Phân lập và xác định một số đặc điểm sinh học của virus gây bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú (epinephelus spp) luận văn thạc sĩ nông lâm ngư

Bộ GIáO DụC Và đào TạO TRờng đại học vinh nguyễn thị vui PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH Ở CÁ MÚ Epinephelus spp.. Qua một số nghiên

Bộ GIáO DụC Và đào TạO TRờng đại học vinh

nguyễn thị vui

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ

THẦN KINH Ở CÁ MÚ (Epinephelus spp.)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP THẠC SỸ

CHUYấN NGÀNH NUễI TRỒNG THỦY SẢN

Nghệ An - 2012

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn chânthành và sâu sắc tới Cô giáo TS Phạm Thị Tâm, người đã định hướng nghiêncứu đề tài cũng như hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trongsuốt quá trình thực hiện luận văn.

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới sự hỗ trợ về tài chính cũng nhưphương pháp từ đề tài cấp Nhà nước mã số KC04.03/11- 15 Tôi xin cảm

ơn tập thể cán bộ Khoa Nông Lâm Ngư, Trung tâm THTN, Khoa Sau đạihọc Trường Đại học Vinh đặc biệt là tập thể cán bộ, học viên và sinhviên Viện Đại học Mở Hà Nội, chia sẻ khó khăn giúp tôi triển khai cácnội dung của đề tài

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo, gia đìnhbạn bè đã động viên và nhiệt tình ủng hộ để tôi hoàn thành khóa học này

Nghệ An, ngày 10 tháng 10 năm 2012

Tác giả

Nguyễn Thị Vui

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đặc điểm sinh học cá mú 3

1.1.1 Hệ thống phân loại cá mú 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học 3

1.2 Tình hình dịch bệnh trên cá mú trên thế giới và Việt Nam 6

1.2.1 Trên thế giới 6

1.2.2 Tại Việt Nam 9

1.3 Một số nghiên cứu về bệnh do Virus trên cá mú 10

1.3.1 Trên thế giới 10

1.3.2 Tại Việt Nam 12

1.4 Một số đặc điểm sinh học của virus NNV 14

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu: 20

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Phương pháp phân lập virus 20

2.2.2 Phương pháp tách dòng gen 25

2.2.2.6 Phương pháp giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động .27

2.2.3 Phương pháp xác định đặc tính sinh học của NNV 28

2.4 Phương pháp xử lý số liệu, đánh giá, so sánh 31

2.5 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 31

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Kết phân lập virus gây bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú 32

3.1.1 Kết quả sàng lọc mẫu nhiễm virus gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp mô bệnh học 32

3.1.2 Kết quả sàng lọc mẫu nhiễm virus gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp RT-PCR 34

3.1.3 Kết quả phân lập virus trên tế bào mẫn cảm 35

3.1.4 Kết quả xác định loài dựa trên trình tự gen mã hóa kháng nguyên của NNV phân lập 37

3.2 Kết quả xác định đặc tính sinh học của virus gây bệnh hoại tử thần kinh (NNV) 45

3.2.1 Đặc tính gây bệnh của virus ở các nồng độ pha loãng 45

3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh của virus 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

KẾT LUẬN 53

KIẾN NGHỊ 53

PHỤ LỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC 59

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Polymerase Chain Reaction Reverse transcription-polymerase chain reactionStriped Snakehead cell line

Tissue Culture Infectious DoseViral Encephalopathy and RetinopathyViral Nervous Necrosis

Necrosis Nervous ViralEpinephelus

Barfin flounder nervous necrosis virusRedspotted grouper nervous necrosis virusStriped jack nervous necrosis virus

Tiger puffer nervous necrosis virusGrouper nervous necrosis virusGreasy grouper nervous necrosis virusIndirect flounder nervous systemImmunohistochemistry

Central nervous systemLeibovitz 15

50% Tissue culture infective doseOpen readinh flame

RNA depending RNA polymeraseCộng tác viên

Tế bàoBiểu hiện bệnh

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả kiểm tra virus bằng phương pháp mô bệnh học 33Bảng 3.2 Kết quả kiểm tra virus gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phươngpháp RT-PCR 34Bảng 3.3 Kết quả phân lập virus trên tế bào GS 01 36Bảng 3.4 So sánh mức độ tương đồng của trình tự đoạn gen T2 thu được vớicác trình tự của GeneBank 43Bảng 3.5 Kết quả xác định khả năng gây bệnh của NNV trên tế bào GS1 46Bảng 3.6 Kết quả gây nhiễm NNV trên ấu trùng cá mú 47

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu tạo của Nervous Necrosis Virus 15

Hình 1.2 Cấu trúc genome của Nervous Necrosis Virus 16

Hình 3.1 Bệnh tích tế bào ở mô não và mô mắt cá 32

Hình 3.2 Bệnh tích của tế bào GS1 sau khi gây nhiễm NNV 35

Hình 3.3 Mức độ CPE của tế bào GS1 gây nhiễm NNV 36

Hình 3.4 Kết quả điện di kiểm tra RNA tổng số trên gel agarose 1% 37

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 1% 38

Hình 3.6 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α 40

Hình 3.7 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt bằng enzyme EcoRI 41

Hình 3.8 Kết quả tinh sạch DNA plasmid tái tổ hợp 42

Hình 3.9 Mật độ tế bào sống sót sau khi gây nhiễm NNV 49 Hình 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra ấu trùng cá thí nghiệm 51

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Việt Nam có điều kiện địa lý và khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm, có bờbiển dài 3260km, 12 đầm phá eo vịnh, 112 cửa lạch và có hơn 600.000 havùng triều Đó là các điều kiện thuận lợi cho việc phát triển nghề biển nóichung và nghề nuôi trồng thuỷ sản nói riêng

Ngành thủy sản trong những năm gần đây đã và đang phát triển nhanhchóng, dần khẳng định vị trí của mình và trở thành một trong những ngànhkinh tế mũi nhọn của thế giới cũng như của Việt Nam, với kim ngạch xuấtkhẩu nông, lâm, thuỷ sản theo thống kê của Bộ NN&PTNT tháng 9 năm 2012đạt 20,4 tỷ USD Trong đó nghề nuôi cá biển được đánh giá là một nghềmang lại hiệu quả kinh tế cao và cá mú được xem là một trong số những đốitượng chủ lực

Cá mú (Epinephelus spp.) có giá trị kinh tế rất cao do hàm lượng dinh

dưỡng giàu axit béo không no Thịt cá thơm ngon và bổ dưỡng cho nên cá múđược thị trường trong và ngoài nước rất ưa chuộng Có thể nói cá mú là đốitượng nuôi hấp dẫn với nhiều người dân vùng biển Tuy mang lại hiệu quả kinh

tế cao nhưng cá mú lại rất dễ nhiễm bệnh, tỷ lệ chết rất cao

Qua một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng những tác nhân gây bệnh chủ yếutrên cá mú thường là virus, nấm và vi khuẩn trong đó nguy hiểm nhất là bệnh

hoại tử thần kinh (Viral Nervous Necrocis - VNN) hay bệnh não và võng mạc (VER-Viral Encephalopathy) do Betanodavirus gây ra Virus có thể tấn công

và gây bệnh trên cá mú ở tất cả các giai đoạn phát triển song bệnh thường gặpnhiều nhất và gây tác hại lớn nhất là ở giai đoạn từ ấu trùng đến cá giống (10

- 45 ngày tuổi) Khi bị bệnh cá có biểu hiện rối loạn thần kinh như mất thăngbằng, bơi xoay tròn, bơi không định hướng, đầu chúc xuống dưới hoặc treotrên mặt nước hoặc nằm dưới đáy bể, đáy lồng Cá bệnh có thể chết sau 3 - 5

ngày với tỷ lệ chết cao từ 80-100% Ở Việt Nam, bệnh phân bố ở hầu hết cácvùng nuôi trên cả nước Mùa vụ xuất hiện bệnh từ tháng 5 đến tháng 10 đặcbiệt khi nhiệt độ nước cao (25-30ºC)

Như vậy để góp phần nâng cao hiệu quả trong nghề nuôi cá mú vàphòng, chữa bệnh hoại tử thần kinh cho cá, các đặc tính của virus gây bệnhcần được xem xét, nghiên cứu để đưa ra các giải pháp hữu hiệu, nhất là bệnhhoại tử thần kinh do virut gây ra Chính vì vậy, được sự cho phép của KhoaSau đại học, Trường Đại hoc Vinh và với sự hỗ trợ đề tài cấp nhà nước, mã

số: KC04.03/11-15 ,Khoa công nghệ sinh học Viện Đại học mở Hà Nội

chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Phân lập và xác định một số đặc điểm sinh

học của virus gây bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú (Epinephelus spp.)”

