Nghiên cứu kỹ thuật nhân sinh khối và đánh giá khả năng sử dụng nấm isaria tenuipes phòng trừ sâu khoang trong điều kiện thực nghiệm luận văn thạc sĩ nông lâm ngư

Xin chân thành cảm ơn các nhà khoa học, các đề tài KH & CN đã hỗ trở kinh phí và phương pháp nghiên cứu cho tôi để thực hiện đề tài: 1 Đề tài Nghị định thư giữa Trường Đại học Vinh Việt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

NGÔ THỊ OANH

NGHI£N CøU Kü THUËT NH¢N SINH KHèI

Vµ Sö DôNG NÊM Isaria tenuipes PHßNG TRõ S¢U KHOANG

h¹i c©y trång TRONG §IÒU KIÖN THùC NGHIÖM

CHUYÊN NGÀNH: TRỒNG TRỌT

MÃ SỐ: 60.62.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học:

PGS TS TRẦN NGỌC LÂN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực, các số liệu được thu thập qua các thí nghiệm do bản thân tiến hành và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào.

Tôi xin cam đoan các thí nghiệm để thu thập số liệu trong luận văn đã được chính bản thân tôi tiến hành tại phòng thí nghiệm Công nghệ Phòng thí nghiệm Công nghệ Nấm ký sinh côn trùng, Khoa Nông Lâm Ngư, Trường Đại học Vinh, với sự đồng ý và hướng dẫn của PGS.TS Trần Ngọc Lân là giáo viên hướng dẫn, các thầy cô giáo là kĩ thuật viên phụ trách phòng thí nghiệm.

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.

Vinh, tháng 12 năm 2011

Tác giả

Ngô Thị Oanh

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình công tác, học tập và nghiên cứu đề tài luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Chuyên ngành Trồng trọt, tôi đã luôn nhận được rất nhiều sự giúp

đỡ quý báu từ phía thầy cô, đồng nghiệp, người thân, bạn bè, các nhà khoa học.

Với tấm lòng chân thành và sự biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin được gửi lời cảm

ơn tới PGS TS.Trần Ngọc Lân, người đã dẫn dắt, định hướng cho tôi từ những

bước đầu làm nghiên cứu khoa học, rất tận tâm và nhiệt tình hướng dẫn tôi suốt thời gian làm đề tài cũng như trong quá trình học tập Thầy luôn động viên, khuyến khích và mang đến cho tôi niềm say mê nghiên cứu khoa học.

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô giáo là các kĩ thuật viên phòng thí nghiệm đã hướng dẫn, giúp đỡ về chuyên môn và tạo điều kiện về cơ sở vật chất cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm cùng tập thể cán bộ trong Khoa Nông Lâm Ngư, Ban lãnh đạo Trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện cho tôi trong công tác, học tập và nghiên cứu đề tài.

Xin chân thành cảm ơn các nhà khoa học, các đề tài KH & CN đã hỗ trở kinh phí và phương pháp nghiên cứu cho tôi để thực hiện đề tài: (1) Đề tài Nghị định thư

giữa Trường Đại học Vinh (Việt Nam) và BIOTEC (Thái Lan): “Hợp tác nghiên

cứu xác định một số loài nấm ký sinh trên côn trùng và tuyển chọn một số loài nấm đặc hữu có hoạt chất sinh học làm dược liệu”, Mã số: 04/2009/HĐ-NĐT

Và tôi xin được gửi lời cảm ơn đặc biệt tới người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ, hỗ trở tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.

Vinh, tháng 12 năm 2011

Tác giả

Ngô Thị Oanh

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

EPF Entomopathogenic fungi

EPF Entomology Pathogenic Fungi

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT iii

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 3

3 Ý nghĩa của đề tài 3

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Nấm ký sinh côn trùng 4

1.1.1 Khái niệm 4

1.1.2 Chu trình sống và lây nhiễm của nấm ký sinh côn trùng 5

1.2 Tình hình nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng trên thế giới 9

1.2.1 Nghiên cứu các hoạt chất sinh học có trong nấm ký sinh côn trùng .9

1.2.2 Nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng trong kiểm soát và phòng trừ sâu hại 13

1.2.3 Tình hình nghiên cứu về nhân sinh khối nấm ký sinh côn trùng .15

1.3 Tình hình nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng ở Việt Nam 20

1.3.1 Nghiên cứu về đa dạng nấm ký sinh côn trùng và hoạt chất sinh học 20

1.3.2 Nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng trong phòng trừ sâu hại 21

1.3.3 Nghiên cứu về kỹ thuật nhân sinh khối nấm ký sinh côn trùng 23

Chương II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Nội dung nghiên cứu 24

2.2 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 24

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.2.2 Vật liệu nghiên cứu 24

2.3 Thời gian và địa điểm 24

2.4 Phương pháp nghiên cứu 25

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu sinh trưởng nấm trên môi trường PDA .25

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật nhân sinh khối nấm Isaria tenuipes 27

2.4.3 Phương pháp đánh giá hiệu lực chế phẩm nấm Isaria tenuipes phòng trừ nhộng sâu khoang hại cây trồng trong phòng thí nghiệm .30

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 31

Chương III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Sự phát triển của Isaria tenuipes trên môi trường PDA 32

3.1.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Isaria tenuipes trên môi trường PDA .32

3.1.2 Ảnh hưởng của thể tích môi trường PDA tới sự sinh trưởng theo chiều ngang khuẩn lạc Isaria tenuipes 34

3.1.5 Ảnh hưởng của hàm lượng dinh dưỡng tới sự phát triển theo chiều ngang của Isaria tenuipes 40

3.1.6 Ảnh hưởng của hàm lượng dinh dưỡng tới sự phát sinh bào tử nấm Isaria tenuipes 42

3.2 Sinh trưởng của Isaria tenuipes trên môi trường lỏng 43

3.2.1 Sinh trưởng của nấm Isaria tenuipes trên bề mặt môi trường lỏng .44

3.2.2 Ảnh hưởng của môi trường lỏng tới quá trình tạo sinh khối nấm

Isaria tenuipes 45

3.2.3 Ảnh hưởng của môi trường lỏng tới sự hình thành bào tử của

nấm Isaria tenuipes 47 3.2.4 Đánh giá sinh trưởng và phát triển của nấm Isaria tenuipes trên

môi trường lỏng được lựa chọn 493.3 Sinh trưởng và phát triển nấm I tenuipes trên môi trường rắn 50

3.3.1 Sinh trưởng của Isaria tenuipes trên bề mặt môi trường rắn 50 3.3.2 Khả năng phát sinh bào tử nấm I tenuipes trên các môi

trường rắn 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Khả năng sinh trưởng của Isaria tenuipes trên PDA 32

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thể tích môi trường PDA tới sự sinh trưởng

theo chiều ngang khuẩn lạc nấm I tenuipes 34

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thể tích môi trường PDA tới chiều cao nấm

I.tenuipes 37

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thể tích môi trường PDA tới sự phát sinh bào

tử nấm I tenuipes 38

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của hàm lượng dinh dưỡng tới sự phát triển theo

chiều ngang của khuẩn lạc I tenuipes 41

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của hàm lượng dinh dưỡng tới sự phát sinh bào tử

Bảng 3.10 Mối quan hệ giữa sinh khối nấm I tenuipes và thể tích môi

trường còn lại theo thời gian theo dõi 50

Bảng 3.11 Sinh trưởng của nấm I tenuipes trên môi trường rắn 52 Bảng 3.12 Khả năng phát sinh bào tử của nấm I tenuipes trên môi

trường rắn 54

Bảng 3.13 Hiệu lực phòng trừ trên nhộng sâu khoang của nấm Isaria

tenuipes ở các nồng độ bào tử khác nhau 55

Bảng 3.14 Diễn biến số lượng nhộng sâu khoang mọc nấm Isaria

tenuipes theo thời gian xử lý 57

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Chu trình xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng 5Hình 1.2 Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng 8Hình 2.1 Mô tả các bước cấy nấm trên môi trường PDA 26

Hình 3.1 Sự sinh trưởng và phát triển Isaria tenuipes trên môi trường

PDA 33Hình 3.2 Ảnh hưởng của thể tích môi trường tới sự sinh trưởng theo

chiều ngang khuẩn lạc nấm I tenuipes 35 Hình 3.3 Ảnh hưởng của thể tích môi trường tới chiều cao khuẩn lạc I.

tenuipes 37

Hình 3.4 Ảnh hưởng của thể tích môi trường PDA tới sự phát sinh bào

tử nấm I tenuipes 39 Hình 3.5 Ảnh hưởng của dinh dưỡng tới đường kính khuẩn lạc I tenuipes

41Hình 3.6 Ảnh hưởng của hàm lượng dinh dưỡng tới sự phát sinh bào tử

Hình 3.13 Hiệu lực phòng trừ trên nhộng sâu khoang của nấm Isaria

tenuipes ở các nồng độ bào tử khác nhau 56

Hình 3.14 Diễn biến số lượng nhộng sâu khoang mọc nấm Isaria

tenuipes theo thời gian xử lý 58

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Isaria tenuipes là giai đoạn vô tính của nấm Codyceps takaomontana.

