào và nồng độ đại thực bào protein viêm 2 và TNF-œ trong

tế bào nôi đã bị ức chế bởi việc sử dụng puerarin trước đó [43]

Puerarin thu dọn cả các anion superoxid tạo ra bởi ánh sánh riboflavin và gốc hydroxyl sinh ra từ phản ứng Fenton, làm giảm phản ứng oxi hóa tán huyết hồng cầu và nồng độ malondialdehyd tạo ra từ HO; trong tế bào hồng cầu, sửa chữa những biến đổi trên LDL gây ra bởi tia cực tím và đồng II sulfat, cho thấy tác dụng chống peroxy hóa và tiềm năng sử dụng để phòng ngừa vữa xơ động mạch của puerarin Puerarin ngăn cân quá trình oxi hóa LDL gây ra bởi ion Cu” trên invitro, tăng sản xuất prostacyclin huyết tương và HDL, ức chế kết tụ và bám dính tiêu cầu, ngăn chặn quá trình hình thành cục nghẽn Ngoài ra puerarin còn có tác dụng làm giảm sản xuất LDL và cholesterol toàn phần, do đó làm tăng sản xuất HDL trên mô hình thỏ tăng lipid

Puerarin vẫn thường được biết đến như là một phytoestrogen bởi tác dụng kiêu

esfrogen của nó trên nhiều mô hình động vật Tiêm ngắn hạn puerarin (0,7 mg/kg)

làm tăng số lượng các tuyến tử cung ở chuột chưa trưởng thành và tiêm kéo dài puerarin (7 mg/kg) làm tăng rõ rệt tỷ lệ phần trăm các tế bào sừng hóa ở chuột cái trưởng thành, điều này chứng tỏ puerarin có tác dụng kiểu estrogen Sử dụng puerarin đường uống trong 3 tháng làm tăng cả áp lực bàng quang và niệu đạo, giảm béo phì và tăng cường trọng lượng tử cung ở chuột Các tác dụng này của puerarin

đều tương đương hoặc yếu hơn 17ÿ-estradiol (E;) Những kết quả này chứng tỏ rằng puerarin có thê giúp cải thiện tình trạng bế niệu, mang lại những lợi ích đáng

kế trong điều trị các rồi loạn do mãn kinh Puerarin làm tăng rõ rệt cân nặng, IGF-I

và biêu hiện C3 và nồng độ chất chống oxy hóa trong huyết thanh, đồng thời làm giảm nồng độ melondialdehyd và tổn thương DNA ở tế bào lympho trên chuột, chứng tỏ rằng puerarin có tác dụng trên tử cung và có thê là một tác nhân trị liệu có hiệu quả trong việc chống tăng sản nội mạc tử cung và hội chứng tiền kinh nguyệt

1.2.4.6 Úc chế các rỗi loạn do rượu

Khả năng sống của tế bào, sự tích lũy lipid bên trong tế bào ở các tế bào gan

ủ ethanol đã được khôi phục về bình thường sau khi điều trị bằng puerarin Ngoài ra, puerarin còn kích thích quá trình phosphoryl hóa AMPK, và block các protein ribosome S6 và protein 4E-binding là những protein mục tiêu ở động vật

có vú của rapamycin (mammalia targets of rapamycin - mTOR), phục hôi cơ chế

tự tiêu hủy ở các tế bào sản xuất ethanol Những kết quả này chỉ ra rằng cơ chế bảo vệ của puerarin có liên quan đến con đường AMPK/mTOR Trong tế bào

mô đệm tủy xương gây ngộ độc bằng rượu, puerarin ức chế tăng sinh số lượng

tế bào mỡ, ức chế sản xuất triglycerid và tăng cường hoạt động của phosphatase

kiềm, osteocalcin và biểu hiện mRNA của osteocalcin Điều đó cho thây

puerarin có tác dụng phòng ngừa các rối loạn liên quan tới nghiện rượu [43]

Puerarin đã được sử dụng để điều trị đái tháo đường ở Trung Quốc từ những

năm 1990 Tiêm tĩnh mạch puerarin giúp làm hạ đường huyết, tăng mRNA và tăng biêu hiện protein vận chuyển glucose trong cơ, kích thích tuyến thượng thận tăng tiết B-endorphin, làm giảm đường huyết ở chuột bị gây tiêu đường bởi strep(tozotocin Ở chuột đực Sparague-Dawley được cho ăn với chế độ ăn giàu chất béo, các dấu hiệu như tăng trọng lượng cơ thể và giảm glucose dung nạp/tăng đề kháng insulin đã giảm, sự tăng nồng độ resistin và leptin huyết tương cũng được ngăn chặn khi điều trị bằng puerarin (100 và 20 mg/kg) [43]

