Xác định hàm lượng vitamin a trong sưaz lỏng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao luận văn tốt nghiệp đại học

===  ===lê thị hơng XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN A TRONG SỮA LỎNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC Kí LỎNG HIỆU NĂNG CAO khóa luận tốt nghiệp đại học Chuyên ngành: hóa thực phẩm Vinh - 2011... Vì vậy

===  ===

lê thị hơng

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN A TRONG SỮA LỎNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SẮC Kí LỎNG HIỆU NĂNG CAO

khóa luận tốt nghiệp đại học

Chuyên ngành: hóa thực phẩm

Vinh - 2011

===  ===

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN A TRONG SỮA LỎNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SẮC Kí LỎNG HIỆU NĂNG CAO

khóa luận tốt nghiệp đại học

Khóa luận được thực hiện tại phòng thí nghiệm Trung tâm Kiểm định An toànThực phẩm và Môi trường, Trường Đại học Vinh.

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn đến Ths Lê

Thế Tâm - Khoa Hóa, Trường Đại học Vinh đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo

mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Chu Thị Thanh Lâm - Khoa Hóa - TrườngĐại học Vinh đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình làm thínghiệm, hướng dẫn cách sử dụng máy HPLC đo mẫu

Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các cán bộ trongkhoa Hoá

Và lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã động viên đã giúp đỡ tôi hoànthành khóa luận này

Vinh, tháng 5 năm 2011

Sinh viên

Lê Thị Hương

LỜI MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

3 Đối tượng nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về sữa 3

1.2 Giới thiệu về vitamin 3

1.2.1 Khái niệm 3

1.2.2 Đặc điểm chung và phân loại 4

1.2.2.1 Đặc điểm chung 4

1.2.2.2 Phân loại 5

1.3 Vitamin A 6

1.3.1 Giới thiệu 6

1.3.2 Tính chất vật lý 6

1.3.3 Tính chất hóa học 6

1.3.4 Tính chất quang phổ 8

1.3.5 Tính ổn định 10

1.3.6 Vai trò của vitamin A 10

1.3.7 Tác hại của vitamin A 11

1.3.8 Nguồn vitamin A trong thực phẩm 14

1.4 Các phương pháp xác định vitamin A 16

1.4.1 Phương pháp quang phổ 16

1.4.1.1 Phương pháp so màu 16

1.4.1.2 Phương pháp quang phổ khác 16

1.4.2 Phương pháp đo quang 16

1.4.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 18

1.5 Giới thiệu về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 21

1.5.1 Cơ sở lý thuyết 21

1.5.4 Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ 23

1.5.5 Hệ thống HPLC 26

1.5.5.1 Bình đựng dung môi 26

1.5.5.2 Bộ khử khí Degasse 26

1.5.5.3 Bơm (Pump) 27

1.5.5.4 Bộ phận tiêm mẫu (injection) 27

1.5.5.5 Cột sắc ký 27

1.5.5.6 Đầu dò (Detector) 28

1.5.5.7 Bộ phận ghi tín hiệu 28

1.5.5.8 In kết quả 29

1.5.6 Chọn điều kiện sắc ký 29

1.5.6.1 Lựa chọn pha tĩnh 29

1.5.6.2 Lựa chọn pha động 30

1.5.7 Tiến hành sắc ký 31

1.5.7.1 Chuẩn bị dụng cụ và máy móc 31

1.5.7.2 Chuẩn bị dung môi pha động 32

1.5.7.3 Chuẩn bị mẫu đo HPLC 32

1.5.7.4 Cách đo HPLC 32

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Phương pháp lấy mẫu 33

2.2 Nguyên tắc 33

Chương 3 THỰC NGHIỆM 34

3.1 Thiết bị, dụng cụ 34

3.2 Hóa chất 34

3.3 Thực nghiệm 35

3.3.1 Sơ đồ xử lý chất chuẩn và mẫu 35

3.3.2 Tiến hành 36

3.3.2.1 Chất chuẩn gốc 36

3.3.2.2 Mẫu phân tích 38

3.5.1 Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn xác định (LOQ) của

phương pháp 40

3.5.2 Đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp 40

3.5.3 Khảo sát độ lặp 40

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

4.1 Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn của Vitamin A 41

4.2 Đánh giá phương pháp 43

4.2.1 Xác định độ lặp lại của phương pháp 43

4.2.2 Xác định độ thu hồi của phương pháp 45

4.2.3 Xác định LOD và LOQ của phương pháp 46

4.3 Sắc đồ 47

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

5.1 Kết luận 51

5.2 Kiến nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

Bảng 1.3.4: Bảng thể hiện tính chất quang phổ 9Bảng 1.2.7: Tham khảo khẩu phần ăn chứa vitamin A và mức độ chấp nhận

được (UL) 13Bảng 1.3.8: Vitamin A trong thực phẩm 14Bảng 4.1.1: Diện tích peak của vitamin a tương ứng với từng nồng độ chuẩn

41Bảng 2.4: Giá trị LOD và LOQ 42Bảng 4.1.2: Kết quả phân tích hàm lượng vitamin A trong sữa 43Bảng 4.2.1 Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên của các

mẫu sữa 44Bảng 4.2.2: Kết quả xác định hiệu suất thu hồi của phương pháp 46Bảng 2.4: Giá trị LOD và LOQ 46