Các nghiên cứu đã cho thấy, Isaria tenuipes là một nấm ký sinh côn trùng có

nhiều hoạt chất sinh học có giá trị cao Các hoạt chất sinh học có giá trị dược

lý rất lớn, được ứng dụng trong y - dược để chữa bệnh và làm thực phẩm chứcnăng nhằm nâng cao sức khỏe cho con người Đặc biệt, các bệnh về ung thư -một trong những căn bệnh nan y của con loài người hiện nay Do đó, nhu cầu

về sử dụng nấm Isaria tenuipes trên thị trường là rất lớn Các sản phẩm sản xuất từ Isaria tenuipes rất đa dạng về chủng loại, từ dạng thực phẩm chức năng cho đến thuốc viên nang Ngoài ra, nấm Isaria tenuipes còn được coi là tác nhân kiểm soát sinh học Trong tự nhiên, từ các mẫu nấm Isaria tenuipes thu thập được cho thấy chúng thường ký sinh trên giai đoạn nhộng của nhiều

loại côn trùng thuộc bộ cánh vảy (Lepidopera) và chúng được xác định lànguồn gây bệnh phổ biến cho các côn trùng thuộc bộ này Các chế phẩm từ

nấm Isaria tenuipes được ứng dụng để phòng trừ trên các đối tượng sâu hại

cây trồng như: Các loài sâu thuộc bộ cánh vảy, rệp trắng hại rau Kết quả chothấy, chế phẩm hiệu lực phòng trừ đạt hiệu quả cao đối với sâu hại, không gâyảnh hưởng xấu đến sinh thái môi trường như thảm thực vật, các loài sinh vậtkhác và con người Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đã và đang nhân nuôi

thành công nấm Isaria tenuipes trong điều kiện nhân tạo ở quy mô thủ công

và công nghiệp nhằm cung cấp nguồn nguyên liệu cho sản xuất thuốc trong y

- dược và làm thực phẩm chức năng Trong đó, Trung Quốc là nước có quy

mô sản xuất lớn nhất

Việt Nam có vị trí địa lý nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên

có nguồn nấm ký sinh côn trùng có tính đa dạng sinh học rất lớn Trên các địađiểm thu thập mẫu nấm ký sinh côn trùng ở các vùng sinh thái khác nhau nhưvườn Quốc gia Pù Mát, Pù Huống (Trần Ngọc Lân, 2008), Vườn Quốc gia

Cát Tiên (Trần Tuấn Hưng và cs 2010) cho thấy, nhóm nấm Isaria luôn có

mặt và chiếm tỷ lệ mẫu vật cao trong tổng số mẫu vật thu thập được, trong đó

có nấm Isaria tenuipes (chiếm 79,87%) Các nghiên cứu đã xác định các loài

nấm ký sinh côn trùng này có giá trị cao trong ứng dụng kiểm soát sinh học.Tuy nhiên, hiện nay ứng dụng nấm ký sinh côn trùng vào phòng trừ sinh học

ở Việt Nam mới chỉ tập trung nghiên cứu trên một số ít loài thuộc nhóm nấmBeauveria và Metahizium, các loài khác được nghiên cứu rất ít Thành tựutrong việc sử dụng nấm côn trùng phòng trị các loại côn trùng và sâu hại cây

trồng, điển hình như nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana đã

được ứng dụng trong phòng trừ mối nhà, sâu khoang hại cải xanh (Võ ThịThu Oanh và cộng sự, 2005), sâu hại đậu tương và đậu xanh (Phạm Thị Thùy

và cộng sự, 2005), rầy mềm và các loài sâu hại lúa, Bọ cánh cứng hại dừa [1],[7], [18], [21], [24], [6]

Sâu khoang (Spodoptera litura) là loài gây hại đa thực, nó là đối tượng

gây hại chính trên nhiều loại cây trồng khác nhau như: đậu đỗ, lạc, cây rauthuộc nhóm cây hoa thập tự, Để phòng trừ sâu khoang trong sản xuất đã sửdụng các loại thuốc hóa học có phổ tác dụng rộng và liều lượng mạnh gây ranhiều tác dụng xấu đến chất lượng sản phẩm, môi trường sinh thái và sứckhỏe con người Với chiến lược phát triển nền nông nghiệp bền vững và antoàn, ứng dụng các biện pháp sinh học vào trong sản xuất nông nghiệp đã vàđang đóng vai trò rất quan trọng

Trước những thực tế như trên, để đánh giá khả năng ứng dụng của nấm

Isaria tenuipes trong kiểm soát sinh học chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề

tài: “Nghiên cứu kỹ thuật nhân sinh khối và sử dụng nấm Isaria tenuipes

phòng trừ sâu khoang hại cây trồng trong điều kiện thực nghiệm”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Mục tiêu tổng quát

Trên cơ sở nghiên cứu kỹ thuật nhân sinh khối và đánh giá khả năng sử

dụng nấm Isaria tenuipes phòng trừ sâu khoang nhằm tạo cơ sở khoa học để ứng dụng Isaria tenuipes phòng trừ sâu khoang hại cây trồng.

Kết quả của đề tài sẽ bổ sung và cung cấp thêm một số dẫn liệu khoa

học cho nghiên cứu nhân sinh khối nấm Isaria tenuipes theo hướng phòng trừ

sinh học Nghiên cứu cung cấp thêm một loài vi nấm có tác dụng kiểm soátsinh học sâu khoang hại cây trồng

Chương ITỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nấm ký sinh côn trùng

1.1.1 Khái niệm

“Nấm ký sinh công trùng - Entomology phathogenic fungi (EPF) haynấm côn trùng - Insect fungi” là khái niệm được các nhà khoa học sử dụngnhư là một thuật ngữ đồng nghĩa, đề cập về nhóm sinh vật ký sinh gây bệnhcho côn trùng

Theo Evans (1988), nấm ký sinh côn trùng được chia thành 4 nhóm: (1)

Ký sinh trong tức là nấm ký sinh trong các nội quan, khoang cơ thể của côntrùng ký chủ

(2) Ký sinh ngoài tức là nấm phát triển trên lớp cuticun vỏ cơ thể củacôn trùng và gây nên bệnh hại cho ký chủ

(3) Nấm mọc trên côn trùng tức là những nấm đã được trực tiếp hoặcgián tiếp chứng minh chúng ký sinh trên côn trùng (samson và cs., 1988)

(4) Cộng sinh có nghĩa là cả nấm và côn trùng cùng mang lại lợi íchcho nhau trong mối quan hệ cùng chung sống

Nấm còn được chia ra thành nhóm ký sinh sơ cấp (primery pathogen)

và nhóm ký sinh thứ cấp (secondery pathogen) (Pu và Li, 1996) Nấm ký sinh

sơ cấp thường nhiễm vào ký chủ côn trùng khoẻ mạnh, gây bệnh và sau đógiết chết côn trùng Trong khi đó, nấm ký sinh thứ cấp chỉ có thể ký sinh trênnhững côn trùng yếu hoặc bị thương Các mầm bệnh ký sinh trên côn trùngtrưởng thành hoặc côn trùng bị bệnh được gọi là ký sinh cơ hội hoặc ký sinhkhông chuyên tính, loại ký sinh này có thể nhiễm vào ký chủ thông qua sựxâm nhập qua lớp cuticun vỏ cơ thể côn trùng (dẫn theo Trần Ngọc Lân vàcs., 2008) [13]

Như vậy, nấm ký sinh côn trùng (EPF) được dùng để mô tả hiện tượngnấm ký sinh trên hoặc trong ký chủ côn trùng Theo Tzean và cs (1997), kháiniệm này cũng được dùng cho nấm ký sinh trên nhện bởi vì nhện và côn trùng

là 2 nhóm (lớp) trong một nghành Động vật chân khớp và chúng có cùngkiểu sinh thái ăn thực vật hoặc ăn thịt và sinh sống chủ yếu trên cây [13]

1.1.2 Chu trình sống và lây nhiễm của nấm ký sinh côn trùng

Nấm ký sinh côn trùng có thể xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng qua conđường hô hấp, tiêu hóa hoặc qua cơ quan sinh dục, nhưng phần lớn là qua lớp

vỏ cuticun của chúng Tức là phải có sự tiếp xúc của bào tử nấm và bề mặt cơthể vật chủ Bào tử nấm bám vào bề mặt cơ thể vật chủ, khi đủ điều kiện ẩm

độ bào tử mọc mầm và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp vỏcuticun Khi nấm xâm nhiễm vào bên trong, nấm mọc khắp cơ thể của côntrùng và sản xuất các độc tốc trong đó để tăng tốc độ giết chết côn trùng hoặcngăn chặn sự cạnh tranh của các loài vi sinh vật khác

Hình 1.1 Chu trình xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng

Nấm xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng gồm 3 giai đoạn chính:

(i) Giai đoạn xâm nhập

Giai đoạn xâm nhập được tính từ khi bào tử nấm mọc mầm đến lúc hoànthành việc xâm nhập vào trong xoang cơ thể côn trùng Bào tử nấm sau khimọc mầm phát sinh mầm bệnh, nó giải phóng các enzyme ngoại bào tương ứngvới các thành phần chính của lớp vỏ cuticun của côn trùng để phân hủy lớp vỏnày như Protease, chitinase, lipase, aminopeptidase, carboxypeptidase A,esterase, N - axetylglucosaminidase, cenlulase Các enzyme này được tạo ramột cách nhanh chóng, liên tục và với mức độ khác nhau giữa các loài và thậmchí ngay cả trong một loài.