Puerarin giúp tăng cường đáng kê sự hấp thu glucose vào các tế bào nhạy cảm insulin, giảm lượng đường trong máu, triglycerid, insulin, cholesterol toàn phần và trọng lượng cơ thê ở chuột Zucker béo phì và chuột mắc tiểu đường type 2 theo di truyền Sự chuyên hóa glucose vả insulin được cải thiện đáng kê ở nhóm chuột được thêm puerarin sẵn dây vào chế độ ăn hằng ngày [43]

12.5 Các nghiên cứu tỉnh chế puerarin hiện nay

được có độ tinh khiết cao trên 90%, đáng kề nhất là puerarin có độ tĩnh khiết trên

98% [42]

Năm 2004, Xiangling He và cộng sự sử dụng sắc ký hấp phụ trên epichlorohydrin gắn ligand B-cyclodextrin Pha động là dung dịch acid acetic 10% Dung lượng phân tích khoảng 1,2 mg dịch chiết Puerarin thu được có độ

tỉnh khiết khoảng 98% [40]

Có thê thấy, phương pháp sắc ký tách hoạt chất với độ tinh khiết cao

(>90%) từ một lượng rất nhỏ dịch chiết (<100mg) Phương pháp này thích hợp

để tinh chế ra chất chuân cho định lượng nhưng với lượng mẫu nhỏ khó triển khai trên quy mô lớn

Mặc dù phương pháp tinh chế bằng sắc ký cho ra các sản phẩm có độ tỉnh khiết cao song chỉ thực hiện với cỡ mẫu nhỏ, chi phí tốn kém chủ yêu dùng nghiên cứu thành phần của dược chất hơn là tinh chế sản xuất trên quy mô công nghiệp Và do vậy, bên cạnh phương pháp sắc ký người ta luôn phải nghiên cứu tìm ra các phương pháp tinh chế hoạt chất khác rẻ tiền, dễ triển khai trên quy mô

lớn với mức độ tinh khiết chấp nhận được

Phương pháp đơn giản nhất có thê kê đến đó là phương pháp của Hua- Neng Xu và cộng sự Chiết rễ củ sắn dây Pueraria lobaía bằng hỗn hợp dung môi n-butanol/nước (1:1) ở 25°C trong 6 giờ Dịch chiết thu được để lắng cho tách pha thu lấy phần nước đê tinh chế puerarin (daidzein phân bố chủ yêu ở pha n-butanol) Phần dịch này được lắc với n-butanol trong 1 giờ, sau đó điều chỉnh

pH của pha nước bằng acid HCI về 4,0, lúc này puerarin sẽ chuyển sang pha n- butanol Thu lấy pha n-butanol, tiếp tục lắc với đồng thê tích nước trong 1 giờ,

pH của pha nước được điều chỉnh về giá trị 8,0 Lúc này puerarin lại chuyên sang pha nước Thu lấy phần chiết nước Phân tích HPLC cho thấy sau 2 lần chuyên pha puerarin thu được tương đối tỉnh khiết [ 16]

Tại Việt Nam, tinh chế puerarin từ dịch chiết sắn dây chưa được quan tâm nghiên cứu mặc dù đây là thành phần chiếm hàm lượng lớn và cho tác dụng sinh

học chủ đạo của sắn dây Hiện tại chỉ có duy nhất nghiên cứu của Dược sĩ Lê Thùy

Linh đã tiến hành tinh chế được daidzein bằng phương pháp sắc ký cột với hệ dung

môi CC: : Methanol (98:2) [Š]

1.3 Cao thuốc

1.3.1 Khái niệm

Cao thuốc là chế phẩm được chế băng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định

các dịch chiết thu được từ được liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích

hợp[2]

1.3.2 Phân loại

Theo thê chất, cao thuốc được chia làm 3 loại:

Cao lỏng: Là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng

trong đó cồn và nước đóng vai trò dung môi chính (hay chất bảo quản hay cả hai) Nếu không có chỉ dẫn khác, quy ước 1 ml cao lỏng tương ứng với 1 g dược liệu dùng đề điều chế cao thuốc

