Nguồn lợi nấm ký sinh côn trùng các giống cordyceps, isaria, nhân sinh khối chủng cordycepssp1 VN1331 và isaria javanica VN1487 để kiểm soát sâu khoáng luận văn thạc sĩ nông lâm ngư (tài liệu này chưa full)

Có thể nói, nấm ký sinh côn trùng là nhóm chưa được quan tâm đúng mức,nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng trong kiểm soát sinh học, dược liệu vàbảo tồn đa dạng sinh học đang còn là

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

NGUYỄN THỊ THÚY

NGUåN LîI NÊM Ký SINH C¤N TRïNG

Cordyceps sp1 VN1331 Vµ Isaria javanica VN1487

§Ó KIÓM SO¸T S¢U KHOANG

CHUYÊN NGÀNH: TRỒNG TRỌT

MÃ SỐ: 60.62.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học:

PGS TS TRẦN NGỌC LÂN

VINH - 2011

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này làhoàn toàn trung thực, các số liệu được thu thập qua các thí nghiệm do bản thân tiếnhành và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan các thí nghiệm để thu thập số liệu trong luận văn đã đượcchính bản thân tôi tiến hành tại phòng thí nghiệm Công nghệ Phòng thí nghiệmCông nghệ Nấm ký sinh côn trùng, Khoa Nông Lâm Ngư, Trường Đại học Vinh,với sự đồng ý và hướng dẫn của PGS.TS Trần Ngọc Lân là giáo viên hướng dẫn,các đồng nghiệp và các kĩ thuật viên phụ trách phòng thí nghiệm

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đượccảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Vinh, tháng 12 năm 2011

Tác giả

Nguyễn Thị Thuý

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình công tác, học tập và nghiên cứu đề tài luận văn tốtnghiệp Thạc sỹ Chuyên ngành Trồng trọt, tôi đã luôn nhận được rất nhiều sự giúp

đỡ quý báu từ phía thầy cô, đồng nghiệp, người thân, bạn bè, các nhà khoa học

Với tấm lòng chân thành và sự biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin được gửi lời cảm

ơn tới PGS TS Trần Ngọc Lân, người đã dẫn dắt, định hướng cho tôi từ những

bước đầu làm nghiên cứu khoa học, rất tận tâm và nhiệt tình hướng dẫn tôi suốt thờigian làm đề tài cũng như trong quá trình công tác Thầy luôn động viên, khuyếnkhích và mang đến cho tôi niềm say mê nghiên cứu khoa học

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Nguyễn Tài Toàn, ThS.Nguyễn Thị Thanh, KS Thái Thị Ngọc Lam, KS Hồ Thị Nhung tổ bộ môn Bảo vệthực vật, cùng các kĩ thuật viên phòng thí nghiệm đã hướng dẫn, giúp đỡ về chuyênmôn và tạo điều kiện về cơ sở vật chất cho tôi trong quá trình làm việc và thực hiện

đề tài; cùng các em sinh viên đã rất nhiệt tình hỗ trở tôi trong thu mẫu nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm cùng tập thể cán bộ trong KhoaNông Lâm Ngư, Ban lãnh đạo Trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện cho tôi trongcông tác, học tập và nghiên cứu đề tài

Xin chân thành cảm ơn các nhà khoa học, các đề tài KH & CN đã hỗ trở kinhphí và phương pháp nghiên cứu cho tôi để thực hiện đề tài: (1) Đề tài Nghị định thư

giữa Trường Đại học Vinh (Việt Nam) và BIOTEC (Thái Lan): “Hợp tác nghiên cứu xác định một số loài nấm ký sinh trên côn trùng và tuyển chọn một số loài nấm đặc hữu có hoạt chất sinh học làm dược liệu”, Mã số: 04/2009/HĐ-NĐT; (2) Đề tài cấp Trường Đại học Vinh năm 2010, “Nguồn lợi nấm Cordyceps sp (Đông trùng -

Hạ thảo) ở Khu Bảo tồn thiên nhiên Pù Huống” Mã số: T2010 - 45.

Và tôi xin được gửi lời cảm ơn đặc biệt tới người thân trong gia đình, bạn bè

đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ, hỗ trở tôi trong suốt quá trình học tập, nghiêncứu và hoàn thành luận văn này

Vinh, tháng 12 năm 2011

Tác giả

MỤC LỤC

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.2 Tình hình nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng trên thế giới và Việt Nam 101.2.1

Tình hình nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng trên thế giới 10

1.2.2

Tình hình nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng ở Việt Nam 19

1.4 Những vấn đề còn tồn tại và những vấn đề mà đề tài tập trung

nghiên cứu, giải quyết trong nghiên cứu EPF ở Việt Nam

25

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

giống Cordycep và Isaria

2.4.5

Phương pháp xác định hàm lượng cơ chất gạo lứt và bột nhộng tằm

trong nhân nuôi Cordyceps sp VN1331 và I javanica VN1487 trên

môi trường lên men rắn

33

2.4.6

Phương pháp đánh giá hiệu lực của chế phẩm nấm Isaria javanica

VN1487 phòng trừ sâu khoang trong phòng thí nghiệm

Nguồn lợi nấm EPF giống Cordyceps, Isaria cho hoạt chất sinh học 48

3.3 Đặc điểm sinh học, sinh thái một số loài, chủng nấm ký sinh côn trùng

giống Cordyceps và Isaria đặc hữu Việt Nam

53

3.3.1

Đặc điểm sinh học, sinh thái nấm Cordyceps sp1 VN1331 và dạng

vô tính Isaria javanica VN1487

53

3.3.2

Đặc điểm sinh học, sinh thái Cordyceps takaomontana VN1468 và

dạng vô tính Isaria tenuipes VN1348

58

3.3.3

Đặc điểm sinh học, sinh thái Cordyceps ninchukispora VN1053 64

3.4 Nghiên cứu xác định hàm lượng cơ chất gạo lứt và nguồn dinh

dưỡng bổ sung nhộng tằm nhân sinh khối chủng Cordyceps sp1.

67

VN1331 và Isaria javanica VN1487 trên môi trường lên men rắn

3.4.1

Nghiên cứu xác định hàm lượng cơ chất gạo lứt và nguồn dinh

dưỡng bổ sung nhộng tằm nhân sinh khối chủng Cordyceps sp1.

VN1331 trên môi trường lên men rắn

68

3.4.2

Nghiên cứu xác định hàm lượng cơ chất gạo lứt và nguồn dinh

dưỡng bổ sung nhộng tằm nhân sinh khối chủng Isaria javanica

VN1487 trên môi trường lên men rắn

76

3.5 Sự gây bệnh và hiệu lực phòng trừ của nấm Isaria javanica VN187

đối với sâu non sâu khoang (Spodoptera litura)

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nội dung

BTTN Bảo tồn thiên nhiên

Bảng 3.1 Số loài và mẫu vật nấm ký sinh côn trùng giống

Cordyceps và Isaria ở VQG Pù Mát và Khu BTTN Pù

Huống

40

Bảng 3.2 Đa dạng về thành phần loài nấm ký sinh côn trùng giống

Cordyceps và Isaria ở VQG Pù Mát và Khu BTTN Pù

Huống

42

Bảng 3.3 Đa dạng về vật chủ của nấm ký sinh côn trùng giống

Cordyceps, Isaria ở VQG Pù Mát và Khu BTTN Pù Huống

45

Bảng 3.4 Đa dạng theo nhóm vi sinh cảnh nấm ký sinh côn trùng

giống Cordyceps và Isaria ở VQG Pù Mát và Khu BTTN

Bảng 3.7 Khả năng bao phủ bề mặt môi trường rắn của nấm

Cordyceps sp1 VN1331 ở các mức hàm lượng cơ chất gạo

lứt khác nhau

69

Bảng 3.8 Khả năng bao phủ khối môi trường rắn của nấm

Cordyceps sp1 VN1331 ở các hàm lượng cơ chất gạo lứt

khác nhau

70

Bảng 3.9 Khả năng phát sinh bào tử của Cordyceps sp1 VN1331 ở

các mức hàm lượng cơ chất gạo lứt khác nhau

Bảng 3.12 Khả năng phát sinh bào tử của Cordyceps sp1 VN1331

trên môi trường rắn với hàm lượng bột nhộng tằm khác nhau

75

Bảng 3.13 Khả năng bao phủ bề mặt môi trường rắn của Isaria

javanica VN1487 với hàm lượng cơ chất gạo lứt khác nhau

77

Bảng 3.14 Khả năng bao phủ khối môi trường rắn của Isaria

javanica VN1487 ở các mức hàm lượng cơ chất gạo lứt

khác nhau

78

Bảng 3.15 Khả năng phát sinh bào tử của nấm Isaria javanica 79

chất gạo lứt khác nhau Bảng 3.16 Khả năng bao phủ bề mặt môi trường rắn của Isaria

javanica VN1487 với hàm lượng bột nhộng tằm khác nhau

Bảng 3.18 Khả năng phát sinh bào tử Isaria javanica VN1487 trên

môi trường rắn với hàm lượng bột nhộng tằm khác nhau

83

Bảng 3.19 Hiệu lực phòng trừ sâu khoang của Isaria javanica

VN1487 ở dạng lỏng với các nồng độ bào tử khác nhau

86

Bảng 3.20 Hiệu lực phòng trừ sâu khoang của Isaria javanica

VN1487 ở dạng bột khô với các nồng độ bào tử khác nhau

87

Bảng 3.21 Hiệu lực phòng trừ của nấm Isaria javanica VN1487 ở

các tuổi sâu non sâu khoang khác nhau

88

Bảng 3.22 Diễn biến số lượng sâu khoang mọc nấm I javanica

VN1487 theo thời gian sau xử lý nấm

90

Bảng 3.23 Mức độ biểu hiện bệnh của nấm Isaria javanica VN1487

trên sâu khoang

Hình 1.1 Chu trình xâm nhiễm chung của nấm ký sinh côn trùng

(Cheah C et al., 2004)

8

Hình 1.2 Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng

(Nguồn: Thomas M.B & Read A.F., 2007)