Enzyme protease và chitinase hình thành trên cơ thể côn trùng, thamgia phân hủy lớp da côn trùng (cuticula) và lớp biểu bì (thành phần chính làprotein) Lipase, cenlulase và các enzyme khác cũng là những enzyme có vaitrò không kém phần quan trọng Nhưng quan trọng nhất là enzyme phân hủyprotein (protease) và enzyme phân huỷ kitin (chitinase) của côn trùng Haienzyme này có liên quan trực tiếp đến hiệu lực diệt côn trùng của nấm ký sinhcôn trùng [2]

(ii) Giai đoạn phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng

Giai đoạn này được tính từ khi nấm hoàn thành quá trình xâm nhiễmvào cơ thể côn trùng cho đến khi côn trùng chết Đây là giai đoạn sống kýsinh của nấm Trong xoang cơ thể côn trùng nấm tiếp tục phát triển, hìnhthành rất nhiều sợi nấm ngắn Khi hệ sợi nấm được hình thành trong cơ thể,

nó phân tán khắp cơ thể theo dịch máu, phá hủy các tế bào máu và làmgiảm tốc độ lưu thông máu Toàn bộ các bộ phận nội quan bị xâm nhập.Nấm thường xâm nhập vào khí quản làm suy yếu hô hấp Hoạt động củacôn trùng trở nên chậm chạp và phản ứng kém với các tác nhân kích thíchbên ngoài Kết quả là vật chủ mất khả năng kiểm soát hoạt động sống vàdẫn đến chết [12]

(iii) Giai đoạn sinh trưởng của nấm sau khi vật chủ chết

Đây là giai đoạn sống hoại sinh của nấm ký sinh Xác côn trùng chết lànguồn dinh dưỡng có giá trị cho các vi sinh vật Thông thường, các bộ phậnbên trong cơ thể côn trùng sẽ bị phân hủy bởi vi khuẩn hoại sinh Trên bề mặt

ngoài của cơ thể côn trùng, các nấm hoại sinh như Aspergillus spp.,

Penicillium spp và Fusarium spp định cư ở lớp biểu bì và cạnh tranh với vi

khuẩn ở bên trong cơ thể côn trùng Do nấm côn trùng có khả năng sản xuất

ra các chất có hoạt tính như thuốc kháng sinh ức chế hoạt động của vi khuẩn

và nấm hoại sinh khác nên chúng có thể cạnh tranh với các sinh vật này đểtồn tại và phát triển, làm cho xác vật chủ không bị phân hủy

Sau khi nấm côn trùng đã sử dụng cạn kiệt nguồn dinh dưỡng bên trong

cơ thể côn trùng, nó chuyển sang giai đoạn hình thành bào tử

Ở giai đoạn xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng, nấm sử dụngcác enzyme ngoại bào để phân hủy lớp vỏ cuticun Khác với giai đoạn này, ởgiai đoạn nấm đâm xuyên, mọc thành sợi ra bên ngoài nó sử dụng toàn bộ tácđộng cơ học Sau đó các bào tử được hình thành trên lớp sợi nấm ở bề mặt cơthể vật chủ Nhiều côn trùng bị bao bọc toàn bộ bên ngoài bởi hệ sợi nấm vàcác bào tử, vì vậy mà rất khó hoặc không thể xác định các vật chủ [61]

Đặc điểm cơ thể côn trùng bị chết do nấm côn trùng không bao giờ bịthối, nhũn mà thường vẫn giữ nguyên hình dạng như khi còn sống Toàn bộbên trong cơ thể sâu chết chứa đầy sợi nấm Sau đó, các sợi nấm này mọc rangoài qua vỏ cơ thể và bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của cơ thể sâu Đây làđặc điểm rất đặc trưng để phân biệt sâu chết do nấm côn trùng với sâu chết dovirus, vi khuẩn gây bệnh [12]

Thomas M B., Read A F (2007) đã đưa ra sơ đồ xâm nhiễm của nấm

ký sinh côn trùng vào cơ thể vật chủ (hình 1.2) [55]

Hình 1.2 Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng

Theo Thomas M B., Read A F., chu kỳ phát triển của nấm ký sinh côn

trùng, như nấm Beaueria bassiana và Metarhizium anisopliae gồm các giai

đoạn: Bào tử đính tiếp xúc với tầng cuticun của lớp vỏ vật chủ Bào tử nảymầm và sinh sản hình thành vòi và giác bám (cấu trúc cơ quan xâm nhập)

Sự xâm nhập của bào tử đính là sự tổ hợp của sức ép cơ học và sự tácđộng của enzyme phân giải tầng cuticun Quá trình sinh trưởng bên trongxoang máu cơ thể vật chủ và sự sinh sản của bào tử đính làm vật chủ chết.Tầng cuticun của vỏ cơ thể vật chủ là tầng chống chịu đầu tiên trong việc bảo

vệ chống lại sự xâm nhiễm của nấm và nó có vai trò quyết định tính chuyênhóa đặc hiệu của nấm Nếu nấm phá vỡ được tầng cuticun thì sự xâm nhiễmthành công, sau đó phụ thuộc vào khả năng chiến thắng được phản ứng miễndịch bẩm sinh ở côn trùng của nấm

Các loài côn trùng có thể phản ứng lại sự xâm nhiễm này của nấm bằng

cả hai phương thức là tế bào và thể dịch Sự hình thành hoạt động miễn dịchcàng sớm ở điểm phân giải bào tử đính trong suốt quá trình xâm nhập Các

loài nấm nói chung đều có hai phương thức để chiến thắng các phản ứng tự

vệ của vật chủ: Sự phát triển của các dạng sinh trưởng giai đoạn tiềm ẩn là

sự ngụy trang hữu hiệu từ các phản ứng tự vệ của côn trùng và sự sản xuất

ra các chất miễn dịch phân hóa thuận nghịch của bộ phận ức chế hệ thốngbảo vệ

Nấm ký sinh thường để lại những dấu hiệu trên cơ thể vật chủ hay làmcho tập tính sống của chúng bị thay đổi Những cá thể sâu hại bị nhiễm nấmthường có các vệt chấm đen xuất hiện trên bề mặt, có thể tại nơi bào tử nấmbám vào và mọc mầm xâm nhiễm vào bên trong cơ thể vật chủ Nơi xâm nhậpcủa nấm Beaueria bassiana thường có vệt chấm đen hình dạng bất định Khi

bị bệnh do nấm, sâu hại ngừng hoạt động khoảng 2 - 3 ngày trước thời điểmphát triển hoàn toàn của nấm ở trong cơ thể vật chủ Nếu bị bệnh do nấmBeauveria thì sâu hại sẽ ngừng hoạt động khoảng 7 ngày trước khi chết.Những cá thể sâu hại bị nhiễm bệnh nấm côn trùng thường có màu hồng nhạt.Một số loài nấm có thể làm cho sâu bệnh trở nên có màu vàng nhạt, xanh lácây hoặc nâu Cơ thể sâu bị bệnh trở nên hóa cứng Một số loài Cordyceps ký

sinh có thể ảnh hưởng đến hành vi của vật chủ sâu bọ Cordyceps unilateralis

gây bệnh trên kiến và khiến chúng leo lên cây rồi bám ở đó trước khi chết,đảm bảo phân phối tối đa bào tử từ quả thể mọc ra ngoài cơ thể côn trùng đãchết [12]

1.2 Tình hình nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng trên thế giới

1.2.1 Nghiên cứu các hoạt chất sinh học có trong nấm ký sinh côn trùng

Đông trùng hạ thảo là một nấm dược liệu quý hiếm và kỳ lạ, được biếtđến ở Trung Quốc trong nhiều thế kỷ Ở các nước phương Tây biết đến loạidược liệu qúy hiếm này từ khoảng hai mươi năm qua Từ đó đến nay cácnghiên cứu hiện đại chứng minh tác dụng kỳ diệu của nấm Đông trùng hạthảo trong điều trị bệnh và bồi bổ sức khỏe và được nghiên cứu nhiều nhất là

ở Trung Quốc Nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao đang được phát hiệnnhờ sự tiến bộ của ngành hoá học các hợp chất thiên nhiên [35].

Các nghiên cứu của Pegler D.N và cs (1994), Mizuno T (1999) cho thấy

các loài Cordyceps sp thường được sử dụng như là một loài thuốc kéo dài tuổi

thọ và nó được xem như là thuốc cầm máu, thuốc chữa bệnh hen suyễn vàchứng giảm glucoza trong máu Chức năng này do chúng có nhiều hợp chất

có hoạt tính sinh học cao, như cordycepin, ophiocordin và một số hợp chấtpolisaccharides [37], [43]

Phần lớn các loài của giống Cordyceps cho các chất có hoạt tính sinh học cao, như loài C unilateralis có các chất 6 dẫn xuất của napthoquinone có hoạt

tính sinh học cao như eythrostominone, deoxyerythrostominone, 4 - O - methylerythrostominone, epierythrostominol, deoxyerythrostominol và đặc biệt là 3,5 - β

trihydrooxy 6 methoxy 2 (5 oxyohexa 1,3 dienyl) 1,4 naphthoquinone được xem như là chất có khả năng chống lại bệnh sốt rét -malaria [62]

-Nghiên cứu của Li Pei-Jung và cs (2003), Chen Y.Q et al (2004) chothấy, hợp chất cordysinocan có tác dụng tăng cường chức năng của bạch cầu,hạn chế sự phát triển của khối u và bảo vệ chức năng gan cũng như chống oxyhoá Theo hướng này, đã cho thấy hoạt chất 2-5-oligoadenylate (tương tự nhưcordycepin) có khả năng tăng cường hệ miễn dịch của con người, ức chế hoạtđộng của virus HIV trong điều kiện nuôi cấy invitro [46], [33]

Bên cạnh loài Cordyceps sinensis, các nhà khoa học trên thế giới tiếp tục

nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ một số loài nấm ký sinh

côn trùng khác, trong đó có loài Cordyceps militaris cũng được xem như là

một loại thuốc bổ và được sử dụng trong thuốc đông y, dùng để chữa một loạt

các loại bệnh, chữa ung thư Cũng giống như loài Cordycep sinensis, các nghiên cứu về các hợp chất có hoạt tính sinh học cho thấy loài Cordyceps

militaris cũng có hợp chất Cordycepin, ngoài ra còn có các hợp chất như

peptide tuần hoàn, 10-membered macrolides, cepharosporolides C, E and F,pyridine-2,6-dicarboxylic acid, 2-carboxymethyl-4-(30-hydroxybutyl) furan,axít dipicolinic [46], [37], [38]

Isaria tenuipes là dạng vô tính của giai đoạn vô tính của Cordyceps takaomontana Yakushiji et Kumazawa [39] Đây là một nấm tương đối phổ

biến trong tự nhiên, có giá trị dược liệu cao nên loài nấm này nhận được quantâm nghiên cứu và ứng dụng từ rất sớm Các kết quả nghiên cứu cho thấy thể

quả của nấm P tenuipes có các hoạt chất có giá trị cao về mặt dược liệu do

các tác dụng về dược lý và đặc tính sinh học của chúng

Rachada Haritakun và cs (2007), nghiên cứu về các hợp chất trong loài

Isaria tenuipes BCC 7.831, kết quả phân tích cho thấy Isariotins A - D (1 - 4),

có một ancaloit sở hữu một đơn chất được cố định với vòng kép Các cấu trúccủa các hợp chất này đã được làm sáng tỏ chủ yếu bởi NMR và phân tích khốilượng bằng kính quang phổ

Theo kết quả nghiên cứu của Haruhisa Kikuchi và cs (2004) cho thấy,

trong sinh khối nấm I tenuipes chứa Paecilomycine A, B và C là các hoạt

chất có hoạt tính sinh học cao [35]

Năm 2009, Akira Sakakura, Kazufumi Shioya và cs đã phát hiệnhợp chất mới chống oxy hóa pseudo-di-peptide và tiền chất của nó được

chiết xuất từ Isaria tenuipes Chất này đã được sử dụng như một loại

thuốc dân gian có nguồn gốc từ thiên nhiên tại Nhật Bản và có tên là

‘Hanasanagitake’ Cấu trúc pseudo-di-peptide được xác định là diguanidinobutanoyl-(S)-DOPA và (R) - 3,4 - diguanidinobutanoyl - (S) -tyrosine bằng phân tích quang phổ, tổng hợp hóa học và chuyển đổi enzym [29]

(R)-3,4-Theo nghiên cứu của T Bunyapaiboonsri và cs (2009), MộtHêmiacêtan mới có vòng kép và đơn, isariotins E (1) và F (2), cùng với TK-

57-164A (3) đã được phân lập từ nấm ký sinh côn trùng Isaria tenuipes BCC

12.625 Cấu hình tuyệt đối của (3) được ghi địa chỉ bằng cách áp dụng cácphương pháp sửa đổi của Mosher Isariotin F (2) trưng bày các hoạt độngchống lại bệnh sốt rét ký sinh trùng Plasmodium falciparum K1 với IC50 là5.1 •m và các hoạt động độc tế bào chống lại dòng tế bào ung thư (KB, BC,

và NCI-H187) và nonmalignant (Vero) tế bào, tương ứng với giá trị IC50 của15.8, 2.4, 1.6, và 2.9 •m [56]

Nghiên cứu của Ban và cs (1998) cho thấy Polysaccharides phân lập từ

P tenuipes có hoạt động chống ưng thư trong cơ thể Nghiên cứu này cho

rằng tác dụng chống ưng thư của Polysaccharides có thể do sự kích thích của hệthống miễn dịch Ngày nay, với các dụng cụ nghiên cứu hiện đại các nhà khoa

học ngày càng khám phá ra nhiều hoạt chất từ quả thể P tenuipes có khả năng

khống chế tế bào ung thư cũng như các hoạt chất sinh học khác như: Các hoạt

chất Ergosterol peroxide và Acetoxyscirpenediol tách chiết từ nấm P tenuipes

nuôi cấy nhân tạo có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư ở người như tếbào khối u dạ dày, tế bào ung thư gan, tế bào ung thư ruột kết - ruột thẳng Hoạttính của Acetoxyscirpenediol mạnh hơn Cisplatin là hoạt chất đang được dùngđiều trị cho các bệnh nhân ung thư hiện nay là 4 đến 6.6 lần [40]

Từ các kết quả nghiên cứu trong nấm ký sinh côn trùng thuộc họ

Cordyceps có những chất sinh học có hoạt tính cao như cordycepin,

ophiocordin và một số hợp chất polisaccharides, Các chất này có thể cungcấp cho cơ thể chất dinh dưỡng, tăng sức đề kháng giúp cơ thể chống lại đượcmột số bệnh như: bệnh hen, bệnh giảm glucoza trong máu, sốt rét - malaria,bệnh thận, huyết áp, tim mạch, miễn dịch, ung thư, nội tiết tố, Đặc biệt cóthể giúp chữa trị bệnh ung thư - một trong những căn bệnh nan y của loàingười hiện nay Một số loài nấm được sử dụng như thực phẩm chức nănggiúp kéo dài tuổi thọ [48].

1.2.2 Nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng trong kiểm soát và phòng trừ sâu hại

Ứng dụng nấm ký sinh côn trùng để phòng trừ sâu hại được biết đến từrất sớm Năm 1709, Balisneri là người đầu tiên phát hiện về hiện tượng nấmgây bệnh trên côn trùng Từ đó đến nay, ngành nghiên cứu về bệnh lý học côntrùng không ngừng phát triển Nhiều loài nấm ký sinh côn trùng được xemnhư là một tác nhân hiệu quả trong phòng trừ sinh học cây trồng nông lâmnghiệp Hiện nay, tập trung nghiên cứu ứng dụng tạo ra các loại chế phẩmthuốc trừ sâu vi sinh

Trong số các loài vi nấm ký sinh côn trùng nói trên thì các loài nấm

thuộc chi Isaria cũng được xem như là một tác nhân quan trọng trong phòng

trừ sâu hại cậy trồng vì chúng dễ dàng phân lập và hình thành bào tử trong

môi trường nuôi cấy [61] Điển hình như Isaria javanica, Isaria tenuipes,

Isaria fumosorosea, P tenuipes, Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana.

