Luận văn thạc sĩ thiết kế quy trình phân tích alpha lipoic acid trong một số thực phẩm chức năng

TÓM TẮT LUẬN VĂNTHIẾT KẾ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ALPHA LIPOIC ACID TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG Học viên: Bùi Minh Đức Chuyên Ngành: Kỹ thuật hóa học Mã số: 8520301 Khóa: 2017-2019 Trườn

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian học tập nghiên cứu và tổ chức thí nghiệm dưới sự hướng dẫn củaPGS.TS Nguyễn Thị Diệu Hằng

Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến:

PGS.TS Nguyễn Thị Diệu Hằng, Phó trưởng phòng Đào tạo Trường Đại học

Bách Khoa Đà Nẵng đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý cho tôi những kiến thứcquý báu và chỉ ra những thiếu xót để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Các thầy cô giảng viên khoa Hóa, phòng Đào tạo Trường Đại học Bách Khoa

Đà Nẵng đã tham gia giảng dạy, hổ trợ những kiến thức nền, góp ý phản biện bảo vệ

đề tài này

Viện An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc gia đã tổ chức đánh giá so sánh liên

phòng giúp đề tài nghiên cứu có độ chính xác và tin cậy cao hơn

Trung Tâm Kiểm Nghiệm Thuốc, Mỹ Phẩm, Thực Phẩm Quảng Ngãi và các anh chị trong Khoa Mỹ Phẩm – Thực phẩm đã giúp đỡ, hỗ trợ chia sẻ những

khó khăn với tôi trong công việc

Và cuối cùng tôi xin chúc các quý thầy cô và các tổ chức; cá nhân ở trên lờichúc sức khỏe và thành công

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫncủa PGS.TS Nguyễn Thị Diệu Hằng Các số liệu, kết quả nên trong luận văn là trungthực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn

Bùi Minh Đức

TÓM TẮT LUẬN VĂN

THIẾT KẾ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ALPHA LIPOIC ACID TRONG MỘT

SỐ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

Học viên: Bùi Minh Đức Chuyên Ngành: Kỹ thuật hóa học

Mã số: 8520301 Khóa: 2017-2019 Trường Đại học Bách khoa – ĐHĐN

Tóm tắt - Alpha Lipoic Acid (ALA) là một trong những chất chống oxy hóa hiện diện tự

nhiên trong tất cả các tế bào nhân sơ và sinh vật nhân thực ALA có chức năng tổng hợpnội sinh là một trong yếu tố tạo thành cho một số phức hợp enzyme quang trọng trong tythể Do đặc tính chống oxy hóa độc đáo của nó, nó đã được sử dụng trong nhiều bệnh liênquan đến mất cân bằng oxy hóa và thường có sẵn trên thị trường dưới dạng thực phẩm bổsung Mục đích của công việc nghiên cứu hiện tại là xây dựng và tối ưu phương phápphân tích để xác định hàm lượng ALA trong thực phẩm bổ sung khác nhau bằng phươngpháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Thiết kế quy trình phân tích bao gồm: Điều kiệnsắc ký HPLC; Điều kiện sử lý mẫu; Đánh giá xác nhận giá trị của phương pháp; Thửnghiệm thành thạo hay so sánh liên phòng; Phân tích mẫu ở địa phương Tác giả đã tómtắt các kết quả đạt được và đưa ra các hướng phát triển tiếp theo

Từ khóa - Alpha Lipoic Acid (ALA); Đánh giá phương pháp; So sánh liên phòng; Tối ưu

phương pháp; Điều kiện sử lý mẫu.

DESIGN OF ALPHA LIPOIC ACID ANALYSIS PROCESS IN

SUPPLEMENTS FOOD Abstract - Alpha Lipoic Acid (ALA) is a universal antioxidant present naturally in all

prokaryotic and eukaryotic cells Endogenously synthesized ALA functions as a cofactor for several important mitochondrial enzyme complexes Due to its unique antioxidant properties,

it has been administered in many oxidative stress related diseases and is also commercially available in the form of supplements food The aim of the present research work was to build and optimal analytical method to determine ALA content in various supplement food using high performance liquid chromatography (HPLC) Analysis process design includes: HPLC conditions; Sample handling conditions; Selection, verification and validation of method; Proficiency testing inter-laboratory comparision; Analyzing samples in the locality The achieved results are summarized and perspective of the work is provided.

Key words - Alpha lipoic acid (ALA); verification and validation of method;

inter-laboratory comparision; optimal analytical method; Sample handling conditions.

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4 Phương pháp nghiên cứu 2

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

6 Cấu trúc của luận văn 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Khái quát về thực phẩm chức năng 3

1.2 Tổng quan về Alpha Lipoic Acid 4

1.3 Sản xuất ALA trong công nghiệp 6

1.4 Tổng quan về sắc ký lỏng HPLC 6

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Đối tượng nghiên cứu 12

2.2 Phương pháp nghiên cứu 14

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện đo sắc ký lỏng 31

3.2 Kết quả Khảo sát và tối ưu điều kiện Xử lý mẫu trên modde 5 36

3.3 Đánh giá quy trình phân tích ala 41

3.4 Đánh giá phương pháp bằng so sánh liên phòng 54

3.5 Phân tích một số mẫu lấy trên địa bàn 55

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

PHỤ LỤC

QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN (Bản sao)

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

ALAAOAC

ISO17025:2017

DANH MỤC CÁC BẢNG

Số hiệu

bảng

ký pha đảo2.3 Giá trị α2 phụ thuộc vào k và n

Quảng Ngãi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Số hiệu

hình

3.12 Thông số và sắc ký đồ chuẩn ALA 0,4mg/ml ở các bước sóng

Số hiệu

hình

3.18 Hệ số và kết quả kiểm tra các hệ số phương trình hồi quy

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Chất lượng thực phẩm chức năng là một vấn đề cần phải được quan tâm bởi vìđược sử dụng trực tiếp vào trong cơ thể con người Nếu thực phẩm chức năng giả, kémchất lượng, không đảm bảo nguồn gốc thì có khả năng ảnh hưởng nghiêm trọng đếnsức khỏe con người Trong khi “Thuốc” có những quy định rất chặt chẽ như cần phảighi rõ nguyên liệu, công dụng và luật định, sự chuyển hóa trong cơ thể, đào thải ra sao,tác dụng phụ, hàm lượng… thì thực phẩm chức năng lại không có những yêu cầu khắtkhe Do vậy, việc sản xuất thực phẩm chức năng trở nên dễ dàng hơn, nhất là trongkhâu đăng ký sản xuất hay các khâu kiểm định chất lượng

Trong thời gian qua, việc sản xuất, kinh doanh thực phẩm chức năng không đảmbảo chất lượng, không rõ nguồn gốc xuất xứ, chưa đăng ký bản công bố với cơ quanquản lý, đặc biệt kinh doanh qua mạng điện tử có chiều hướng diễn biến phức tạp, ảnhhưởng đến quyền lợi và sức khỏe người tiêu dùng, gây bức xúc với xã hội