IU: Đơn vị quốc tế

DRI: Thuật ngữ chung cho một tập các giá trị tham chiếu được sử

dụng để lập kế hoạch đánh giá lượng chất dinh dưỡng ở ngườikhoẻ mạnh

DRIs: Chế độ khẩu phần ăn tham khảo

UL: Mức độ chấp nhận được

RDA: Chế độ ăn uống phụ cấp

RE: Đương lượng retinol

Với 1 IU=0,3μg retinol1RAE = 1μg vitamin A = 12 μg β carotence =24 μg cáccarotenoid khác

1RAE = 3,3 IU

LỜI MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Vitamin là một nhóm chất hữu cơ có phân tử lượng lớn và các tính chất lý,hoá học rất khác nhau Tác dụng của chúng trên các cơ thể sinh vật cũng rất khácnhau nhưng đều cần thiết cho sự sống của sinh vật, nhất là đối với người và độngvật So với nhu cầu về các chất dinh dưỡng cơ bản như protein, lipit, gluxit thì nhucầu về vitamin rất thấp Trong cơ thể vitamin đóng vai trò như những chất xúc tác

Có khoảng 40 vitamin và khoáng chất cần thiết cho con người Vitaminđược cung cấp vào cơ thể con người để giúp cơ thể đáp ứng nhu cầu dinh dưỡnggiúp cơ thể khỏe mạnh khỏe mạnh Trong nhiều thế kỉ, do thiếu một số vitamin gâynên các bệnh mù lòa (thiếu vitamin A), bệnh beri-beri (thiếu vitamin B1), bệnhscobut (thiếu vitamin C), thiếu axit folic trong thời kì thai nghén gây khuyết tật ốngthần kinh ở thai nhi Theo thống kê, chỉ riêng ở Mỹ, có tới 7/10 người phải “cầucứu” tới vitamin, còn 3 người thì sử dụng chúng một cách có định hướng và thườngxuyên Từ những năm 70, chính phủ Mỹ đã cho phép sử dụng các phụ gia thựcphẩm có chứa vitamin liều cao Kết quả là, hàng năm ở Mỹ, người ta tiêu tốnkhoảng 4 tỷ đôla cho các loại vitamin Nhiều người còn cho rằng vitamin là thầndược chữa ung thư và kéo dài tuổi thọ Hiện nay, khoa học đang tiến hành nhữngnghiên cứu thực nghiệm trên quy mô rộng lớn về vitamin Cơ quan quản lý thuốc vàthực phẩm của Mỹ cũng đưa ra một lời khuyên là: đa dạng hóa ăn uống là biện pháptốt nhất để đáp ứng nhu cần vitamin của cơ thể Sử dụng bổ sung các loại vitamin vàcác chất khoáng cần phải có mức độ Liều lượng sử dụng nhiều hay ít là vấn đề cótính riêng biệt, tùy thuộc vào lối sống, khẩu phần ăn uống, tình trạng sức khỏe củatừng người và vô số những nhân tố khác

Các nhà khoa học đã nghiên cứu vitamin A là một trong những loại vitamincần thiết cho cơ thể Vì vậy nên cần bổ sung một lượng thích hợp cho cơ thể.Vitamin A có trong dược phẩm, thực phẩm tự nhiên và các loại thực phẩm qua chếbiến.Viamin A là một trong những vitamin có nhiều trong sữa và tuỳ thuộc vàohàm lượng carotence trong thức ăn của gia súc dùng lấy sữa Để biết được hàm

lượng của vitamin A trong sữa ra sao? Ở khóa luận này chúng tôi nghiên cứu việcxác định hàm lượng vitamin A trong sữa lỏng của một số sản phẩm sữa Có thể xácđịnh vitamin A bằng phương pháp trắc quang, quang phổ, sắc kí, hoá học… Nhưng

do vitamin A là hợp chất hữu cơ thuộc đối tượng khó phân tích vì nó tồn tại ở trạngthái tan trong dầu Do đó cần phải lựa chọn phương pháp phân tích mang lại hiệuquả cao nhất Chúng tôi chọn phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao(HPLC) Vìđây là một phương pháp hiện đại cho ta biết kết quả nhanh và chính xác, có thể tiếtkiệm thời gian và lượng mẫu cần dùng

2 Nhiệm vụ nghiên cứu

Trong khóa luận này, chúng tôi có các nhiệm vụ sau:

- Nghiên cứu các tính chất vật lý, hóa học và các phương pháp xác địnhvitamin A

- Tách, chiết vitamin A trong mẫu sữa lỏng

- Định lượng vitamin A bằng phương pháp HPLC

- Kết quả thực nghiệm

3 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu sữa lỏng được thu thập từ các cửa hàng tạp hoá trong thành phố Vinh.Mỗi mẫu được lấy 1 dây sữa 4 hộp 110ml, đựng vào túi nilông sạch Bao gồm:

+ Sữa tươi Vinamilk

+ Sữa Ba Vì

+ Sữa Mộc Châu

Chương 1

TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về sữa

Sau sữa mẹ, sữa bò là thực phẩm chứa các chất dinh dưỡng đầy đủ và cân đốinhất Các sữa từ trâu, dê, ngựa cũng có các chất dinh dưỡng khác nhau do điều kiện

về giống, điều kiện tự nhiên, hay điều kiện chăn nuôi Mặc dù ở nước ta chăn nuôitrâu sữa,dê sữa đã có từ khá lâu nhưng cho sản lượng thấp Vì vậy cho đến naynguyên liệu chủ yếu cho ngành sữa Việt Nam vẫn là sữa bò

Các sản phẩm sữa có thể ở dạng rắn như các phomat, dạng hạt đơn điệu nhưtrong các sữa bột, dạng đặc mịn màng đôi khi có thêm hương sắc của hoa trái nhưtrong các sữa chua, dạng lỏng như trong các sữa cô đặc với đường, các loại sữa tươi

có đường Từ nguyên liệu sữa bò ngươi ta đã chế tác ra vô vàn các sản phẩm cócấu trúc, trạng thái và hương vị khác nhau.Các sản phẩm sữa có thể ở dạng rắn nhưcác phomat, dạng hạt đơn điệu như trong các sữa bột, dạng đặc mịn màng đôi khi cóthêm hương sắc của hoa trái như trong các sữa chua, dạng lỏng như trong các sữa côđặc với đường

Trong sữa có các thành phần chính là: nước, gluxit, chất béo, hợp chất nitơ,chất khoáng chất khô tổng số, các chất khác (các chất xúc tác sinh học như vitamin

A, D, K,B1 các khí hòa tan,enzyme) Trong đó vitamin A (Retinol) chiếm 0,3mg/l,tốt cho cơ thể Để biết hàm lượng vitamin A trong sản phẩm sữa như thế nào so vớisữa tươi nguyên thì cần kiểm tra chất lượng sản phẩm

1.2 Giới thiệu về vitamin

1.2.1 Khái niệm

Vitamin là hợp chất hữu cơ, phần lớn có phân tử tương đối nhỏ Bản chất hóahọc, lý học của các vitamin rất khác nhau Nhóm chất hữu cơ này có một đặc điểmchung là đặc biệt cần thiết cho mọi hoạt động sinh sống bình thường của các cơ thểsinh vật dị dưỡng

Vitamin là những chất mà cơ thể con người không thể tự tổng hợp được.Phần lớn phải đưa từ ngoài vào bằng con đường ăn uống Mặc dù lượng vitamin có

thể sử dụng ít nhưng khi thiếu một loại vitamin nào đó sẽ dẫn đến những rối loạn vềhoạt động sinh lý bình thường của cơ thể Vitamin còn cần thiết cho cơ thể tự dưỡngnhư thực vật là những đối tượng có khả năng tự tổng hợp nên hầu hết các vitamin.Còn một số bộ phận cây xanh không có khản năng tổng hợp vitamin, vì thế cầncung cấp thêm cho chúng để đảm cho sự sinh trưởng và phát triển Nhưng cơ thểcon người, thực vật và động vật có thể không hoàn toàn tự tổng hợp được vitamin

mà chủ yếu lấy từ các nguồn dược phẩm, thực phẩm vào cơ thể

1.2.2 Đặc điểm chung và phân loại

- Không thể thay thế lẫn nhau: thiếu một loại vitamin này không thể thay thếđược bằng một loại khác

- Vitamin ảnh hưởng tới hoạt động và quá trình phát triển của tổ chức: là chấtxúc tác, bằng cách hoạt hoá quá trình oxi hoá thức ăn và chuyển hoá Tham gia vàothành phần cấu tạo coenzym, quyết định hoạt tính đặc thù của chúng

- Khi trong thức ăn thiếu vitamin hoặc cơ thể hấp thụ kém, sẽ dẫn đến các rốiloạn trao đổi chất đặc trưng và rối loạn chức năng, cơ thể sẽ xuất hiện các rối loạnbệnh lý (bệnh thiếu vitamin và bệnh thừa vitamin)

Thực vật và vi sinh vật có khả năng tổng hợp hầu hết các loại vitamin và tiềnvitamin (provitamin)

Người và động vật không có khả năng tổng hợp mà chỉ sử dụng đượcvitamin lấy từ thức ăn Một số loại vitamin (B6, B12, acid pantotenic, acid folid )được hệ vi khuẩn ở ruột tổng hợp hoặc tạo ra trong cơ thể (ví dụ acid nicotinic đượctổng hợp từ tryptophan), tuy vậy các phản ứng này không đủ cung cấp cho nhu cầucủa cơ thể

1.2.2.2 Phân loại

Dựa vào cơ sở sinh lý và hoá học vitamin được phân chia thành 2 nhóm lớn:

 Vitamin hòa tan trong chất béo (dầu):

Có khả năng dự trữ trong cơ thể , do vậy sự thiếu hụt tạm thời của chúngkhông dẫn đến tác hại lớn đối với cơ thể Khi cơ thể tiếp nhận một lượng lớnvitamin tan trong dầu, thì nồng độ của chúng trong lipit của cơ thể có thể vượt quamức bình thường và trong một số trường hợp có thể dẫn đến những rối loạn quátrình trao đổi chất và các rối loạn chức năng ( bệnh thừa vitamin )

 Vitamin hòa tan trong nước:

Chúng được tích lũy chỉ với lượng ít Lượng dư thừa được thải qua nước tiểu

- Vitamin B13 ( Acid orotic)