Đây cũng là đối tượng được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong kiểm soátsâu hại trên thể giới

Ở Jamaica, cho biết thành phần nấm bệnh sâu tơ gồm Beauveria

bassiana (trên sâu non và trên nhộng), Hirsutella sp (trên sâu non) và Paecilomyces sp (trên nhộng) Nấm ký sinh côn trùng phát triển mạnh trong

mùa mưa Nguồn nấm Beauveria được sản xuất thành chế phẩm thử nghiệm

đạt hiệu quả cao ngoài đồng Tuy nhiên tỷ lệ sâu chết trong lô xử lý chỉ đạt12,5 - 54,5% và trong lô đối chứng là 10,7 - 46,9%, và không có sai khác ởmức ý nghĩa thống kê Tác giả này cũng cho rằng, có thể trong thời gian xử lýthuốc, gió tương đối mạnh đã di chuyển thuốc đến những lô không xử lý kế

cận Dù vậy, kết quả sử dụng nguồn nấm bệnh tại chỗ như Beauveria để

phòng trừ sâu tơ đã mở ra phương hướng phòng trừ sinh học sâu tơ trongtương lai [13]

Theo kết quả nghiên cứu của Takeshi Maruyama và cs (2009) sử dụng

P tenuipes để tạo ra sản phẩm làm thuốc trừ sâu sinh học phòng trừ rệp trắng

hại rau trong nhà kính với hiệu quả cao Thuốc trừ sâu này có tác động diệtsâu khi sâu giai đoạn ấu trùng và nhộng Thuốc không gây ảnh hưởng đến sứckhỏe của con người và hệ sinh thái xung quanh [54]

Nấm Isaria javanica đã được sử dụng để phòng trừ nhiều loại cây trồng Năm 2008, ở Argentina sử dụng Isaria javanica để phòng trừ sâu hại

cây trồng với nồng độ 107 bào tử/ml sau 7 ngày hiệu quả phòng trừ từ 26.6 76.6% [53]

-Theo kết quả nghiên cứu của Takeshi Maruyama và cs (2009) sử dụng

P tenuipes để tạo ra sản phẩm làm thuốc trừ sâu sinh học phòng trừ rệp trắng

hại rau trong nhà kính với hiệu quả cao Thuốc trừ sâu này có tác động diệtsâu khi sâu giai đoạn ấu trùng và nhộng Thuốc không gây ảnh hưởng đến sứckhỏe của con người và hệ sinh thái xung quanh [54]

Nghiên cứu của Vega-Aquino và cs (2010) cho thấy, nấm Nomuraea

rileyi và Isaria tenuipes (Paecilomyces tenuipes) là các tác nhân gây bệnh phổ

biến của Lepidoptera Các thử nghiệm được thực hiện để đánh giá hoạt động

của dầu làm chất bám dính cho bào tử của N rileyi và I tenuipes chống lại ấu trùng của Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Helicoverpa Zea, và

Heliothis virescens Cả hai loại nấm được đánh giá cao tương thích với các

loại dầu và tỉ lệ chết gây ra gần 100% trong tất cả các phương pháp kết hợp

với dầu, giá trị LT(50) thấp nhất 4,7 ngày đối với N rileyi và 6,0 ngày đối với

I tenuipes trong dầu đậu nành Tỉ lệ chết với I tenuipes chống lại S exigua

dao động từ 90% đến 100% (giống ARSEF 2488 và 4096), N rileyi gây ra tử vong 95% S frugiperda Kết quả cho thấy sử dụng dầu thực vật làm chất bám

dính trong phòng trừ sâu hại bằng vi sinh vật là một phương pháp đạt hiệuquả cao [57]

Nghiên cứu các công trình về ứng dụng Isaria tenuipes trong phòng trừ sinh học kết quả cho thấy, Isaria tenuipes có khả năng phòng trừ trên nhiều

đối tượng, trong các giai đoạn phát triển khác nhau của sâu hại Nấm có hiệulực phòng trừ đạt cao

1.2.3 Tình hình nghiên cứu về nhân sinh khối nấm ký sinh côn trùng

Nấm ký sinh côn trùng nói chung, Isaria tenuipes nói riêng là nguồn

lợi rất lớn trong đời sống của con người Nó không chỉ là nguồn nguyênliệu trong sản xuất y dược, thực phẩm chức năng mà còn có vai trò rất quantrọng trong phòng trừ sinh học Để đáp ứng nhu cầu sử dụng ngày càngnhiều của mình, con người đã không ngừng nghiên cứu để nhân nhanh sinhkhối của các loài vi nấm trong điều kiện nhân tạo Kết quả đã tìm ra một sốđiều kiện ngoại cảnh tối ưu giúp các loài nấm ký sinh côn trùng có thể sinhtrưởng và nhân nhanh số lượng trong điều kiện nhân tạo trên nhiều môitrường khác nhau

1.2.3.1 Nhân sinh khối nấm ký sinh côn trùng trên môi trường lỏng

Mỗi loài sinh vật cần một điều kiện ngoại cảnh thích hợp để sinhtrưởng tốt nhất Các loài sinh vật khác nhau cần điều kiện ngoại cảnh khácnhau Nhằm tìm ra môi trường dinh dưỡng thích hợp nhất cho nhân sinh khốinấm ký sinh côn trùng các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu và đạt đượcnhiều kết quả

Nghiên cứu về thành phần môi trường thích hợp cho nhân sinh khối

nấm C.mlitaris cho thấy nguồn carbon thích hợp cho sự phát triển của sợi

nấm bao gồm lactose, sucrose, glucose, fructose, galactose, maltose vàxylose Trong đó, glucose là nguồn đường thích hợp nhất cho sự sản xuấtcordycepin Kết quả cho thấy tại điều kiện môi trường có chứa 40g glucose/l thìsản lượng của cordycepin là cao nhất đạt 245.7±4.4 mg/l trong 18 ngày nuôi và

tỷ lệ 42.0g glucose/l và 15.8g peptone/l cho sản lượng cordycepin cao nhất đạt345.4±8.5mg/l và đạt trung bình 19.2 0.5 mg/l [59]

Kết quả nghiên cứu các điều kiện nhằm làm tăng sản lượng cordycepin(3-deoxyadenosine) bằng phương pháp lên men chìm trong môi trường bình

tam giác của loài nấm ký sinh côn trùng Cordyceps militaris NBRC 9787 cho

thấy việc thêm một loạt hợp chất như hợp chất sinh tổng hợp purine, các loạicoenzymes và các chất hoạt động bề mặt vào môi trường cơ bản đã làm tăngđáng kể hàm lượng cordycepin, glycine, l-aspartic acid, l-glutamine, adenine

và adenosine Điều kiện tối ưu nhất là môi trường kết hợp 1g/l adenine và16g/l glycine cho sản lượng cordycepin đạt 2.5g/l tăng hơn 4.1 lần so với môi

trường cơ bản (đối chứng) Khoảng 98% cordycepin tổng hợp bởi C militaris

được tiết ra vào môi trường nuôi cấy và các hợp chất axit nucleic khác liênquan đến ngoại trừ cho cordycepin và guanine chỉ hơi quan sát thấy trong môitrường Nguồn nitơ thích hợp để sản xuất cordycepin là hỗn hợp của peptone

và yeasextrac (75%) hoặc cao hơn Tỷ lệ cacbon/nitơ tối ưu là 2/1 và đường

đã được sử dụng như là nguồn cacbon Theo các điều kiện tối ưu, nồng độcordycepin tối đa trong môi trường nuôi cấy đạt 640 mg/l và cordycepin sảnsuất tối đa là 32 mg/lít/ngày [49]

Trong khi đó, môi trường tối thích cho nhân sinh khối C.

Takaomontana bao gồm hai nguồn dinh dưỡng từ glucose (30g/l), yeast

extract (4g) [53] Môi trường thích hợp cho Isaria tenuipes có nhiệt độ 25

-280C với thành phần dinh dưỡng cơ bản là glucose nhưng thành phần proteinlại là KNO3 [31] Các nhà nghiên cứu cũng đã xác định được thành phần dinhdưỡng tối ưu của môi trường cho các loài được xác định là có các hoạt chất có

tính dược lý có giá trị cao như Cordyceps sinensis 16, Cordyceps

sphecocephala [32], [51], [ 41].

Ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên men đến quá trình sinh trưởngcủa tế bào sợi nấm, sản xuất các hoạt chất sinh học có hoạt tính cao nhưexopolysaccharide (EPS), adenosine và đặc biệt cordycepin đã được nghiêncứu Các kết quả nghiên cứu cho thấy, kết hợp giữa lên men chìm trên môitrường lỏng lắc và lên men lỏng tĩnh trên bề mặt môi trường cho hiệu quả thusinh khối và sản xuất exo - biopolymer đạt cao hơn so với phương pháp chỉlên men tĩnh trên bề mặt môi trường Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, nuôicấy nấm trên môi trường lên men chìm cho sinh khối cao hơn trên môitrường lên men lỏng lắc Khi nuôi cấy nấm theo công nghệ lên men chìmtrong môi trường dinh dưỡng lỏng, ngoài thành phần dinh dưỡng của môitrường, nhiệt độ thì tốc độ rung của thiết bị lên men, tỷ lệ thông khí trong môitrường nuôi cũng có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng của nấm, khả năng sảnxuất Exo - biopolymer

Kết quả nghiên cứu của Jung-Yong Oh và cs (2007) nhằm sản xuất hỗnhợp polysaccharide và peptide bằng phương pháp lên men chìm từ giống

nấm Cordyceps sphecocephala cho thấy Ảnh hưởng của các thành phần và

yếu tố môi trường đến sản lượng sinh khối và hỗn hợp polysaccharide vàpeptide (exobiopolymers) Nhiệt độ và pH môi trường ban đầu thích hợp chosản xuất sinh khối và hỗn hợp exobiopolymers là 25.80C và pH 4-5 Thànhphần tối ưu cho môi trường nuôi cấy là (g/l): sucrose 40, yeast extract 6,polypepton 2, KH2PO4 0.46, K2HPO4 1 và MgSO4.7H2O 0.5 Trong điều kiệnmôi trường như vậy, sản lượng sinh khối đạt (28.2 g/l) ở tốc độ khuấy của

nồi lên men là 300 vòng/phút, tốc độ không khí 2 vvm Sản lượng hỗn hợppolysaccharide và peptide đạt cao nhất là 2.5 g/l ở tốc độ khuấy là 150 vòng/phút [37]