Ngày 19/06/2018, Thử tướng Chính phủ đã ban hành Chỉ thị số 17/CT-TTg vềviệc “Tăng cường đấu tranh chống buôn lậu, gian lận thương mại, sản xuất, kinhdoanh hàng giả, hàng kém chất lượng thuộc nhóm hàng dược phẩm, mỹ phẩm, thựcphẩm chức năng, dược liệu và vị thuốc y học cổ truyển”

Hiện nay trong thị trường có nhiều loại thực phẩm chức năng có thành phầnchính là Alpha Lipoic Acid (ALA) Tuy nhiên chất lượng của các sản phẩm là vấn đềcần quan tâm chính vì vậy cần có phương pháp tối ưu để phân tích định lượng hàmlượng hoạt chất trên trong sản phẩm Trong đó hầu như các quy trình phân tích chỉđược tham khảo từ các tiêu chuẩn và các kênh nước ngoài Các hệ thống TCVN;QCVN; Dược Điển Việt Nam; Dược Điển Anh… hiện tại chưa thấy có quy trình chínhthức về phân tích chất lượng Alpha Lipoic Acid và chưa tìm ra các bài báo khoa học ởViệt Nam nói về việc xây dựng quy trình và tối ưu điều kiện chiết xuất phân tích ALAtrong thực phẩm chức năng Các quy trình phân tích ở Việt nam chỉ là các quy trìnhnội bộ cho nên điều kiện phân tích thiết bị hóa chất khác nhau, và chưa được đánh giátối ưu theo điều kiện phân tích Chính vì vậy cần xây dựng và áp dụng các phươngpháp đánh giá và tối ưu để hoàn thiện quy trình phân tích này

Ngoài ra thực trạng nhu cầu về quản lý trên địa bàn tỉnh Quảng Ngãi cần tìm hiểu

về chất lượng các sản phẩm thực phẩm chức năng, đặc biệt là những hoạt chất mới,những hoạt chất đáng quan tâm và được sử dụng nhiều như ALA

Với những lý do và các vấn đề thực tiễn trên tôi xin được lựa chọn đề tài “Thiết

kế quy trình phân tích Alpha Lipoic Acid trong một số thực phẩm chức năng”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

1 Xây dựng và đánh giá được quy trình phân tích ALA trong một số thực phẩmchức năng, quy trình này phải tối ưu và phân tích được hầu hết các mẫu thực phẩmchức năng có chứa ALA trên thị trường

2 Từ quy trình đã xây dựng lập hướng dẫn phương pháp ở cơ quan đơn vị để phân tích các mẫu nghiên cứu có trên địa bàn

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Thực phẩm chức năng có chứa ALA trên địa bàn tỉnh Quảng Ngãi

- Sắc ký lỏng cao áp HPLC

4 Phương pháp nghiên cứu

- Nghiên cứu lý thuyết

- Phân tích dữ liệu

- Xây dựng quy trình

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Xây dựng và lựa chọn quy trình phân tích, lựa chọn các thông số và điều kiện quy trình phân tích

- Xây dựng và tối ưu được quy trình xử lý mẫu phân tích

-Xây đựng quy trình và đánh giá quy trình phân tích Sau đó tiến hành thực hiện phân tích đối chứng về quy trình với các phòng thí nghiệm khác nhau

- Phân tích một số mẫu đối chứng trên địa bàn

6 Cấu trúc của luận văn

Cấu trúc luận văn gồm các Chương sau:

- Chương 1: Tổng quan

- Chương 2: Đối tượng, hóa chất, thiết bị và phương pháp nghiên cứu

- Chương 3: Thực nghiệm và thảo luận

- Chương 4: Kết luận

Vào nửa cuối thập niên 1990, Ủy ban Châu Âu xây dựng và thảo luận về kháiniệm thực phẩm chức năng Tại cuộc họp này góp mặt với nhiều chuyên gia về dinhdưỡng và các ngành khoa học liên quan khác để đưa ra một khái niệm đồng thuận và

từ đó đã được sử dụng rộng rãi Theo đó “Thực phẩm chức năng là các sản phẩm cónguồn gốc tự nhiên hoặc là thực phẩm trong quá trình chế biến được bổ sung thêm cácchất chức năng Cũng như thực phẩm thuốc, thực phẩm chức năng nằm giữa nơi giaothoa thực phẩm và thuốc cho nên đôi khi người ta cũng gọi thực phẩm chức năng làthực phẩm thuốc Sở dĩ thực phẩm chức năng có khả năng hỗ trợ điều trị bệnh vàphòng ngừa bệnh vì nó có khả năng phục hồi tất cả các cấu trúc tế bào trong cơ thểđang bị tổn thương”

Bộ Y tế Việt Nam định nghĩa thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng để hỗ trợchức năng của các bộ phận trong cở thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thểtình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ gây bệnh Tùy theo côngthức, hàm lượng vi chất và hướng dẫn sử dụng, thực phẩm chức năng còn có các têngọi sau: thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng, thực phẩm bổ sung, thực phẩm bảo vệsức khỏe, sản phẩm dinh dưỡng y học

1.1.2 Phân loại thực phẩm chức năng

Thực phẩm chức năng được phân loại như sau [2]:

 Thực phẩm bổ sung (Supplemented Food) là thực phẩm thông thường được bổsung vi chất và các yếu tố có lợi cho sức khỏe như vitamin, khoáng chất, acid amin,acid béo, enzym, probiotic, prebiotic và chất có hoạt tính sinh học khác

 Thực phẩm bảo vệ sức khỏe (Health Supplement, Food Supplement, DietarySupplement) là sản phẩm được chế biến dưới dạng viên nang, viên hoàn, viên nén,cao, cốm, bột, lỏng và các dạng chế biến khác có chứa một hoặc hỗn hợp của các chấtsau đây:

 Vitamin, khoáng chất, acid amin, acid béo, enzym, probiotic và chất có hoạt tính sinh học khác

 Hoạt chất sinh học có nguồn gốc tự nhiên từ động vật, chất khoáng và nguồn gốc thực vật ở các dạng như chiết xuất, phân lập, cô đặc và chuyển hóa

 Thực phẩm dinh dưỡng y học còn gọi là thực phẩm dinh dưỡng dùng cho mụcđích y tế đặc biệt (Food for Special Medical Purposes, Medical Food) là loại thựcphẩm có thể ăn bằng đường miệng hoặc bằng ống xông, được chỉ định để điều chỉnhchế độ ăn của người bệnh và chỉ được sử dụng dưới sự giám sát của nhân viên y tế

 Thực phẩm dùng cho chế độ ăn đặc biệt (Food for Special Dietary Uses) dùngcho người ăn kiêng, người già và các đối tượng đặc biệt khác theo quy định của Ủyban tiêu chuẩn thực phẩm quốc tế (CODEX) là những thực phẩm được chế biến hoặcđược phối trộn theo công thức đặc biệt nhằm đáp ứng các yêu cầu về chế độ ăn đặc thùtheo thể trạng hoặc theo tình trạng bệnh lý và các rối loạn cụ thể của người sử dụng.Thành phần của thực phẩm này phải khác biệt rõ rệt với thành phần của những thựcphẩm thông thường cùng bản chất, nếu có