Hình 3.6 Hình thái nấm Cordyceps takaomontana VN1468 60

Hình 3.8 Hình thái nấm Cordyceps ninchukispora VN1053 66Hình 3.9 Tỷ lệ bao phủ bề mặt môi trường rắn của nấm Cordyceps

sp1 VN1331 ở mức hàm lượng cơ chất gạo lứt khác nhau

69

Hình 3.10 Tỷ lệ bao phủ khối môi trường rắn của nấm Cordyceps

sp1 VN1331 ở các mức hàm lượng cơ chất gạo lứt khác nhau

70

Hình 3.11 Nồng độ bào tử của nấm Cordyceps sp1 VN1331 ở các

mức hàm lượng cơ chất gạo lứt khác nhau

Hình 3.14 Nồng độ bào tử của Cordyceps sp1 VN1331 trên môi

trường rắn với mức hàm lượng bột nhộng tằm khác nhau

75

Hình 3.15 Tỷ lệ bao phủ bề mặt môi trường rắn của Isaria javanica

VN1487 ở các mức hàm lượng cơ chất gạo lứt khác nhau

77

Hình 3.16 Tỷ lệ bao phủ khối môi trường rắn của Isaria javanica

VN1487 ở các mức hàm lượng cơ chất gạo lứt khác nhau

78

Hình 3.17 Nồng độ bào tử của nấm Isaria javanica VN1487 trên môi

trường rắn ở các mức hàm lượng cơ chất gạo lứt khác nhau

Hình 3.20 Nồng độ bào tử của nấm Isaria javanica VN1487 trên môi

trường rắn ở các mức hàm lượng nhộng tằm khác nhau

83

Hình 3.21 Hiệu lực phòng trừ sâu khoang của nấm I javanica

VN1487 dạng lỏng với nồng độ bào tử khác nhau

86

Hình 3.22 Hiệu lực phòng trừ sâu khoang của Isaria javanica VN1487

ở dạng bột khô với các nồng độ bào tử khác nhau

88

Hình 3.23 Hiệu lực phòng trừ của nấm Isaria javanica VN1487 các

tuổi sâu non sâu khoang khác nhau

89Hình 3.24 Diễn biến số lượng sâu khoang mọc nấm Isaria javanica 91

Hình 3.25 Chu kỳ phát triển của nấm Isaria javanica VN1487 trên sâu

khoang

93

MỞ ĐẤU

1 Tính cấp thiết của việc nghiên cứu đề tài

Điểm đặc biệt của rừng nhiệt đới là những cánh rừng nguyên sinh được đặctrưng bởi tài nguyên vi sinh vật phong phú và đa dạng trong đó có nấm ký sinh côntrùng (Evan H.C, 1982) [36] Nấm ký sinh côn trùng (Entomopathogenic fungi -

EPF) thuộc bộ Hypocreales không chỉ là một nhóm có tính đa dạng sinh học cao mà

còn có vai trò quan trọng trong kiểm soát sinh học sâu hại cây trồng và trong y dược Nhiều nghiên cứu đã khẳng định giá trị của nấm ký sinh côn trùng nên ngàycàng được nhiều nước trên thế giới quan tâm Sự phong phú về nguồn lợi của nấm

-ký sinh côn trùng đã tạo nên sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghệ sinh họcnấm ký sinh côn trùng ở nhiều quốc gia trên thế giới

Điểm nổi bật của nấm ký sinh côn trùng lại là những giá trị y dược độc đáo vàquý hiếm của chúng Loài nấm ký sinh côn trùng có giá trị y dược được biết đến

đầu tiên và nổi tiếng là loài Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc (Đông trùng hạ thảo), sau đó là loài Cordyceps militaris (L ex Fr.) Link (Nhộng trùng thảo) với 25 tác

dụng về các chức năng và bệnh thuộc thận, huyết áp, tim mạch, miễn dịch, nội tiết

tố, ung thư,… (Nguyễn Lân Dũng và cs., 2005) [3] Các nghiên cứu của Thomadaki

H et al (2008) [83] cho thấy, một số loài nấm ký sinh côn trùng thuộc giống

Cordyceps có chất Cordycepine có thể chữa các bệnh ưng thư thông qua việc tăng

khả năng miễn dịch của con người, có thể ngăn chặn được di căn và sự phát triểncủa tế bào ung thư, Sự thành công của các nghiên cứu sản xuất nhân tạo ở cácnước như Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Hàn Quốc, Hoa Kỳ,… đã tạo các sảnphẩm và được chứng minh trên thế giới trong những thập kỷ qua Sản phẩm từ

Cordyceps sinensis, C militaris được gọi là thần dược.

Bên cạnh đó, nấm ký sinh côn trùng còn được biết đến như là một trong nhữngtác nhân chính trong kiểm soát sinh học tạo ra những chế phẩm sinh học tốt hơn, antoàn hơn Trên thế giới đã sử dụng thành công một số loài nấm để kiểm soát nhiều

loài sâu hại, như Metarhizium anisopliae, Hirsutela lecaniicola, Beauveria basiana, Beauveria amorpha, Akathomyces aranearum, [11], [12], [69], [85].

Đối với Việt Nam thì nấm ký sinh côn trùng và công nghệ nấm ký sinh côntrùng là lĩnh vực mới, chưa được quan tâm Nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùnglàm dược liệu và sử dụng trong kiểm soát sinh học còn rất hạn chế Hiện nay mới

chỉ có một vài dẫn liệu nghiên cứu về hai loài nấm là Beauveria basiana, Metarhizium anisopliae để kiểm soát sâu hại rau ở vùng Hà Nội và phụ cận, kiểm

soát sâu róm thông ở một số tỉnh phía Bắc, sâu hại đậu tương và đậu xanh ở HàTĩnh, kiểm soát bọ cánh cứng hại dừa ở các tỉnh phía Nam (Nguyễn Thị Lộc và cs.,2004), (Nguyễn Thị Thùy và cs., 2005) [18], [19], [20]

Mặt khác, Việt Nam là đất nước nhiệt đới có nguồn đa dạng sinh học rất phongphú, trong đó Vườn Quốc gia Pù Mát, Khu Bảo tồn thiên nhiên Pù Huống ở Nghệ

An được đánh giá là có tính đa dạng sinh học cao, đặc biệt chứa đựng nguồn lợi lớn

về nấm ký sinh côn trùng, nhưng cho đến nay mới chỉ có một số dẫn liệu nghiêncứu ban đầu của Trần Ngọc Lân và cs (2008) [12]

Có thể nói, nấm ký sinh côn trùng là nhóm chưa được quan tâm đúng mức,nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng trong kiểm soát sinh học, dược liệu vàbảo tồn đa dạng sinh học đang còn là khoảng trống ở Việt Nam cũng như trên thế

giới Trong nhóm nấm ký sinh côn trùng, các giống Cordyceps, Isaria được đánh giá

vừa đa dạng và có nhiều đặc tính sinh học quý Vì vậy, hướng nghiên cứu đánh giánguồn lợi nấm ký sinh côn trùng, đặc biệt việc đi sâu nghiên cứu các giá trị dược liệu

và kiểm soát sinh học là thực sự cần thiết, có giá trị khoa học và thực tiễn cao

Xuất phát từ những điểm nêu trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu:

“Nguồn lợi nấm ký sinh côn trùng các giống Cordyceps, Isaria, nhân sinh

khối chủng Cordyceps sp1 VN1331 và Isaria javanica VN1487 để kiểm soát sâu khoang”.

2 Mục đích nghiên cứu

(i) Đánh giá tính đa dạng sinh học và nguồn lợi nấm ký sinh côn trùng thuộc

các giống Cordyceps, Isaria ở Vườn Quốc gia Pù Mát và Khu Bảo tồn thiên

nhiên Pù Huống, tỉnh Nghệ An

(ii) Nghiên cứu ứng dụng công nghệ lên men bề mặt trên môi trường rắn để nhân

sinh khối các chủng nấm Cordyceps sp1 VN1331, Isaria javanica VN1487

và ứng dụng trong kiểm soát sâu khoang

3 Nội dung nghiên cứu

(i) Đánh giá đa dạng sinh học của nấm ký sinh côn trùng thuộc giống

Cordyceps và Isaria về thành phần loài, nhóm vật chủ và vi sinh cảnh

(ii) Đánh giá nguồn lợi của nấm ký sinh côn trùng trong kiểm soát sinh học, khả

năng cho hoạt chất sinh học, xác định các loài và chủng Cordyceps spp đặc

hữu Việt Nam có hợp chất sinh học

(iii) Mô tả đặc điểm sinh học, sinh thái của một số loài, chủng Cordycesps spp.

và dạng vô tính thuộc giống Isaria đặc hữu Việt Nam.

(iv) Xác định hàm lượng cơ chất gạo lứt và nguồn dinh dưỡng bổ sung là nhộngtằm trong ứng dụng công nghệ lên men bề mặt trên môi trường rắn để nhân

sinh khối chủng Cordyceps sp1 VN1331 và Isaria javanica VN1487.

(v) Đánh giá sự gây bệnh và hiệu lực phòng trừ của nấm Isaria javanica VN1487 đối với sâu non sâu khoang (Spodoptera litura).

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

* Cung cấp các dẫn liệu khoa học về mức độ đa dạng sinh học, sinh thái họcđánh giá nguồn lợi trong kiểm soát sinh học và làm dược liệu của nấm ký sinh côn

trùng giống Cordyceps, Isaria ở VQG Pù Mát và Khu BTTN Pù Huống, tỉnh Nghệ

An; góp phần nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng ở Việt Nam

* Xác định được các loài, chủng nấm đặc hữu của Việt Nam, nhất là các loài

có khả năng cho các chất có hoạt tính sinh học cao (Cordyceps spp.) làm thực phẩm

chức năng đáp ứng nhu cầu tăng cường sức khỏe ngày càng cao của con người

5 Yêu cầu và phạm vi nghiên cứu

* Điều tra, đánh giá nguồn lợi nấm ký sinh côn trùng thuộc các giống

Cordyceps, Isaria trong kiểm soát sinh học và làm dược liệu dựa trên kết quả phân

tích và tham khảo các nghiên cứu được công bố trên thế giới và Việt Nam

* Trong nghiên cứu ứng dụng công nghệ lên men bề mặt trên môi trường rắn

để nhân sinh khối 2 chủng Cordyceps sp1 VN1331 và Isaria javanica VN1487, đề

tài chỉ giới hạn các nghiên cứu xác định hàm lượng cơ chất gạo lứt và nguồn dinhdưỡng bổ sung là bột nhộng tằm

* Nghiên cứu nhân sinh khối nấm theo 2 định hướng ứng dụng, chủng

Cordyceps sp1 VN1331 để phân tích hoạt chất sinh học; đối với nấm Isaria javanica VN1487 sử dụng cho kiểm soát sinh học (có thể cho phân tích một số hoạt chất) Cho nên, trong đề tài chỉ tiến hành các nghiên cứu sử dụng chủng nấm Isaria javanica VN1487 để kiểm soát sâu khoang.