2 Mục tiêu đề tài

Đề tài được thực hiện với những mục tiêu sau:

- Phân lập được (Necrosis Nervous Viral NNV) gây bệnh cho cá mú

- Xác định được một số đặc tính sinh học của virus NNV làm tiền đềxác định dịch tễ bệnh, phòng bệnh

3 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được các mục tiêu trên, đề tài triển khai các nội dung nghiêncứu sau:

- Phân lập virus từ cá mú tự nhiên có biểu hiện bệnh hoại tử thần kinh

- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của virus gây bệnh hoại tử thầnkinh ở cá mú

Chương 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm sinh học cá mú

1.1.1 Hệ thống phân loại cá mú

Theo tài liệu của Lindberg G U(1969) và của FAO (1974) cá mú thuộc họ

Serranidae, phụ họ cá song (Epinephelinae) Ở khu vực Ấn Độ Thái Bình

Dương đã phát hiện được 63 loài thuộc giống Epinephelus Ở biển Việt Nam,

họ cá mú có 13 giống và trên 40 loài, riêng giống cá song có tới 23 loài

- Đặc điểm môi trường sống

Cá mú sống ở vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới Chúng phân bốrộng rãi ở vùng nước ven bờ, cửa sông, quanh các đảo, các rạn đá san hô chotới vùng biển sâu 70 - 80m Môi trường sống của chúng thay đổi tuỳ theo

loài, chẳng hạn như loài E akaara, Cephalopholis miniata sống ở những nơi

nước có độ trong cao, có chất đáy là rạn đá ngầm, san hô ngoài khơi, các

loài E merra, E fuscogustatus, E bleekeri sống chủ yếu ở vùng biển cạn,

nơi có bờ đá và rạn san hô, độ mặn cao và ổn định Cá con thường tìm thấy

ở trong các đám rong, cỏ biển Các loài E tauvina, E malabaricus, E.

coioides, E sexfasciatus thường sống cả ở vùng nước lợ và nước mặn, có

độ mặn từ 10 - 32 ‰, chất đáy rất đa rạng từ đáy cứng, cát đến đáy bùn Cácon thường tìm thấy ở vùng triều ven bờ, cửa sông và rừng ngập mặn

Các loài cá mú sống phân tán không tập trung thành đàn, phân bố chủyếu ở vùng biển ấm, mùa hè chúng thường tập trung ở vùng nước nônggần bờ, mùa đông di chuyển ra vùng nước sâu có cá rạn đá và san hô, chỉ

di cư với cự ly ngắn, do vậy chúng có thể sống được ở những nơi có nhiệt độ

từ 22 - 32oC, khoảng thích hợp cho tăng trưởng và phát triển là 26 - 30oC

Có thể sống bình thường ở môi trường cá độ pH từ 7,0 - 9,0, tuy nhiên thíchhợp là 7,5 - 8,5

- Đặc điểm dinh dưỡng và sinh trưởng

Cá mú thuộc động vật ăn thịt, thức ăn chủ yếu của chúng là các loàigiáp xác Crustacae, cá và một số các động vật không xương sống Trong tựnhiên chúng thường sống ẩn nấp ở các rạn đá, hang hốc nằm chờ con mồi đếngần mới đớp gọn Cá mú săn mồi mạnh nhất vào lúc chạng vạng tối và lúcrạng đông Theo Randall (1965), thức ăn trong dạ dày cá mú đỏ tại biểnCaribe có tới 83% là giáp xác và 17% là cá Cá mú thích ăn các loài giáp xáchơn cá, thích ăn mồi sống hơn mồi chết Cá mú giai đoạn nhỏ thức ăn là độngvật phù du như: rotifer, artemia, copepoda,…khi trưởng thành cá ăn là cácloài cá nhỏ, giáp xác, mực

Tốc độ tăng trưởng cá mú khác nhau giữa các loài, tốc độ tăng trưởng

một số loài cá mú nuôi ở nước ta sau 1 năm: cá mú đỏ (Cephalopholis

miniata) là 0,3 - 0,4 kg, cá Song Malabar (E malabaricus) và cá mú chấm

cam (E coioides) là 0,8 kg, cá mú mỡ (E tauvina) là 1,0 - 1,2 kg; cá mú nghệ (E lanceoratus) là 3 - 4 kg, đây cũng là loài lớn nhất trong họ Serranidae, cỡ khai thác được lớn nhất là 150 kg; cá mú chấm đỏ (E akaara)

lúc 1 tuổi dài 18 cm, 2 tuổi dài 18 - 24 cm, 3 tuổi dài 23 - 28 cm, khối lượng0,5 kg, 4 tuổi dài 26 - 33 cm khối lượng 0,7 - 1,0 kg, 5 tuổi dài 31 - 34 cm

- Đặc điểm sinh sản

là cá cái, lớn chuyển thành cá đực Thời điểm chuyển đổi giới tính khác

nhau tuỳ theo loài Ở loài E akaara chuyển đổi giới tính ở tuổi 4+ trở lên,

lúc có chiều dài 27 - 30 cm và trọng lượng 700 - 1.000 kg; cá có chiều dàidưới 26 cm, trọng lượng dưới 500 g thì không có cá đực;người ta đã pháthiện ra cá đực nhỏ nhất của loài này khi kích thước đạt 25 - 28 cm, trọng

lượng 500 - 600 g Các loài E tauvina, E coioides, E malabaricus chuyển

đổi giới tính lúc có chiều dài 65 – 75 cm, trên 75 cm và khối lượng trên 10 kgthì hoàn toàn là cá đực Tuy nhiên, vẫn có một số ít không có sự chuyển đổi giớitính, mà phát triển trực tiếp thành cá cái hoặc đực ngày từ khi còn nhỏ

- Tuổi và kích thước thành thục ở cá mú có sự khác nhau tùy theo loài

trọng lượng 700 - 1000g

- Hệ số thành thục và sức sinh sản của cá mú khác nhau tuỳ theo loài

Loài E malabaricus hệ số thành thục đạt cao nhất khi buồng trứng ở giai đoạn IV từ 2,5 - 7,9% Sức sinh sản của cá loài E tauvina, E malabaricus

từ 130.000 - 3.180.000 trứng/kg cá cái tuỳ theo các tháng trong mùa sinhsản, cũng như kích thước cá mẹ, sức sinh sản trung bình từ 500.000 -

1.000.000 trứng/ kg cá cái Loài E akaara có sức sinh sản tuyệt đối là

150.000 - 300.000 trứng/ kg cá cái, cá biệt là 500.000 trứng/ kg cá cái Loài

E coioides sức sinh sản là 600.000 - 1.900.000 trứng/kg cá cái, cá có trọng

lượng từ 3,5 - 5,0 kg số lượng trứng từ 2,3 - 3,9 triệu/ cá cái

- Mùa vụ sinh sản của cá mú thay đổi tuỳ theo loài, tuỳ theo vùng địa lý Cá m ú là loài đẻ rải rác quanh năm, nhưng thời điểm chính tháng