1.1.3 Yêu cầu kiểm nghiệm của thực phẩm chức năng [2]

Việc lấy mẫu kiểm nghiệm định kỳ được thực hiện bởi tổ chức, cá nhân hoặc tổ chức, cá nhân chủ động mời cơ quan có thẩm quyền thực hiện

Các chỉ tiêu để kiểm nghiệm định kỳ là các chỉ tiêu chất lượng chủ yếu đã công

bố trong bản thông tin chi tiết về sản phẩm hoặc trên nhãn sản phẩm đang lưu hành;một số chỉ tiêu hóa lý, vi sinh vật đã công bố trong bản thông tin chi tiết về sản phẩmhoặc theo quy định của pháp luật

Các hoạt chất có tác dụng chính tạo nên công dụng của sản phẩm, mà các đơn

vị kiểm nghiệm trong nước thực hiện kiểm nghiệm được thì phải định lượng hoạt chấtchính đó trong sản phẩm

Hoạt chất chính mà các đơn vị kiểm nghiệm trong nước chưa có phương phápthử, mẫu chuẩn để kiểm nghiệm định lượng được thì yêu cầu công bố hàm lượngthành phần có chứa hoạt chất chính trong hồ sơ công bố

1.2 Tổng quan về Alpha Lipoic Acid

1.2.1 Cấu tạo và tính chất lý hóa

Alpha Lipoic Acid (ALA) có tên hóa học là 1,2-dithiolane-3-pentanoic acid.Một số tên khác của ALA: 1,2-dithiolane-3-valeric acid; acetate-replacingfactor; iletan; 5-(1,2dithiolan-3-yl) valeric acid; 6,8-dithiooctanoic acid; Heparlipon;lipoic acid; Liposan; Lipothion; protogenA; pyruvate oxidation factor; Thioctacid;thioctic acid; 6,8-thioctic acid; 6-thioctic acid; thioctidase; thiooctanoic acid; Tioctan

 Độ hòa tan: Không tan trong nước, hòa tan trong dung môi chất béo.

1.2.2 Công dụng đối với sức khỏe

ALA là một chất tự nhiên được tổng hợp trong ty thể của tế bào, đóng vai trò làcoenzyme cho hai loại enzyme:

 Pyruvate Dehydrogenase

 Ketoglutarate -Dehydrogenase

ALA được sử dụng trong cơ thể để phá vỡ carbonhydrate và tạo năng lượng chocác cơ quan khác trong cơ thể ALA được tế bào cơ thể người sản xuất ra nhưng vớinồng độ thấp và lượng giảm dần theo tuổi Khi được cung cấp đủ nhu cầu cần thiết cơthể sẽ khỏe mạnh và trẻ đẹp

ALA là một chất chống oxy hóa mạnh đã được sử dụng rộng rãi trong các chếphẩm thực phẩm chức năng:

 Kích thích tổng hợp glutathione

 Tăng cường tác dụng của các chất chống oxy hóa khác (ví dụ: Vitamin C vàE)

 Tăng cường hoạt động insulin

 Giảm sơ hóa niêm mạc

 Ngăn ngừa và điều trị hóa trị gây ra tác dụng phụ, chẳng hạn như bệnh thầnkinh ngoại biên Hơn nữa, có một số báo cáo về ALA đang được sử dụng như một tácnhân có đặc tính chống ung thư

Hiện nay trên thị trường có các loại thực phẩm chức năng có chứa ALA thườngđược bào chế dưới dạng thuốc có hàm lượng dao động từ 50mg đến 600mg/viên vàdạng bào chế thường: Viên nén, viên bao phim, gói bột thuốc, viên nang cứng haymềm

Hình 1.2 Một số thực phẩm chức năng có chứa ALA trên thị trường

1.3 Sản xuất ALA trong công nghiệp [13]

Acid lipoic có thể được điều chế bằng cách phản ứng:

Acid 6,8-dichlorooctanoic + Natri disulfide

Trong sản xuất công nghiệp acid-lipoic người ta sử dụng phương pháp chuyểnđổi monomethyl hoặc monoethyl adipate thành acid clorua tương ứng bằng phản ứngvới thionyl clorua Hỗn hợp này được xử lý bằng ethylene và nhôm clorua khan tạo ramột hợp chất trung gian sau khi khử được xử lý bằng natri disulfide Quá trình tạo raeste dithionooctyl sau đó tạo ra acid-lipoic sau khi thủy phân

1.4 Tổng quan về sắc ký lỏng HPLC [1]

Sắc ký lỏng là phương pháp tách sắc ký các chất dựa trên sự phân bố khác nhaucủa chúng giữa hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là một chất lỏng chảy quapha tĩnh chứa trong cột

Sắc ký lỏng được tiến hành chủ yếu dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố khốilượng, trao đổi ion, loại trừ theo kích thước hoặc tương tác hóa học lập thể

Thiết bị bao gồm một hệ thống bơm, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký (bộ phậnđiều khiển nhiệt độ có thể được sử dụng nếu cần thiết), detector và một hệ thống thu

dữ liệu (hay một máy tích phân hoặc một máy ghi đồ thị) Pha động được cung cấp từmột hoặc vài bình chứa và chảy qua cột, thông thường với tốc độ không đổi và sau đóchạy qua detector

Hình 1.3 Nguyên lý hoạt động của hệ thống HPLC

1.4.2 Hệ thống bơm

Hệ thống bơm trong sắc ký lỏng phải giữ cho pha động luôn chảy với một lưulượng không đổi Những biến đổi áp suất sẽ được giảm thiểu, ví dụ cho dung môi chạyqua một thiết bị giảm xung Ống dẫn và hệ thống nối phải là loại chịu được áp suấtsinh ra do hệ thống bơm Các bơm có thể được lắp với thiết bị loại bỏ bọt khí

Hệ thống điều khiển bằng bộ vi xử lý có khả năng cung cấp pha động hoặc hằngđịnh (rửa giải đẳng dòng) hoặc thay đổi tỷ lệ thành phần (rửa giải gradient) theo mộtchương trình xác định Trong trường hợp rửa giải gradient, hệ thống bơm lấy các dungmôi từ một vài bình chứa và các dung môi có thể được trộn lẫn ở áp suất thấp hoặc ápsuất cao

1.4.3 Bộ phận tiêm mẫu

Dung dịch mẫu thử được đưa vào dòng pha động hoặc vào vị trí gần đầu hoặcđầu cột nhờ một bộ phận tiêm mẫu có khả năng hoạt động ở áp suất cao Có thể dùngvòng chứa mẫu thử, có thể tích cố định hoặc thiết bị có thể tích thay đổi, có thể vậnhành bằng tay hoặc tự động Khi tiêm mẫu bằng tay có thể gây ra sai số do thể tíchtiêm vào vòng chứa mẫu không đủ

1.4.4 Pha tĩnh

Có nhiều loại pha tĩnh có thể được sử dụng trong sắc ký lỏng, bao gồm:

 Silica (silicon dioxide), nhôm oxide hoặc than graphit xốp thường được dùngtrong sắc ký pha thuận mà quá trình phân tách dựa trên sự khác nhau về khả năng hấpphụ hoặc phân bố khối lượng;

 Nhựa hoặc polymer có chứa các nhóm chức acid hoặc base, sử dụng trong sắc

ký trao đổi ion mà trong đó sự chia tách được thực hiện dựa trên sự cạnh tranh giữacác ion cần tách và các ion trong pha động;

 Silica xốp hoặc polymer, sử dụng trong sắc ký rây phân tử, ở đó sự chia tách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử, tương ứng với sự loại trừ không gian;

 Rất nhiều chất mang biến đổi hóa học được chế tạo từ polymer, silica gel hoặcthan graphit xốp được dùng trong sắc ký lỏng pha đảo mà ở đó sự chia tách về nguyêntắc cơ bản dựa trên sự phân bố phân tử các chất giữa pha động và pha tĩnh;

 Pha tĩnh loại biến đổi hóa học đặc biệt, ví dụ dẫn xuất của celulose hoặcamylose, protein hoặc peptid, cyclodextrin v.v dùng để tách các đồng phân đối quang(sắc ký đối quang)

Phần lớn sự chia tách dựa trên cơ chế phân bố, sử dụng silica biến đổi hóa họclàm pha tĩnh và các dung môi phân cực làm pha động Bề mặt của chất mang, ví dụnhư các nhóm silanol của silica được phản ứng với các thuốc thử silan khác nhau tạothành các dẫn xuất silyl có liên kết cộng hóa trị, che phủ một số lượng khác nhau các

Đặc điểm và yêu cầu của pha tĩnh sắc ký:

 Trừ khi có tiêu chuẩn riêng của nhà sản xuất, thông thường các cột sắc ký pha

đảo dựa trên silica được coi là ổn định đối với pha động có pH từ 2,0 tới 8,0 Cột chứathan graphit xốp hoặc các hạt vật liệu polymer như styren - divinylbenzen copolymer

ổn định ở một khoảng pH rộng hơn

 Phân tích sử dụng sắc ký pha thuận với pha tĩnh là silica không bị biến đổi,than graphit xốp hoặc silica biến đổi hóa học làm cho phân cực (ví dụ cyanopropylhoặc diol) và pha động không phân cực được sử dụng trong một số trường hợp

 Đối với sự tách nhằm mục đích phân tích, kích thước hạt của pha tĩnh phổ biếnnhất từ 3 µm đến 10 µm Các hạt có thể hình cầu hoặc không có hình dạng nhất định,

có độ xốp khác nhau và diện tích bề mặt đặc hiệu Những tham số này cấu thành biểuhiện sắc ký của từng pha tĩnh cụ thể Trong trường hợp pha đảo, các yếu tố bổ sungnhư bản chất của pha tĩnh, mức độ liên kết, ví dụ như độ dài mạch carbon liên kết,hoặc các nhóm hoạt động bề mặt của pha tĩnh có được che phủ hết hay không Sự kéođuôi pic, đặc biệt của các chất base, có thể xảy ra khi có mặt các nhóm silanol bề mặtcủa silica

 Cột được làm bằng thép không gỉ trừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên luậnriêng, có chiều dài và đường kính trong () khác nhau được sử dụng cho phân tích sắc

ký Cột với đường kính trong nhỏ hơn 2 mm thường được coi là vi cột Nhiệt độ củapha động và cột phải được giữ ổn định trong suốt thời gian phân tích Phần lớn quátrình tách được thực hiện ở nhiệt độ phòng, nhưng cột có thể được làm nóng nhằm thuđược hiệu quả cao hơn Tuy nhiên, nhiệt độ cột cũng không được phép vượt quá 60°C

vì khả năng phân hủy của pha tĩnh hoặc sự thay đổi thành phần của pha động có thểxảy ra

1.4.5 Pha động

Đối với sắc ký pha thuận, thường sử dụng dung môi ít phân cực Sự có mặt của

nước trong pha động phải được hạn chế và kiểm tra chặt chẽ nhằm thu được kết quả táilặp lại Đối với sắc ký lỏng pha đảo, sử dụng pha động chứa nước, có hoặc không códung môi hữu cơ

Các thành phần của pha động thường được lọc nhằm loại bỏ các tiểu phân lớnhơn 0,45m Pha động chứa nhiều thành phần được chuẩn bị bằng cách đong các thểtích qui định (trừ khi có chỉ định về khối lượng) của các thành phần riêng lẻ rồi sau đótrộn lẫn với nhau Ngoài ra, dung môi cũng có thể được cấp qua các bơm riêng lẻ, điềukhiển bằng các van chia tỷ lệ, để có thể trộn lẫn theo các tỷ lệ mong muốn Dung môithường được loại khí trước khi bơm bằng cách sục khí Heli, lắc siêu âm hoặc sử dụng

hệ thống lọc màng lọc/chân không trực tuyến nhằm tránh sự tạo bọt khí trong cốc đocủa detector

Dung môi dùng để chuẩn bị pha động thường không được chứa các chất làm ổnđịnh và phải trong suốt (không hấp thụ quang) ở vùng bước sóng phát hiện, nếu như sửdụng detector tử ngoại Dung môi và những thành phần khác được dùng phải có chấtlượng phù hợp Khi cần điều chỉnh pH chỉ thực hiện với thành phần nước của phađộng mà không điều chỉnh với hỗn hợp Nếu sử dụng dung dịch đệm, cần phải rửa hệthống bằng hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ (5 % v/v) nhằm ngăn chặn sự kết tinhmuối sau khi kết thúc quá trình sắc ký

Pha động có thể chứa những thành phần khác, ví dụ một ion trái dấu trong sắc

ký tạo cặp ion hoặc một chất chọn lọc đối quang trong trường hợp sắc ký sử dụng phatĩnh không chọn lọc đối quang

1.4.6 Detector

Detector hấp thụ tử ngoại/khả kiến gồm cả detector chuỗi diod là được sử dụngphổ biến nhất Detector huỳnh quang, detector khúc xạ vi sai, detector điện hóa,detector khối phổ, detector tán xạ ánh sáng bay hơi, detector phóng xạ hoặc các loạidetector đặc biệt khác cũng có thể được sử dụng

1.4.7 Các thông số trong sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.4.7.1 Sắc đồ

Sắc đồ (hay sắc ký đồ) là một đồ thị hay một cách trình bày khác mô tả sự thayđổi của đáp ứng của detector (hay nồng độ của chất hay một đại lượng khác dùng làmthước đo nồng độ của chất) theo thời gian, thể tích hay khoảng cách Một sắc đồ lýtưởng có dạng một chuỗi các pic kiểu Gauss trên một đường nền

1.4.7.2 Thời gian lưu và thể tích lưu

Trong sắc ký rửa giải, sự lưu giữ của một chất có thể được biết dưới dạng thờigian lưu tR. Thời gian lưu được xác định trực tiếp trên sắc đồ bởi vị trí của đỉnh pic Từthời gian lưu có thể tính được thể tích lưu VR dựa trên công thức:

w 0,05 là chiều rộng của pic ở 1/20 chiều cao của pic;

d là khoảng cách từ đường thẳng đứng đi qua đỉnh pic đến cạnh phía trước của

pic ở 1/20 chiều cao của pic

Khi As = 1,0 thì pic hoàn toàn đối xứng (lý tưởng)

Hình 1.5 Hệ số đối xứng trong sắc ký

1.4.7.5 Hiệu năng của cột và số đĩa lý thuyết biểu kiến

Tùy theo kỹ thuật được sử dụng, dựa trên các dữ liệu thu được trong điều kiệnđẳng nhiệt, đẳng dòng hay đẳng mật độ, hiệu năng của cột (hay hiệu lực biểu kiến củacột), biểu thị dưới dạng số đĩa lý thuyết biểu kiến (N), có thể tính được theo công thứcdưới đây:

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu và đặc điểm của đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là các mẫu thực phẩm chức năng bao gồm: các nền mẫu

tự tạo, các nền mẫu dùng để xây dựng quy trình thẩm định và các mẫu lưu hành trênthị trường có thành phần và thể chất phức tạp, tiêu chí phân tích đa dạng

Cụ thể là:

 Viên nén Webber naturals Alpha-Lipoic Acid 100mg

 Viên nén Alpha-Lipoic Acid 300mg

 Swanson Alpha Lipoic Acid 50mg

Ngoài ra còn có 3 nền mẫu đặc trưng dùng để phân tích và nghiên cứu đánh giáquy trình theo yêu cầu của ISO 17025-2017 mà trong đó cụ thể AGL 03 yêu cầu bổsung để công nhận các phong thử nghiệm lĩnh vực hóa (Văn phòng công nhận chấtlượng BOA) thì đối với các mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe bào chế dưới dạng thuốcthì xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp trên các dạng bào chế: Bào chế dạng rắn,lỏng, thân dầu/ưa dầu, cốm… .Ở đây ta chọn 03 dạng bào chế thường gặp nhất đối vớihoạt chất Alpha Lipoic Acid bao gồm:

 Nền mẫu 1: Dung dịch tiêm truyền Thiotic acid 300mg/12ml (nền mẫu ALA dạng lỏng)

 Nền mẫu 2: Viên nén Thực phẩm bảo vệ sức khoẻ Alpha Lipoic Acid 600mg (nền mẫu ALA dạng rắn)

 Nền mẫu 3: Thực phẩm chức năng Omega 3-4-6, Alpha Lipoic Acid 780mg (nền mẫu ALA ưa dầu)

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện nghiên cứu phân tích ALA trong thực phẩm chức năng, quy trình nghiên cứu được thực hiện như sau:

 Sử dụng hệ thống phân tích Sắc ký lỏng tiến hành nghiên cứu Khảo sát cácthông số HPLC, đưa ra quy trình và tiến hành xác định ALA bằng HPLC Lựa chọnquy trình phân tích, lựa chọn các thông số và điều kiện quy trình phù hợp nhất Mụcđích sao cho pic sắc ký lỏng tách tốt, có độ phân giải tốt nhất

 Thực hiện mô hình quy hoạch và tối ưu hóa thực nghiệm trên nền mẫu thêmchuẩn, từ đó đưa ra các thông số tối ưu cho quá trình chiết tách ALA trên các nền mẫuthực phẩm Nhằm mục đích chiết tách sản phẩm được tối đa và mức độ chiết cao nhất

 Xây đựng quy trình và đánh giá quy trình phân tích Sau đó tiến hành thực hiệnphân tích đối chứng về quy trình với các phòng thí nghiệm khác nhau

 Khảo sát một số mẫu thực phẩm chức năng theo quy trình đã tối ưu

2.1.3 Mục tiêu nghiên cứu

 Xây dựng được quy trình phân tích ALA trong một số thực phẩm chức năng,quy trình này phải tối ưu và phân tích được hầu hết các mẫu thực phẩm chức năng cóchứa ALA trên thị trường

 Quy trình đã xây dựng được đánh giá theo ISO 17025:2017 từ đó được đưa vàoquy chuẩn trong phòng thí nghiệm

2.1.4 Chất chuẩn, dung môi, hóa chất

2.1.4.1 Chất chuẩn

Chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu gồm có:

 Alpha Lipoic Acid (Hàm lượng: 99,0 %; Nơi sản xuất: Trung Quốc; Hạn dùng: 03/2021; Đã kiểm tra và thực hiện nối chuẩn)

 Alpha Lipoic Acid (Hàm lượng: 99,9%; Viện An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia)

2.1.4.2 Dung môi, hóa chất

Một số dung môi, hóa chất khác được sử dụng trong nghiên cứu gồm có:

 Acetonitrile (Merck; Lô: K49707491; Hạn dùng: 30/11/2020)

 Acid phosphoric 85% (Trung Quốc)

 Acid sulfuric đậm đặc 95% (Prolabo; Lô: 17J44013; Hạn dùng:

20/11/2022)

 Methanol HPLC (Merck; Lô: I0916118; Hạn dùng: 30/9/2020)

 Ethanol Absolution (Prolabo; Lô: 17K074009; Hạn dùng: 03/11/2022)

 NaOH (Prolabo; Lô: 17E4110; Hạn dùng: 05/2020)

 Tetrahydrofuran (Prolabo; Lô: 14L090500; Hạn dùng: 12/2019)

 Acid Formic 98-100% (Merck; Lô: S5779554; Hạn dùng: 30/04/2021)

 Acid Acetic 100% (Prolabo; Lô: 17E034008; Hạn dùng: 03/2022)

 Ethylenglycol (Trung Quốc)

 Acetanilid (Merck; Lô: S6921344; Hạn dùng: 31/07/2019)

 Saccharose (Merck; Lô: K47396387; Hạn dung: 31/01/2020)

 Tinh bột (Trung Quốc)

 Dầu thực vật

2.1.5 Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị dụng cụ theo quy định và yêu cầu của ISO 17025 – 2017 và được

Viện kiểm nghiệm thuốc TW và các công ty hiệu chuẩn và bảo trì gồm:

 Máy sắc ký lỏng hiệu nâng cao (Model: U-3000; Nơi sản xuất: Dionex)

 Máy sắc ký lỏng hiệu nâng cao (Model: D7000; Nơi sản xuất: Hitachi)

 Cân phân tích 4 số lẻ (Model: ML 204/01; Nơi sản xuất: Thụy sĩ)

 Bể điều hòa nhiệt độ (Model: 1,5HP; Nơi sản xuất: LG)

 Nồi cách thủy (Model: WNB145; Nơi sản xuất: Đức)

 Máy li tâm (Model: Z206A; Nơi sản xuất: Đức)

 Bể siêu âm (Model: Elma; Nơi sản xuất: Anh)