* Mẫu vật nấm được thu thập ở VQG Pù Mát, Khu BTTN Pù Huống, tiếnhành mô tả, phân lập, nhân nuôi tại Phòng thí nghiệm Công nghệ nấm ký sinh côntrùng, Khoa Nông Lâm Ngư, Trường Đại học Vinh

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cơ sở khoa học

1.1.1 Khái niệm nấm ký sinh côn trùng

Các loài nấm ký sinh côn trùng thường phân bố trong các khu rừng nhiệt đớiđặc biệt ở những cánh rừng nhiệt đới nguyên sinh Đây là nguồn tài nguyên phongphú, đa dạng và rất có giá trị trong kiểm soát sinh học sâu hại cây trồng và làm thựcphẩm chức năng, dược liệu

Khái niệm “Nấm ký sinh côn trùng - Entomopathogenic fungi (EPF)” hay “nấmcôn trùng - Insect fungi” được các nhà khoa học sử dụng như là một thuật ngữ đồngnghĩa, để chỉ về nhóm các loài nấm ký sinh gây bệnh cho côn trùng Nấm ký sinh côntrùng là thuật ngữ chỉ nhóm sinh thái (những loài nấm ký sinh trên nhóm vật chủ làcôn trùng Hexapoda/Insecta) mà không phải là đơn vị taxon phân loại

Nấm ký sinh côn trùng được phân chia thành 4 nhóm chính: (1) Ký sinh trong,tức là nấm ký sinh trong các nội quan, xoang cơ thể của côn trùng; (2) Ký sinhngoài, tức là nấm phát triển trên lớp cuticun vỏ cơ thể côn trùng và gây nên bệnh hạicho côn trùng vật chủ; (3) Nấm mọc trên cơ thể côn trùng, tức là những nấm đãđược trực tiếp hoặc gián tiếp chứng minh chúng ký sinh trên côn trùng; (4) Cộngsinh, có nghĩa là cả nấm và côn trùng cùng mang lại những lợi ích cho nhau trongmối quan hệ cùng chung sống (Samson et al., 1988) [77]

Nấm ký sinh côn trùng còn được phân chia thành ký sinh sơ cấp (primerypathogen) và ký sinh thứ cấp (secondary pathogen) Nấm ký sinh sơ cấp thườngnhiễm vào vật chủ côn trùng khỏe mạnh, gây bệnh và sau đó giết chết côn trùng.Trong khi đó, nấm ký sinh thứ cấp chỉ có thể ký sinh trên những côn trùng bị yếuhoặc côn trùng bị thương Các nấm bệnh ký sinh trên côn trùng trưởng thành hoặccôn trùng bị bệnh được gọi là ký sinh cơ hội hoặc ký sinh không chuyên tính, loại kýsinh này có thể nhiễm vào vật chủ thông qua sự xâm nhập qua lớp cuticun vỏ cơ thể

thương Sự khác nhau của ký sinh cơ hội và ký sinh qua vết thương đó là ký sinh quavết thương chỉ có thể xâm nhập vào côn trùng qua vết thương.

Như vậy, nấm ký sinh côn trùng (EPF) được dùng để mô tả hiện tượng nấm kýsinh trên hoặc trong vật chủ côn trùng Theo Tzean et al (1997) [87], khái niệm nàycũng được dùng cho nấm ký sinh trên nhện bởi vì nhện và côn trùng là 2 nhóm (lớp)trong một ngành (phyllum) Động vật chân khớp (Arthropoda) và chúng có cùng kiểusinh thái ăn thực vật hoặc ăn thịt và sinh sống chủ yếu trên cây

1.1.2 Cơ chế tác động của nấm lên cơ thể côn trùng

Nấm ký sinh côn trùng có thể xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng qua con đường

hô hấp, tiêu hóa hoặc qua cơ quan sinh dục, nhưng phần lớn là qua lớp vỏ cuticun,tức là phải có sự tiếp xúc của bào tử nấm vào bề mặt cơ thể vật chủ Bào tử nấmbám vào bề mặt cơ thể vật chủ, khi đủ điều kiện ẩm độ bào tử mọc mầm và xâmnhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp cuticun Nấm xâm nhiễm vào cơ thểcôn trùng gồm 3 giai đoạn chính:

 Giai đoạn xâm nhập

Giai đoạn xâm nhập được tính từ khi bào tử nấm mọc mầm cho đến lúc hoànthành việc xâm nhập vào trong xoang cơ thể côn trùng Bào tử nấm sau khi mọcmầm phát sinh mầm bệnh, giải phóng các enzyme ngoại bào tương ứng với cácthành phần chính của lớp vỏ cuticun của côn trùng để phân hủy lớp vỏ này nhưprotease, chitinase, lipase, aminopeptidase, carboxypeptidase A, esterase, N -axetylglucosaminidase, cenlulase Các enzyme tạo ra nhanh chóng, liên tục vàvới mức độ khác nhau giữa các loài và trong các chủng của một loài nấm Haienzyme quan trọng nhất là protease và chitinase tham gia phân hủy lớp da côn trùng(cuticula) và lớp biểu bì (thành phần chính là protein), liên quan trực tiếp đến hiệu lựcdiệt côn trùng của nấm ký sinh côn trùng (Lerger R J et al., 1986 [58]; Charley A K

et al., 1991 [26]; Eguchi M., 1992 [35]; Janet Jennifer et al., 2006 [44])

 Giai đoạn phát triển nấm trong cơ thể côn trùng đến khi côn trùng chết

Đây là giai đoạn sống ký sinh của nấm Trong xoang cơ thể côn trùng nấm tiếptục phát triển, hình thành rất nhiều sợi nấm, chúng phân tán khắp xoang cơ thể theo

dịch máu, phá hủy các tế bào máu và làm giảm tốc độ lưu thông máu Toàn bộ các bộphận nội quan bị xâm nhập Nấm thường xâm nhập vào khí quản làm suy yếu hô hấp,hoạt động của côn trùng trở nên chậm chạp và phản ứng kém với các tác nhân kíchthích bên ngoài, kết quả là vật chủ mất khả năng kiểm soát hoạt động sống và dẫn đếnchết (dẫn theo Phạm Văn Lầm, 2000) [10].

 Giai đoạn sinh trưởng của nấm sau khi vật chủ chết

Đây là giai đoạn sống hoại sinh của nấm ký sinh Xác côn trùng chết là nguồndinh dưỡng có giá trị cho các vi sinh vật Thông thường, các bộ phận bên trong cơthể côn trùng sẽ bị phân hủy bởi vi khuẩn hoại sinh Trên bề mặt ngoài của cơ thể

côn trùng, các nấm hoại sinh như Aspergillus spp., Penicillium spp và Fusarium

spp định cư ở lớp biểu bì và cạnh tranh với vi khuẩn ở bên trong cơ thể côn trùngchết Do nấm côn trùng có khả năng sản sinh ra các chất có hoạt tính như thuốckháng sinh ức chế hoạt động của vi khuẩn và nấm hoại sinh khác nên chúng có thểcạnh tranh với các sinh vật này để tồn tại và phát triển, làm cho xác vật chủ không

bị phân hủy Sau khi nấm côn trùng đã sử dụng cạn kiệt nguồn dinh dưỡng bêntrong cơ thể côn trùng, nó chuyển sang giai đoạn hình thành bào tử

Ở giai đoạn nấm đâm xuyên, mọc thành sợi ra bên ngoài nó sử dụng toàn bộtác động cơ học, sau đó các bào tử được hình thành trên lớp sợi nấm ở bề mặt cơ thểvật chủ Nhiều côn trùng bị bao bọc toàn bộ bên ngoài bởi hệ sợi nấm và bào tử, vìvậy mà rất khó xác định loài côn trùng vật chủ (Janet Jennifer et al., 2006) [44].Những cá thể sâu hại bị nhiễm nấm thường có các vệt chấm đen xuất hiện trên

bề mặt, có thể tại nơi bào tử nấm bám vào và mọc mầm xâm nhiễm vào bên trong

cơ thể vật chủ Nơi xâm nhập của nấm Beauveria basiana thường có vệt chấm đen

hình dạng bất định Khi bị bệnh do nấm, sâu hại ngừng hoạt động khoảng 2 - 3 ngàytrước thời điểm phát triển hoàn toàn của nấm ở trong cơ thể vật chủ Nếu bị bệnh do

nấm Beauvera thì sâu hại sẽ ngừng hoạt động khoảng 7 ngày trước khi chết Những

cá thể sâu hại bị nhiễm bệnh nấm côn trùng thường có màu hồng nhạt Một số loàinấm có thể làm cho sâu bệnh trở nên có màu vàng nhạt, xanh lá cây hoặc màu nâu

côn trùng không bao giờ bị nát, mà thường vẫn giữ nguyên hình dạng như khi cònsống Toàn bộ bên trong cơ thể sâu chết bệnh chứa đầy sợi nấm Sau đó, các sợinấm này mọc ra ngoài qua vỏ cơ thể và bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của cơ thể sâuchết bệnh Đây là đặc điểm rất đặc trưng để phân biệt sâu chết bệnh do nấm côntrùng với các bệnh khác (Phạm Văn Lầm, 2000) [10]

Hình 1.1 Chu trình xâm nhiễm chung của nấm ký sinh côn trùng

(Cheah C et al., 2004) [27]

Thomas M B., Read A F (2007) [84], đưa ra sơ đồ xâm nhiễm của nấm kýsinh côn trùng vào cơ thể vật chủ Chu kỳ phát triển của nấm ký sinh côn trùng, như

nấm Beauveria bassiana và Metarhizium anisopliae gồm các giai đoạn: Bào tử đính

tiếp xúc với tầng cuticun của lớp vỏ vật chủ, bào tử nảy mầm và sinh sản hình thànhvòi và giác bám (cấu trúc cơ quan xâm nhập)

Sự xâm nhập của bào tử đính là sự tổ hợp của sức ép cơ học và sự tác động củaenzyme phân giải tầng cuticun Quá trình sinh trưởng bên trong xoang máu cơ thể vậtchủ và sự sinh sản của bào tử đính làm vật chủ bị chết Tầng cuticun của vỏ cơ thể vậtchủ là tầng chống chịu đầu tiên trong việc bảo vệ chống lại sự xâm nhiễm của nấm và

có vai trò quyết định tính chuyên hóa đặc hiệu của nấm Nếu nấm phá vỡ được tầngcuticun thì sự xâm nhiễm thành công, sau đó phụ thuộc vào khả năng chiến thắngđược phản ứng miễn dịch bẩm sinh ở côn trùng của nấm Các loài côn trùng có thểphản ứng lại sự xâm nhiễm này của nấm bằng cả hai phương thức là tế bào và thểdịch Sự hình thành hoạt động miễn dịch càng sớm ở điểm phân giải bào tử đínhtrong suốt quá trình xâm nhập Các loài nấm đều có hai phương thức để chiến thắngcác phản ứng tự vệ của vật chủ Sự phát triển của các dạng sinh trưởng giai đoạn tiềm