Cao đặc: Là khôi đặc quánh Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại trong cao không quá 20%

Cao khô: Là khôi hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút âm Cao khô

không được có độ âm lớn hơn 5% [2]

1.3.3 Kỹ thuật điều chế

Quy trình điều chế cao khô gồm những giai đoạn sau:

1.3.3.1 Chuẩn bị dung môi, được liệu

Dược liệu thường được sây khô, chia nhỏ đến kích thước thích hợp Một số dược liệu đặc biệt cần diệt enzym hoặc loại chất béo Dung môi điều chế cao

thường là nước, ethanol, ete ethylic Đề làm tăng độ tan của hoạt chất có thê acid

hóa hoặc kiềm hóa dùn môi bằng acid hydrochloric, acid acetic, amoniac, natr1

hydroxyd

1.3.3.2 Chiết xuất hoạt chất

Tùy theo bản chất được liệu và dung môi, tiêu chuẩn chất lượng thành phâm cũng như điều kiện trang thiết bị và quy mô sản xuất, có thể sử dụng các phương pháp: Ngâm, ngắm kiệt, chiết xuất ngược dòng hay các phương pháp thích hợp khác

1.3.3.3 Loại bớt tạp chất

Cần phải loại tạp chất vì chúng thường dễ phân hủy ảnh hưởng đến chất lượng cao thuốc Trường hợp điều chế cao đặc, cao khô, nêu hàm lượng hoạt chất chưa đủ quy định cũng có thể cũng có thê tiến hành loại bớt tạp chất

1.3.3.4 Cô đặc và sấy khô

Đề điều chế cao thuốc thường phải tiến hành loại dung môi Dịch chiết được

cô đặc đến tỷ lệ dung môi quy định, với cao đặc và cao khô thì sau khi cô đặc,

sây đến độ âm không quá 20% đối với cao đặc và không quá 5% đối với cao khô

giai đoạn cô đặc [ 1]

13.4 Các chỉ tiêu chất lượng của cao thuốc

Cảm quan: Cao thuốc phải có thê chất, màu sắc, độ đồng nhất theo quy định

Độ tan: Cao lòng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã dùng để điều chế cao Mất khối lượng do làm khô: Thông thường cao đặc không quá 20%, cao khô không quá 5%

Các chỉ tiêu khác: Độ nhiễm khuẩn, giới hạn thuốc bảo vệ thực vật, kim loại

nặng, chất bảo quản, định tính, định lượng [2]

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

1 Ethanol 96% | Việt Nam DĐVNIV

5 Nước cất Nước tự cất 2.12 Dụng cụ

2.1.3 Phương tiện và máy móc

Máy siêu âm Ultrasomic LC 60H (Đúc)

Máy cất quay Buchi B480 (Thuy Sỹ)

Cần phân tích Mettler Toledo AB2045 (Thuy Sỹ)

Cần kỹ thuật Sartorius BP20015 (Đúc)

Máy đo quang HTACHI U-1900

Đèn tử ngoại

Tủ sấy MEMMERT (Đức)

Máy xay búa

Máy xay sinh tô

Hệ thông lọc hút Buchner

Cân xác định hàm âm nhanh Precisa XM 60 (Thụy Ñï)

Máy đo tỷ trọng biểu kiến ERWEKA SVM (Đức)

Hệ thống phun sấy LPG-5 Centrifugal Spray Dryer (Changzhou ]indiao, Trung Quốc) công suất 5 L/giờ

Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản), gồm:

+ Bộ phân loại khí DGU — 14A

+ Bơm cao áp LC - IOADVP

+ Buồng chứa cột CTO - 10AVP

+ Bộ điều khiển SCL - 10AVP

+ Detector dãy diod quang SPD - M1O0AVP

+ Phần mềm Class vp 6.14

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Chiết xuất isoflavonoid từ nguyên liệu khô

— _ Xác định hàm lượng isoflavonoid toàn phân và puerarin trong sẵn dây khô

— Chiết xuất isofTavonoid từ sẵn dây khô

—_ Tinh chế dịch chiết, khảo sát một số phương pháp loại tạp

2.2.2 Chiết xuất isollavonoid từ nguyên liệu tươi

Xác định hàm lượng isoflavonoid toàn phần và puerarin trong sắn dây tươi Chiết xuất isoflavonoid từ sẵn dây tươi