Nghiên cứu của Xu Quiqin và cs (2009) sử dụng phương pháp lên menchìm trong môi trường có chứa sucrose 66.0g/l, bột yeast 10.0g/l, dịch chiết

từ tằm 30.0g/l, MgSO4·7H2O 0.4g/l và KH2PO4 0.4g/l trên đối tượng loài nấm

ký sinh côn trùng Cordyceps ophioglossoides L2 Kết quả nghiên cứu cho

thấy trong điều kiện giống cấy 6 ngày tuổi, thể tích giống là 6% so với thểtích nuôi cấy, pH ban đầu là 5.6, nhiệt độ nuôi cấy là 240C và lắc 160vòng/phút thì sản lượng sinh khối đạt được cao nhất khoảng 20,2 g/l sau 90giờ nuôi cấy Khi tăng thể tích nuôi cấy trong hệ thống lên men quy mô 15 lít,sản lượng sinh khối cũng đạt xấp xỉ 19g/l Kết quả nghiên cứu cho thấy khả

năng ứng dụng phương pháp này để nhân sinh khối loài Cordyceps

ophioglossoides L2 phục vụ cho chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học

cao sử dụng trong y dược [47], [60]

Kết quả nghiên cứu về nhân nuôi Cordyceps sphecocephala cho thấy

trong môi trường dinh dưỡng tối ưu, sinh khối sợi nấm đạt được tối đa 28,2g/

1 khi tốc độ rung của máy là 300 vòng/phút và với một tốc độ sục khí của 2VVM, trong khi sản xuất exobiopolymer đạt tối đa 2,5 g/l khi tốc độ rung ở

150 vòng/phút và có sự biến dạng đáng kể trong hình thái các sợi nấm giữa

các điều kiện sục khí khác nhau Trong khi đó đối với nấm Isaria tenuipes với

tốc độ sục khí 3,5 vvm cho sinh khối nấm đạt cao nhất (21,56 g/l) [32], [41],[54]

1.2.3.2 Nhân sinh khối nấm ký sinh côn trùng trên môi trường rắn

Nhân sinh khối nấm trên môi trường rắn hay lên men trạng thái rắn(Solid State Fermentation - SSF) được định nghĩa là quá trình lên men xảy rakhi không có mặt hoặc vắng mặt của lượng nước tự do [49] Khả năng lên

men của nấm trên môi trường rắn tùy thuộc vào các yếu tố nguồn nguyên liệumôi trường, độ ẩm, độ xốp của môi trường lên men [63], [56], [52], [57].Sản xuất sinh khối nấm ký sinh côn trùng bằng phương pháp lên menrắn được quan tâm nghiên cứu nhiều trên nguyên liệu là các loại sản phẩm vàphụ phẩm nông nghiệp như hạt ngũ cốc, phụ phẩm rau quả và môi trườnglỏng như nước dừa, nước ngâm gạo, nước ngâm lúa mì, nước nấu gạo, Cácmôi trường này dùng để thử nghiệm đánh giá khả năng sản xuất sinh khối của

ba loài nấm ký sinh côn trùng beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Paecilomyces

fumosoroseus (Wize Brow and Smith), Verticillium lecanii (Zimm) Viegas.

Kết quả nghiên cứu cho thấy, trên các môi trường khác nhau mức sinh trưởng

của nấm là khác nhau Trong các loại hạt ngũ cốc, hạt lúa mì cho sinh khối B.

Bassiana lớn nhất Nấm Paecilomyces fumosoroseus và Verticillium lecanii

đạt sinh khối lớn nhất trên hạt lúa miến

Nhân sinh khối nấm cho sự hình thành quả thể cần môi trường dinhdưỡng nhiều hơn, điều kiện ngoại cảnh được kiểm soát nghiêm ngặt hơn sovới nhân sinh khối hình thành bào tử Nghiên cứu của Chen Y Q và cs.(2004) cho thấy, trên các môi trường mùn cưa, cám gạo có bổ sung thêm bộtnhộng tằm thì có sự hình thành quả thể Trọng lượng tươi của quả thể tỷ lệthuận với hàm lượng bột nhộng tằm thêm vào [33] Nghiên cứu của Chen Zhu

-AN và cs đã phát hiện ra môi trường thích hợp cho sự hình thành quả thể

của nấm Isaria tenuipes có thành phần bao gồm úa mạch, lúa mì và cám +

bột ngô + trấu theo tỷ lệ 2: 1: 1 [34]

Chế độ ánh sáng có ảnh hưởng quan trọng lên sự sinh trưởng của nấm

Isaria tenuipes Nếu để tối trong khoảng thời gian sau khi lây nhiễm 6 -14

ngày sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hình thành synema, nhưng để thuận lợicho sự hình thành bào tử thì cần chế độ chiếu sáng khác [28]

1.3 Tình hình nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng ở Việt Nam

1.3.1 Nghiên cứu về đa dạng nấm ký sinh côn trùng và hoạt chất sinh học

Nấm ký sinh côn trùng và công nghệ nấm - côn trùng là một lĩnh vực mới đốivới Việt Nam Cho đến nay, ở Việt Nam nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùngmới chỉ dừng lại ở mức đánh giá độ đa dạng về thành loài nấm ký sinh côntrùng trên một số vùng sinh thái và có thêm một số nghiên cứu theo hướngphòng trừ sâu hại cây trồng Nhưng các nghiên cứu này mới chỉ tập trung vàohai loài nấm Beaueria, Metarhizium Những nghiên cứu về các loài nấm kýsinh côn trùng theo các hướng khác như phân tích các hợp chất có hoạt tínhsinh học cao, nhân nuôi để thu synnema cũng như những nghiên cứu và ứngdụng về những loài nấm mới còn rất hạn chế

Đánh giá đa dạng sinh học về thành phần loài nấm ký sinh côn trùng

có công trình nghiên cứu của Võ Thị Thu Oanh (2003) [18] Kết quả nghiêncứu về thành phần nấm ký sinh trên côn trùng gây hại tại một số quận ngoạithành của thành phố Hồ Chí Minh cho thấy, có 8 loài nấm ký sinh côn trùng

thuộc các giống Beaueria, Metarhizium, Normuraea, Entomophthora,

Verticillium, Aschersonia, Fusarium và Hirsutella Trong các mẫu thu thập

thì 2 loại nấm Beaueria, Metarhizium ký sinh trên nhiều loài côn trùng khác

nhau Kết quả nghiên cứu giữa Viên sinh học Nhiệt đới thành phố Hồ ChíMinh và Trung tâm Quốc gia về Kỹ nghệ gen và Công nghệ sinh học(BIOTEC, Thái Lan) về đa dạng nấm ký sinh côn trùng ở Vườn Quốc giaCát Tiên cho thấy có 35 loài nấm ký sinh côn trùng thuộc 13 giống Giống

có thành phần loài đa dạng nhất là giống Aschersonia với 8 loài, tiếp theo là giống Cordyceps và Torrubiella với 5 loài Các giống khác biến động từ 1-3

loài [8] Theo kết quả của Phạm Quang Thu và cs (2009) đã phát hiện ra

nấm Nhộng trùng thảo Cordyceps militaris Link tại Vườn quốc gia Hoàng

Liên, tỉnh Lào Cai [20] Kết quả nghiên cứu của Trần Ngọc Lân và cs

(2007),(2010) về đa dạng nấm ký sinh côn trùng giống Isaria ở vườn Quốcgia Phù Mát và khu bảo tồn thiên nhiên Phù Huống cho thấy có 13 loài

Isaria đã được thu thập và định loại, trong đó Isaria teuipes là loài phổ biến nhất (79,87%), tiếp theo là Isaria javanica Các loài còn lại rất hiếm gặp, số

mẫu thu được dao động từ 1 - 5 mẫu [13]

Những nghiên cứu về các hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ nấm kýsinh côn trùng hiện nay chưa được nghiên cứu nhiều ở Việt Nam, mới chỉ cómột số kết quả phân tích dược lý nấm Đông trùng hạ thảo được nhập từ TrungQuốc, Hàn Quốc Từ thập niên 60 của thế kỷ XX, Việt Nam đã đạt đượcnhiều thành công về khoa học và ứng dụng thực tiễn trong lĩnh vực nghiêncứu vi sinh vật và những thành công trong lĩnh vực nghiên cứu ứng dụng sinhvật [26], [10], [11]

Theo các nhà khoa học thì người dân Việt Nam đã sử dụng hai loại nấm

ký sinh côn trùng làm dược liệu, một loại nhập từ Trung Quốc và một loại củaViệt Nam Hàng năm tại Thất Khê (Lạng Sơn), Hoà Bình, Lào Cai khai thác

một loại Đông trùng Hạ thảo có tên Brihaspa atrostigmella thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptera), sống trong thân cây đót (Thysanoloena maxima O Kuntze)

thuộc họ Hòa thảo (Gramineae) Đông trùng Hạ thảo được người dân Việt Nam

sử dụng là loài nấm ký sinh côn trùng Cordyceps sinensis được nhập từ Trung

Quốc [11] Theo Nguyễn Lân Dũng, Dương Văn Hợp, Phạm Thế Hải (2005)

“Đông Trùng Hạ Thảo” (Cordyceps sinensis) là một loại thần dược, các

nghiên cứu y học và dược học đã chứng minh chúng có 25 tác dụng phòngchống bệnh và tăng cường sức khoẻ con người [5]

1.3.2 Nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng trong phòng trừ sâu hại

Ngành nông nghiệp hiện nay đang phải đối mặt mới các loại dịch hại côntrùng gây hại, trong đó phải kể đến các loại sâu gây hại trên rau và cây thựcphẩm Sử dụng nấm ký sinh côn trùng được xem là một hướng đi thích hợp

nhằm tạo ra những sản phẩm an toàn Nấm ký sinh côn trùng là nhóm ít đượcquan tâm nghiên cứu và là lĩnh vực mới đối với Việt Nam Cho đến nay, mớichỉ nghiên cứu một vài loài nấm ký sinh côn trùng theo hướng nghiên cứu sửdụng chúng trong phòng trừ sâu hại cây trồng và chỉ tập trung nghiên cứu ứng

dụng hai loài nấm là Beauveria bassiana, Metarhizium anisoplae

Các công trình nghiên cứu chỉ tập trung vào nấm Beauveria, Metarhizium

phòng trừ sâu hại rau để sản xuất rau an toàn ở Hà Nội và vùng phụ cận

Nghiên cứu sử dụng nấm Metarhizium anisopliae phòng trừ bọ cánh cứng hại

dừa ở các tỉnh phía Nam; Nghiên cứu và hoàn thiện công nghệ sản xuất thuốc

trừ sâu vi nấm Beauveria và Metarhizium để phòng trừ sâu hại đậu xanh ở Hà Tĩnh năm 2003; sử dụng chế phẩm nấm Metarhizium anisopliae để phòng trừ

bọ cánh cứng hại dừa Brontispa sp [23], [24], [17]

Nghiên cứu đặc tính sinh học và hiệu lực diệt côn trùng có hại của nấm

Metarhizium anisopliae Sorokin, sử dụng nấm Metarhizium anisopliae để

phòng trừ rệp sáp Pseudococcus citri Risso hại rễ cây cà phê tại tỉnh Daklak

năm 2002 - 2003 (Phạm Thị Thùy, 2005); ứng dụng chế phẩm nấm

Metarhizium anisopliae để phòng trừ bọ xít hại cây trồng [19], [6].

Kết quả nghiên cứu của Trần Ngọc Lân và cs (2008) cho thấy loài

Paecilomyces sp1 có khả năng phòng trừ sâu xanh (Heliothis armigera F.) hại

lạc và sâu tơ (Plutella xylostella L.) hại rau cải một cách có hiệu quả [16].

Kết quả nghiên cứu của Trần Ngọc Lân và cs (2008) về sử dụng nấm B.

bassiana (BbGc), B bassiana (BbPs) và M anisopliae (MaPs) phòng trừ sâu

mọt hại kho, cho thấy ảnh hưởng của các công thức khác nhau của nấm B.

bassiana lên mọt ngô Sitophilus zeamais Motsch gây hại ở kho ngô [19] Dạng

nhũ tương với B bassiana ở nồng độ 109 bào tử/ml cho thấy hiệu quả phòng

trừ đạt cao nhất đối với ngô Công thức dạng bột của nấm B bassiana đạt hiệu

quả phòng trừ mọt ngô tới 90% sau 15 ngày, ở 250C với mức thử 20g thuốc bột

nấm/kg ngô (2x1010 bào tử/kg ngô) và đạt 77% với liều lượng 5g/kg (5 x 109

bào tử/kg ngô) [15]

1.3.3 Nghiên cứu về kỹ thuật nhân sinh khối nấm ký sinh côn trùng

Trong thời gian qua ở nước đã có những nghiên cứu về công nghệ lênmen nhân sinh khối để sản xuất chế phẩm sinh học nấm ký sinh côn trùng như

Beauveria và Metarhizium dùng trong phòng trừ sinh học (Phạm Thị Thùy và

nnk, 2005; Nguyễn Thị Lộc và nnk, 2004) [17], [21], [23]

Chương IINỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Đề tài được tiến hành nghiên cứu với các nội dung chính như sau:

1) Đánh giá sinh trưởng của nấm Isaria tenuipes trên môi trường PDA 2) Đánh giá sinh trưởng của nấm Isaria tenuipes trên môi trường lỏng 3) Đánh giá sinh trưởng của nấm Isaria tenuipes trên môi trường rắn.

4) Đánh giá khả năng phòng trừ sâu khoang giai đoạn nhộng của nấm

Isaria tenuipes.

2.2 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Nấm ký sinh côn trùng Isaria tenuipes (Peck.) Samson (VN1342) đã

được thu thập tại Vườn Quốc Gia Pù Mát, Pù Huống

- Nhộng sâu khoang (Lepidoptera Litura) ở độ tuổi 1 đến 4.

2.2.2 Vật liệu nghiên cứu

- Nguyên liệu, hóa chất: Khoai tây, Agar, Dextrose, Glucose, Peptone,cồn, glucose, sucrose, peptone, yeast extract, K2HPO4, KH2PO4, CaCl2,MgSO4,.

- Các thiết bị và dụng cụ thí nghiệm: Đĩa Petri, ống nghiệm, bình tamgiác, kính hiển vi, tủ lạnh khô, tủ hấp tiệt trùng, buồng nuôi cấy, dụng cụnuôi cấy,

2.3 Thời gian và địa điểm

- Thời gian: Tháng 1/2010 - 12/2011.

- Địa điểm: Nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bảo vệ

thực vật và phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Nông nghiệp, khoa NôngLâm Ngư, Trường Đại học Vinh

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu sinh trưởng nấm trên môi trường PDA

Cấy chuyển nấm và thí nghiệm đánh giá sinh trưởng nấm trên môitrường Potato Dextrose Agar (PDA) theo phương pháp của Brown and Smith(1957) và Samson (1974) [65]

Chuẩn bị môi trường

PDA (Potato Dextrose Agar) là môi trường nhiều hyđrat cacbon có chứa20g glucose, 15g agar và nước luộc 200g khoai tây, trong 1lít nước Khoai tâygọt vỏ rửa sạch và cắt nhỏ trước khi nấu cho vừa mềm Bào tử vô tính hìnhthành trên PDA thường có hình dạng và kích thước không ổn định Môitrường PDA có thể được dùng để bảo quản, phân lập hoặc làm môi trườngnhân giống cấp 1

Chuẩn bị môi trường PDA gồm 5 bước như sau:

Bước 1: Khoai tây được rửa sạch và gọt vỏ, để ráo nước.

Bước 2: Cân 200g và cắt nhỏ theo kích thước 1,0 x 1,0 cm rồi cho vào

nồi cùng 1000ml nước cất, nấu mềm trong khoảng 45 phútđến 1 giờ

Bước 3: Lọc lấy dịch chiết và thêm vào 20g glucose + 15g agar +

lượng nước sao cho đủ 1000ml, cho lên bếp từ, vừa đun nóngvừa cho con khuấy từ đánh tan đều

Bước 4: Cho vào một cái chai loại 1000ml có nắp kín, đem hấp tiệt trùng ở

1210, 20 Phút, 15 psi

Bước 5: Lấy ra làm nguội và đổ vào đĩa petri

Phương pháp cấy chuyền từ đĩa petri sang đĩa petri

Bước1:

Chuẩn bị

Tiến hành khử trùngbuồng cấy, tay, khửtrùng que cấy bằng cồn

70 %Bước 2:

Mẫu nấm

Những mẫu nấm gốcphải đạt tiêu chuẩntrước khi cấy chuyền

Bước 3:

Cách cấy

Có 2 cách để cầm đĩaPetri trong khi cấy nấm,

có thể cấy một điểmhoạch nhiều điểm trênđĩa petri

Bước 4:

Nuôi dưỡng

Cấy xong, các đĩa petriđược xếp vào hộp vàđem nuôi trong tủcolofom 22 - 240C Hình 2.1 Mô tả các bước cấy nấm trên môi trường PDA

* Bố trí thí nghiệm

- Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của hàm lượng dinh dưỡng trên môi trường

PDA tới sinh trưởng và phát triển của nấm Isaria tenuipes.

Trên môi trường PDA tiến hành bổ sung thêm các hàm lượng đường vớicác mức: CT 1: 20 gam, CT 2: 15 gam và CT 3: 10 gam cho 1 lít môi trường.Mỗi hàm lượng đường là một công thức thí nghiệm

- Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thể tích môi trường PDA tới sinh

trưởng và phát triển của nấm Isaria tenuipes.