 Giấy lọc, màng lọc 0,45m

 Bếp điện, nhiệt kế thủy tinh

 Dụng cụ thủy tinh chính xác cấp A (Pipet; bình định mức)

 Dụng cụ thủy tinh (Bình gạn; cốc có mỏ)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Xác định nồng độ ALA trong các mẫu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Trong nghiên cứu này, việc xác định nồng độ ALA trong các mẫu được thựchiện bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC trên máy Ultimate 3000,Hãng Dionex – Mỹ:

 Bơm dung môi 4 kênh (Model: LPG-3400SD; tốc độ dòng 0,001 – 10,0

ml/phút; Độ đúng tốc độ dòng: ± 0,1%; Độ chính xác tốc độ dòng: < 0,05% )

 Khoang chứa dung môi (Model: SR-3000)

 Buồng điều nhiệt cột (Model: TCC-3000SD; Dải nhiệt độ 5oC đến 70oC; Độ chính xác ± 0,5oC; Độ đúng ± 0,1oC )

 Diode Array Detector (Model DAD 3000; Cấu tạo dạng mảng quang diodequang với 1024 mảng diode không cần motor quay Độ phân giải hệ quang: < 1nm;Khoảng bước sóng: 190 – 800nm; Nguồn sáng sử dụng đèn Deuterium cho khoảng

UV và Tungsten cho khoảng Vis…)

Hình 2.1 Hệ thống máy HPLC Ultimate 3000

 Phần mềm điều khiển Chromeleon

Hình 2.2 Giao diện phần mềm Chromeleon của máy HPLC Ultimate 3000

2.2.1.2 Khảo sát cột sắc ký lỏng

a) Bàn luận hướng nghiên cứu:

Khi nghiên cứu cấu tạo và tính chất của ALA, cho thấy ALA là hoạt chất cókhối lượng phân tử nhỏ (<5000g/mol), tan tốt trong các dung môi hữu cơ Vì vậynghiên cứu này lựa chọn phương pháp sắc ký pha đảo với 2 loại cột sau:

 C18–Octadecyl silane: Octadecyl silane liên kết với silicagel xốp kích thước từ

Bảng 2.1 Danh mục các loại cột khảo sát trong quá trình nghiên cứu

a) Bàn luận hướng nghiên cứu:

Việc lựa chọn pha động phải yêu cầu: Hòa tan được mẫu phân tích, phải trơ vớipha tĩnh, bền vững theo thời gian, có độ tinh khiết cao, nhanh đạt cân bằng trong quátrình sắc ký, phù hợp với các loại đầu dò để phát hiện chất phân tích, có độ nhớt thấp

để tránh áp suất dội lại cao, ngoài ra phải có tính kinh tế

Ngoài ra ở các dạng chất hữu cơ trong mẫu nghiên cứu thường tồn tại ở cácdạng muối và kết tinh trên cột khi gặp MeOH hay ACN chính vì vậy cần sử dụng môitrường pH thấp để tránh tắt nghẽn cột Các loại acid thường dùng trong HPLC thườngacid yếu như: acid acetic, acid formic, acid phosphoric…

Khảo sát các loại acid trên ta thấy acid phosphoric H3PO4 tốt nhất Ngoài ra nó

là acid vô cơ, ít hấp thụ ở các bước sóng tử ngoại Tiến hành khảo sát nồng độ phù hợpnhất của acid H3PO4 sao cho pH phù hợp tách tốt mà không làm ảnh hưởng đến biếnđổi trong pha tĩnh

Bên cạnh H3PO4, sau khi khảo sát thăm dò các loại dung môi ở bảng trên nhậnthấy ACN là dung môi hữu cơ phù hợp nhất Acetonitril cung cấp lợi ích kép là gâynhiễu thấp do độ hấp thụ UV ở mức kém và tuổi thọ của cột được kéo dài, cũng như nócho phép việc phân tích diễn ra ở áp suất thấp nên sẽ chọn ACN phối hợp với H3PO4

làm pha động để khảo sát nghiên cứu

Chọn đầu dò UV ở đa bước sóng: 208nm, 215nm, 218nm, 220nm

18Thể tích tiêm: 20µl.

Nhiệt độ cột: 30oCCột tách: RP-18e (5μm; 250 x 4.6mm)Pha động: Lựa chọn tỉ lệ ACN: H3PO4

 Các nồng độ H3PO4 dưới đây hay dùng trong sắc kí lỏng pha đảo nên sẽ chọn thứ tự để khảo sát và chọn ra nồng độ nào phù hợp nhất cho quá trình phân tích

2.2.1.4 Khảo sát bước sóng [11]

a) Bàn luận hướng nghiên cứu:

Trong phần khảo sát pha động, cài đặt trong hệ thống phân tích sắc ký với đầu dòDAD điều kiện quét phổ UV-VIS từ 190nm đến 700nm Nhận thấy ở bước sóng từ190nm đến 220nm độ hấp thu của ALA cho những tín hiệu tốt Việc quét phổ UV-Vis

ởtrên máy HPLC khác với quét trên máy quang phổ Như hình 3.9 quá trình quét phổnày được chia làm 3 vùng trên một pic bao gồm vùng: Upslope 50%; Apex 100%;Downslope 50% Từ 2 vùng 50% trước và sau một pic để đối chiếu với vùng chínhgiữa 100% cho ra độ phù hợp hay còn gọi là độ tinh khiết của pic Độ tinh khiết > 999

là đạt yêu cầu

Nghiên cứu này tiến hành khảo sát ở 4 bước sóng sau đây: 208nm, 215nm,218nm, 220nm Riêng các bước sóng gần và dưới 200nm không thực hiện khảo sát vìđây là vùng giới hạn dưới của đèn HPLC nên dễ gây sai số

Hình 2.3 Phổ UV-VIS của hoạt chất ALA

b) Cách tiến hành:

 Tiến hành với điều kiện sắc ký sau:

 Pha dung dịch chuẩn: Thực hiện với 5 nồng độ 0,1mg/ml; 0,2mg/ml;0,3mg/ml; 0,4mg/ml; 0,5mg/ml (Đây là khoảng nồng độ làm việc sau này khi phântích mẫu) Các dung dịch chuẩn này được pha trong dung dịch ACN Sau đó xây dựngđường chuẩn để tìm ra ở bước sóng nào tốt nhất để lựa chọn phân tích

1,1ml/min; 1,3ml/min; 1,5ml/min; 1,7ml/min

2.2.2 Quy hoạch và tối ưu hóa thực nghiệm

2.2.2.1 Khái niệm về quy hoạch thực nghiệm

Quy hoạch thực nghiệm là tập hợp các tác động nhằm đưa ra chiến thuật làm

thực nghiệm từ giai đoạn đầu đến giai đoạn kết thúc của quá trình nghiên cứu đối

tượng (từ nhận thông tin mô phỏng đến việc tạo ra mô hình toán, xác định các điều

kiện tối ưu), trong điều kiện đã hoặc chưa hiểu biết đầy đủ về cơ chế của đối tượng

Đối tượng quy hoạch thực nghiệm là một quá trình hoặc hiện tượng nào đó có

những tính chất, đặc điểm chưa biết cần nghiên cứu Người nghiên cứu có thể chưa

hiểu biết đầy đủ về đối tượng nhưng đã có một số thông tin tiên nghiệm (dự đoán) dù

chỉ là sự liệt kê sơ lược những thông tin biến đổi, ảnh hưởng đến tính chất đối tượng

2.2.2.2 Khái niệm về tối ưu hóa

Tối ưu hóa là quá trình tìm kiếm điều kiện tối nhất (điều kiện tối ưu) của hàm

số được nghiên cứu Đây là quá trình xác định cực trị của hàm hay tìm điều kiện tối ưu

tương ứng để thực hiện một quá trình cho trước

Để đánh giá điểm tối ưu thì cần lựa chọn chuẩn tối ưu

2.2.2.3 Các bước quy hoạch và tối ưu hóa thực nghiệm [5]

Quy hoạch thực nghiệm bằng phương pháp trực giao bậc 2:

 Lựa chọn yếu tố và mức yếu tố ảnh hưởng, xác định tâm quy hoạch, khoảng

2k là số thí nghiệm ở nhân phương án

2k là số thí nghiệm ở các điểm (*) (Ví dụ: k = 3, 2k = 6, số thí nghiệm tại

 Thực hiện thí nghiệm theo mô hình đã thiết lập lấy kết quả để xây dựng

phương trình hồi quy

 Phương pháp trực giao cấp 2 có phương trình hồi qui có dạng sau: Y1 = b0 +

b1x1 + … + bkxk + b12x1x2 + … + b11x12 + … + bkkxk2

Sau khi thực hiện quy hoạch xong kiểm tra phương trình hồi quy nếu tươngthích và phù hợp với thực nghiệm thì ta tiến hành thực hiện các phương pháp tối ưuthực nghiệm tìm ra các thông số của các yếu tố phù hợp nhất bằng nhiều phương phápkhác nhau

Để nhanh chóng và thuận lợi, các công việc quy hoạch và tối ưu hóa được thực hiện trên phần mềm Modde 5

2.2.2.4 Xây dựng điều kiện xử lý mẫu bằng quy hoạch và tối ưu hóa thực nghiệm

a) Bàn luận hướng nghiên cứu

Nhận thấy ALA hòa tan tốt trong ACN và các dung môi hữu cơ, vì vậy nghiêncứu này dùng ACN để chiết xuất lượng hoạt chất ALA trong mẫu thử Ngoài ra vìtrong thực phẩm chức năng có nhiều thành phần phức tạp nên cần phối hợp tỷ lệ thích hợp giữa ACN: H2O để tăng khả năng chiết xuất và hòa tan mẫu

Việc chiết tách ALA yêu cầu phải trộn đều mẫu, nghiền mẫu thật kỹ, để đảmbảo tính đồng nhất Quá trình chiết tách được tiến hành trong thiết bị siêu âm ở điềukiện nhiệt độ nhất định Chính vì vậy cần khảo sát điều kiện nhiệt độ môi trường chiếttách và thời gian siêu âm để hòa tan và chiết hoàn toàn lượng ALA ra khỏi mẫu phântích

Để tính toán và xây dựng quy trình xử lý mẫu, công việc xử lý số liệu đượcthực hiện trên phần mềm Modde 5, sử dụng phương pháp quy hoạch trực giao cấp 2 vàtối ưu hóa trực tiếp trên phần mềm

Việc chọn mẫu nghiên cứu: Do không biết chính xác được hàm lượng hoạt chấtALA trong các mẫu thực phẩm chức năng trên thị trường, vì vậy rất khó để xác địnhviệc chiết tách và hòa tan mẫu có hoàn toàn hay không Do đó nghiên cứu này sử dụngnền mẫu tự tạo là nền mẫu đã biết trước nồng độ ALA Nền mẫu này là nền mẫu thựcphẩm chức năng không có ALA nhưng sau đó được bổ sung một lượng ALA nhất định

để đưa vào nghiên cứu

Mục đích yêu cầu là hàm mục tiêu sao cho lượng ALA được hòa tan và chiếttách là lớn nhất và lượng này phải đảm bảo điều kiện thu hồi trong phụ lục F củaAOAC

b) Cách tiến hành

Chuẩn bị mẫu thử và mẫu chuẩn ALA:

 Mẫu thử: Sử dụng nền mẫu thực phẩm chức năng tự tạo có bổ xung thànhphần (Tinh bột; Saccharose; Acetanilid; Lipid) mang đặc trưng gần giống dạng thựcphẩm nhất gồm (Đường; protein; béo; chất xơ), sau đó được bổ sung thêm một lượngchuẩn vào mẫu, tiến hành nghiền mịn, trộn đều và đồng nhất mẫu Mẫu này có nồng

độ 500mg/g ALA (Ta chọn nồng độ này vì đa số các dạng thuốc thực phẩm chức năngtrên thị trường bao gồm viên ALA 600mg, 300mg, 100mg có hàm lượng như vậy)

 Chuẩn bị mẫu thử: Cân khoảng 0,2g mẫu thử (tương ứng với 100mg ALA)vào bình nón 250ml, thêm khoảng 5ml NaOH 0,1N, lắc đều (NaOH vai trò thúc đẩyquá trình hòa tan mẫu) Sau đó thêm 70ml ACN: H2O (m:n); (v/v), điều chỉnh nhiệt độ

và thời gian siêu âm theo mô hình quy hoạch trực giao bậc 2 Sau khi kết thúc xong thìchuyển toàn bộ mẫu vào bình định mức 100ml, định mức bằng dung dịch ACN:H2O(m:n); (v/v) tương ứng Hút chính xác 10ml dịch lọc cho vào bình định mức 50ml, định mức bằng nước cất và lắc đều

 Chuẩn bị mẫu chuẩn: Cân tương ứng khoảng 100mg ALA + 5ml NaOH 0,1Nrồi lắc đều, định mức vừa đủ 100 ml bằng dung dịch ACN Hút chính xác 10ml dungdịch này cho vào bình định mức 50ml, định mức bằng nước cất và lắc đều

Sau khi chuẩn bị xong ta tiến hành thực hiện thí nghiệm theo mô hình quy hoạch

và tối ưu hóa thực nghiệm trên phần mềm Mode 5

2.2.3 Xác nhận giá trị của phương pháp

2.2.3.1 Độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp chấtkhác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất Cụ thể, trongphép phân tích định tính, là phải chứng minh được kết quả là dương tính khi có mặtchất phân tích, âm tính khi không có mặt nó, đồng thời kết quả phải là âm tính khi cómặt các chất khác có cấu trúc gần giống chất phân tích Trong phép phân tích địnhlượng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng củatất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác

Tính đặc hiệu thường liên quan đến việc xác định chỉ một chất phân tích

a) Bàn luận hướng nghiên cứu

Việc xác định tính đặc hiệu được thực hiện bằng cách sắc ký các loại mẫu sauđây theo quy trình phân tích: Mẫu trắng, mẫu chuẩn và 03 nền mẫu thử có chất phân tích gồm thuốc tiêm truyền, thuốc viên nén, thuốc viên nang (theo mục 2.1.1)

nghĩa thống kê với các pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn (thư ờngtrên mặc định của máy sắc ký do nhà sản xuất thì độ lệch thời gian lưu giữa chuẩn vàthử không quá 5%) Trên sắc ký đồ của mẫu thử pic của chất cần phân tích tách hoàntoàn khỏi các pic khác nếu có trên nền mẫu

 Sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn

 Pic của chất cần phân tích trong sắc ký đồ của dung dịch thử phải tinh khiết, phổ UV-Vis của thử và chuẩn phải tương ứng với nhau

b Cách tiến hành

 Chuẩn bị mẫu trắng: dung dịch ACN:H2O (63:37) (v/v)

 Chuẩn bị mẫu chuẩn: dung dịch chứa chất chuẩn cần phân tích được chuẩn bị theo qui trình, lấy nồng độ 0,1mg/ml để so sánh

 Nền mẫu 3: Lấy 20 viên nang mềm, lấy hỗn dịch trong nang trộn đều Cân

và xử lý mẫu theo quy trình trên

2.2.3.2 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có

sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích

Khoảng làm việc của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ giữa giớihạn trên và giới hạn dưới của chất phân tích (bao gồm cả các giới hạn này), tại đó đượcchứng minh là có thể xác định được bởi phương pháp nhất định với độ đúng, độ chínhxác và độ tuyến tính như đã nêu

Đường chuẩn được tính bằng chất chuẩn tinh khiết, thường trong thực phẩmhay thực phẩm chức năng người ta lấy ít nhất 05 điểm chuẩn đem đo lấy tín hiệu chuẩn

để khảo sát và biều diễn phương trình đường chuẩn Phương trình đường chuẩn códạng: y = ax + b và được đánh giá bằng hệ số tương quan R2 R2 càng tiệm cận với 1,000 càng tốt

Đường chuẩn và phương trình hồi quy

70 60

Hình 2.4 Đường chuẩn và phuơng trình hồi quy của một chất

a) àn luận hướng nghi n cứu [6]

Việc khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của phương pháp liên quan đến các

giá trị sau:

 Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn (tối thiểu 5 nồng độ) Xác định các giá trị đo

được y theo nồng độ x (lặp lại 2 lần lấy giá trị trung bình) Nếu sự phụ thuộc tuyến

tính, ta có khoảng khảo sát đường biểu diễn là một phương trình:

b: giá trị hệ số chặn intercept

và hệ số tương quan:

∑ ̅̅̅̅̅

 Giới hạn chấp nhận của đường chuẩn:

 Hệ số hồi quy tuyến tính (R): Chỉ tiêu đầu tiên của một đường chuẩn đạt

yêu cầu là hệ số tương quan hồi quy (Coefficient of correlation) R phải đạt yêu cầu

sau :

0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R2 ≤ 1 : Có tương quan tuyến tính rõ rệt

 Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn Sau khi

lập

đường chuẩn xong cần kiểm tra bằng phương pháp tính ngược lại nồng độ các điểm

chuẩn sử dụng để xây dựng đường chuẩn, từ đó tính các giá trị độ chệch theo công

thức sau :

Trong đó :

Δi : Độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn

Ct : Nồng độ tính ngược theo đường chuẩn của các điểm chuẩn

Cc : Nồng độ của các điểm chuẩn

Theo quy định của nhiều tổ chức của Mỹ, Canada, Châu Âu, giá trị Δ không được vượt quá ± 15% cho tất cả các nồng độ [6]

b) Cách tiến hành

Chuẩn bị chất chuẩn: Cân tương ứng khoảng 50mg chuẩn ALA + 5ml NaOH0,1N, lắc đều, định mức vừa đủ 100 ml bằng dung dịch ACN:H2O (63:37); (v/v) Hútchính xác 5,8,10,20,25 ml dung dịch này cho vào bình định mức 50ml, định mức bằngnước cất và lắc đều Nồng độ chuẩn từ 0,05mg/ml đến 0,25mg/ml

Điều kiện sắc ký chạy như quy trình trên

2.2.3.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn đ nh lư ng

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu cóthể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được (đối với phương pháp địnhlượng)

Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử

mà có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mongmuốn

LOQ chỉ áp dụng cho các phương pháp định lượng

a) Bàn luận hướng nghiên cứu [6]

Cách tính giới hạn phát hiện (LOD) dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu (S/N) Cáchnày áp dụng đối với các quy trình phân tích sử dụng các công cụ có nhiễu đường nền.Thông thường cách tính này áp dụng phổ biến cho các phương pháp sắc ký, điện di

Một số yêu cầu :

 Phân tích mẫu (mẫu thực, mẫu thêm chuẩn hoặc mẫu chuẩn) ở nồng độ thấp

có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Số lần phân tích lặp lại 3-4 lần Xác định

tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio)

Trong đó : S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích N

là nhiễu đường nền

 Nhiễu đường nền được tính về hai phía của đường nền và tốt nhất là tínhnhiễu lân cận hai bên của pic, bề rộng mỗi bên tối thiểu gấp 10 lần chiều rộng của pictại nửa chiều cao

 LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu

26đường nền, thông thường lấy S/N =3.

Hình 2.5 Xác định LOD, LOQ bằng nhiễu đường nền

 Tính giới hạn định lượng (LOQ) dựa trên tính hiệu nhiễu cách này chỉ ápdụng đối với các quy trình phân tích sử dụng các công cụ có nhiễu đường nền Cáchtính toán hoàn toàn tương tự như trong phần tính LOD

 LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10-20 lần nhiễu

đường nền, thông thường thường lấy S/N = 10

 Tuy nhiên phương pháp này đang dùng để định lượng nên ta chỉ cần quan tâm

đến LOQ, còn LOD là chỉ dùng để tham khảo

b) Cách tiến hành

 Phân tích mẫu trắng có thêm chuẩn ALA xử lý mẫu như quy trình cần đánhgiá trên, sau đó pha loãng ở các nồng độ thấp dưới giới hạn thấp nhất của đường chuẩnđến khi phù hợp

 Nồng độ pha loãng bao gồm: 0,50mg/L; 1,00mg/L; 1,5mg/L

 Tiến hành phân tích lặp lại 4 lần

2.2.3.4 Đánh giá độ chụm của phương pháp

Trong nhiều trường hợp các phép thử nghiệm trên những đối tượng và vớinhững điều kiện khác nhau thường không cho kết quả giống nhau Điều này do các sai

số ngẫu nhiên của mỗi quy trình gây ra, người thao tác không thể kiểm soát được hoàntoàn tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm Do đó, để kiểm soát đượccác sai số này, phải dùng đến khái niệm độ chụm Độ chụm chỉ phụ thuộc vào sai sốngẫu nhiên và không liên quan đến giá trị thực Độ chụm là một khái niệm định tính vàđược biểu thị định lượng bằng độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên Độ chụm càng thấpthì độ lệch chuẩn hay hệ số biến thiên càng lớn