- Vitamin B15 (Acid pangamic)

- Vitamin Bc (Acid folid)

- Vitamin P P (Acid nicotinic)

1.3 Vitamin A

1.3.1 Giới thiệu

Quá trình phát hiện ra vitamin A vào khoảng năm 1906 trong đó người ta chỉ

ra rằng các yếu tố không phải các cacbohydrat, protein, chất béo cũng là cần thiết đểgiữ cho bò khỏe mạnh Vào năm 1917, một trong các chất này đã được Elmer McColum tại Đại học Wisconsin - Madison và Lafayette Mendel cùng ThomasOsborne tại Đại học Yale phát hiện ra độc lập với nhau Do "yếu tố hòa tan trongnước B" (vitamin B) cũng mới được phát hiện ra gần khoảng thời gian đó, nên cácnhà nghiên cứu chọn tên gọi "yếu tố hòa tan trong dầu A" (vitamin A)

Năm 1920, Osborn, Mendel và một số nhà khoa học đã phát hiện ở thực vậtcũng có một số hợp chất tương tự vitamin A đó là caroten Sau đó Eiler (1929) vàMur (1930) đã xác định một số caroten ( β-Carotene ) đó là tiền vitamin A(provitamin A)

1.3.2 Tính chất vật lý

Vitamin A là chất kết tinh lăng trụ, màu vàng, nóng chảy ở nhiệt độ 620

-640C Vitamin A không hòa tan trong nước và hòa tan trong chất béo và dầu, vànhất là dung môi hữu cơ

Vitamin A có thể bị ảnh hưởng xấu bởi oxy hay không khí, ánh sáng và nhiệt

độ Sự ẩm ướt và độ ẩm không khí cao sẽ làm tăng các hiệu ứng Vì vậy sự hư hỏng

có thể được giảm đáng kể khi tách nó khỏi nguồn oxy hay hơi ẩm và sự hiện diệncủa chất chống oxy hoá cùng với việc bảo quản ở nhiệt độ thấp

β-Carotene là tiền vitamin A carotenoid quan trọng nhất, hoà tan r ất caotrong các dung môi không phân cực(bao gồm cả dầu mỡ), CS2, cloroform,nhưng không tan trong nước nhiệt độ nóng chảy là 1830 C Chúng thường táchkhỏi các nguyên liệu thực vật bằng dầu mỏ, ether β-Carotene nhạy cảm vớioxy và không khí

1.3.3 Tính chất hóa học

Vitamin A không tồn tại dưới dạng một hợp chất duy nhất, mà dưới mộtvài dạng

- Trong thực phẩm có nguồn gốc động vật, dạng chính của vitamin a là rượu

là retinol, nhưng cũng có thể tồn tại dưới dạng andehyt là retinal, hay dạng axit làaxit retinoic Hai dạng quan trọng của nhóm vitamin A là vitamin A1 và vitamin A2:

- Trong thực phẩm có nguồn gốc thực vật gồm 3 loại α, β, γ - caroten(carotenoid) Chúng khác nhau ở cấu tại vòng ionnon, β - caroten có 2 vòng β -ionon nên khi thuỷ phân cho 2 vitamin A còn α và γ - caroten chỉ có 1 vòng β -ionon (ngoài ra là α - ionon) nên chỉ cho một phân tử vitamin Trong thực phẩm,tiền vitamin A chủ yếu là β - caroten:

Vitamin A có tính chất hóa học sau:

- Không tan trong nước, tan tốt trong các dung môi của lipit, ete, ethanol…

- Bền trong điều kiện yếm khí, bền với acid và kiềm ở nhiệt độ khôngquá cao

- Dễ bị oxy hóa bởi oxy không khí, ánh sáng làm tăng quá trình oxy hóavitamin A

- Dưới tác dụng của enzyme dehydrogenase thì retinol chuyển sangdạng retinal

- Phản ứng với SbCl3 cho phức chất màu xanh

- Phản ứng với H2SO4 cho phức chất màu nâu

Tính chất của β-carotencaroten

- Khi đưa vào cơ thể động vật thì caroten chuyển thành vitamin A nhờ hệ visinh vật đặc trưng

- Trong cơ thể động vật sự chuyển hóa caroten thành vitamin A có thể xảy ra

ở tuyến giáp trạng nhờ sự tham gia của chất tireoglobulin (có tính chất của enzymcarotenase).-

- Có nghiên cứu cho rằng vị trí chuyển hóa của caroten thành vitamin A là thànhruột non

1.3.4 Tính chất quang phổ

Vitamin A có tính hấp thụ tia cực tím mạnh (UV) nhờ vào hệ nối đôi liênhợp Phổ hấp thụ trong tia tử ngoại là λmax = 324-325 Ta có bảng sau:

C20H30O

C20H30O

328319

16891220

(48.3)(34.9)All-trans-retinyl-

acetate C22H32O 325 1560 (51.2)All-trans-retinyl-

palmitate C36H60O 325 940 (49.3)All-trans-retinal C20H28O 383 1510 (49.2)All-trans-retinol acid C20H28O2 350 1510 (45.3)13-cis-retinoic acid C20H28O2 354 1325 (39.8)