Trên môi trường PDA tiến hành đánh giá sinh trưởng của nấm Isaria

tenuipes với các mức môi trường có độ dày CT 1: 1.5 mm, CT 2: 3 mm và CT

3: 5 mm

Nấm Isaria tenuipes được bố trí nhân nuôi trên các đĩa petri có đường

kính 6cm, với 8 lần lặp lại cho 1 công thức thí nghiệm Trên mỗi đĩa Petri cấy

5 điểm nấm

 Chỉ tiêu theo dõi

Thí nghiệm tiến hành theo dõi các chỉ tiêu:

- Đặc điểm hình thái khuẩn lạc nấm Isaria tenuipes sinh trưởng trên môi

trường PDA

- Sự sinh trưởng phát triển của nấm Isaria tenuipes theo bề ngang môi

trường (đường kính khuẩn lạc)

- Sự sinh trưởng, phát triển chiều cao của khuẩn lạc nấm Isaria tenuipes

- Sự phát sinh và hình thành bào tử nấm Isaria tenuipes trên môi trường

PDA

- Các chỉ tiêu được theo dõi và lấy số liệu định kỳ 3 ngày 1 lần Riêng

chỉ tiêu miêu tả đặc điểm hình thái khuẩn lạc nấm Isaria tenuipes thì

theo dõi và lấy chỉ tiêu theo từng ngày một

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật nhân sinh khối nấm Isaria tenuipes

Nghiên cứu kỹ thuật nhân sinh khối nấm Isaria tenuipes bằng phương

pháp lên men trên môi trường lỏng, tĩnh và trên môi trường rắn nhằm tìm ramôi trường dinh dưỡng thích hợp cho sinh trưởng và phát sinh bào tử nấm

Isaria tenuipes.

Nhân nuôi sinh khối nấm nấm ký sinh côn trùng dựa theo phương phápcủa Chen Y.Q et al (2004) [33]; Weiyun Zhang et al (2005) [46]; Sung-Hom Yeon et al (2006) [45]; In-Pyo Hong et al (2010) [43]

 Phương pháp nhân sinh khối

(1) Phương pháp nhân giống cấp I trên môi trường PDA

Môi trường PDA pha chế theo đúng tỉ lệ thành phần các nguyên liệu.Đun sôi sau đó cho dung dịch môi trường vào các ống nghiệm một lượng5ml/ống nút bông, khử trùng ở nhiệt độ 1210C, thời gian 20 phút, lấy ra đểnghiêng ống nghiệm 150 Cấy chuyển giống thuần vào nuôi ở điều kiện nhiệt

độ 20 - 240C, thời gian theo dõi nuôi 15 - 20 ngày Thao tác cấy được tiếnhành trên ngọn lửa đèn cồn trong buồng cấy sinh học vô trùng

(2) Phương pháp nhân giống cấp II

Khi pha chế môi trường nhân giống cấp II cần trộn đều các thành phầnnguyên liệu theo tỉ lệ Sau đó cho hỗn hợp nguyên liệu vào 1/2 bình tam giác

cỡ 250ml Các bình tam giác được nút lại bằng bông sạch Đem hấp khử trùng

ở nhiệt độ 1210C, trong thời gian 50 phút Sau đó lấy ra để nguội Cấy chuyểngiống cấp I vào theo tỷ lệ 1:1 (1 ống nghiệm giống cấp I cấy chuyển vào 1bình tam giác cấp II) Nuôi giống cấp II ở nhiệt độ 20 - 240C, độ ẩm không

khí 80%, lấy số liệu 5 ngày/lần và trong thời gian 20 ngày.

(3) Phương pháp nhân giống cấp III

Trộn đều các thành phần nguyên liệu theo đúng tỉ lệ, cho hỗn hợpnguyên liệu vào 1/3 bình tam giác cỡ 500ml Các bình tam giác được nút lạibằng bông sạch Đem hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, trong thời gian 50phút Sau đó lấy ra để nguội Cấy chuyển giống cấp II vào theo tỷ lệ 1:15 (1bình tam giác 250ml làm giống cho 15 bình tam giác 500ml) Nuôi giống cấpIII ở nhiệt độ 20 - 240C, độ ẩm không khí 80%, lấy số liệu 5 ngày/lần và trongthời gian 10 - 15 ngày

(4) Phương pháp thu hồi sinh khối

Sau khi nhân giống trên môi trường lỏng ở cấp 1, 2 và có thể trên môitrường lỏng cấp 3, nấm được chuyển sang các môi trường nhân sinh khối đặctrưng trên môi trường lỏng hoạc rắn

Khi sợi nấm bao phủ lên toàn bộ thể tích khối môi trường rắn đồng thờiquá trình hình thành bào tử kết thúc và bào tử đã được định hình trên bề mặtcủa môi trường Tiến hành thu hồi nấm nuôi trên môi trường Sau đó đem sấykhô ở nhiệt độ 100C, trong 10 - 15h khi độ ẩm của cơ chất và bào tử đạt

ngưỡng 5%, nghiền mịn thu được chế phẩm nấm Isaria tenuipes.

Trên môi trường lên men lỏng tĩnh, khi nấm lan tỏa phủ kín hoàn toàn bềmặt môi trường, khối lượng váng nấm và số lượng bào tử đạt tối đa thì tiếnhành thu sinh khối nấm Sau đó đem sấy khô ở nhiệt độ 100C, trong 10 - 15hkhi độ ẩm của váng nấm đạt ngưỡng 5%, nghiền mịn thu được chế phẩm nấmhoặc tiến hành bảo quản cho quá trình phân tích thu hoạt chất sinh học trên

nấm Isaria tenuipes.

* Bố trí thí nghiệm

- Thí nghiệm trên môi trường lỏng

Nhân sinh khối nấm trên môi trường lỏng được bố trí với ba công thức cóthành phần môi trường dinh dưỡng như sau:

 CT1: 2% sucrose, 0,9% yeast extract, 0,3% KHPO4, 0,4% CaCl2, 1lítnước cất Môi trường có pH = 6

 CT 2: 30g glucose, 4g yeast extract, 0,46g KH2PO4, 1g K2HPO4, 0,5gMgSO4, 1 lít nước cất Môi trường có pH = 8

 CT3: 40g glucose, 10g yeast extract, 0,5g KH2PO4, 0,5g

K2HPO4.3H2O, 0,5g MgSO4.7H2O, 1 lít nước cất Môi trường có pH = 7

Bố trí thí nghiệm với 3 lần lặp lại/1công thức; 30 bình/1công thức.Nấm được nuôi trong các bình tam giác thuỷ tinh có dung tích 500ml với thểtích môi trường nuôi là 100ml, được đặt trên các giá đỡ nuôi trong điều kiện

250C, độ ẩm 80% và có chế độ sáng/tối là 12/12

- Thí nghiệm trên môi trường rắn

Nấm sinh trưởng và phát triển trên môi trường rắn là gạo lứt có bổ sungthêm các các thành phần dinh dưỡng khác Thành phần dinh dưỡng củacác công thức được bố trí như sau:

 CT 1: 100 gam gạo lứt

 CT 2: 100 gam gạo lứt + 3 gam sucrose + 2 gam yeast extrac

 CT 3: 100 gam gạo lứt + 5 gam nhộng tằm

Các công thức đều có tỷ lệ gạo và nước đạt 1: 1,2

Mỗi công thức được bố trí với 3 lần lặp lại 30 túi bóng/1 lần lặp lại Cáccông thức thí nghiệm được bố trí nhân nuôi trong các túi bóng có dung tích 1000

ml Nấm được nuôi ở điều kiện 250C, độ ẩm 80%, thời gian sáng tối là 12/12

Chỉ tiêu theo dõi

 Thí nghiệm trên môi trường lỏng tiến hành theo dõi với các chỉ tiêu sau:

- Khả năng lan tỏa trên bề mặt môi trường lỏng (%)

- Khối lượng váng nấm (gam)

- Nồng độ bào tử được phát sinh và hình thành (bào tử/1ml)

- Thể tích môi trường còn lại, pH của môi trường

Các chỉ tiêu theo dõi được lấy định kỳ 3 ngày một lần Thí nghiệm được theodõi trong thời gian một tháng

 Thí nghiệm trên môi trường lên men rắn theo dõi với các chỉ tiêu như sau:

- Khả năng bao phủ trên bền mặt môi trường (%)

- Số lượng bào tử được hình thành (bào tử/1gam)

Các chỉ tiêu được theo dõi lấy định kỳ 3 ngày 1 lần thí nghiệm được theo dõitrong thời gian 45 ngày

2.4.3 Phương pháp đánh giá hiệu lực chế phẩm nấm Isaria tenuipes

phòng trừ nhộng sâu khoang hại cây trồng trong phòng thí nghiệm

 Phương pháp

Đánh giá hiệu lực chể phẩm nấm Isaria tenuipes trong phòng trừ nhộng

sâu khoang hại cây trồng tuân thủ theo các phương pháp thường quy về thínghiệm bảo vệ thực vật (Bảo vệ thực vật, 2010)

 Bố trí thí nghiệm

Đánh giá hiệu lực phòng trừ của chế phẩm nấm Isaria tenuipes trên nhộng

của sâu khoang được tiến hành với thí nghiệm như sau: Đánh giá hiệu lực