Tinh chế dịch chiết, khảo sát một số phương pháp loại tạp: sử dụng nhiệt độ,

sử dụng ethanol, kết hợp cả ethanol và nhiệt độ

2.2.3 Điều chế cao khô

— Điều chế cao khô bằng phương pháp phun sấy

— Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng cao khô

2.2.4 Phân lập puerarin và daidzin

— Phân lập daidzin và chứng minh câu trúc sản phâm

—_ Phân lập puerarin và chứng minh câu trúc sản phâm

2.3.1 Phương pháp định lượng isoflavonoid toàn phần và puerarin

2.3.1.1 Định lượng isoflavonoid toàn phần bằng phương pháp đo quang

Qua tham khảo các tài liệu [11], [41], [45] chúng tôi xây dựng phương

pháp định lượng isoflavonoid toàn phân trong dược liệu và trong dịch chiết bằng quang phô hấp thụ UV như sau

Cân chính xác khoảng 12,1 mg chất đối chiếu (chứa 82,31% puerarin) tương đương với khoảng 10,0 mg puerarin hòa tan trong khoảng 20ml

ethanol 96% sau đó chuyển vào bình định mức 50ml Thêm ethanol 96%

đến vạch, lắc đều được dung dịch A Lấy chính xác 1,0 ml dung dịch A cho vào bình định mức 25 ml, thêm ethanol 96% vừa đủ đến vạch, lắc đều được dung dịch chất đối chiếu có hàm lượng puerarin khoảng 8§ug/ml Lọc qua màng 0,45m, quét phô đề chọn ra bước sóng thích hợp cho định lượng

Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: Lẫy chính xác 20,0 ml dung dịch A cho

vào bình định mức 100 ml, thêm ethanol 96% đến vạch, lắc đều được dung

dịch B Từ dung dịch B pha loãng thành dãy dung dịch chuẩn có nồng độ lần

lượt là 1,6; 3,2; 4,8: 6,4; 8 Hg/ml theo như bảng sau:

Mẫu trắng là dung dịch ethanol 19,2% (10ml dung dịch ethanol 96% pha loãng với nước cất vừa đủ 50ml) Mẫu trắng và mẫu chuẩn sau khi pha

được lọc qua màng 0,45m, đo độ hấp thụ tại bước sóng đã chọn, đo lặp lại 3

lần, lấy kết quả trung bình để xây dựng đường chuẩn

Với mẫu thử là sắn đây tươi: Cân chính xác khoảng 10 g dược liệu,

ml, thêm 5 ml ethanol 96% và nước cất vừa đủ, lắc đều được dung dịch thử

Với mẫu thử là sắn dây khô: Cân chính xác khoảng 0,4 g dược liệu,

ml, thêm 5 ml ethanol 96% và nước cất vừa đủ, lắc đều được dung dịch thử

hàm lượng, hòa tan bằng ethanol 96%, chuyên vào bình định mức 50 ml,

thêm ethanol 96% đến vừa đủ, lắc đều Lấy chính xác 1,0 ml dung dịch vừa

pha vào bình định mức 50 ml, thêm 9,0 mi ethanol 96% và bổ sung nước cất vừa đủ, lắc đều Dung dịch thu được đem lọc qua màng 0,45m trước khi đo

As A‹ : Mật độ quang của dung dịch thử và dung dịch chuẩn

Cc : Nơng độ dung dịch chuẩn

V‹w¿ : Thê tích dịch chiết

mụ : Khối lượng dược liệu đem vào chiết xuất

Hàm lượng 1soflavonoid trong cao được tính theo cơng thức

"“x

(%) = Ác m¿à 105

Trong đĩ:

As A‹ : Mật độ quang của dung dịch thử và dung dịch chuẩn

Cc : Nơng độ dung dịch chuẩn mụạ„ : Khối lượng cao

2.3.1.2 Định lượng puerarin bằng HPLC

Để định lượng puerarin trong nguyên liệu, cao khơ tồn phần và sản phẩm tinh chế, chúng tơi sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Qua tham khảo các tài liệu [29], [45], [16] và quá trình khảo sát ban đầu,

chúng tơi lựa chọn các điêu kiện sắc ký như sau:

— Thơng số máy sắc ký:

+ Bộ phân loại khí DGU — 14A

+ Bơm cao áp UC — 10ADVP

+ Buồng chứa cột CTO - I0AVP

+ Bộ điều khiển SCL - 10AVP

+ Detector dãy diod quang SPD —- MIOAVP

+ Phần mềm Class vp 6.14

+ CỘC sắc ký Alltech C18 với kích thước cột 250 x 4,6 mm, kích

thước hạt nhồi 5 im

— Pha động: methanol: nước = 30:70, pha động được lọc qua màng 0,45

ụm, siêu âm trong 15 phút

— Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút

— Thê tích tiêm mẫu: 5 hl

— Detector DV phát hiện ở bước sóng 250 nm

Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,125 g chất đối

chiếu puerarin 82,31% Hòa tan trong khoảng 50ml ethanol 96% sau đó chuyên

vào bình định mức 100 ml Thêm ethanol 96% vừa đủ đến vạch được dung dịch

A Lấy chính xác khoảng 5,0 ml dung dịch A, pha loãng 10 lần bằng nước cất

ethanol 96% vừa đủ đến vạch Pha loãng dung dịch này 10 lần bằng pha động, sau đó lọc qua màng 0,45um trước khi phân tích sắc ký

Hàm lượng puerarin trong nguyên liệu, trong cao đặc và cao khô được tính theo công thức:

trong dịch chiết, dịch tinh chế Tham khảo các tài liệu [2], [32] chúng tôi xây

dựng phương pháp sắc ký lớp mỏng như sau:

— Bản mỏng: Silicagel 60Fas¿, hoạt hoá ở 110 °C trong 1 giờ

— Dung môi khai triển:

Hệ 1: Cloroform-methanol-nước (7:2,5:0,25)

Hệ 2: Cloroform-methanol (7:3)

—_ Dung dịch thử:

+ Mẫu thử là dịch chiết: Lây một thê tích dịch chiết trơng đương với 1

mg isoflavonoid toàn phần, cô cách thủy đến cắn Hoà cắn trong 1 ml ethanol

dịch có nồng độ khoảng 1 mg/ml

— Dung dịch đối chiêu: Hòa tan chất đối chiêu trong methanol đê có nồng

độ puerarin khoảng I mg/ml

Sau khi khai triển sắc ký, lấy bản mỏng ra, để bay hơi dung môi ở nhiệt độ phòng, soi bản mỏng dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm

2.3.3 Phương pháp chiết xuất isoflavonoid từ sắn dây khô

Hầu hết các ¡isoflavonoid trong sắn dây đều ở dạng glycosid, chỉ có một vài chất là aplycon như daidzein, genistein Vì vậy có thể lựa chọn dung môi phân cực

để chiết isoflavonoid từ sắn dây Ưu tiên chọn dung môi rẻ tiền, không độc, dễ kiếm, chúng tôi tiến hành thử nghiệm với các dung dịch ethanol có nồng độ khác

nhau và nước Cân xác định khối lượng cao thu được với mỗi dung môi, định lượng hàm lượng isoflavonoid và puerarin trong dịch chiết và cao thu được Tính hiệu suất của quá trình chiết dựa vào hàm lượng isoflavonoid chiết được

Hiệu suất của quá trình chiết được tính theo công thức:

TRsoƑlauonotd /di

TRhso Ƒlaono td/cao

Trong đó: — m;¿snavonoiaai là lượng 1soflavonoid có trong được liệu đưa vào chiệt

T;soflavonoid/cao là lượng 1soflavonoid có trong cao thu được

2.3.4 Phương pháp chiết isoflavonoid từ sắn dây tươi

Nhằm tận dụng quy trình chế tinh bột từ sẵn dây tươi, chúng tôi kết hợp quá

trình chiết xuất isoflavonoid từ sẵn dây tươi với quá trình thu tinh bột Quy trình

chiết xuất được tóm tắt theo sơ đồ trong hình 2.1

Mô tả các bước tiến hành:

ngày, củ được rửa sạch đất và vỏ đen bên ngoài, cắt bỏ những phần bị hỏng

Để ráo nước và cân xác định khối lượng Sau đó xay mịn thành bột nhão, trước đó có thê thái thành lát đê xay đễ dàng hơn

rồi vắt loại bã bằng túi vải Bã sẵn được rửa lại một lần với lượng nước như

lần một Gộp các dịch chiết, để lắng qua đêm, gạn, lọc qua vải lấy phần dịch trong: đây là dịch chiết chứa isoflavonoid Lấy 100ml dịch chiết này