Hình 1.3.4: Đặc điểm quang phổ của β-carotencaroten

1.3.5 Tính ổn định

Vtamin A là một trong những vitamin tan trong dầu Chất này nhạy cảm vớioxy, acid, tia tử ngoại nhưng hơi bền vững hơn ở dạng ester (ví dụ vitamin Apalmifate hay acetate)

Vitamin A có tính ổn định trong huyết tương và trong thực phẩm Nhưng hiệntượng mất vitamin A có thể xuất hiện do các phản ứng hóa học gây mất hoạt tính củavitamin A, do bị tách ra hay bị rò rỉ khỏi thực phẩm Như các quá trình chế biến vàbảo quản thực phẩm có thể làm mất từ 5-40% vitamin A và carotenoid Vì thế việcbảo vệ các vitamin trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm là rất cần thiết

1.3.6 Vai trò của vitamin A

- Tham gia vào quá trình trao đổi protein, lipit, sacharid, muối khoáng Nếuthiếu vitamin A sẽ làm giảm quá trình sinh tổng hợp protein, giảm quá trình tích lũyglycogen trong gan, giảm lượng α,β,γ- globulin, albumin trong máu, ảnh hưởng tớiquá trình hoạt động của tuyến giáp, tuyến thượng thận

- Tham gia chức năng cảm nhận thị giác: Đây là chức năng được xác định rõnhất của vitamin A, đóng vai trò quan trọng quá trình cảm quang của mắt Dạngandehyt của vitamin A kết hợp với opsin(protein), tạo nên sắc tố thị giác gọi làrodopsin, chất này đảm bảo tính nhạy cảm của mắt đối với ánh sáng

Opsin

tối Rodopsin sáng Luminorodopsin (da cam)Retinal(cis)

NADH 2 Retinal(trans) Opsin (vàng) (không màu)NAD NAD

Dưới tác dụng của ánh sáng, rodopssin sẽ bị phân giải thành opsin vàandehyt của vitamin A là retinal(trans), ngược lại, trong bóng tối lại xảy ra quá trìnhtổng hợp rodop(để tổng hợp được rodopsin, retinal phải tồn tại ở dạng cis).

- Duy trì cấu trúc bình thường của da và niêm mạc, biệt hoá tế bào: vitamin

A giúp cho quá trình phát triển và tái tạo các tế bào da và niêm mạc, khả năng tiếtdịch của các tế bào niêm mạc Nếu thiếu vitamin A, các tế bào sản xuất keratin thaythế các tế bào tiết nhày ở nhiều tổ chức biểu mô của cơ thể, đặc biệt là ở mắt, dẫntới khô kết mạc, giác mạc

- Đáp ứng miễn dịch: miễn dịch không đặc hiệu, bảo vệ toàn vẹn cho da và

niêm mạc, chống sự xâm nhập vào cơ thể của vi khuẩn và các tác nhân gây bệnh.Miễn dịch đặc hiệu giúp duy trì, bảo vệ dòng tế bào lympho, tham gia trong đáp ứngmiễn dịch trung gian tế bào của tế bào Tham gia vào quá trình oxy hóa-khử trong

cơ thể, chống lão hóa, liên quan tới quá trình chuyển hóa năng lượng

- Tạo máu: Cơ chế vẫn còn chưa rõ, nhưng người ta thấy rằng thiếu vitamin

A liên quan chặt chẽ với thiếu máu do thiếu sắt, có thể thiếu vitamin A đã gây cảntrở hấp thụ, vận chuyển, dự trữ sắt

- Tăng trưởng: Retinoic acid được biết là đóng vai trò như một hóc môn

(hormone-like) trong điều chỉnh sự lớn và phát triển của các mô trong hệ cơ – xương

- Sinh sản: ảnh hưởng tới quá trình sinh sản của một số loài Như ảnh hưởngtới tỉ lệ đẻ trứng, tỉ lệ nở trứng của gia cầm Vì vậy cần bổ sung vitamin A vào thức

ăn cho chúng Hay khi thiếu hụt retinol hoặc retinal chuột đực không sinh sản tế bàotinh trùng ,bào thai chuột cái không phát triển bình thường

1.3.7 Tác hại của vitamin A

vụn keratin thành các mảng trong mờ nhỏ(đốm biot) và cuối cùng là sự ăn mòn bềmặt màng sừng thô ráp với sự thoái hóa và phá hủy của giác mạc và mù toàn phần.Các thay đổi khác còn có suy giảm miễn dịch, giảm chiều dày lớp vảy ở da (cácbướu nhỏ màu trắng ở nang tóc) bệnh da gà (Keratosis pilaris) và Squamousmetaplasia của biểu mô ở bề mặt của lối vào phía trên của hệ hô hấp và bàng quang,với lớp biểu mô bị keratin hóa

b Thừa vitamin A

- Do vitamin A hòa tan trong chất béo, việc thải lượng dư thừa đã hấp thụvào từ ăn uống là khó khăn hơn so với các vitamin hòa tan trong nước như cácvitamin B và C (các vitamin tan trong nước khi dư thừa thì được cơ thể tự đào thảiqua bài tiết hoặc tiêu hoá) Do vậy, quá liều có thể dẫn tới ngộ độc vitamin A Nó cóthể gây buồn nôn, vàng da, dị ứng, chứng biếng ăn, nôn mửa, nhìn mờ, đau đầu, tổnthương cơ và bụng, uể oải và thay đổi tính tình