3 đến tháng 10

lên Trước khi đẻ trứng cá đực và cá cái bắt cặp và đuổi nhau ở tầng mặt, lúcnày cá đực màu sắc nhạt hơn, xương nắp mang xuất hiện nhiều vệt sáng

- Thụ tinh và phát triển phôi: Trứng đẻ ra được thụ tinh ngay trongmôi trường nước, đường kính trứng lúc này khoảng 0,76 – 0,82 mm và cógiọt dầu nhỏ giúp trứng nổi trong nước Trứng sau khi thụ tinh thì quá trìnhphân cắt tế bào và sự phát triển phôi xảy ra Ơ độ mặn 30 ppt, hàm lượngoxy trên 5 mg/L, nhiệt độ 26 – 30 oC thì sau thời gian từ 15 – 25 giờ trứng sẽ

nở ra cá bột

- Sự phát triển của cá bột: cá bột cá mu sau 1 ngày tuổi dài 2,18 mm,miệng đóng, chưa có sắc tố, khối moãn hoàng vẫn còn Sau 3 ngày tuổi,miệng mở, cá bắt đầu ăn thức ăn ngoài, lúc này ống tiêu hoá chưa hoànchỉnh Khi đạt 12 ngày tuổi, dài 3,57 mm; miệng, mắt, ống tiêu hoá hoànchỉnh, bắt đầu phát triển sắc tố thân Sau 18 ngày tuổi, dài 5 – 8 mm, vâyngực có hình con diều, gai lưng thứ 2 dài, giai đoạn này cá rất nhạy cảm vớicác yếu tố bên ngoài, thời điểm này tỷ lệ hoa hụt rất lớn 32 ngày tuổi, dài 8– 10 mm; vây phát triển hoàn tất và có sắc tố đen trên tất cả các tia vây, gailưng thứ 2 và cơ thể ngắn lại Cá 39 ngày tuổi dài 10 – 12 mm, các vây hoànchỉnh, tỷ lệ gai lưng thứ 2 giảm đáng kể Cá 54 ngày tuổi dài 16,5 mm, gailưng ngắn, hình dáng và sắc tố giống cá trưởng thành, nhưng chỉ nhỏ hơn vềkích thước

1.2 Tình hình dịch bệnh trên cá mú trên thế giới và Việt Nam

1.2.1 Trên thế giới

Cá mú là một trong những đối tượng được nuôi ở nhiều nước trên thếgiới như Đài Loan, Singapore, Thái Lan Trước đây, nguồn giống được cungcấp chủ yếu bằng đánh bắt ngoài tự nhiên Trong một vài năm trở lại đây,nhiều nước đã chủ động được nguồn cung cấp giống do sinh sản nhân tạo cá

luật tất yếu, khi nuôi trồng thuỷ sản mở rộng và phát triển thì dịch bệnh cũngngày càng gia tăng Những số liệu thống kê cho thấy 95% cá nuôi lồng bè và80% cá nuôi ao có ảnh hưởng bởi dịch bệnh Theo các chuyên gia, cả 2 loạiNodavirus và Iridovirus đã gây thất thoát 62,44% tổng giá trị nuôi Bệnh vikhuẩn cũng là một vấn đề trong nuôi cá mú, gây tổn thất khoảng 35,2% ởThái Lan (Somporn và ctv, 2001)

Ở Malaysia bệnh dịch là một trong những nguyên nhân làm thiệt hạikinh tế cho nghề nuôi biển ở đây Năm 1982, ước tính thiệt hại do dịch bệnhgây ra đối với nghề nuôi cá biển là 13 triệu đô la Năm 1988, dịch bệnh xảy ratrên 3 loài cá nuôi chính là cá hồng, cá chẽm, cá mỳ làm mất hơn 15 tỷ Yên

và năm 1990, bệnh do Vibrio đã làm thiệt hại khoảng 5 triệu đô la cho nghềnuôi cá biển (Leong Tak Seng, 1992)

Tại Singapore năm 1998, Chew lim và ctv đã phân lập được Nodavirus

từ loài E tauvina trên cỡ cá 2 - 5cm nuôi và xác định đó chính là nguyên nhân

gây chết 86-91% cá giai đoạn ương giống Cá bị bệnh không có dấu hiệu hoại

tử hay lở loét bên ngoài cũng như trong cơ thể, cá bột có biểu hiện mất thăngbằng, không định hướng trong khi bơi, hoạt động yếu dần bơi vòng tròn vàmột số nhảy lên mặt nước sau đó cơ thể yếu đi và chết

Trên loài E tauvina cũng phát hiện được Iridovirus gây bệnh với cỡ cá

100 - 200g và 2 - 4kg từ tháng 4 đến tháng 8 năm 1992, làm giảm tới 50% sảnlượng Cá bệnh không có dấu hiệu tổn thương, tuy nhiên, thường thấy cá thiếusinh khí, phản ứng chậm với các kích thích, cá thường chết vào ban đêm hoặcgần sáng (Chua và ctv, 1994)

Năm 1993, ở Singapore có 2 trại cá biển nuôi thâm canh bị bệnh đã gâythiệt hại tổng cộng là 360.500 đô la Singapore (Melba và ctv, 2001)

Ở Hàn Quốc, bệnh cá biển đã trở thành một vấn đề phức tạp và khógiải quyết Hầu hết, sự bùng nổ dịch bệnh đều liên quan mật thiết với quản lý

môi trường nuôi kém Vì vậy, nâng cao hiểu biết về kỹ thuật là vấn đề quantrọng trong nghề nuôi cá biển của nước này (Bondad – Reantaso, 2000)

Năm 1998, Sohn và Park tổng kết rằng bệnh VNN đã ảnh hưởng đến 7loài cá Mỳ nuôi ở Hàn Quốc, bệnh thường xảy ra vào mùa hè và tỷ lệ chết lêntới 80% trong vài tuần

Tại Thái Lan vào năm 1993, diện tích nuôi trồng và sản lượng sụt giảmtới 85 - 90% mà nguyên nhân chủ yếu là do nguồn cung cấp giống không đủ

và bệnh dịch xảy ra mạnh ở giai đoạn cá đang ương thành giống Một trongnhững bệnh nguy hiểm nhất đối với quá trình sản xuất giống ở đây chính làbệnh VNN (Danayadol và ctv, 1995)

Năm 1993, Iridovirus đã gây tác hại đến nghề nuôi cá mỳ ở miền Namnước này với cỡ cá 0,2 - 5kg và làm giảm 50% sản lượng cá nuôi (Danayadol

và ctv, 1994) Cũng trên cá mỳ, năm 1995 đã phát hiện thấy loài E.

malabaricus nuôi ở Thái Lan cỡ cá từ 2,5 - 15cm có triệu chứng tê liệt do

VNN gây ra và tỷ lệ chết lên tới 100% ở cỡ cá nhỏ, 20% ở cỡ cá lớn hơn(Danayadol và ctv, 1995)

Trong khi đó ở Indonesia tác nhân gây bệnh chủ yếu đã được tìm thấy

là vi khuẩn Vibrio, Sán ký sinh, Nodavirus và Iridovirus (Koesharyani và ctv,2001) Theo Koesharyani năm 2001, bệnh VNN đã xuất hiện và gây tác hại

trên một số loài cá mỳ: C altivelis, E malabaricus, E fuscoguttatus và

E.coioides nuôi ở nước này

Cũng theo Koesharyani bệnh do Iridovirus đã được tìm thấy trên loài

E coioides ở miền Bắc Sumatra, 2000 và gây chết tới 80% Gần đây, bệnh

này lại được tìm thấy trên loài E coioides và E bleekeri, tỷ lệ chết lên tới

100% trong vòng 2 tuần khi dấu hiệu bệnh lý đầu tiên xuất hiện

Tại Đài Loan, bệnh VNN đã xảy ra gây thành dịch trên các loài E.