ẩn từ các phản ứng tự vệ của côn trùng và sự sản xuất ra các chất miễn dịch phân hóathuận nghịch của bộ phận ức chế hệ thống bảo vệ

Khi nấm Cordyceps tấn công vật chủ thì thể sợi nấm xâm chiếm và dần dần

thay thế các mô trong cơ thể vật chủ, vào lúc hình thành dạng quả thể thon dài (chấtđệm) có thể có hình trụ, phân nhánh hay tập hợp nhiều hình dạng khác nhau Một số

loài Cordyceps có thể ảnh hưởng đến hành vi của vật chủ Cordyceps unilateralis

gây bệnh trên kiến và khiến chúng leo lên cây và bám ở đó trước khi chết, đảm bảocho sự phát tán tối đa bào tử từ quả thể mọc ra ngoài cơ thể kiến đã chết

Hình 1.2 Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng

1.2 Tình hình nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng trên thế giới và Việt Nam

1.2.1 Tình hình nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng trên thế giới

 Nghiên cứu về đa dạng sinh học nấm ký sinh côn trùng

Cho đến nay đã phát hiện trên thế giới có khoảng 1,5 triệu loài nấm, trong đó cókhoảng 2.000 loài nấm ký sinh côn trùng và mô tả được khoảng trên 500 loài nấm

thuộc nhóm Cordyceps (Sung Gi-Ho et al., 2007) [81] Theo kết quả công bố mới

nhất của trang website Index Fungorum (www.indexfungorum.org), trên thế giới cókhoảng 2500 loài nấm ký sinh côn trùng, trong đó giống có thành phần loài đa dạng

nhất là Cordyceps với 525 loài, tiếp theo đó là Verticilium với 261 loài, Entomophthora với 152 loài, Hypocrella với 112 loài, Aschersonia 79 loài và Torrubiella 83 loài,.…

Nghiên cứu về đa dạng các loài nấm ký sinh côn trùng tại Bắc Mỹ phát hiện

được 39 loài nấm ký sinh côn trùng thuộc giống Cordyceps Trong số 137 loài nấm

ký sinh côn trùng được Kobayasi mô tả thì có đến 34 loài có nguồn gốc ở Bắc Mỹ.Kết quả tổng kết nghiên cứu cùng thời gian liên quan đến vật chủ ký sinh cho thấy

giống Cordyceps có 5 loài ký sinh trên nhện (Arachnida), 39 loài ký sinh trên Bộ

Coleoptera, 36 loài ký sinh trên Bộ Lepidoptera, 20 loài ký sinh trên BộHymenoptera, 12 loài ký sinh trên Bộ Hemiptera, 8 loài ký sinh trên Bộ Orthoptera,

3 loài trên Bộ Diptera và 1 loài trên Bộ Isoptera Cũng như các loài nấm ký sinhkhác, mối quan hệ với vật chủ là một phần quan trọng trong định loại nấm ký sinhcôn trùng, đặc biệt là định loại đến loài (Mains, 1958) [63]

Ở Thái Lan, nấm ký sinh côn trùng mới được nghiên cứu trong khoảng 15

năm gần đây và đã phát hiện các loài nấm ký sinh côn trùng mới Cordyceps khaoyaiensis, Cordyceps pseudomilitaris (Hywel-Jones N L., 1994) [40], phát hiện loài Cordyceps sphecocephala và Hymenostilbe sp ký sinh trên một số loài ong tại

Thái Lan (Hywel - Jones N L.,1995) [41] Sau 15 năm nghiên cứu, các nhà khoahọc Trung tâm Kỹ nghệ gen và Công nghệ sinh học (BIOTEC) đã phát hiện hơn

400 loài nấm ký sinh côn trùng thuộc 15 giống có ở Thái Lan, trong đó có hơn 120

loài nấm ký sinh côn trùng thuộc giống Cordyceps (Morakot T., 2003) [68].

BIOTEC đã có nhiều thành công trong nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùngsản xuất thuốc sinh học kiểm soát sâu hại cây trồng và làm dược liệu (Janet JenniferLuangsa-ard, 2006) [44] Các nhà khoa học BIOTEC đã phân loại nấm ký sinh côntrùng về hình thái, sinh học (Janet Jennifer Luangsa-ard, 2006, 2007) [44, 45]; phân

loại các loài Cordyceps bằng sinh học phân tử DNA (Sung G H., 2007) [81]

Kết quả nghiên cứu của Liu Z Y et al (2001) [60] đã phát hiện ra tác nhân

gây bệnh mới của côn trùng là Cordyceps brittlebankisoides là dạng hữu tính của dạng vô tính là Metarhizium anisopliae var majus

Nghiên cứu về đa dạng nấm ký sinh côn trùng trong thời gian 2005 - 2006 tạiChiang Mai, Thái Lan đã tìm thấy có 34 loài thuộc 15 giống nấm ký sinh côn trùngtrong tổng số 301 mẫu thu thập, ký sinh trên 10 bộ côn trùng và nhện Các loài phổ

biến là Ophiocordyceps myrmecophila với tần suất bắt gặp 22,61%, Ophiocordyceps unilateralis 13,78%, Isaria fumosoroseus 13,07%, Paecilomyces marquandii 7,42%

và Isaria tenuipes 5,30% Các bộ côn trùng bị nấm ký sinh nhiều nhất là

Hymenoptera, Hemiptera và Lepidoptera (Aung O.M et al., 2008) [24]

Theo Chen C S (1999) [28] để xác định các loài nấm một cách chính xác thìphải sử dụng phương pháp PCR 18S rRNA với cặp mồi NS3/NS6 Nghiên cứu ứngdụng sinh học phân tử từ việc kết hợp 5 đến 7 locus gen (nrLSU, nrSSU, tef1, npb1,

npb2, tub, atp 6) trong định loại các loài thuộc giống Cordyceps (thuộc họ

Clavicipitaceae trước đây) hiện nay họ này được chia ra thành 3 họ là Cordycipitaceae,Ophiocordycipitaceae và Clavicipitaceae Trong đó, họ Ophiocordycipitaceae có thêm

giống mới là Elaphocordyceps, họ Clavicipitaceae có thêm giống mới là Metacordyceps Kết quả nghiên cứu này cũng mô tả thêm 2 loài mới là Metacordyceps yongmunensis (G H Sung, J.M Sung & Spatafora, 2004); Ophiocordyceps communis

Hywel-Jones & Samson Ngoài ra, nghiên cứu này còn đặt tên lại cho nhiều loài nấm

ký sinh côn trùng trước đây thuộc giống Cordyceps nhưng hiện nay thuộc các giống khác Elaphocordyceps, Ophiocordyceps, Metacordyceps (Sung G H et al., 2007)

[81]

Cho đến nay loài Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc và Cordyceps militaris (L.

ex Fr.) Link là 2 loài được nghiên cứu nhiều nhất (Paterson R R M., 2008) [71].Nhìn chung, các nghiên cứu được tiến hành khá nhiều về các đặc tính sinh học củanấm cũng như phân tích, đánh giá hiệu quả trong việc hỗ trợ ngăn ngừa các bệnhhiểm nghèo của Đông trùng hạ thảo nhằm thu thập tìm kiếm các nguồn gen quý trênthế giới để tạo chế phẩm phục vụ việc bảo vệ sức khoẻ con người (Stensrod et al.,

2005 [79]; Nigel L H J., 2005 [69]; Sung G H et al 2007 [81])

 Nghiên cứu về công nghệ lên men nấm ký sinh côn trùng

Trên thế giới, nghiên cứu ứng dụng công nghệ vi sinh nhân nuôi nấm ký sinhcôn trùng đang ngày càng được quan tâm tại nhiều nước, đặc biệt trong 10 năm trởlại đây Hiện nay, hướng nghiên cứu này đã thành công ở một số nước như TrungQuốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Mỹ và bước đầu đã triển khai sản xuất ở quy mô côngnghiệp nhỏ Sinh khối nấm được sản xuất bằng công nghệ lên chìm trên môi trườngmen lỏng, lên men bề mặt trên môi trường rắn, nhộng tằm dâu, ; tạo dạng hệ sợinấm hay quả thể stroma có chứa các hoạt chất sinh học cao (cordycepine,

adenosine, ) Hiện nay, tập trung nghiên cứu nhiều về 2 loài Đông trùng hạ thảo là

Cordycep militaris, Cordyceps sinensis và loài Isaria tenuipes.

Nghiên cứu nuôi nhân sinh khối Cordyceps militaris để chiết suất các hoạt

chất làm dược liệu có các công trình của Jong Pil Park et al (2002) [49]; Kim S.W

et al (2003) [54]; Mina Masuda et al (2006) [66]; Sung-Hom Yeon et al (2006)[80], Xian-Bing Mao et al (2005) [89], In-Pyo Hong et al (2010) [43]

Kết quả nghiên cứu của Jong Pil Park et al (2002) [49] về ảnh hưởng của tốc

độ gió cung cấp cho hệ thống nồi lên men chìm đến đặc điểm hình thái của sợi nấm

và sản lượng exo-biopolymer của loài Cordyceps militaris trong môi trường nuôi

cấy 40g sucrose, 10g dịch chiết ngũ cốc (corn teep powder), 0,5g K2HPO4, 0,5g

KH2PO4, 0,5g MgSO4.7H2O, 0,1g FeSO4.7H2O trong 1 lít nước cất Kết quả nghiêncứu cho thấy, ở tốc độ gió 2 vvm đường kính sợi nấm và mức độ kết dính của sợi

nấm đạt cao nhất, gần như tương tự với exo-biopolymer tổng hợp.

Kết quả nghiên cứu của Xian-Bing Mao et al (2005) [89] về việc tối ưu hoánguồn C và tỷ lệ C/N trong điều kiện nuôi cấy lắc để sản xuất cordycepine bằng

phương pháp lên men chìm từ loài nấm ký sinh côn trùng Cordyceps militaris cho thấy

tại điều kiện môi trường có chứa 40g glucose/l thì sản lượng của cordycepine là caonhất đạt 245,7 ± 4,4 mg/l trong 18 ngày nuôi và tỷ lệ 42,0g glucose/l và 15,8g peptone/lcho sản lượng cordycepine cao nhất đạt 345,4 ± 8,5mg/l và trung bình 19,2 mg/l/ngày Kết quả nghiên cứu các điều kiện nhằm làm tăng sản lượng cordycepine (3-deoxyadenosine) bằng phương pháp lên men chìm trong môi trường bình tam giác

của chủng nấm ký sinh côn trùng Cordyceps militaris NBRC 9787 cho thấy việc

thêm một loạt hợp chất như hợp chất sinh tổng hợp purine, các loại coenzyme vàcác chất hoạt động bề mặt vào môi trường cơ bản đã làm tăng đáng kể hàm lượngcordycepine, glycine, l-aspartic acid, l-glutamine, adenine và adenosine Điều kiệntối ưu nhất là môi trường kết hợp 1g/l adenine và 16g/l glycine cho sản lượngcordycepine đạt 2,5g/l tăng hơn 4,1 lần so với môi trường cơ bản (đối chứng)

Khoảng 98% cordycepine tổng hợp bởi C militaris được tiết ra môi trường nuôi cấy

guanine thì quan sát thấy có ít trong môi trường Nguồn nitơ thích hợp để sản xuấtcordycepine là hỗn hợp của peptone và yeasextrac (75%) hoặc cao hơn Tỷ lệcacbon/nitơ tối ưu là 2/1 và đường đã được sử dụng như là nguồn cacbon Theo cácđiều kiện tối ưu, nồng độ cordycepine tối đa trong môi trường nuôi cấy đạt 640 mg/l

và cordycepine sản suất tối đa là 32 mg/lít/ngày (Mina Masuda et al., 2006) [66].Việc lựa chọn giống tằm cho hình thành stroma và synnema cũng đã đượcnghiên cứu Ba giống tằm là Daeseungjam, Baegokjam và Keumokjam đã được thử

nghiệm Các nhộng tằm bị nhiễm nấm C militaris chết trong vòng 2 - 3 ngày và cứng sau 7 ngày tiêm Nhiễm nấm C militaris trên nhộng đạt được nhiều nhất ở

giống Daeseungjam với liều tiêm 100 ul với tỷ lệ đạt 90.8% (n=2611), kết quả cũngchỉ ra rằng nồng độ bào tử lớn hơn 2x105 bt/ml là phù hợp cho tiêm nhiễm C militaris trên nhộng tằm (In-Pyo Hong et al., 2010) [43]

Nhiều công trình nghiên cứu nhân sinh khối loài Cordyceps sinensis để chiết

suất lấy các hoạt chất làm dược liệu, như Weiyun Zhang (2005) [88], Richard AlanMiller (2005) [76], Cleaver Phillip D (2006) [34], Jian Hui Xiao et al (2006) [46],

Xu Quiqin et al (2009) [90], Pil-Don Kang et al (2010) [75]

Nghiên cứu của Kim H.O., Yun J.W (2005) [53] về so sánh nhân nuôi nấm C militaris và C sinensis trên môi trường lỏng bằng công nghệ lên men chìm cho thấy,

hai loại nấm cho thấy yêu cầu dinh dưỡng khác nhau Nhìn chung, nồng độ của sinh

khối sợi nấm, EPS và cordycepine đạt được C militaris là cao hơn so với những của

C sinensis Trong trường hợp của C militaris, sinh khối sợi nấm cao nhất (22,9 g/lít)

và sản xuất EPS (5 g/lít) đã đạt được trong môi trường với thành phần và tỷ lệ trong 1lít gồm 40g sucrose, 5 g ngô bột, ở 300C, và độ pH ban đầu 8,0 Các điều kiện nuôi

cấy tối ưu cho C sinensis với thành phần và tỷ lệ trong 1 lít gồm 20g sucrose, ngô

bột 25g, 0,78 CaCl2, MgSO4.7H2O 1,73 ở 200C và độ pH ban đầu 4.0, các sợi nấm tối

đa sinh khối và EPS là 20,9 và 4,1 g/lít Cordycepine, một chất chuyển hóa có hoạttính sinh học được bài tiết ở mức thấp trong thời gian lên men sớm (tối đa 38,8 mg/lít

với C militaris, C sinensis là 18,2 mg/lít).

Kết quả nghiên cứu Jian Hui Xiao et al (2006) [46] loài nấm ký sinh côn trùng

Cordyceps pruinosa về tối ưu hoá điều kiện môi trường lên men chìm trong bình tam giác dưới điều kiện lắc để sản xuất sinh khối polysaccharide, đây là một loài có

chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao Môi trường và điều kiện môi trườngnuôi cấy bao gồm: dịch chiết khoai tây 2%, sucrose 2,5%, đậu tương 0,5%, dịchchiết thịt bò 0,5%, yeast extract 0,1%, KCl 0,02%, K2HPO4 0.1%, MgSO4.7H2O0,05%, pH 7,0, thể tích giống cấy 5%, môi trường nuôi cấy 50 ml/250 ml thể tíchbình tam giác, nuôi cấy trong 7 ngày Trong môi trường lên men, sucrose, dịch chiếtthịt bò (beef extract) và yeast extract được thay thế bằng sucrose rỉ đường, đậutương và hỗn hợp vitamin B Dưới điều kiện môi trường chuẩn, sản lượngpolysaccharide đạt 9,51 g/l sau 54 giờ nuôi cấy trong nồi lên men 25 lít, giá trị nàygần cao gấp đôi so với nuôi cấy trong môi trường bình tam giác ở điều kiện lắc

Nghiên cứu của Jian-Hui Xiao et al (2006) [46] nhân nuôi nấm Cordyceps jiangxiensis bằng phương pháp lên men chìm tăng cường đồng thời sản lượng sợi

nấm và các hợp chất polysaccharide Trong bình tam giác thể tích 500 ml có 200mlcủa dung dịch 40g/l glycerol mật đường, 5g/l dịch chiết dầu lạc (peanut steep meal),6g/l yeast extract, 1g/l KH2PO4, 0,5g/l ZnCl2, 0,5g/l MgSO4 và 5% thể tích giốngnấm; pH ban đầu 6, nhiệt độ môi trường đặt ở 28,80C sản lượng của sợi nấm và hợpchất polysaccharide đạt tương ứng là 24,5 và 8,9 g/l, sau 9 ngày

Kết quả nghiên cứu của Jung-Yong Oh et al (2007) [50] nhằm sản xuất hỗn

hợp polysaccharide và peptide bằng phương pháp lên men chìm từ nấm Cordyceps sphecocephala cho thấy, ảnh hưởng của các thành phần và yếu tố môi trường đến sản

lượng sinh khối và hỗn hợp polysaccharide và peptide (exobiopolymers) Nhiệt độ và

pH môi trường ban đầu thích hợp cho sản xuất sinh khối và hỗn hợp exobiopolymers

là 25,80C và pH 4 - 5 Thành phần tối ưu cho môi trường nuôi cấy là (g/l): sucrose 40,yeast extract 6, polypepton 2, KH2PO4 0,46, K2HPO4 1 và MgSO4.7H2O 0,5 Trongđiều kiện môi trường như vậy, sản lượng sinh khối đạt (28,2 g/l) ở tốc độ khuấy củanồi lên men là 300 vòng/phút, tốc độ không khí 2 vvm Sản lượng hỗn hợp

Nghiên cứu của Xu Quiqin et al (2009) [90] sử dụng phương pháp lên menchìm trong môi trường có chứa sucrose 66,0g/l, bột yeast 10,0g/l, dịch chiết từ tằm30,0g/l, MgSO4.7H2O 0,4g/l và KH2PO4 0,4g/l trên chủng Cordyceps ophioglossoides L2 Kết quả nghiên cứu cho thấy, trong điều kiện giống cấy 6 ngày

tuổi, thể tích giống là 6% so với thể tích nuôi cấy, pH ban đầu là 5,6, nhiệt độ nuôicấy là 240C và lắc 160 vòng/phút thì sản lượng sinh khối đạt được cao nhất khoảng20,2 g/l sau 90 giờ nuôi cấy Khi tăng thể tích nuôi cấy trong hệ thống lên men quy

mô 15 lít, sản lượng sinh khối cũng đạt xấp xỉ 19g/l

Loài nấm Isaria tenuipes cũng được quan tâm nghiên cứu ứng dụng trong sản

xuất được phát triển mạnh ở các nước như Nhật Bản, Trung Quốc và đặc biệt là Hàn

Quốc như một ngành công nghiệp nhỏ tạo ra các sản phẩm của I tenuipes đa dạng từ

thực phẩm chức năng đến các dạng thuốc viên nang

Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại màu sắc nhộng tằm đến hình thànhsynnema Thời gian phát triển của ấn trùng tằm kén vàng ngắn hơn ấu trùngYangwonjam 25,30C và 78,5% RH, tương ứng là 24 ngày và 7 giờ và 24 ngày và 15

giờ Trong thử nghiệm lây nhiễm I tenuipes trên tằm và ấu trùng của sâu tơ thì thời gian nhiễm thường dài hơn tiêm I tenuipes trên nhộng tằm vàng và Yangwonjam.

Tỷ lệ sống sót nhộng tằm vàng là 94,4%, trong khi đó là 91,9% Yangwonjam Tỷ lệ

nhiễm I tenuipes trên ấu trùng tằm vàng là 93,8% và 96,9% trên Yangwonjam Tuy

nhiên, synnema tốt hơn trong Yangwonjam với tỷ lệ 99,8% so với tằm vàng là98,6% Trọng lượng synnema của tằm vàng là 1,12 g thấp hơn Yangwonjam 1,29 g

Tuy nhiên, sai khác này không có ý nghĩa thống kê Synnemata của I tenuipes được

sản xuất trên nhộng màu trắng hoặc màu trắng sữa về màu sắc, và tương tự nhưtrong hình dạng và màu sắc synnemata hoang dã được thu thập ở Hàn Quốc (Pil-Don Kang et al., 2010) [75]

 Nghiên cứu về các hoạt chất sinh học từ nấm ký sinh côn trùng

Đông trùng hạ thảo là một nấm dược liệu quý hiếm được biết đến ở TrungQuốc trong nhiều thế kỷ Ở các nước phương Tây biết đến loại dược liệu quý hiếmnày từ khoảng 20 năm gần đây Từ đó đến nay các nghiên cứu hiện đại chứng minh

tác dụng kỳ diệu của nấm Đông trùng hạ thảo trong điều trị bệnh và bồi bổ sức khỏe

và được nghiên cứu nhiều nhất ở Trung Quốc (John Holliday et al., 2004) [48] Các nghiên cứu của Pegler D.N et al (1994) [74], Mizuno T (1999) [67] cho

thấy các loài Cordyceps thường được sử dụng như là một loại thuốc kéo dài tuổi thọ

và nó được xem như là thuốc cầm máu, thuốc chữa bệnh hen suyễn và chứng giảmglucoza trong máu Chức năng này do chúng có nhiều hợp chất có hoạt tính sinhhọc cao, như cordycepine, ophiocordine và một số hợp chất polisaccharides

Phần lớn các loài của giống Cordyceps cho các chất có hoạt tính sinh học cao, như loài C unilateralis có các chất 6 dẫn xuất của napthoquinone có hoạt tính sinh học cao

như eythrostominone, deoxyerythrostominone, 4 - O - methyl erythrostominone,epierythrostominol, deoxyerythrostominol và đặc biệt là 3,5 - β - trihydrooxy - 6 -methoxy - 2 - (5 - oxyohexa - 1,3 - dienyl) - 1,4 - naphthoquinone được xem như là chất

có khả năng chống lại bệnh sốt rét - malaria (Patcharaporn Wongsa et al., 2005) [72].Nghiên cứu của Li Pei-Jung et al (2003) [59], Chen Y.Q et al (2004) [30]cho thấy, hợp chất cordysinocan có tác dụng tăng cường chức năng của bạch cầu,hạn chế sự phát triển của khối u và bảo vệ chức năng gan cũng như chống oxy hoá.Theo hướng này, đã cho thấy hoạt chất 2, 5-oligoadenylate (tương tự nhưcordycepine) có khả năng tăng cường hệ miễn dịch của con người, ức chế hoạt độngcủa virus HIV trong điều kiện nuôi cấy invitro

Loài Cordyceps militaris cũng được xem như là một loại thuốc bổ và được sử

dụng trong thuốc đông y, dùng để chữa một loạt các loại bệnh, chữa ung thư,…

Cũng giống như loài Cordycep sinensis, các nghiên cứu về các hợp chất có hoạt tính sinh học cho thấy loài Cordyceps militaris cũng có hợp chất cordycepine, ngoài ra

còn có các hợp chất như peptide tuần hoàn, 10-membered macrolides,cepharosporolides C, E and F, pyridine-2,6-dicarboxylic acid, 2-carboxymethyl-4-(30-hydroxybutyl) furan, axít dipicolinic (Weiyun Zhang et al., 2005 [88]; Jung etal., 2007 [50])

Theo Kim H.G (2006) [52], thành phần của nấm Cordyceps militaris có chứa

nhiều hoạt chất sinh học khác Acid trùng thảo làm hạ nội áp hộp sọ, thúc đẩy sự traođổi chất, đồng thời chữa khỏi ho và lợi tiểu Trùng thảo tố có tác dụng kháng khuẩn,chống virus, ngăn chặn tế bào ung thư phát triển, có tác dụng hạ độ đường trong máu,trùng thảo đa đường nâng cao khả năng miễn dịch của cơ thể và tăng công năng bàitiết gan, có tác dụng bảo vệ gan, SOD có thể tiêu trừ axit tự do (free acid) thừa trong

cơ thể, ngăn chặn sự lão hoá, chống và ngăn chặn tế bào ung thư phát triển

Các synnema (bó cuống bào tử đính) của Isaria tenuipes (Peck.) Samson được

gọi là “Bông tuyết Đông trùng hạ thảo”, chứa các hợp chất sinh học và dượcphẩm như adenosine và N6-(2-hydroxyethyl) adenosine, một loại hợp chất sinh họcchống rối loạn nhịp tim, lưu thông mạch vành, chất kháng khuẩn ức chế khối u ungthư ruột kết, ruột thẳng, gan và kháng được trùng rốt rét do trong loài này có chứahoạt chất thuộc nhóm cyclodepsipeptides … (Choi Y W, 1999) [32]

 Nghiên cứu khả năng kiểm soát sâu hại của nấm ký sinh côn trùng

Nhiều loài nấm ký sinh côn trùng được xem như là một tác nhân hiệu quảtrong kiểm soát sinh học sâu hại cây trồng nông lâm nghiệp Hiện nay, tập trungnghiên cứu ứng dụng tạo ra các loại chế phẩm thuốc trừ sâu vi sinh

Các nghiên cứu cho thấy các loài nấm thuộc giống Isaria cũng được xem như

là một tác nhân quan trọng trong kiểm soát sâu hại cây trồng, điển hình như Isaria javanica, Isaria tenuipes, Isaria fumosorosea, sử dụng P tenuipes để tạo ra sản

phẩm làm thuốc trừ sâu sinh học kiểm soát rệp trắng hại rau đạt hiệu quả cao, tácnhân gây bệnh phổ biến cho các loài sâu bộ cánh vảy Lepidoptera (Nigel L., Hywel

- Jones, 2005) [69]

Các nghiên cứu tại Đức khi sử dụng 7 chủng nấm của 3 loài nấm ký sinh côn

trùng như Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Paecilomyces fumosoroseus để đánh giá khả năng kiểm soát sâu xanh tuổi 3 trong điều kiện phòng

thí nghiệm Kết quả nghiên cứu cho thấy, hiệu lực kiểm soát của 7 chủng nấm thuộc

3 loài nấm ký sinh côn trùng biến động từ 68 đến 100% Nồng độ gây chết 50%(LC50) của loài M anisopliae đối với ấu trùng tuổi 3 là 6,0x105 bào tử/ml Nồng độgây chết 50% (LC50) của loài B bassiana đối với ấu trùng tuổi 3 là 1,5 x 105 bào tử/

ml và loài P fumosoroseus đối với ấu trùng sâu xanh tuổi 3 là 4,2x104bào tử/ml.

Kết quả cả 3 loài nấm ký sinh côn trùng nói trên, đặc biệt là P fumosoroseus, có tiềm năng cao cho việc kiểm soát sinh học loài sâu xanh (Heliothis armigera Hub.)

và có thể sử dụng để tiêu diệt nhộng của sâu xanh ở trong đất (dẫn theo Trần NgọcLân và cs., 2008) [11, 12]

Nấm Beauveria bassiana (Balsamo) (Bb.5335) và Metarhizium anisopliae (Metsch) (Ma.7965) có khả năng gây bệnh trên nhiều côn trùng như Coccinella septempunctata L (Col., Coccinellidae), Chrysoperla carnea (Stephens) (Neur., Chrysopidae) và Dicyphus tamaninii Wagner (Him., Miridae) cũng như côn trùng trong đất Heteromurus nitidus Templeton (Collembola: Entomobryidae) đã được

nghiên cứu Các thí nghiệm được tiến hành ở mức nồng độ bào tử conidia 108 bào tử/

ml trên sâu non của C septempunctata, C carnea và trưởng thành của loài D tamaninii và H nitidus Theo dõi tỷ lệ chết hàng ngày, kết quả cho thấy B bassiana

đã được tìm thấy là không gây bệnh cho thiên địch tự nhiên và côn trùng đất có lợi (Thungrabeab M., Tongma S., 2007) [85]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng ở Việt Nam

 Nghiên cứu về đa dạng nấm ký sinh côn trùng

Kết quả nghiên cứu của Võ Thị Thu Oanh và cs (2003) [15] về thành phầnnấm ký sinh trên côn trùng gây hại tại một số quận ngoại thành của thành phố Hồ

Chí Minh cho thấy, có 8 loài nấm ký sinh côn trùng thuộc các giống Beauveria, Metarhizium, Normuraea, Entomophthora, Aschersonia, Hirsutella Trong các mẫu thu thập, thì 2 loài nấm Beauveria bassiana và Metarhizium anisopliea ký sinh trên

nhiều loại côn trùng khác nhau

Kết quả hợp tác nghiên cứu giữa Viện Sinh học Nhiệt đới thành phố Hồ ChíMinh và Trung tâm Quốc gia về Kỹ nghệ gen và Công nghệ sinh học (BIOTEC, TháiLan) về đa dạng nấm ký sinh côn trùng ở Vườn Quốc gia Cát Tiên cho thấy, có 35 loàinấm ký sinh côn trùng thuộc 13 giống Giống có thành phần loài đa dạng nhất là giống

Aschersonia với 8 loài, tiếp theo là giống Cordyceps và Torrubiella với 5 loài Các

giống còn lại biến động từ 1 - 3 loài (Lê Tấn Hưng, 2008) [6]

Theo kết quả của Phạm Quang Thu và cs (2009) [17] đã phát hiện ra nấm

Nhộng trùng thảo Cordyceps militaris Link tại Vườn quốc gia Hoàng Liên, tỉnh Lào

Cai Nấm phân bố trong rừng ở độ cao 1900 - 2100 m so với mực nước biển, vật chủthuộc bộ cánh vảy Nấm dài 2,0 - 6,5 x 0,6 cm, chình chùy; cấu trúc lỏng lẻo; màu dacam nhạt đến da cam đậm Túi bào tử kích thước 300,0 - 510,0 x 3,5 - 5,0 μm; bào tửtúi dài, dạng sợi chỉ, có vách ngăn, dứt gãy tạo bào tử kích thước 2,0 - 4,5 x 1 -1,5 μm.Đây là phát hiện và mô tả ghi nhận đầu tiên về sự phân bố của loài Nhộng trùng thảo

Cordyceps militaris ở Việt Nam, qua đó cho thấy tiềm năng về nấm ký sinh côn trùng

nói chung và Đông trùng hạ thảo nói riêng ở nước ta

 Nghiên cứu về công nghệ lên men nấm ký sinh côn trùng

Trong thời gian qua ở nước mới có một số nghiên cứu về công nghệ lên men

nhân sinh khối để sản xuất chế phẩm sinh học nấm ký sinh côn trùng như Beauveria

và Metarhizium dùng trong kiểm soát sinh học (Phạm Thị Thùy và cs., 2005;

Nguyễn Thị Lộc và cs., 2004) [18, 20]

 Nghiên cứu về các hợp chất tính sinh học từ nấm ký sinh côn trùng

Những nghiên cứu về các hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ nấm ký sinhcôn trùng hiện nay ở Việt Nam còn rất hạn chế, mới chỉ có một số kết quả phân tíchdược lý nấm Đông trùng hạ thảo được nhập từ Trung Quốc, Hàn Quốc Từ thậpniên 60 của thế kỷ XX, Việt Nam đã đạt được nhiều thành công về khoa học và ứngdụng thực tiễn trong lĩnh vực nghiên cứu vi sinh vật và những thành công trong lĩnhvực nghiên cứu ứng dụng sinh vật dược liệu Nguyễn Bá Hoạt và cs (2000) [5],Viện Dược liệu (2001) [13], các công trình nghiên cứu về nấm dược liệu của TrịnhTam Kiệt (2003) [7], Trịnh Tam Kiệt, Trịnh Tam Bảo (2005, 2007) [8, 9]

Theo Đỗ Tất Lợi (1999) [14], người dân Việt Nam đã sử dụng hai loại EPF làmdược liệu, một loại nhập từ Trung Quốc và một loại của Việt Nam Hàng năm tạiThất Khê (Lạng Sơn), Hoà Bình, Lào Cai khai thác một loại Đông trùng Hạ thảo có

tên Brihaspa atrostigmella thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptera), sống trong thân cây đót

(Thysanoloena maxima O Kuntze) thuộc họ Hòa thảo (Gramineae) Đông trùng Hạ thảo được người dân Việt Nam sử dụng là loài nấm ký sinh côn trùng Cordyceps sinensis được nhập từ Trung Quốc

Theo Nguyễn Lân Dũng, Dương Văn Hợp, Phạm Thế Hải (2005) [3] “Đông

trùng hạ thảo” (Cordyceps sinensis) là một loại thần dược, các nghiên cứu y học và

dược học đã chứng minh chúng có 25 tác dụng phòng chống bệnh và tăng cườngsức khoẻ con người

 Nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng trong kiểm soát sâu hại

Ngành nông nghiệp hiện nay đang phải đối mặt mới các loại dịch hại do côntrùng gây hại, trong đó phải kể đến các loại sâu gây hại trên rau và cây công nghiệp

Sử dụng nấm ký sinh côn trùng được xem là một hướng đi thích hợp nhằm tạo ranhững sản phẩm an toàn Nấm ký sinh côn trùng là nhóm ít được quan tâm nghiêncứu và là lĩnh vực mới đối với Việt Nam Cho đến nay, mới chỉ nghiên cứu một vàiloài nấm ký sinh côn trùng theo hướng nghiên cứu sử dụng chúng trong kiểm soát

sâu hại cây trồng và chỉ tập trung nghiên cứu ứng dụng hai loài nấm là Beauveria bassiana, Metarhizium anisoplae

Các công trình nghiên cứu chỉ tập trung vào nấm Beauveria, Metarhizium

kiểm soát sâu hại rau để sản xuất rau an toàn ở Hà Nội và vùng phụ cận, sử dụng

nấm Metarhizium anisopliae kiểm soát bọ cánh cứng hại dừa ở các tỉnh phía Nam

(Nguyễn Thị Lộc và cs., 2004) Nghiên cứu và hoàn thiện công nghệ sản xuất thuốc

trừ sâu vi nấm Beauveria và Metarhizium để kiểm soát sâu hại đậu xanh ở Hà Tĩnh năm 2003; sử dụng chế phẩm Metarhizium anisopliae để kiểm soát bọ cánh cứng hại dừa Brontispa sp (Phạm Thị Thùy và cs., 2005) [18], [20]

Nghiên cứu đặc tính sinh học và hiệu lực diệt côn trùng có hại của nấm

Metarhizium anisopliae Sorokin, sử dụng nấm Metarhizium anisopliae để kiểm soát rệp sáp Pseudococcus citri Risso hại rễ cây cà phê tại tỉnh Daklak năm 2002 - 2003 (Phạm Thị Thùy, 2005) [18]; ứng dụng chế phẩm nấm Metarhizium anisopliae để

kiểm soát bọ xít hại cây trồng (Đàm Ngọc Hân, Phạm Thị Thùy, 2007) [4]

Kết quả nghiên cứu của Trần Ngọc Lân và cs (2008) [12] cho thấy loài

Paecilomyces sp1 có khả năng kiểm soát sâu xanh (Heliothis armigera F.) hại lạc và sâu tơ (Plutella xylostella L.) hại rau cải một cách có hiệu quả.

Kết quả nghiên cứu của Trần Ngọc Lân và cs (2008) [11], [12] về sử dụng nấm

B bassiana (BbGc), B bassiana (BbPs) và M anisopliae (MaPs) kiểm soát sâu mọt hại kho, cho thấy ảnh hưởng của các công thức khác nhau của nấm B bassiana lên mọt ngô Sitophilus zeamais Motsch gây hại ở kho ngô Dạng nhũ tương với B bassiana ở nồng độ 109 bào tử/ml cho thấy hiệu quả kiểm soát đạt cao nhất đối với

ngô Công thức dạng bột của nấm B bassiana đạt hiệu quả kiểm soát mọt ngô tới

90% sau 15 ngày, ở 250C với mức thử 20g thuốc bột nấm/kg ngô (2x1010 bào tử/kgngô) và đạt 77% với liều lượng 5g/kg (5 x 109 bào tử/kg ngô)

1.3 Một số đặc điểm của VQG Pù Mát và Khu BTTN Pù Huống

1.3.1 Đặc điểm Vườn Quốc gia Pù Mát

 Điều kiện tự nhiên

Địa giới hành chính: Vườn Quốc gia Pù Mát có diện tích là 91113 ha, toàn bộdiện tích VQG nằm trong địa giới hành chính của 3 huyện Anh Sơn, Con Cuông vàTương Dương của tỉnh Nghệ An Trong đó khu bảo vệ có 89517 ha, phân khu phụchồi sinh thái: 1596 ha Vùng đệm của VQG Pù Mát có diện tích 86000 ha

Địa hình: VQG Pù Mát nằm trên dãy Trường Sơn, độ cao biến động từ 200

-1841 m, trong đó độ cao xa dưới 1000 m chiếm 90% Khu vực cao nhất của VQGnằm ở phía Tây Nam, nơi có các đỉnh đông chính của dãy Trường Sơn cũng là nơi

có đỉnh Pù Mát là đỉnh cao nhất 1842 m Từ hệ thống chính này, các hệ thống dôngphụ trải dài theo hướng Tây Bắc - Đông Nam; các thung lũng đã hình thành nên 3

hệ thống sông suối chính trong các khu vực Khe Thơi, Khe Choang (gần Khe Bu)

và Khe Khặng

Khí hậu thủy văn: VQG Pù Mát nằm ở vùng nhiệt đới gió mùa, chịu ảnhhưởng của gió mùa Đông Bắc và Tây Nam Nhiệt độ trung bình năm từ 23 - 240C.Mùa Đông tháng 12 đến tháng 2 năm sau, chịu ảnh hưởng của gió mùa Đông Bắc,nhiệt độ trung bình của các tháng này dưới 200C Lượng mưa trung bình ở phía BắcVQG là 1268 mm nhưng ở phía Nam lên tới 1701 mm/năm

Thảm thực vật: Vườn Quốc gia Pù Mát có kiểu chính và kiểu phụ sau: Rừngkín thường xanh hỗn giáo lá rộng hay lá kim, ở độ cao trên 900 m ở phía Bắc vàtrên 800 m ở phía Nam VQG, chiếm 29% diện tích Rừng kín thường xanh mưa ẩmnhiệt đới, nằm ở dưới đai độ cao 800 m ở phía Nam và 900 m ở phía Bắc, chiếm46,5% diện tích VQG Trong kiểu rừng này có các kiểu phụ nhân tác phát triển saukhi khai thác mạnh và canh tác nương rẫy bỏ hóa lâu ngày Trảng cỏ, cây bụi và cây

gỗ rải rác Là diện tích trước đây đã canh tác nương rẫy trong thời gian bỏ hóa chưa

đủ để quá trình phục hồi rừng Loại rừng này chiếm 1,4% diện tích VQG, tập trung

ở Khe Khặng, nơi tập trung 3 bản người Đan Lai đang sinh sống

 Khu hệ sinh vật

Hệ thực vật: Bước đầu ghi nhận ở VQG Pù Mát có 1297 loài cây cỏ thuộc 607chi và 160 họ của ngành thực vật bậc cao, trong đó có 37 loài nằm trong sách đỏ ViệtNam, trong đó: 1 loài cấp E, 12 loài sắp nguy cấp (V), 9 loài hiếm (R), 3 loài bị đedọa (T) và 12 loài không biết chính xác Có 20 loài nằm trong Danh mục đỏ của Liênminh Quốc tế Bảo tồn Thiên nhiên và Tài nguyên Thiên nhiên (IUCN) (có 1 loài cấp

E, 3 loài cấp V và 16 loài quý hiếm)

Hệ động vật: Qua kết quả điều tra của các nhà khoa học trong nước và nướcngoài vào những năm 1993, 1994, 1998 và 2004 đã thống kê được 540 loài độngvật, trong đó lưỡng cư 22 loài và bò sát 48 loài, chim có 287 loài thuộc 46 họ Đặcđiểm vùng phân bố, hiện trạng và những mối đe dọa đến sự tồn tại của các loài này

trong VQG Pù Mát chưa được khảo sát đánh giá một cách kỹ lưỡng (Lê Xuân Huệ

và nnk, 2006)

Hệ côn trùng: Kết quả nghiên cứu của Lê Xuân Huệ (2006) cho thấy đa dạng sinhhọc côn trùng ở VQG Pù Mát bao gồm 1084 loài thuộc 7 bộ (Lepidoptera - 434 loài,Coleoptera - 318 loài, Hemiptera - 143 loài, Hymenoptera - 113 loài, Homoptera - 45loài, Orthopterra - 5 loài)

Hệ nấm: Đây là một trong những nhóm được ít sự quan tâm nhất của các nhàkhoa học, đặc biệt là nấm ký sinh côn trùng Cho đến nay, chưa có một công bố nào vềthành phần loại nấm nói chung và nấm ký sinh côn trùng nói riêng ở VQG Pù Mát

1.3.2 Đặc điểm Khu BTTB Pù Huống

 Điều kiện tự nhiên

Khu Bảo tồn thiên nhiên (BTTN) Pù Huống có 36.458 ha diện tích rừng,tương đương với 73% tổng diện tích khu bảo tồn (Ban Quản lý Khu BTTN PùHuống, 2003) Khu BTTN Pù Huống nằm trên địa bàn các huyện Quế Phong, QuỳChâu, Quỳ Hợp, Tương Dương và Con Cuông Khu bảo tồn thiên nhiên nằm cách

30 km về phía bắc của dải núi Bắc Trường Sơn, bị ngăn cách bởi thung lũng sông

Cả Độ cao trong vùng dao động trong khoảng từ 200 đến 1.447 m

Kiểu địa hình phổ biến là các ngọn núi chạy theo hướng tây bắc - đông nam,hình thành nên gianh giới giữa các huyện Quế Phong, Quỳ Châu và Quỳ Hợp vềphía đông bắc và các huyện Tương Dương, Con Cuông vầ phía Tây Nam

 Khu hệ sinh vật

Hệ thực vật: Khu BTN Pù Huống có hai kiểu rừng chính: rừng thường xanhđất thấp và rừng thường xanh núi thấp (Kemp và Dilger, 1996) Cả hai kiểu rừngtrên đều ít nhiều mang yếu tố rừng rụng lá Rừng thường xanh đất thấp phân bốtrong khoảng độ cao từ 400 đến 900 m Rừng thường xanh núi thấp phân bố ở độcao trên 900 m Càng lên cao hệ thực vật càng ưu thế bởi các loài thuộc các họ

Hồ đào Juglandaceae, Dẻ Fagaceae và Long não Đến nay, tổng cộng có 665loài thực vật bậc cao, trong đó có 43 loài có tên trong Sách Đỏ Việt Nam

Hệ động vật: Ngoài ra, tại khu bảo tồn thiên nhiên đã ghi nhận được 291loài thú, trong đó có 45 loài có trong Sách Đỏ Việt Nam (Ban Quản lý Khu BTTN

Pù Huống, 2003) Tổng cộng 148 loài chim đã ghi nhận ở Pù Huống (Kemp vàDilger 1996), trong đó có 10 loài trong Sách Đỏ Việt Nam Tuy vậy, với áp lực sănbắn cao đang diễn ra ở Pù Huống và các sinh cảnh rừng tự nhiên thích hợp chochúng đang bị suy giảm và và tách ly thành từng vạt rừng nhỏ

Hệ côn trùng: Nghiên cứu mới đây của các nhà khoa học đã xác định tên vàthống kê được 558 loài côn trùng tại KBTTN Pù Huống (Nghệ An), có 9 loài có têntrong sách đỏ Việt Nam năm 2007 và 2000 Sinh cảnh rừng thứ sinh xa suối có chỉ số

đa dạng côn trùng lớn nhất (302 loài với 468 cá thể) chủ yếu là bướm rừng, chuồnchuồn, xén tóc, bọ xít, Sinh cảnh khu dân cư, khu trồng cây nông nghiệp có chỉ số

đa dạng thấp nhất (167 loài với 231 cá thể) phần lớn là các loài gây hại cho câytrồng như cào cào, châu chấu, bọ xít và thiên địch như bọ rùa, ong ký sinh

1.4 Những vấn đề còn tồn tại và những vấn đề mà đề tài tập trung nghiên cứu

 Những vấn đề còn tồn tại

Việt Nam là nước được đánh giá có nhiều tiềm năng về nấm ký sinh côn trùngnhưng lĩnh vực nấm ký sinh côn trùng và công nghệ nấm ký sinh côn trùng vẫn cònrất mới và chưa được quan tâm đúng mức Cho đến nay có rất ít công bố về đadạng, nguồn lợi cũng như các nghiên cứu chuyên sâu về nhân nuôi nhân tạo, sảnxuất và ứng dụng nấm ký sinh côn trùng

Trong kiểm soát sinh học, hiện nay mới chỉ có một số dẫn liệu nghiên cứu về 2

loài nấm là Beauveria, Metarhizium để kiểm soát sâu hại cây trồng (Nguyễn Thị

Thùy, 2005; Nguyễn Thị Lộc, 2004)

Ở Nghệ An có VQG Pù Mát và Khu BTTN Pù Huống được đánh giá có tính

đa dạng sinh học cao và có tiềm năng về nấm ký sinh côn trùng Nhưng mới chỉ cómột số dẫn liệu ban đầu của Trần Ngọc Lân và nnk (2008) về nguồn lợi nấm ký sinhcôn trùng ở VQG Pù Mát và đánh giá khả năng kiểm soát của một số loài nấm đối

với sâu hại cây trồng như Paecilomyces sp1, một số loài Isaria, Beauveria,

 Những vấn đề mà đề tài tập trung nghiên cứu

Điều tra đánh giá mức độ đa dạng sinh học nấm ký sinh côn trùng thuộc 2

giống Cordyceps, Isaria tại VQGPù Mát và Khu BTTN Pù Huống, Nghệ An.

Đánh giá nguồn lợi nấm giống Cordyceps, Isaria có khả năng ứng dụng kiểm

soát sinh học và cho các chất có hoạt tính sinh học cao làm dược liệu dựa trên cácnghiên cứu được công bố trên thế giới và kết quả gửi phân tích mẫu

Nghiên cứu ứng dụng công nghệ lên men bề mặt trên môi trường rắn để nhân

sinh khối chủng nấm Cordyceps sp VN1331 và Isaria javanica VN1487.

Nghiên cứu sự gây bệnh và đánh giá hiệu lực của chủng nấm Isaria javanica

VN1487 đối với sâu non sâu khoang

Chương 2

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Quy trình nghiên cứu

2.2 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

 Đối tượng nghiên cứu

Các loài nấm ký sinh côn trùng thuộc các giống Cordyceps, Isaria thu thập tại

Vườn Quốc gia Pù Mát và Khu BTTN Pù Huống

Chủng nấm Cordyceps sp1 VN1331 và Isaria javanica VN1487

Nuôi nhân sinh khối Cordyceps sp1 và I javanica

trên môi trường lên men rắn (gạo lứt và nhộng tằm)

Nghiên cứu ứng dụng nấm

Isaria javanica trong

kiểm soát sâu khoang

Thu thập mẫu vật Cordyceps và Isaria

- Trên và trong đất

- Trên tàn dư thực vật

- Trên lá cây

Xây dựng bộ sưu tập mẫu vật EPF

- Đánh số thứ tự EPF vào bộ sưu tập

- Định loại sơ bộ bằng hình thái mẫu

- Mô tả đặc điểm hình thái, sinh học, vi sinh cảnh

Phân lập, nuôi cấy EPF

- Phân lập EPF trên các môi

trường thích hợp (PDA)

- Nuôi cấy EPF trên môi trường

đã phân lập thành công

Bảo quản mẫu vật EPF

- Để mẫu vật khô ở điều kiện nhiệt độ phòng

- Lưu giữ mẫu thu thập

- Lưu giữ mẫu phân lập, nuôi cấy

Đánh giá khả năng sử dụng

giống Cordyceps và Isaria

làm dược liệu

 Vật liệu nghiên cứu

Nguyên liệu, hóa chất: khoai tây, agar, dextrose, nguồn cacbon (glucozo,mantozo, glactozo, sucrozo, fructozo), nguồn nitơ (peptone, yeast extract, malatextrac), paraffin, cồn, vitamin (B1, B2, B6, B12),

Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm: đĩa Petri, ống nghiệm, bình tam giác, kínhhiển vi, tủ lạnh khô, tủ hấp tiệt trùng, buồng nuôi cấy, hộp và dụng cụ thu mẫu thựcđịa, dụng cụ nuôi cấy,…

2.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

 Thời gian nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu từ 08/2009 - 08/2011

 Địa điểm nghiên cứu

Thu mẫu nấm ở V QG Pù Mát , Khu BTTN Pù Huống, Nghệ An

Mô tả, phân lập, nhân nuôi tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Nấm ký sinh côn

trùng, Khoa Nông Lâm Ngư, Trường Đại học Vinh

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp điều tra thu thập và xử lý mẫu vật nấm giống Cordyceps và Isaria

 Đặc điểm của nơi thu thập

Nấm ký sinh côn trùng có thể sinh trưởng và phát triển bình thường trong điềukiện môi trường có thời tiết ẩm ướt (khi nhiệt độ dao động từ 150C - 300C và độ ẩmdao động từ 75 - 100%) Nơi thu thập thường là những khu rừng nguyên sinh pháttriển trên núi đất, có nhiều cây lớn, trên mặt đất có ít cây nhỏ để tạo điều kiện chocác lá từ cây lớn có thể rơi xuống trên bề mặt đất Nếu thu thập trong mùa khô, cóthể thu thập tại các khu rừng có sông suối Nơi thu thập thường là những khu rừngbằng phẳng hoặc độ dốc không quá lớn, nơi có đất tơi xốp, rừng phát triển trên đất sétrất khó để tìm thấy EPF

 Thời gian thu thập

Thu thập mẫu vật côn trùng bị nấm ký sinh thường được tiến hành vào buổisáng, mỗi ngày thu thập từ 3 - 4 giờ/1 khu vực cụ thể Khi thu thập càng nhiều

người tham gia thì khả năng thu được EPF càng cao Tiến hành thu thập tự do theophương châm càng nhiều điểm điều tra càng tăng thêm cơ hội bắt gặp EPF Cầnchụp ảnh, thu mẫu, đánh số thứ tự mẫu và ghi chép thực địa khác để tiến hành mô tảcác đặc điểm hình thái, sinh thái của nấm ký sinh và côn trùng bị nấm ký sinh, kếthợp với điều tra định kỳ trên một khu vực điều tra cố định để theo dõi sự xuất hiện

và biến động số lượng của EPF

 Thu thập trên lá hoặc thân cây

EPF có thể tồn tại trên các vi sinh cảnh (môi trường sống) khác nhau Nó cóthể tồn tại trên thân cây (cây đang sống hoặc cây chết) hoặc mặt dưới của các lá cây(chủ yếu là các lá già) Trên mặt lá rất ít khi chúng ta tìm thấy EPF Để thu đượcEPF, phải lật các lá cây để quan sát phía mặt dưới EPF dễ dàng nhận biết được do cómàu sắc tương đối sáng Dùng tay hoặc dao, kéo để cắt lá có EPF bỏ vào hộp đựngmẫu phù hợp với kích thước mẫu vật, chú ý không cắt quá sát mẫu Lấy 1 mẩu lá khác(tốt nhất là cùng loài với lá có mẫu vật) để trên miệng hộp đựng mẫu và đậy nắp lại.Mục đích của việc này là để giúp tăng độ ẩm mẫu, giữ cho nắp hộp chặt hơn và có thểcăn cứ để xác định loài cây mà có mẫu EPF thu thập

Nguyên tắc thu thập: Nếu phát hiện được EPF ở một điểm thì phải tìm ở nhiềuđiểm xung quanh nó, thu thập ở nhiều loài cây khác nhau, nhiều địa thế khác nhau, chú ý

có thể thu nhầm còn hơn bỏ sót

Cách phân biệt giữa nấm bệnh thực vật với EPF: Nếu lá có nấm bệnh thực vậtthì vết bệnh sẽ biểu hiện cả 2 bề mặt lá; Nếu lá có EPF thì thì ta chỉ thấy mẫu nấm ởmột bề mặt lá, thường là mặt dưới

Cách phân biệt EPF với côn trùng: Một số loài côn trùng ở dạng ấu trùng,trứng hoặc nhộng có cấu tạo bề mặt phía ngoài rất giống EPF Khi thu được mẫu vậtnghi ngờ, ta dùng tay hoặc một cái que nhỏ ấn vào mẫu vật, mẫu EPF thường cứng,bám rất chắc vào lá hoặc thân cây, nếu là côn trùng thì mềm và nếu ấn mạnh sẽ códịch sinh học (dịch cơ thể) chảy ra

 Thu thập trong đất