- Ngộ độc cấp tính nói chung xảy ra ở liều 25.000 IU/kg, và ngộ độc kinhniên diễn ra ở 4.000 IU/kg mỗi ngày trong thời gian 6-15 tháng.Tuy nhiên, ngộ độc

ở gan có thể diễn ra ở các mức thấp tới 15.000 IU/ngày tới 1,4 triệu IU/ngày, vớiliều gây ngộ độc trung bình ngày là 120.000 IU/ngày Ở những người có chức năngthận suy giảm thì 4.000 IU cũng có thể gây ra các tổn thương đáng kể Việc uống

nhiều rượu cũng có thể làm gia tăng độc tính Trong các trường hợp kinh niên, rụng

tóc, khô màng nhầy, sốt, mất ngủ, mệt mỏi, giảm cân, gãy xương, thiếu máu và tiêuchảy có thể là các triệu chứng hàng đầu gắn liền với ngộ độc ít nghiêm trọng

Bảng 1.2.7: Tham khảo khẩu phần ăn chứa vitamin A

300400

600900900900900900

60070070070070070

750750750

120013001300

600600

600900

170028003000300030003000

170028003000300030003000

280030003000

280030003000

1.3.8 Nguồn vitamin A trong thực phẩm

Vitamin A trong thực phẩm có nguồn gốc động vật dưới dạng retinol, cònthức ăn có nguồn gốc thực vật ở dưới dạng caroten (tiền vitamin A) Retinol cónhiều trong gan, lòng đỏ trứng, bơ, sữa, phomát… Caroten có nhiều trong rau cómàu xanh đậm hoặc màu vàng, quả có màu vàng như: rau muống, rau ngót, rau cảixanh, rau dền, bí đỏ, cà rốt, xoài…

Bảng 1.3.8: Vitamin A trong thực phẩm Loại NDB NO Ug RAE

4 Mạch nha trộn với các chất dinh dưỡng bổ sung

5 Thịt gà, thân gà, đầu cổ chân cánh ngỗng, nấu chín

10 Bơ thực vật ,80% chất béo,có muối

11 Khoai lang luộc chín không có da

12 Bí đỏ, đóng hộp mà không có muối

13 Cải xoăn, đông lạnh, nấu chín, luộc thoát nước mà

không có muối

14 Bơ ,muối

15 Rau bina, đông lạnh, lát nhỏ, nấu chín luộc thoát

nước mà không có muối

050221150811655

1112511124046111151011424

1123601001

11464115810806908048

10737

774439293929

1753961956

860841817787778

735683

603582516507

19 Ngũ cốc, sữa tổng hợp.

20 Ngũ cốc, bột mì

21 Rau bina tươi

22 Khoai lang đóng hộp

23 Củ cải xanh, đun sôi mà không có muối

24 Củ cải xanh nấu chín

25 Rau diếp, lá xanh tươi

26 Phomat,kem

27 Các loại rau mùa đông nấu chín mà không có muối

28 Cám nho khô ăn liền

29 Bắp cải, nấu chín, đun sôi, để ráo nước, mà không

có muối

30 Trứng, toàn bộ nấu chín, rán

31 Các loại dưa ,dưa đỏ tươi

32 Rau diếp, bơ

33 Trứng tươi nguyên

34 Phomat, coctai, toàn bộ sữa

35 Sữa bột đóng hộp không béo

36 Sữa đóng hộp cô đặc có đường

37 Sữa không béo, lỏng, với thêm vitaminA, không

có chất béo hoặc gầy

38 Sữa socola ít béo

39 Sữa, chất béo, trái cây, sữa 2% chất béo, có thêm

Vitamin A

40 Xoài tươi

41 Phomat, tiểu thủ, kem, với trái cây

42 Sữa đậu nành, nước trái cây

43 Dưa hấu nguyên

44 Sữa tổng hợp 32% chất béo

08013080891145711512110871156911253010171164408060

1111701128091811125001123010360109701095

0108501104

010790917601013161200932601077

500500470399383381370366261254

21219816916614012011874

6158

553838312828

sử dụng các thuốc thử ăn mòn và gây ung thư, các bước khảo nghiệm phải đượckiểm soát cẩn thận

Quang phổ Raman với kích thích laser xác định thật cụ thể từng mức nănglượng của các phân tử retinol hoặc este của nó Nhưng phương pháp quang phổthường có kết quả sai sót, trừ khi nguyên liệu phân tích là một nguồn tương đối tậptrung của tất cả các retinol hoặc este của nó

1.4.2 Phương pháp đo quang

a Phương pháp đo quang trực tiếp

Có thể áp dụng đối với các nguyên liệu vitamin A ester tổng hợp (retinylacetat, retinyl propionat hoặc retinyl palmitat…) và các dầu hoặc nang mềm chứavitamin A ester với hàm lượng lớn ( 5000 IU/g)

Cân chính xác khoảng từ 25 mg đến 100 mg chế phẩm và đem hòa tan trong

5 ml pentan (TT) rồi pha loãng trong isopropanol để được dung dịch chứa chính

xác khoảng 10 IU đến 15 IU vitamin A trong 1 ml Xác định bước sóng có hấp thụcực đại và đo độ hấp thụ của dung dịch tại các bước sóng 300 nm, 326 nm, 350 nm

và 370 nm trong cốc đo dày 1 cm, dùng isopropanol làm mẫu trắng Tính tỷ lệ độhấp thụ tại các bước sóng 300 nm, 350 nm và 370 nm so với độ hấp thụ tại bướcsóng 326 nm (A/A326)