fuscoguttatus, E akaara và E owoara Tác nhân Iridovirus cũng đã gây bệnh

trên cá mỳ nuôi ở Đài Loan năm 1992 và bùng phát trở lại năm 1995 và làmchết tới 60% (Melba và ctv, 2001)

Ở Nhật Bản bệnh dịch là một trong những vấn đề nghiêm trọng: năm

1992 thiệt hại về kinh tế đối với nghề nuôi cá biển ước tính khoảng 114,4triệu đô la (Angus Robert Camerone, 2001)

Tác nhân Nodavirus đã gây bệnh trên các loài E moara, E fasciatus,

Pseudocaran dentex, E akaara và C altivelis nuôi ở Nhật (Melba và ctv,

2001)

1.2.2 Tại Việt Nam

Theo Bùi Quang Tề (1996 - 1998) khi nghiên cứu trên 3 loài cá: mỳ

mỡ, mỳ sáu sọc, mỳ chấm tại khu vực Vịnh Hạ Long đã phát hiện được 13loài ký sinh trùng thuộc 12 giống, 11 họ, 7 bộ, 3 lớp, 3 ngành (mỳ mỡ gặp 12loài, mỳ sáu sọc gặp 10 loài, mỳ chấm gặp 9 loài) Tỷ lệ cảm nhiễm nhóm sán

lá đơn chủ Pseudohabdosynochus epinepheli, Cycloplectanum cupatum,

Diplectanum hargia, Haliotrema sp ký sinh ở mang 3 loài cá mỳ rất cao từ

71,4 - 93,8%, ở nhóm sán lá mỳ chủ Prosorhynchus epinepheli, Haliotrema

fasciata, Nagnacetabulum selari là 26-41%, tỷ lệ cảm nhiễm ký sinh đơn bào

và giáp xác thấp

Đối với bệnh vi khuẩn đã phân lập được 6 loài Vibrio alginolyticus, V.

vulnificus, V parahaemolyticus, V anguilbrum, V cholarae và một loài Pseudomonas sp Trong đó thường hay gặp loài V alginolyticus, V vulnificus

chiếm tới 25% (Bùi Quang Tề và ctv, 2003)

Bệnh do nấm gây ra đã phân lập được 4 giống là Furasium sp,

Haliphthoros sp, Lagenidium và Exophiala sp Các loài thường gặp là Lagenidium sp và Furasium sp, khi chúng phát triển mắt thường có thể nhìn

thấy được và là tác nhân cơ hội (Bùi QuangTề và ctv, 2003)

Phạm Đức Phương (2002) báo cáo rằng cá mỳ nuôi tại Cát Bà có khốilượng từ 200 - 500g bị bệnh lở loét và “chết đẹp” chiếm tỷ lệ cao nhất; với cỡ

cá nhỏ hơn 200g thì tỷ lệ bị bệnh chiếm 32,06% và cá bị chết chủ yếu do lởloét xuất huyết; ở cỡ cá lớn hơn 500g tỷ lệ bị bệnh chiếm 25,29%, giai đoạnnày cá chủ yếu bị bệnh “chết đẹp” và khi cá bị bệnh tỷ lệ chết lên tới 100%

1.3 Một số nghiên cứu về bệnh do Virus trên cá mú

1.3.1 Trên thế giới

Các nghiên cứu cho thấy có hai loài virus thường gây bệnh trên cá mú

là virus Nodavirus gây bệnh Viral Nervous Necrosis (VNN) và bệnh do Virus

Iridovirus Virus gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú (Viral nervous - VNN)

là nguyên nhân gây chết cá mú công nghiệp với tỷ lệ chết cao, đặc biệt với cá

mú nhỏ dưới 15 ngày tuổi, bệnh có thể gây chết tới 100% cá trong bể ương.Virus gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú thuộc nhóm Betanodavirus, họNodaviridae (Mori và ctv, 1992), kích thước khoảng 25±30nm, không có vỏbọc, hệ gen gồm 2 sợi dương RNA trong đó sợi RNA1 có kích thước 3100bp,sợi RNA2 có kích thước 1400bp Dựa vào trình tự gen của đoạn RNA2 người

ta xác định được có 25 chủng thuộc nhóm Betanodavirus, chia thành 4 kiểugen: BFNNV, TPNNV, SJNNV và RGNNV (Nishizawa và ctv, 1997) Virusgây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú thuộc kiểu gen RGNNV, tính khángnguyên của virus này nằm ở lớp vỏ có bản chất glycoprotein, trọng lượngphân tử 42Kda

Tác nhân chính gây bệnh VNN là Nodavius, virus này có vật chất ditruyền là một ARN thuộc giống Betanodavirus với kích thước 25-30 nm(Kazuya Nagasawa và ctv, 2004) Bệnh VNN có phân bố rộng, xuất hiện ởnhiều nước từ châu Mỹ đến châu Âu: Pháp, Đức, Italy và Châu Á: Nhật Bản,Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia, Brunei, Singapore, Philipine

Nodavirus có ký chủ khá rộng bao gồm hơn 20 loài cá như: cá vược

Châu Âu, cá bơn sao, bơn Nhật Bản, tráp đỏ, nóc, bơn Đại Tây Dương, múlưng gù Các loài cá mú có thể bị cảm nhiễm virus này bao gồm: Epinephelusmalabaricus; E bruneus; Cromileptes altivelis

Dấu hiêu bệnh lý bên ngoài của bệnh là hiện tượng cá bơi nhanh, khôngđịnh hướng, quay tròn hoặc xoắn cơ thể Cá trưởng thành và cá bố mẹ bụng

có thể phình to, bơi lờ đờ, màu sắc cơ thể nhợt nhạt, bỏ ăn Các dấu hiệu bêntrong cá bị nhiễm VNN: gan chuyển màu nhợt nhạt, ruột chứa đầy dịch hơixanh và nâu Tuy nhiên, đối với cá giai đoạn nhỏ thì dấu hiệu của bệnh không rõràng Virus gây bệnh được tìm thấy ở não, tuỷ sống, tuyến sinh dục, gan, dạ dày

và ruột

VNN được đánh giá là bệnh truyền nhiễm gây tác hại lớn nhất với cábiển đặc biệt là giai đoạn cá giống: cá hương khi bị nhiễm VNN có thể chếttới 70%, cá cỡ 2,5 -7,5 cm chết tới 100%, khi cá đạt kích cỡ lớn hơn 15 cm thì

tỉ lệ chết giảm hơn (dưới 20%)

Trong những năm gần đây, VNN đã thực sự trở thành mối đe dọa đốivới ngành nuôi trồng thuỷ sản trên thế giới Năm 1994 - 1995, bệnh này đã

gây chết 80 - 90% cá bột và cá giống loài E akaara ở nhật Fukuda và ctv (1995) cũng khẳng định rằng Nodavirus chính là tác nhân gây bệnh cho E.

septemfasciatus ở Nhật, bệnh thường xảy ra khi nhiệt độ cao (tháng 7-8).

Bệnh VNN cũng được báo cáo tại một số nước khác: tại Triều Tiên, bệnh cóthể gây chết tới 80% số cá chỉ trong một vài tuần (Salem và ctv, 1996) Tại

Thái Lan, bệnh thường xảy ra trên cá mú E malabaricus, gây chết 100% nếu

cá ở giai đoạn nhỏ, cá lớn chết 20% (Danaxado và ctv, 1995) Bệnh có thểxuất hiện ở hầu hết các giai đoạn phát triển của cá nhưng khả năng nhiễmbệnh nặng nhất là giai đoạn ấu trùng dưới 20 ngày tuổi

Như vậy, có thể thấy rằng bệnh VNN gây tác hại rất nghiêm trọng chonghề nuôi cá biển, đặc biệt là trong sản xuất giống nhân tạo, vì vậy để giảmthiểu tác hại của bệnh VNN, các biện pháp phòng bệnh tổng hợp được ápdụng: chọn đàn giống cá bố mẹ sạch bệnh, vệ sinh dụng cụ bằng Chlorine(100 ppm), loại bỏ cá chết, cá yếu ra khỏi đàn cá nuôi Hiện nay các nghiêncứu về bệnh VNN vẫn được triển khai nhằm hạn chế tác hại của bệnh

1.3.2 Tại Việt Nam

Ở Việt Nam, một số loài cá thuộc họ các mú cũng đã phát hiện sự hiện

diện của virus VNN Trong đó có các loài: E.coioides, E.fuscogutatus,

E.tauvina, E.lanceolatus, E.malabaricus ở Khánh Hoà; loài E.coioides ở Cát

Bà (Hải Phòng) và Cửa Hội (Nghệ An) Bệnh hoại tử thần kinh trên cá biểntại Việt Nam được báo cáo lần đầu tiên vào năm 2002 trên cá mú

(Epinephelus spp) nuôi lồng trên vịnh Hạ Long Kết quả điều tra ở huyện

Vân Đồn, Quảng Ninh (2002) có số lồng bị bệnh Bệnh xuất hiện từ tháng 5

Ở Khánh Hòa, có khoảng 30% hộ nuôi cá biển chịu tác hại của bệnhnày Giai đoạn cá nhỏ (5-20cm) thường chịu tác hại nặng hơn giai đoạn cálớn Tỷ lệ chết có thể đến 50-100% và đây là bệnh không có mùa vụ rõ ràng(2008) Cũng ở Khánh Hòa vào tháng 7 năm 2008 người ta cũng phát hiệnbệnh VNN trên cá mú cỡ 5-6cm nuôi tại bè của trường Đại Học Nha Trang,bệnh lây lan rất nhanh và gây chết 100% cá trong vòng một tuần Khi cá tronglồng bị bệnh người ta còn quan sát được một số loài cá khác sống xung quanhlồng cũng có dấu hiệu tương tự

Năm 2010, huyện Hương Trà - tỉnh Thừa Thiên Huế, hai khu vực nuôi

cá mú trên lồng có hiện tượng cá từ một đến hai tháng tuổi chết hàng loạt, số

lượng thiệt hại ước tính trên 25 vạn con thả nuôi với tổng giá trị thiệt hạikhoảng 450 triệu đồng Dấu hiệu bệnh lý cho thấy cá bỏ ăn, màu sậm, xươngsống cong lên, mắt lồi, bơi lòng vòng, chết rất nhanh, chết đồng loạt.

Kết quả điều tra sơ bộ của khoa nuôi trồng thủy sản - Đại Học NhaTrang cho thấy cá nuôi tại vùng biển Khánh Hòa thường gặp bệnh có dấu hiệutương tự như bệnh hoại tử thần kinh được thông báo bởi nhiều tác giả Tuynhiên, cho tới nay ở Việt Nam vẫn chưa có một báo cáo khoa học cụ thể nào

về tình hình dịch bệnh

Biểu hiện bệnh lý bên ngoài cho thấy khi cá mắc bệnh thường bơikhông định hướng, bơi thành vòng tròn trên mặt nước, cá bỏ ăn, màu sậm đi.Tuy nhiên, các biểu hiện triệu chứng bên ngoài này chỉ xuất hiện ở cá múgiống và cá nuôi thương phẩm giai đoạn nhỏ ở Cửa Hội – Nghệ An BệnhVNN trên cá mú nuôi ở Cát Bà thì không có dấu hiệu đặc trưng của bệnh

Theo Trần Vĩ Hích và Phạm Thị Duyên (2008) quan sát mô bệnh họctrên cá mú chấm nâu, cá chẽm, cá bớp chết có dấu hiệu bệnh VNN nuôi tạiKhánh Hoà, Việt Nam đã chỉ ra rằng tác nhân gây bệnh đã phá huỷ các tế bàothần kinh và võng mạc mắt của cá mắc bệnh và tạo ra các không bào có hìnhdạng và kích thước khác nhau Ở mô não và mắt tìm thấy sự tồn tại của 2dạng không bào: Dạng tròn và dạng elip, kích cỡ từ 4-30µm

Theo Nguyen và cộng sự (1996), một trong số những điểm tái bản đầutiên có thể là ở tủy sống Từ đó virus có thể tới não đầu tiên và sau đó là tớivõng mạc, thông qua dây thần kinh thị giác

Kết quả nghiên cứu mô bệnh học cho thấy virus gây bệnh đã phá hủy tếbào thần kinh, tạo các không bào có hình dạng và kích thước khác nhau Kếtquả nghiên cứu phù hợp với các nghiên cứu của Mori, Nakai, Muroga,Arimoto, Mushiake và Furusawa (1992) Comps, Pepin và Bomani (1994) Cágiai đoạn ấu trùng 40-45 ngày tuổi tại Cửa Hội có tỉ lệ tử vong lên tới 70-80%

trong vòng bảy ngày sau khi có dấu hiệu bỏ ăn, bơi xoay tròn Nghiên cứu môbệnh học thấy xuất hiện các không bào có kích cỡ 5-7µm, màu trắng đụctrong não, không thấy trong mắt.

Bệnh có thể gặp trên cá mú ở tất cả các độ tuổi, tuy nhiên giai đoạn ấutrùng và cá giống bệnh có ảnh hưởng lớn nhất dễ dàng quan sát được

Ấu trùng (từ 10-25 ngày tuổi) hoặc cá giống bỏ ăn, cá chết rải rác, bơi

lờ đờ trên tầng mặt do bóng hơi trương phồng Dấu hiệu lâm sàng hay xuấthiện ở giai đoạn ấu trùng hay cá con là các tổn thương ở các mô thần kinh, cộtsống, thần kinh võng mạc gây ra bởi virus Não xung huyết, cá nhiễm bệnhbơi không bình thường, bơi lội mạnh không định hướng, đầu chúc xuống dưới

Cá mú lớn (>150g) bị bệnh VNN có ít triệu chứng hơn và tỷ lệ chếtgiảm Cá thường chuyển màu tối, chậm chạp với bóng hơi trương phồng và cóthể hoặc không có vết bệnh ở đầu Cá dưới 20 ngày tuổi không biểu có dấuhiệu rõ ràng

Cá từ 20 đến 45 ngày tuổi mắc bệnh có biểu hiện: yếu, bơi gần tầngmặt Cá từ 45 ngày đến 4 tháng tuổi mang dấu hiệu bệnh nhận biết được như:bơi không định hướng, quay tròn, hoặc xoáy chôn ốc, kém ăn hay bỏ ăn, bónghơi phồng, thân đen xám, đuôi và vây chuyển màu đen, mắt đục, cá bệnh hoạtđộng yếu, đầu treo trên mặt nước hoặc dưới đáy bể (lồng) Cá chết sau 3 - 5ngày có dấu hiệu bệnh với tỉ lệ cao, có thể từ 80 - 100%

Theo số liệu của Nguyễn Ngọc Du và cộng tác viên, trên cá mú nuôi tạiVũng Tàu cho biết bệnh do NNV thường xảy ra trên cá giống, 53/64 mẫu bị nhiễmNNV (tương ứng 82,8%), tỷ lệ chết do virus gây hoại tử thần kinh là từ 90-100%

1.4 Một số đặc điểm sinh học của virus NNV

Virus hoại tử thần kinh (NNV) thuộc giống Betanodavirus, họ Nodaviridae và cùng với 67 họ khác vẫn chưa được ấn định vào bộ nào trong 3 bộ của khoá phân loại ICTV Dựa trên tính tương đồng của một trình tự khoảng 410 bp trên RNA-2, týp huyết thanh, vật

chủ đặc hiệu và nhiệt độ phát triển tối ưu ở điều kiện invitro, giống Betanodavirus được phân thành 4 kiểu gen chính tương đương với 4 loài chính được liệt kê dưới đây:

Nhiệt độtối ưu

Atlantic cod, flounders,

15-20oC

seabass, European seabass,

25-30oC

Ghi chú: Barfin flounder nervous necrosis virus (BFNNV), Redspotted

grouper nervous necrosis virus (RGNNV), Striped jack nervous necrosis virus (SJNNV), Tiger puffer nervous necrosis virus (TGNNV)

GNNV có kích thước nhỏ, đường kính khoảng 30 nm, hình thái đốixứng 20 mặt (T=3) Cấu tạo gồm có vỏ capsid bao quanh 2 RNA sợi đơn,dương, không có màng bao Vỏ capsid được cấu thành bởi 32 capsome gồm

Hệ gen của RGNNV được giải trình tự đầy đủ vào năm 2003 cho thấykích thước RNA-1 là 3105 bp, trong đó từ nucleotit (nt) 79 đến 3027 là vùngORF mã hoá cho protein A (RNA-dependent RNA polymerase), kế 2 bên làvùng 5’ và vùng 3’ không mang mã (NCR-non coding region) với kích thướclần lượt là 78 bp và 76 bp Từ trình tự trên, khối lượng phân tử dự đoán củaRNA-1 GGNNV là 992 735 Da Vùng ORF mã hoá cho protein A với khốilượng phân tử ước tính là 110 420 Da Phân tử protein A có kích thước 982

aa, cũng đã được giải trình tự đầy đủ Ngoài ra, từ nt 2753 đến 2980 là đoạngen mã hoá cho protein B có kích thước 75 aa Vai trò của protein B trongquá trình tái bản của NNV còn đang được làm sáng tỏ Kích thước protein nàytương đương giữa nhiều loài NNV ở những kiểu gen khác

Hình 1.2 Cấu trúc genome của Nervous Necrosis Virus

RNA-2 của RGNNV có kích thước 1434 bp, trong đó từ nt 27 đến 1043

mã hoá cho protein vỏ virus có kích thước 338 aa Hai vùng 5’NCR và3’NCR có kích thước lần lượt là 26 nt và 390 nt Khối lượng phân tử tính toáncủa RNA-2 là 459 025Da và mã hoá cho protein capsid khối lượng 37004 Da

* Cơ chế gây bệnh

Cơ chế gây tổn thương mô bệnh học của NNV đã được nghiên cứu bởinhiều nhà khoa học như Nguyên & cộng sự (1996), Munday (1992),Grotomol (1999), Mladineo (2003), Peducasse (1999) đều có kết luận chungrằng: từ nước, thức ăn, VNN xâm nhập vào trong cơ thể cá qua ruột, mang,

cùng virus tấn công vào mô đích là hệ thống thần kinh (não, tủy sống) vàvõng mạc Từ đó, chúng tái bản và gây hoại tử hệ thống thần kinh của vậtchủ Nếu virus chưa vào não thì cá vẫn sống sót sau dịch bệnh, nhưng trứng

cá có thể nhiễm virus thông qua tuyến sinh dục và nguồn nước

Quá trình hoại tử các nơron được quan sát thấy ở hầu hết các loài Thểvùi nội bào cũng được tìm thấy ở nhiều loài cá đặc biệt là thấy nhiều ở cá mú

chấm nâu Những tổn thương mô bệnh học liên quan tới nhiễm Betanodavirus

chứng minh một cách rõ ràng rằng virus tấn công trước tiên vào hệ thần kinhtrung ương (CNS) và võng mạc, nơi có vị trí tái bản của nó Tuy nhiên còn cónhững quan điểm khác nhau về con đường cũng như phương thức lây truyềncủa NNV trong cơ thể cá

Munday (1992) và Grotmol (1999) lại đưa ra giả thuyết rằng lớp biểu

mô phân tầng của ruột trước có thể là điểm tái bản đầu tiên của virus Virusđược đưa vào thông qua nước và thức ăn, ở đây chúng dễ dàng tương tác vàthông qua dây thần kinh sọ não virus có thể được đưa đến não và gây bệnhtích điển hình tại đây

Ngoài ra Mladineo (2003) còn phát hiện kháng nguyên ở thùy khứugiác, điều ấy cho thấy khoang mũi cũng có khả năng là một đường vào củavirus, bên cạnh đường qua mang, miệng, da (Peducasse., (1999)

Một số tác giả cho biết với kỹ thuật kiểm tra kháng thể gián tiếp (IFAT

- Indirect fluorescent antibody test) đã phát hiện thấy virus ở những cơ quankhác nhau của những cá thể cá sống sót sau dịch bệnh như: tuyến sinh dục,gan, thận, ruột, dạ dày nhưng lại không phát hiện thấy virus ở CNS và võngmạc Kết quả đó củng cố thêm giả thuyết về sự nhiễm virus của trứng cá quacon đường tuyến sinh dục

Về phương thức lây lan bệnh: qua một số những quan sát từ thực tế,cùng với một số những thí nghiệm dưới những điều kiện được kiểm soát của

các nhà khoa học cho thấy tồn tại hai phương thức lây truyền bệnh đó là:phương thức lây truyền theo chiều ngang và phương thức lây truyền theochiều dọc.

Phương thức truyền bệnh theo chiều ngang: Là sự lan truyền virus gây

bệnh trực tiếp từ những con cá bị bệnh sang những con khoẻ hoặc virus đượclan truyền gián tiếp thông qua thức ăn, dòng chảy Virus có thể theo dịch tiếtcủa cá bệnh vào môi trường nước và chúng xâm nhập vào cá khỏe qua mang,

da và miệng của cá hoặc lây lan qua các dụng cụ chuyên dùng trong ươngnuôi cá cá như lưới, vợt, dây sục khí

Có rất nhiều nghiên cứu trên ấu trùng và cá bột của nhiều loài cá khácnhau để xác nhận về những yếu tố liên quan đến con đường lây truyền theochiều ngang Các thí nghiệm lây nhiễm theo nhiều cách đã được thực hiện:lây nhiễm bằng cách nhốt chung những con cá khoẻ với những con cá bệnh,lây nhiễm bằng ngâm cá trong nước có hoà dịch virus

Kết quả đều cho thấy cá bị nhiễm bệnh và có tỉ lệ chết tuỳ thuộc hàmlượng virus cho thí nghiệm cao hay thấp Điều đó cho thấy nước vẫn luôn làmôi trường trung gian cho sự truyền virus, từ những con cá bị bệnh, xác chếtthối rữa của chúng hay từ những nơi khác

Năm 1998, Skrilis và Richards đưa ra giả thuyết về khả năng nhiễm

bệnh thông qua thức ăn tươi hàng ngày, gồm: Artemia salina và Brachionus

plicatilis, những sinh vật phù du, tuyến trùng thường dùng làm thức ăn cho cá

ở giai đoạn ấu trùng Nhưng những kết quả phân lập virus và kiểm tra mô học

ở 2 loài trên đều cho kết quả âm tính, vậy nên mới chỉ dừng lại ở giả thuyếtrằng chúng chỉ có vai trò như những cá thể mang virus cơ học Đến năm

2005, Chi và cộng sự đã chính thức phân lập được virus từ nguồn thức ăn

hàng ngày cho cá, gồm: Artemia salina, Tigriopus japonicas, Acetesinte

medius; và khẳng định đó cũng là một trong những nguồn lây nhiễm virus.

Những nghiên cứu của Mori (2005) tiếp đó cũng củng cố thêm cho nghi ngờtrên Ngoài ra, việc những con cá trong cùng một bể nuôi ăn thịt lẫn nhaucũng được xem như một con đường lây nhiễm virus Đồng thời những vậtdụng trong nuôi cá, quá trình vận chuyển cũng tiềm tàng trong nó khả năng

là trung gian truyền bệnh

Phương thức truyền bệnh theo chiều dọc được đưa ra khi Arimoto(1992) phát hiện thấy virus ở tuyến sinh dục và trứng đã thụ tinh ở

Pseudocaranx dentex bằng phương pháp ELISA Và tiếp đó, là liên tục

những phát hiện tương tự bằng phương pháp PCR được báo cáo Một số báocáo chứng tỏ sự lây truyền theo chiều dọc đã được phát hiện ở cá mú 7 vạch,striped jack, halibut, flounder Sự lây nhiễm vào buồng trứng cũng được công

bố ở Dicentrarchus labrax

nhưng sau đó họ cũng báo cáo bệnh xuất hiện cả ở những vùng có nhiệt độ

sau khi tiêm cơ vào E septemfasciatus và E akaara với hỗn dịch virus từ

não và mắt của những con cá bị bệnh, Tanaka và cộng sự (1998) đã kết luậnrằng cả tỉ lệ chết và triệu chứng đều bị ảnh hưởng một cách có ý nghĩa bởinhiệt độ nước khi mà quan sát thấy tỉ lệ chết cao nhất và thời gian ủ bệnh

bệnh lý đặc trưng cũng thể hiện rõ hơn ở những ngưỡng nhiệt độ cao hơn, và

có khuynh hướng giảm dần khi ở ngưỡng nhiệt độ thấp Cũng theo Tanaka và

ctv (1998) quan sát được trên E septemfasciatus, bệnh VNN hiếm khi bùng

những nghiên cứu trên một số loài đã cho thấy chủng virus của một loài cánhiệt đới thì khó có khả năng tái bản trong một loài cá ôn đới, ở điều kiện ônđới và ngược lại

Chương 2.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu:

- Virus gây bệnh hoại tử thần kinh (Nervous Necrosis Virus - NNV) ở

cá mú

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu

- Tế bào lách cá mú dòng GS 01

- Các loại môi trường nuôi cấy tế bào: Leibovit, MEM, HANK's,

- Các loại hóa chất làm phản ứng PCR, điện di,

- Chai nuôi cấy tế bào, dụng cụ PCR

- Thiết bị máy RT - PCR, Kính hiển vi…

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân lập virus

- Mẫu thu thập tại Quảng Ninh: từ QN

- Mẫu thu thập tại Hải Phòng: từ HP0

- Mẫu thu thập tại Nam Định: từ NĐ

- Mẫu thu thập tại Khánh Hòa: từ KH

- Mẫu thu thập tại Bình Thuận: BT

 Xử lý mẫu

Theo phương pháp [A Hegde và cộng sự, 2002] (A Hegde, C.L Chen,Q.W Qin, T.J Lama, Y.M Sin Aquaculture 213 (2002) 55–72Cá nghi mắcbệnh được thu não và mắt Một phần được đem đi quan sát mô bệnh học, mộtphần được dùng để phân lập virus Nghiền các các mô này trong dung dịchmuối cân bằng Hanks (HBSS) với tỉ lệ 1:10 Sau đó đem ly tâm ở 10 000

0,45µm Dịch lọc được cất trong tủ lạnh

2.2.1.1 Phương pháp mô bệnh học

Theo phương pháp Mitchell và cs (2004)

Sử dụng phương pháp này để tìm hiểu quá trình phát triển bệnh, mức

độ phá huỷ cửa tế bào virus

Các mẫu cá thu thập được có khối lượng khoảng 50g được tiến hànhgiải phẫu lấy não và mắt

Sơ đồ 1: Phương pháp mô bệnh học

Số mẫu bị nhiễm

Tỷ lệ nhiễm ( % ) = x 100 Tổng số mẫu kiểm tra

2.2.1.2 Phương pháp phân lập virus nuôi cấy trên tế bào

Theo phương pháp Q.W Qin và cs (2006)

Trước khi sử dụng, tế bào được hoạt hóa trong chai nuôi cấy với môitrường Leibovitz’s L-15 có bổ xung 10% huyết thanh bào thai bê (FCS) chotới khi tế bào mọc thành một lớp ở đáy chai nuôi cấy với độ bao phủ khoảng90% Loại bỏ môi trường trong chai nuôi cấy và rửa lần 1 bằng cách tráng tếbào với L-15 không có FCS Sau đó rửa bổ sung Leibovitz’s L-15 từ 1-2 tiếngrồi loại bỏ hoàn toàn môi trường L-15 trước khi lây nhiễm dịch mẫu

Mẫu bệnh phẩm sẽ được lây nhiễm trên tế bào GS 01 đã hoạt hóa Hút

đều để virus tiếp xúc với toàn bộ bề mặt chai

lần để nhằm trải đều virus trên bề mặt tế bào trong chai Bổ xung thêm môitrường L-15 chứa 10% FCS

Mẫu đối chứng chỉ có tế bào GS và môi trường L-15, 10% FCS

dõi sự xảy ra của hiệu ứng huỷ hoại tế bào (CPE-cytopathic effect) mỗi ngày.Khi CPE đạt khoảng 90-95% thì thu dịch virus khỏi chai nuôi cấy rồi ly tâmthu dịch nổi có chứa virus ở 10 000 vòng/phút trong 30 phút

Dịch virus được cất giữ như dịch mẫu cho tách chiết RNA và các qui

* Phương pháp chuẩn độ Reed-Muench

lg TCID50= lgA+ x2lgf

Trong đó: f là hệ số pha loãng

A1: tỷ lệ cận trên có bệnh tích

B1: tỷ lệ cận dưới có bệnh tích

A: độ pha loãng với tỷ lệ cận trên có bệnh tích

B: độ pha loãng với tỷ lệ cận dưới có bệnh tích

2.2.1.5 Phương pháp tách chiết RNA tổng số

Theo phương pháp [Sambrook và cộng sự, 2001]

Tách chiết RNA tổng sổ từ mẫu mô tế bào thu nhận từ phôi gà đã đượctiêm VNN theo Kit RNeasy Qiagen của hãng Qiagen

1 Cho 250µl dịch tế bào + 100µl RNase-free water + 350µl RLT buffer(chứa guanidine thiocyanate) vào ống eppendorf 1,5ml, vortex trong 5phút

2 Bổ sung 250µl ethanol (96÷100%), mix nhẹ bằng pipet

3 Hút 700µl sang cột tách silicagel, đậy nắp, ly tâm 10.000 vòng/phúttrong 15 giây ở 4˚C, thu cột rồi đổ dịch

4 Bổ sung 500µl dung dịch RPE pha loãng với ethanol (tỉ lệ 1:4) vào cộttách, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 giây ở 4 ºC (rửa cột để loại bỏtạp chất), thu cột rồi đổ dịch

5 Bổ sung 500µl RPE pha loãng với ethanol (tỉ lệ 1:4) vào cột tách, lytâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút ở 4˚C Thu cột bỏ tube dưới

6 Chuyển cột sang tube mới, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút, thucột tách và bỏ tube

7 Chuyển cột sang eppendorf 1,5ml có nắp Bổ sung 30µl RNase-free

8 water, đóng nắp ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, thu được RNAtinh sạch.

9 Điện di kiểm tra trên gel Agarose 1%

2.2.1.6 Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)

Theo phương pháp [Sambrook và cộng sự, 2001]

Phản ứng RT-PCR là phản ứng khuếch đại một đoạn khuôn mẫu RNAtheo nguyên lý của PCR, bao gồm 2 giai đoạn:

Giai đoạn thứ nhất: Phiên mã ngược khuôn mẫu RNA thành sợi DNAthứ nhất, sau đó dùng sợi này làm khuôn mẫu để tổng hợp sợi DNA thứ hai

Giai đoạn thứ hai: Dùng sợi đôi làm khuôn mẫu để thực hiện phản ứng Đối với NNV, kĩ thuật RT-PCR bao gồm 2 giai đoạn: giai đoạn phiên

mã ngược từ mạch khuôn RNA của NNV để tạo cDNA và giai đoạn khuếchđại đoạn cDNA tạo nên số bản sao cần thiết

Để khuếch đại trình tự T2 của RNA-2 dài 870 bp của E fuscogutatus

và E.akaara, S.C.Chi và ctv (1997) đã dùng 1 cặp mồi gồm:

Mồi xuôi F1 (5’-GGATTTGGACGTGCGACCA-3’)và

Mồi ngược R3 (3’-AGAAGTGGGCACAACTGAGC-5’)

Kết quả RT-PCR sẽ được điện di để so sánh với các mẫu chuẩn để kết luận

2.2.1.7 Điện di trên gel agarose

Theo phương pháp Sambrook J, Russel DW (2001)

+ Cân 0,2 gam agarose đung nóng chảy và bổ sung 1µl EtBr rồi đổ vàokhuôn gel đã lắp sẵn lược để tạo các giếng nhỏ, khoảng 20-30 phút sau khi gel

đã nguội hoàn toàn thì rút lược và đặt vào bể điện di chứa sẵn đệm TAE 1X,sao cho đệm ngập hoàn toàn bản gel

+ Tra mẫu: lấy một thể tích mẫu thích hợp (chứa khoảng 1-2μg DNA),trộn với loading (giúp tạo màu dễ quan sát và giúp cho các phân tử DNA lắngxuống trong quá trình điện di) sau đó tra vào các giếng của gel

+ Chạy điện di ở hiệu điện thế 110V, thời gian 20-30 phút.

+ Sau đó lấy bản gel ra tráng qua nước rồi quan sát và chụp ảnh dướiánh sáng tia tử ngoại có bước sóng λ=260nm

2.2.2 Phương pháp tách dòng gen

2.2.2.1 Phương pháp thiết kế vector tách dòng

Theo phương pháp Sambrook J, Russel DW (2001)

Nguyên tắc: Sản phẩm của phản ứng PCR có đầu adenine sẽ gắn vớidầu thymin của vector được mở vòng Do đó, sản phẩm PCR và DNAplasmid có khả năng liên kết với nhau theo nguyên tắc bổ sung giữa cácadenine và thynin dưới sự xúc tác của enzyme nối T4 DNA ligase

động, sản phẩm PCR, vector pCR 2.1, T4 DNA ligase Phản ứng được tiếnhành ở 14°C trong 16 giờ

2.2.2.2 Phương pháp tạo tế bào khả biến mang gen T2

Theo phương pháp Sambrook J, Russel DW (2001)

Biến nạp là quá trình chuyển DNA plasmid trực tiếp vào tế bào nhận

Cơ chế biến nạp bao gồm việc thay đổi cấu trúc thành tế bào vi khuẩn đểDNA dễ dàng chui vào tế bào nhận Những tế bào có khả năng tiếp nhậnDNA plasmid ngoại lai gọi là tế bào khả biến Quá trình biến nạp vào tế bào

E.coli DH5α gồm hai giai đoạn: tạo tế bào khả biến và biến nạp.

2.2.2.3 Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E.coli

* Các bước tiến hành

1 Chọn các khuẩn lạc trắng và một khuẩn lạc xanh nuôi trong 2 ml môitrường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampicilin với nồng độ100µg/ml, nuôi lắc qua đêm ở 37°C, 200 vòng/phút

2 Hút 1,5ml dịch khuẩn E.coli cho vào eppendorf Ly tâm 12.000

vòng/phút trong 1 phút, loại dịch và thu sinh khối tế bào

3 Bổ sung 150 µl Sol I (Glucoza 50mM; Tris-HCl 50mM, pH = 8,0;EDTA 10mM, pH = 8,0), trộn đều bằng máy vortex.

4 Bổ sung 150 µl Sol II (NaOH 200mM; SDS 1%), đảo đều dung dịchbằng tay tránh vón cục Không vortex vì sẽ làm lẫn plasmid với DNAgenom

5 Bổ sung 150 µl Sol III (Potasium acetat 3M, pH = 5,5 ), đảo nhẹ bằngtay tránh hiện tượng kết tủa cục bộ, dung dịch sẽ có màu trắng sữa

6 Bổ sung 450µl Chloroform : Isoamyl Alcohol ( 24:1), đảo nhẹ, giữ ởnhiệt độ phòng trong 3 phút

7 Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4º C, hút lớp dịch phía trênchuyển sang eppendorf 1,5ml mới

8 Bổ sung 450 µl Isopropanol, đảo nhẹ nhàng ngay rồi để lạnh 10 phút

9 Ly tâm 12000v/p trong 15 phút Loại bỏ dịch nổi thu cặn bên dưới

10 Bổ sung 500 µl ethanol 70% để rửa cặn DNA, loại bỏ các thành phần phụ.

Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C Đổ bỏ dịch, thu cặn

11 Làm khô cặn trong box

12 Bổ sung 40 µl TE-RNase (100 µg/ml)

13 Ủ ở bể ổn nhiệt 37ºC trong 1 giờ để loại bỏ hoàn toàn RNA

14 Kiểm tra điện di trên gel agarose 1%

2.2.2.4 Cắt kiểm tra vector tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn EcoRI

Phản ứng cắt DNA bằng enzym giới hạn có sự tham gia của các thànhphần: dung dịch đệm cho enzym hoạt động, DNA (50ng), enzym giới hạn,nước khử ion

Hỗn hợp phản ứng được trộn đều Phản ứng được thực hiện ở 37°Ctrong 1-3 giờ Kiểm tra điện di trên gel agarose 1%

2.2.2.5 Tinh sạch sản phẩm tách dòng

DNA sau phản ứng cắt giới hạn được tiến hành tinh sạch theoPureLink® Quick Gel Extraction Kit có trong bộ TOPO® TA Cloning Kitcủa hãng Invitrogen với các bước như sau:

1 Cắt bản gel sát phần có chứa đoạn DNA mong muốn

2 Cân lát gel rồi hòa tan với dịch đệm (GS1) có trong bộ kit với tỉ lệ 10:

6 Bổ sung 500 µl Gel Solubilization Buffer (GS1) vào cột, trộn đều rồi ủ

ở nhiệt độ phòng , ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịchphía dưới

7 Bổ sung 700 µl hỗn hợp wash buffer + ethanol (96÷100%) vào cột và ủ

ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

8 Ly tâm 12.000 vòng/phút trong vòng 1 phút, đổ bỏ dịch, chuyển cộttinh sạch sang eppendorf 1,5 ml

9 Bổ sung 50 µl TE buffer (65-70°C) vào cột, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút

10 Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 2 phút, loại bỏ cột tinh sạch, thu hồicác eppendorf chứa DNA tinh sạch, bảo quản ở -20°C

2.2.2.6 Phương pháp giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động

Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên nguyên tắc của phương pháp

Sanger (phương pháp dideoxy) có sử dụng các dideoxynucleotide: Dựa trênnguyên tắc hoạt động của enzym DNA polymerase trong quá trình tổng hợpDNA Enzym DNA polymerase xúc tắc gắn các nucleotide vào mạch đơnDNA đang tổng hợp ở vị trí 3’-OH