Nếu cực đại hấp thụ nằm trong dải sóng từ 325 nm đến 327 nm và tỷ lệ A/

A326 không lớn hơn các giá trị ghi dưới đây:

1900

m

V A

V là lượng thể tích dung dịch thu được sau khi pha loãng để đem đo (ml)

1900 là hệ số chuyển đổi độ hấp thụ riêng của ester retinol thành IU/g

b Phương pháp đo quang sau khi chiết tách vitamin A

Có thể áp dụng cho các nguyên liệu vitamin A có nguồn gốc tự nhiên và đa

số các dạng thuốc chứa vitamin A: thuốc nang, viên nén, thuốc bột, thuốc mỡ, dầugan cá

Lấy chính xác một lượng chế phẩm không ít hơn 500 IU vitamin A và khôngnhiều hơn 1 gam chất béo cho vào bình nút mài, thêm 30 ml ethanol, 3 ml dung dịchkali hydroxyd bão hòa, vài viên đá mầm sôi, đun sôi 30 phút trên cách thủy có lắpống sinh hàn hồi lưu, dưới dòng khí nitrogen không có oxygen Làm nguội nhanhrồi dùng 30 ml nước cất chuyển hết hỗn hợp sang bình gạn, thêm 4 gam natri sulfat

đã nghiền mịn Chiết vitamin A với 150 ml ether và lắc 2 phút [nếu tạo thành nhũtương thì chiết thêm 3 lần nữa, mỗi lần với 25 ml ether Tập trung dịch chiết lại rồirửa dịch chiết 4 lần, mỗi lần 50 ml nước cất, chú ý lắc rất nhẹ nhàng ở 2 lần đầu để

tránh tạo thành nhũ tương Làm bay hơi dịch chiết ether trên cách thủy dưới dòngkhí nitrogen không có oxygen hoặc cất quay chân không ở nhiệt độ không quá 30 °Cđến hết dung môi Hòa tan cặn trong một lượng isopropanol vừa đủ để thu đượcdung dịch chứa 10 đến 15 IU vitamin A trong 1ml.

Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở các bước sóng 300nm, 310nm, 325nm,

334nm trong cốc dày 1 cm với mẫu trắng là isopropanol, sau đó xác định bước sóng

có hấp thụ cực đại

1.4.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Đối với các vitamin A hoạt động và đặc tính của retinol và carotenoid trongcác mẫu sinh học, độ phân giải LC rõ ràng, độ chính xác và độ tin cậy cao, khả năng

áp dụng rộng rãi trên nhiều loại chế phẩm

a Phương pháp sắc ký lỏng trực tiếp

Có thể áp dụng đối với các nguyên liệu vitamin A tổng hợp, các thành phẩmchứa vitamin A tổng hợp mà trong thành phần chỉ chứa vitamin A ở một dạng esterđồng nhất hoặc dạng retinol

Tiến hành theo phương pháp sắc ký lỏng

Pha động: Methanol - ethyl acetat - nước (90: 7: 3)

Dung dịch thử:

Lấy chính xác một lượng chế phẩm có chứa khoảng 4000 IU vitamin A chovào bình định mức dung tích 100 ml, thêm ethanol, lắc kỹ rồi thêm ethanol đến địnhmức, lắc đều, lọc

Dung dịch chuẩn:

Pha chất chuẩn vitamin A (dạng giống với dung dịch thử: retinol, retinylacetat, retinyl palmitat … trong ethanol để thu được dung dịch chuẩn có nồng độvitamin A chính xác khoảng 40 IU/ml

Thể tích tiêm: 20 l

Cách tiến hành:

Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký với dungdịch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của 6lần tiêm lặp lại mẫu chuẩn (RSD) không được lớn hơn 2,0 %

Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và dung dịch thử

b Phương pháp sắc ký lỏng sau khi thủy phân

Có thể áp dụng đối với nguyên liệu vitamin A tổng hợp dạng bột, dạng dầu

ml isopropanol Làm nóng trong cách thủy ở 60 oC đến 65 oC trong thời gian 2 đến 5phút Làm lạnh tới 30 °C rồi thêm 20 ml dung dịch tetrabutylamoni hydroxyd 0,1 Mtrong iso-ropanol Lắc siêu âm 5 phút Thêm isopropanol đến vạch, lắc đều (lắcxoay tròn, tránh tạo bọt khí)

Đối với nguyên liệu dạng dầu hoặc nhũ tương: Lấy chính xác một lượng chếphẩm có chứa khoảng 120000 IU vitamin A cho vào bình định mức dung tích 50

ml, hòa tan ngay trong 5 ml pentan Thêm khoảng 20 mg đến 30 mg BHT và 20 mldung dịch tetrabutylamoni hydroxyd 0,1 M trong isopropanol Lắc siêu âm 5 phút.Thêm isopropanol (TT) đến vạch, lắc đều (lắc xoay tròn, tránh tạo bọt khí)

Dung dịch thử B:

Cho khoảng 20 mg đến 30 mg BHT (TT) vào bình định mức dung tích 50

ml, thêm 5 ml isopropanol (TT), lắc cho tan, thêm 5,0 ml dung dịch thử A, thêmisopropanol (TT) tới vạch, lắc đều, lọc

Dung dịch chuẩn:Dung dịch chuẩn A:

Cân chính xác một lượng chất chuẩn retinyl acetat tương đương với 120000

IU vitamin A cho vào bình định mức dung tích 50 ml Thêm ngay 5 ml pentan,thêm khoảng 20mg đến 30mg BHT và 20 ml dung dịch tetrabutylamoni hydroxyd0,1 M trong isopropanol Lắc siêu âm 5 phút Thêm iso-propanol đến vạch, lắc đều(lắc xoay tròn, tránh tạo bọt)

Dung dịch chuẩn B:Cho khoảng 20 mg đến 30 mg BHT (TT) vào bình địnhmức dung tích 50 ml, thêm 5 ml isopropanol , lắc cho tan, thêm 5,0 ml dung dịchchuẩn A rồi thêm isopropanol đến vạch, lắc đều

c Phương pháp sắc ký lỏng sau khi chiết tách vitamin A

Có thể áp dụng đối với các chế phẩm phức tạp và có chứa vitamin A với hàmlượng thấp không thực hiện được 1 trong 2 phương pháp trên

Lấy chính xác một lượng chế phẩm có chứa khoảng 2000 IU vitamin A đem

xà phòng hóa, chiết và bay hơi dịch chiết đến cắn giống như phương pháp 2 Hòatan cắn thu được và chuyển hỗn hợp sang bình định mức 50 ml với isopropanol

Dung dịch chuẩn gốc:

Hòa tan chất chuẩn retinyl acetat trong isopropanol để thu được dung dịch cónồng độ chính xác khoảng 1000 IU vitamin A trong 1 ml Xác định nồng độ chínhxác của dung dịch chuẩn gốc bằng cách pha loãng trong isopropanol tới nồng độ 10đến 15 IU trong 1 ml rồi đo độ hấp thụ ở bước sóng 326 nm trong cốc đo dày 1 cm,dùng isopropanol làm mẫu trắng

1.5 Giới thiệu về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.5.1 Cơ sở lý thuyết

HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương phápsắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kiagọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)

Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từphương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển

và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích.Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều ngành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụngcho ngành kiểm nghiệm thuốc Và nó hiện là công cụ đắc lực trong phân tích cácthuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng

Ưu điểm của HPLC:

Điều kiện phân tích khá dễ dàng

Dễ dàng thu hồi chất phân tích với độ tinh khiết cao

Độ lặp lại cao

Thường không phân hủy mẫu

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động

là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểuphân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã đượcbiến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựatrên cơ chế hấp thụ, phân bố, trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ (Rây phân tử)

Trong khóa luận này chúng tôi sử dụng Máy sắc ký lỏng cao áp hiệu năng

cao (HPLC) Agilent 1100

1.5.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký vàloại sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hay phađảo Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có Sắc ký trao đổi ion Nếu pha tĩnh làchất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có sắc

ký Gel hay Rây phân tử Cùng với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích ra khỏi cộtchúng ta cần có một pha động Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗnhợp chất phân tích A, B, C Vào cột phân tích, kết quả các chất A, B, C sẽ đượctách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây

là tổng hợp các tương tác F1, F2 và F3

Chất phân tích A + B + CF1 F2

Pha tĩnh F3 Pha động

Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa rải ra khỏi cộttrước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1) và ngược lại

Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được qui định bởi 3 lực F1, F2, F3 Trong đó F1

và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn Ở đây F1 là lựcgiữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏicột Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau Kết quả là các chấtkhác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi rakhỏi cột

- Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC)

- Sắc ký rây phân tử - sắc ký gel (IG-HPLC)

Nhưng thực tế hiên nay chúng ta hiện chỉ đang ứng dụng sắc ký hấp phụ vàophân tích mẫu Sắc ký hấp phụ: quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khácnhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động

để kéo chất tan ra khỏi cột Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động họccủa chất hấp phụ Trong loại này có 02 kiểu hấp phụ:

Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP-HPLC): Pha tĩnh phân cực, pha động khôngphân cực

Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC): Pha tĩnh không phân cực pha độngphân cực

Loại sắc ký này được áp dụng rất rộng rãi, thành công để tách các hỗn hợpcác chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực ,phân cực yếuhay trung bình như các Vitamin, các thuốc hạ hiệt giảm đau Chủ yếu hiện naychúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo (RP)

1.5.4 Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ

Kết quả của quá trình tách các chất được Detector phát hiện ghi thành sắc ký

đồ Từ các thông số của các pic, nhiều đại lượng đặc trưng về lý thuyết được đưa ra

để đánh giá một quá trình sắc ký Dưới đây là một số đại lượng thường dùng trongthực tế và cách thay đổi các đại lượng này có lợi cho quá trình phân tích sắc ký

a Thời gian lưu: Retention time (Rt)

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đếnkhi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại

Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gianlưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn Vì vậy thời gian lưu là đạilượng để phát hiện định tính các chất

Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:

Bản chất sắc ký của pha tĩnh

Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan