Nghiên cứu quy trình tổng hợp axit zoledronic luận văn thạc sỹ hóa học

Một trong các nhiệm vụ quan trọng của đề tài trên là khảo sát tối ưu hóaviệc tổng hợp axit zoledronic từ đó làm cơ sở để ứng dụng tổng hợp hoạt chất... + Nhóm hormon sinh dục nữ Oestroge

NguyÔn thÞ quúnh giang

Nghiªn cøu quy tr×nh tæng hîp

axit zoledronic

LuËn v¨n th¹c sÜ hãa häc

Vinh, 2011

NguyÔn thÞ quúnh giang

các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, được các đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác.

Vinh, tháng 12 năm 2011

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Quỳnh Giang

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành cuốn luận văn này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý nhiệt tình của các quý thầy cô trường Đại học Vinh và các nghiên cứu viên của Viện Hóa sinh biển – Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam.

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

TS Phạm Văn Cường đã giao đề tài, dành nhiều thời gian, tâm huyết

hưỡng dẫn, chỉ bảo tôi trong quá trình thực tập và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.

PGS.TS Nguyễn Văn Hùng đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực tập

và hoàn thành luận văn tốt nghiệp tại Viện Hóa sinh biển – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

PGS.TS Hoàng Văn Lựu, TS Lê Đức Giang đã đọc bản thảo, bổ

sung và đóng góp vào luận văn rất nhiều ý kiến quý báu

Các cô, chú, các anh, chị và các bạn phòng Tổng hợp hữu cơ – Viện Hóa sinh biển – Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập.

Ban chủ nhiệm Khoa Hoá, Tổ bộ môn Hoá hữu cơ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn bố mẹ, các anh chị và những người thân trong gia đình đã nuôi dạy, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi học tập và động viên tôi trong suốt quá trình làm luận văn, cảm ơn các bạn bè đã luôn sát cánh và ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua.

Vinh, tháng 12 năm 2011 Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Quỳnh Giang

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 6 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 8

1.1 Bệnh loãng xương 8

1.1.1 Định nghĩa 8

1.1.2 Tình hình loãng xương hiện nay 10

1.1.3 Các thuốc điều trị loãng xương 11

1.2 Hợp chất bisphotphonat 13

1.3 Nghiên cứu tổng hợp axit zoledronic 19

1.3.1 Tìm hiểu về axit zoledronic 19

1.3.2 Các phương pháp tổng hợp axit zoledronic 22

CHƯƠNG 2 NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 27 2.1 Nội dung nghiên cứu 27

2.2 Hóa chất và thiết bị 28

2.2.1 Hóa chất 28

2.2.2 Dung môi 29

2.2.3 Thiết bị 29

2.3 Thực nghiệm 29

2.3.1 Tổng hợp tác nhân xianometyl-4-metylbenzensulfonat 29

2.3.2 Tổng hợp 1H-imidazol-1-axetonitril (hợp chất 7) 31

2.3.3 Tổng hợp axit 2-(1H-imidazol-1-yl)axetic (hợp chất 3) 34

2.3.4 Tổng hợp axit zoledronic (hợp chất 4) 35

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Quy trình tổng hợp tác nhân xianometyl-4-metylbenzensulfonat 38

3.2 Quy trình tổng hợp 1H-imidazol-1-axetonitril (hợp chất 7) 40 3.3 Quy trình tổng hợp axit 2-(1H-imidazol-1-yl)axetic (hợp chất 3) 43

3.4 Quy trình tổng hợp axit zoledronic(hợp chất 4) 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR Carbon Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon – 13C)

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton)DEPT Detortionless Enhancement by Polarization TransferHMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence

HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation

ESI-MS Electrospray Ionization Mass Spectroscopy

(Phổ khối lượng phun mù điện tử)

IR Infrared Spectroscopy (phổ hồng ngoại)

DANH MỤC BẢNG, HÌNH, SƠ ĐỒ

Trang

Bảng 1.1 Các hợp chất bisphotphonat thông dụng………16

Bảng 1.2 Hoạt tính chống loãng xương tương đối của các loại thuốc bisphotphonat……… 17

Bảng 3.1 Khảo sát phản ứng tổng hợp 1H-imidazol-1-axetonitril (7) ở các nhiệt độ khác nhau……… 40

Bảng 3.2 Khảo sát phản ứng tổng hợp axit 2-(1H-imidazol-1-yl)axetic (3) ở các nhiệt độ khác nhau……… 44

Hình 1.1 Chất cơ bản của xương bình thưởng (normal bone matrix) và khi bị bệnh loãng xương (osteoporosis)………8

Hình 1.2 Các biệt dược chứa thành phần chính là axit zoledronic……… 20

Hình 3.1 Phổ 1H-NMR của chất 1c………38

Hình 3.2 Phổ 13C-NMR của chất 1c……… 39

Hình 3.3 Phổ 1H-NMR của chất 7……….41

Hình 3.4 Phổ 13C-NMR của chất 7………42

Hình 3.5 Phổ 1H-NMR của chất 3……….43

Hình 3.6 Phổ 13C-NMR của chất 3………44

Hình 3.7 Phổ 1H-NMR của hợp chất 4……… 46

Hình 3.8 Phổ 13C-NMR của hợp chất 4……….46

Hình 3.9 Phổ ESI-MS của hợp chất 4………47

Sơ đồ 1.1 Phương pháp tổng hợp axit zoledronic của Zaderenko và cộng sự……….….21

Sơ đồ 1.2 Phương pháp tổng hợp axit zoledronic của Pulla Reddy và cộng sự……… 22

Sơ đồ 1.3 Phương pháp tổng hợp axit zoledronic của Patel và cộng sự… 22

Sơ đồ 1.4 Phương pháp tổng hợp axit zoledronic của S.K.Singh và

cộng sự……… 23

Sơ đồ 2.1 Quy trình tổng hợp axit zoledronic………25

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Hiện nay, loãng xương đang được coi là một “bệnh dịch âm thầm”(Osteoporosis: the Silent Epidemic Disease) lan rộng khắp thế giới, ngày càng

có xu hướng gia tăng và trở thành gánh nặng cho y tế cộng đồng Tổ chức Y

tế thế giới WHO đánh giá bệnh loãng xương là một trong những mối đe dọalớn đến sức khỏe người cao tuổi toàn cầu Riêng ở Việt Nam, trung bình cứ 3phụ nữ trên 50 tuổi thì có 1 người bị loãng xương, và ở nam tỷ lệ này là 1 trên

10 Với tỷ lệ này, nước ta hiện đang có trên 2 triệu phụ nữ và nửa triệu namtrên 50 tuổi trong tình trạng loãng xương Do đó nhu cầu về thuốc dùng điềutrị bệnh loãng xương tại Việt Nam là rất lớn Trong số các loại thuốc chốngbệnh loãng xương hiện nay, nhóm thuốc bisphotphonat là hiệu quả nhất, màđứng đầu là axit zoledronic Axit zoledronic được công ty Novartis bào chế

và đăng ký bản quyền sử dụng đến năm 2013, với tên thương mại là Zometa

và Aclasta Thuốc này được nhập về Việt Nam với giá rất cao, gây khó khăn

về tài chính cho nhiều bệnh nhân Vì vậy, ngay từ bây giờ, việc nghiên cứuquy trình tổng hợp và tinh chế axit zoledronic là hết sức cấp thiết, tiến tới xâydựng quy trình sản xuất thuốc dưới dạng thuốc generic (thuốc đã hết hạn bảo

hộ bản quyền) vào năm 2013 với quy mô lớn nhằm hạ giá thành sản phẩm,giảm gánh nặng tài chính cho người bệnh Với mục đích như vậy, Viện HóaHóa sinh biển, Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam đã tiến hành thực hiện

đề tài “ Nghiên cứu quy trình tổng hợp và tinh chế axit zoledronic dùng làm

thuốc điều trị bệnh loãng xương”.

Một trong các nhiệm vụ quan trọng của đề tài trên là khảo sát tối ưu hóaviệc tổng hợp axit zoledronic từ đó làm cơ sở để ứng dụng tổng hợp hoạt chất

này trên quy mô lớn Trong khuôn khổ của luận văn thạc sĩ này, vấn đề:

“Nghiên cứu quy trình tổng hợp axit zoledronic” được lựa chọn thực hiện.

2 Mục đích nghiên cứu

Mục đích của đề tài luận văn là nghiên cứu đánh giá quy trình tổng hợpaxit zoledronic xuất phát từ nguồn nguyên liệu có giá thành không cao, cóhiệu suất cao, ổn định

3 Đối tượng nghiên cứu

Axit zoledronic và các quy trình tổng hợp axit zoledronic

4 Phương pháp nghiên cứu

- Thu thập tài liệu, lựa chọn quy trình phù hợp, chuẩn bị vật tư hóa chất, thiết bị thực hiện đề tài

- Sử dụng các phương pháp tổng hợp hữu cơ

- Xác định điều kiện tối ưu cho các phản ứng

- Sử dụng các phương pháp kết tinh trong các điều kiện dung môi thích hợp, sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng để tinh chế sản phẩm

- Sử dụng các phương pháp phân tích phổ để xác định cấu trúc sản

phẩm: IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR, 31P-NMR, HMBC, HSQC

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Bệnh loãng xương

1.1.1 Định nghĩa

Loãng xương (Osteoporosis - còn được gọi xốp xương hay thưa xương)

là một bệnh lý của hệ thống xương làm giảm mật độ khoáng chất của xương(Bone Mineral Density-BMD) hay giảm trọng lượng của một đơn vị thể tíchxương, hậu quả của sự suy giảm các protein và các khoáng chất của bộxương, khiến cho sức chống đỡ và chịu lực của xương giảm đi, xương sẽ trởnên mỏng mảnh, dễ gãy, dễ lún và dễ xẹp, đặc biệt ở các vị trí chịu lực của cơthể như: cột sống, cổ xương đùi, đầu dưới xương quay Nói đơn giản hơnloãng xương là tình trạng xương mỏng mảnh và yếu đến mức rất dễ gãy khi bịchấn thương dù rất nhẹ, thậm chí có thể gãy tự nhiên không do chấn thương.Mức độ nặng nề của biến chứng gãy xương trong bệnh loãng xương được xếptương đương với tai biến mạch vành (nhồi máu cơ tim) trong bệnh thiếu máu

cơ tim cục bộ và tai biến mạch máu não (đột qụy) trong bệnh cao huyết áp[7], [8]

Hình 1.1 Chất cơ bản của xương bình thưởng (normal bone matrix)

và khi bị bệnh loãng xương (osteoporosis)

Hiện nay để đo mật độ chất khoáng của xương (viết gọn là mật độxương) người ta thường dùng kỹ thuật DEXA (Dual-emission X-rayabsorptiometry – DXA) Kỹ thuật DEXA sử dụng hai tia X với mức nănglượng khác nhau được định hướng vào xương của bệnh nhân Khi sự hấp thucủa mô mềm được loại trừ, mật độ xương có thể được xác định nhờ vào độhấp thu của mỗi tia bởi xương Phương pháp DEXA này có thể đo ở mức mấtxương cỡ 2% mỗi năm Kết quả của đo lường mật độ xương là gam trên mỗi

cm vuông (g/cm2)

Mật độ khoáng của xương biến đổi theo độ tuổi Ở độ tuổi vị thành niên,mật độ xương tăng rất nhanh, đạt mức độ cao nhất ở vào khoảng 20-30 tuổi.Sau một thời gian quân bình, mật độ xương bắt đầu giảm từ tuổi sau mãn kinhhay trên 50 tuổi ở nam giới Do đó, thay vì mô tả mật độ xương bằng đơn vịg/cm2, người ta mô tả bằng chỉ số T (T-score) Chỉ số T của một cá nhân làmật độ xương hiện tại so với lúc còn ở độ tuổi 20-30 và chuẩn hóa cho độ daođộng trong quần thể Chỉ số T bằng 0 có nghĩa là mật độ xương của cá nhân

đó chưa giảm so với tuổi 20-30; chỉ số T dưới 0 (rất hay thấy ở người caotuổi) có nghĩa là mật độ xương trong cơ thể của cá nhân đó đã bị giảm so vớituổi 20-30

Theo tiêu chuẩn của tổ chức y tế thế giới WHO (World HealthOrganization), nam và nữ trên 50 tuổi với chỉ số T bằng hoặc thấp hơn -2.5được chẩn đoán là “loãng xương” (osteoporosis) Nếu chỉ số T trong khoảng -2.4 và -1.1 thì chẩn đoán là “thiếu xương” (osteopenia) Nếu chỉ số T cao hơn-1.1 thì mật độ xương của cá nhân đó là bình thường

Ngoài phương pháp DEXA đo xương háng và xương cột sống, phươngpháp đo DEXA ngoại biên (Peripheral dual-energy X-ray absorptiometry/P-DEXA) là một phương pháp biến chế của DEXA, dùng để đo mật độ xươngchân tay, như xương cổ tay Máy đo P - DEXA là máy nhỏ có thể di chuyển

dễ dàng P - DEXA dùng số lượng chất phóng xạ rất nhỏ, và đo rất nhanhchóng Tuy nhiên máy này không hữu hiệu như DEXA khi dùng để theo dõihiệu nghiệm của thuốc điều trị bệnh loãng xương.

Siêu âm là phương pháp thường dùng đầu tiên để dò lược tìm chứngloãng xương ở gót chân Khi kết quả siêu âm cho thấy mật độ xương thấp, sau

đó bệnh nhân được đề nghị cho làm DEXA Phương pháp siêu âm cho kết quảnhanh và không độc hại Tuy nhiên điểm bất lợi của siêu âm là không thể đođược mật độ của xương háng hay cột sống, và cũng không hữu hiệu nhưDEXA khi dùng để theo dõi hiệu nghiệm của thuốc điều trị bệnh loãng xương[7], [8]

1.1.2 Tình hình loãng xương hiện nay

Hiện trên thế giới có trên 200 triệu người bị loãng xương, ảnh hưởng đến1/3 phụ nữ và 1/8 nam giới trên 50 tuổi Bệnh loãng xương thường diễn tiến

âm thầm, người bệnh không biết mình bị bệnh cho đến khi bị biến chứng bấtthường xảy ra như gãy cổ xương đùi, lún gãy đốt sống, gãy xương vùng hông.Bệnh để lại hậu quả rất nghiêm trọng cho con người, nó gây tàn tật, tử vong…làm giảm chất lượng sống làm tăng gánh nặng cho gia đình và xã hội.[23]Thống kê cho thấy biến chứng gãy cổ xương đùi đặc biệt nguy hiểm vàđang tăng nhanh trên thế giới Trong đó, 51% số ca nằm ở các quốc gia châu

Á, 20% người mắc phải biến chứng này đã tử vong trong một năm đầu, 20%khác bị tàn phế nặng nề phải có người trợ giúp, 30% phải phụ thuộc vàongười khác, chỉ có 30% có thể bình phục trở lại nhưng luôn luôn bị nguy cơtái chấn thương rình rập

Ở Việt Nam hiện nay tổng số ca mắc bệnh loãng xương trên cả nước làtrên 2,9 triệu người Các chuyên gia dự đoán, con số này sẽ tăng lên 4,5 triệungười vào năm 2020 và 11 triệu người vào năm 2050

Chi phí dùng để điều trị bệnh loãng xương cũng tăng nhanh đến chóngmặt Theo thông báo của Hiệp hội loãng xương quốc tế IOF (InternationalOsteoporosis Foundation), hiện nay chi phí cho bệnh loãng xương tươngđương với chi phí cho bệnh tiểu đường và lớn hơn chi phí cho cả hai bệnh ungthư thường gặp nhất ở phụ nữ cộng lại (ung thư vú và ung thư cổ tử cung).Chi phí lớn nhất cho bệnh loãng xương là để điều trị biến chứng gãy xương,đặc biệt là gãy cổ xương đùi Ước tính tới năm 2050, thế giới có thể phải tốntới 131,5 tỉ USD để chữa trị những ca chấn thương liên quan đến loãngxương.

Bệnh loãng xương tuy rất nguy hiểm nhưng dễ chẩn đoán Khi phát hiệnsớm và điều trị bằng biện pháp thích hợp có thể giảm 50% nguy cơ gãyxương Vì vậy, bên cạnh việc phòng ngừa bệnh loãng xương, việc chẩn đoán

và điều trị sớm bệnh loãng xương sẽ ngăn chặn sự gia tăng số trường hợp gãyxương có thể ảnh hưởng nặng nề về mặt kinh tế - xã hội đến hàng triệu ngườidân

1.1.3 Các thuốc điều trị loãng xương

Xương là kết tinh của hai quá trình sinh học tạo xương và hủy xương

Do đó, thuốc điều trị loãng xương được phát triển dựa vào hai cơ chế này,chia làm hai nhóm chính: nhóm ức chế tế bào hủy xương (thuốc chống hủyxương) và nhóm kích thích tế bào tạo xương (thuốc tăng tạo xương)

a Các thuốc chống hủy xương

Là nhóm thuốc quan trọng nhất trong điều trị loãng xương Tác dụng củathuốc loại này là ức chế hoạt động của tế bào hủy xương (Osteoclast), giúpcho quá trình tái tạo xương thuận lợi Các loại thuốc này được chia làm nhiềunhóm nhỏ hơn

- Nhóm hormon và các thuốc giống hormon:

+ Nhóm hormon sinh dục nữ (Oestrogen và các giống hormon) dùng đểphòng ngừa và điều trị loãng xương cho phụ nữ sau mãn kinh:Oestrogen (biệt dược Premarin), Oertrogen và Progesterone (biệt dượcPrempak C, Prempro…); thuốc giống hormon: Tibolol (biệt dượcLivial); thuốc điều hòa chọn lọc thụ thể Oestrogen (SERMs):Raloxifene (biệt dược Evista).

+ Nhóm hormon sinh dục nam (Androgen) dùng để phòng ngừa và điềutrị loãng xương cho nam giới sau tắt dục: Testosrerone (Biệt dượcAndriol)

- Nhóm Bisphotphonat:

Bisphotphonat là nhóm thuốc mới được sử dụng từ đầu những năm

1990, có tác dụng làm tăng khối lượng và độ cứng của xương, đặc biệt ở cộtsống, giảm đáng kể được nguy cơ gãy xương do loãng xương

Có rất nhiều loại như: Clodronat, Tiludronat, Pamidronat, Etidronat,Alendronat, Risedronat, Zoledronat, …

- Canxitonin

Đây là một hormon có cấu trúc một chuỗi gồm 32 axit amin có nhiệm vụđiều hòa chuyển hóa canxi, làm giảm hoạt động của tế bào hủy xương, do đóchống hủy xương Canxitonin dùng làm thuốc được lấy từ cá hồi vì có ái lựcvới các thụ thể đặc hiệu ở tế bào hủy xương và có tác dụng kéo dài hơncanxitonin tổng hợp từ các loài có vú (kể cả người) Có thể dùng dạng tiêmhay dạng xịt vào mũi (dạng xịt mũi dùng liều 100-200 IU/ngày)

b, Các thuốc tăng tạo xương

- Hormon Parathyroit: rPTH 2 ug TDD/ ngày là thuốc duy nhất đượccông nhận là tăng tạo xương thực sự (11/2002)

- Canxi và vitamin D: để cung cấp “nguyên liệu” cho việc tạo xươngmới, kích thích hoạt động của tế bào sinh xương (Osteoblast)

+ Vitamin D hoặc chất chuyển hoá của vitamin D (Canxitriol –Rocaltrol) giúp cho việc sử dụng canxi hiệu quả hơn.

+ Canxi nhằm cung cấp những nguyên vật liệu để bổ sung cho xươngkhi mà chế độ ăn không đáp ứng đủ hoặc khi cơ thể không hấp thu đầyđủ

- Thuốc tăng đồng hoá (Durabolin, Deca-durabolin) có tác dụng tăngcường hoạt tính của tế bào sinh xương, tăng cường chuyển hoá protein

Trên thực tế các thuốc chống huỷ xương cũng có tác dụng tăng tạoxương và các thuốc tăng tạo xương cũng có tác dụng chống huỷ xương [10],[19]

1.2 Hợp chất bisphotphonat

Bisphotphonat là nhóm thuốc quan trọng nhất trong việc điều trị loãngxương Chúng được gọi là bisphotphonat vì phân tử có hai nhóm photphonat(-PO3) tương tự như trong cấu trúc của pyrophotphat

Hai nhóm –PO3 liên kết cộng hóa trị với C quyết định chức năng củathuốc Chuỗi bên dài R2 quyết định các tính chất hóa học, cơ chế hoạt động và

độ mạnh hoạt tính của thuốc, chuỗi ngắn R1 chủ yếu ảnh hưởng đến tính chấthóa học và dược động học

Các loại thuốc bisphotphonat được dùng để phòng ngừa và điều trị cácbệnh loãng xương ở phụ nữ sau mãn kinh, tăng khối lượng xương ở nam giới

bị loãng xương, phòng ngừa và điều trị bệnh loãng xương do glucocorticoit,

điều trị bệnh viêm xương biến dạng (bệnh Paget xương), phòng chống gãyxương trong loãng xương, điều trị chứng tăng nồng độ canxi trong máu áctính, mất xương và đau xương gây ra bởi ung thư và di căn xương Ngoài rahiện nay cũng có một số công trình đang nghiên cứu về khả năng chống ungthư và điều trị chứng xơ cứng tai (Otosclerosis) của một số thuốcbisphotphonat [12].

Các hợp chất bisphotphonat được các nhà khoa học biết đến từ giữa thế

kỉ thứ 19 nhưng được điều tra dược tính lần đầu tiên trong những năm 1960

để sử dụng trong điều trị các rối loạn chuyển hóa xương Từ đó đến nay, lớpchất bisphotphonat đã được nghiên cứu và phát triển đến ba thế hệ Các hợpchất bisphotphonat được phân loại thành các thế hệ dựa vào hoạt tính chốngloãng xương của chúng

Thế hệ bisphotphonat đầu tiên gồm etidronat, clodronat và tiludronatđược sử dụng để tăng cường xương, điều trị loãng xương và điều trị bệnhPaget xương

Từ thế hệ bisphotphonat thứ nhất hoạt tính kém, các nhà khoa học đãtìm cách thay đổi cấu trúc hóa học, bằng cách gắn các nhóm thế R2 có chứa 1nguyên tử nitơ vào tạo nên thế hệ bisphotphonat thứ hai có hoạt tính mạnhhơn etidronat gấp hàng trăm lần, gồm alendronat, pamidronat, olpadronat,neridronat Các hợp chất thế hệ thứ hai có tác dụng mạnh trong việc tăng mật

độ xương của cột sống, hông, cổ và toàn thân, và giảm đáng kể nguy cơ gãyxương cột sống, xương cổ tay và xương hông Do đó ngay từ lúc mới ra đời,các hợp chất này đã được đón nhận rất nhiệt tình và đến nay vẫn được sửdụng rộng rãi

Nhận thấy được tác dụng mạnh mẽ của việc thêm nguyên tử nitơ trongnhóm R2, các nhà khoa học đã thử nghiệm với các nhóm R2 có chứa dị vòngnitơ liên hợp Từ đó tạo ra các hợp chất có hoạt tính mạnh hơn etidronat gấp

hàng nghìn lần Đây chính là thế hệ bisphotphonat thứ ba, với ibandronat,risedronat và zoledronat Các hợp chất này chỉ cần dùng 1 liều lượng nhỏcũng có tác dụng rất lớn Chẳng hạn để điều trị loãng xương, chỉ cần uống 1viên risedronat 35mg/ 1 tuần hoặc tiêm 1 liều ibandronat 3 mg/ 1 quý hoặctiêm 1 liều zoledronat 5mg/ 1 năm (trong khi alendronat cần uống 1 viên 10

mg hằng ngày) Các bisphotphonat thế hệ thứ ba có hiệu quả cao trong việcgiảm nguy cơ gãy xương cột sống, nguy cơ gãy cổ xương đùi Riêngzoledronate (axit zoledronic 5mg) là thuốc duy nhất được chứng minh giảmnguy cơ tử vong 28% ở bệnh nhân gãy xương hông [15]

Ngoài cách phân loại dựa vào hoạt tính chống loãng xương như trên, cácbisphotphonat còn có thể chia thành hai lớp chất: chứa nitơ và không chứanitơ Hai loại bisphotphonat này có cơ chế làm việc khác nhau trong việc tiêudiệt các tế bào hủy xương

Các bisphotphonat không chứa nitơ gồm: etidronat, clodronat vàtiludronat Trong tế bào, các bisphotphonat không chứa nitơ được chuyển hóathành các hợp chất thay thế phần pyrophotphat của adenozin triphotphat(ATP) rồi kết hợp với tế bào hủy xương từ bề mặt khoáng chất của xương Tếbào hủy xương khởi đầu quá trình apoptosis và chết dẫn đến giảm sự phânhủy xương

Các bisphotphonat chứa nitơ gồm: pamidronat, alendronat, ibandronat,risedronat, zoledronat, … có hoạt tính mạnh hơn hẳn các bisphotphonatkhông chứa nitơ Các bisphotphonat này ngăn chặn hoạt động của tế bào hủyxương bằng cách liên kết với diphosphate ức chế enzim tổng hợppyrophotphat farnesyl trong con đường con đường axit mevalonic (con đườngHMG-CoA reductase) Con đường mevalonate chịu trách nhiệm về sinh tổnghợp cholesterol, sterol khác, và các chất béo isoprenoit Những enzim tổnghợp pyrophotphat farnesyl điều chỉnh một loạt các quá trình nội bào cần thiết

cho tế bào hình thái tế bào hủy xương, chức năng, và sự sống còn Các quátrình này bao gồm phản ứng với các kích thích chẳng hạn như sắp xếpcytoskeletal, và quá trình apoptosis Các bisphotphonat chứa nitơ ức chếenzim tổng hợp pyrophotphat farnesyl sẽ phá vỡ chức năng tế bào hủy xương,

có tác dụng kìm chế sự tăng, và gây quá trình apoptosis của tế bào hủy xương.[22]

Bảng 1.1 Các hợp chất bisphotphonat thông dụng

bis(axit photphonic)

photphonic)Tiludronat -H

metylen} bis(axit photphonic)Pamidronat -OH -CH2-CH2-NH2 (3-amino-1-hidroxipropan-

1,1-điyl) bis(axit photphonic)Neridronat -OH -(CH2)5-NH2 (6-amino-1-hidroxihexan-

1,1-điyl) bis(axit photphonic)Olpadronat -OH -(CH2)2-N-(CH3)2 [3-(đimetylamino)-1-

hidroxipropan-1,1-điyl] bis(axit photphonic)Alendronat -OH -(CH2)3-NH2 (4-amino-1-hidroxibutan-

1,1-điyl) bis(axit photphonic)Ibandronat

-OH -H2 C-H2C-N

CH3(CH2)4CH3

[1-hidroxi-3-metyl(pentyl)amino]propan-1,1-điyl bis(axit photphonic)

[1-hidroxi-2-(3-pridyl)]etan-1,1-điyl bis(axit photphonic)

Zoledronat -OH N N

[1-hidroxi-2-(1-H-điyl bis(axit photphonic)

imidazol-1-yl)]etan-1,1-Bảng 1.2 Hoạt tính chống loãng xương tương đối

của các loại thuốc bisphotphonat

Tên thông dụng Hoạt tính tương đối Tên biệt dược

Tiludronat 10 Skelid, Tildren (sử dụng thú y)

Zoledronat 10000 Zometa, Zomera, Aclasta, Reclast

Về liều dùng, các loại thuốc bisphotphonat có hai dạng là đường uốnghoặc tiêm tĩnh mạch Alendronat và risedronat được dùng ở dạng thuốc uống.Pamidronat và zoledronat chỉ được sử dụng cho tiêm tĩnh mạch Ibandronathiện có sẵn cho cả đường uống và tiêm tĩnh mạch Lịch trình điều trị có thể làdùng hàng ngày (alendronat 10 mg, risedronat 5 mg, ibandronat 2,5 mg), hàngtuần (alendronat 70 mg hoặc risedronat 35 mg), hàng tháng (ibandronat 150mg), hàng quý (ibandronat 3 mg hoặc pamidronat 30 mg tiêm truyền) hoặchàng năm (zoledronat 5 mg tiêm truyền)

Đối với các loại thuốc bisphosphonate dạng viên sử dụng hàng ngày,chẳng hạn các thuốc alendronat, risedronat, … bệnh nhân phải uống thuốc với

1 cốc nước đầy khoảng 200ml ít nhất 30 phút trước khi ăn, uống hoặc dùngthuốc khác Uống thuốc xong, bệnh nhân phải đợi 30 phút mới được ăn, uốnghoặc dùng thuốc khác và giữ tư thế đứng thẳng hoặc ngồi thẳng (không nằm)trong thời gian đó để giảm thiểu nguy cơ kích ứng loét niêm mạc thực quản.Đây là yêu cầu gây phiền hà cho các bệnh nhân khi dùng thuốc Chính vì thếZometa (zoledronat hay axit zoledronic) ra đời đã được hoan nghênh rất nhiều

và được xem là một sự thay thế hữu hiệu cho các loại thuốc viênbisphotphonat được sử dụng hàng ngày cho người bị loãng xương Zometađược bào chế dưới dạng dịch truyền; việc truyền thuốc chỉ mất khoảng 15phút nhưng có công hiệu trong 12 tháng Ngoài ra hiệu quả của việc ngănngừa gãy xương ở phụ nữ loãng xương sau mãn kinh của axit zoledronic cũng

đã được kiểm chứng là cao hơn so với các loại thuốc bisphotphonat trước đó.Các bệnh nhân sử dụng axit zoledronic có nguy cơ gãy xương thấp hơn 41%đối xương hông và 70% đối xương sống trong khi các loại thuốc viên chốngloãng xương hiện nay chỉ giúp giảm nguy cơ gãy xương sống ở tỉ lệ từ 40 -50% mà thôi [18] Axit zoledronic còn được dùng để chống lại hiện tượng dicăn xương trong bệnh ung thư, đặc biệt là ung thư vú ở phụ nữ [16],[27].Việc nghiên cứu và phát triển các loại thuốc bisphotphonat đang ngàycàng được mở rộng và đầu tư nhiều, đặc biệt là các loại thuốc sắp hết hạn bảo

hộ bản quyền Các loại thuốc sau khi đã hết hạn bảo hộ bản quyền có thếđược sản xuất bởi nhiều công ty dược phẩm khác nhau thay vì một công tyđộc quyền Điều nay làm hạ giá giá thành sản phẩm, giúp giảm gánh nặng chobệnh nhân Chẳng hạn, Fosamax (Alendronat) được sản xuất bởi Merckchiếm 40% thị phần với doanh số ước tính khoảng 3 tỉ đô la Mỹ trong năm

2007 Nhưng đến năm 2008, bằng sáng chế đã hết hạn và thuốc generic được

sản xuất rộng rãi khiến thị phần của Merck cho thương hiệu Fosamax chỉ còn

là dưới 10%

Axit zoledronic được công ty Novartis (trụ sở đặt tại Basel, Thụy Sỹ)bào chế và đăng ký bản quyền sử dụng đến năm 2013, với tên thương mại làZometa Thuốc này được nhập về Việt Nam với giá rất cao Giá cho một liềutruyền (4mg hoạt chất axit zoledronic) do các công ty nhập khẩu bán ra là 5,8triệu đồng Với giá bán cao như vây rất nhiều bệnh nhân không đủ khả năngtài chính để có thể sử dụng thuốc Cho tới nay, theo chúng tôi được biết, ởViệt Nam, chưa có công trình nghiên cứu nào công bố về việc tổng hợp axitzoledronic Chính vì vậy việc nghiên cứu quy trình tổng hợp axit zoledronic ởquy mô phòng thí nghiệm để tiến tới sản xuất hoạt chất này khi hết hạn bảo

hộ vào năm 2013 là rất cần thiết và có ý nghĩa to lớn nhằm làm giảm giáthành thuốc và góp phần phát triển ngành công nghiệp hóa dược trong nước

1.3 Nghiên cứu tổng hợp axit zoledronic

1.3.1 Tìm hiểu về axit zoledronic

HO O

OH

OHOHO

1 2 1 2 3

4 5

- Các biệt dược chứa thành phần chính là axit zoledronic:

 Zometa (axit zoledronic 4mg/5ml): do hãng dược phẩm Novartissản xuất từ 2001, được chỉ định điều trị chứng tăng canxi máu áctính, điều trị bệnh đa u tủy, di căn xương từ các khối u rắn và điềutrị bệnh Paget.

 Reclast/Aclasta (axit zoledronic 5mg/100ml): do hãng dược phẩmNovartis sản xuất từ năm 2007, được chỉ định phòng ngừa và điềutrị bệnh loãng xương ở phụ nữ mãn kinh, điều trị loãng xương ởnam giới, phòng ngừa và điều trị loãng xương do glucocorticoit,điều trị bệnh Paget xương

 Ngoài ra ở một số quốc gia còn có một số thuốc mang tên :Zomera, Zoldria, Zoldonat, Zoldic … nhưng bản chất đều là mộttrong hai loại trên

Hình 1.2 Các biệt dược chứa thành phần chính là axit zoledronic

Axit zoledronic là một axit bisphotphonic chứa nitơ, một chuỗi bên cóchứa vòng imidazol Vòng imidazol có chứa hai nguyên tử nitơ ở vị trí quan

trọng Ở điều kiện thường, axit zoledronic tồn tại ở dạng tinh thể màu trắng,hòa tan tốt trong dung dịch natri hidroxit 0,1N, tan trong nước nhưng ít tantrong axit clohidric 0,1N, và thực tế không hòa tan trong các dung môi hữu

cơ Độ pH của dung dịch axit zoledronic 0,7% trong nước là xấp xỉ 2,0

Axit zoledronic là một bisphotphonat thế hệ mới cực kì mạnh mẽ, sựhiện diện của hai nguyên tử nitơ khiến hoạt tính của axit zoledronic tăng lênđáng kể so với các chế phẩm bisphotphonat khác Hoạt tính chống loãngxương của axit zoledronic cao hơn gấp 10000 lần so với axit etidronic(etidronat) Sự thay đổi trong cấu trúc chuỗi có chứa nitơ của bisphotphonat

có ảnh hưởng đến hiệu lực của hợp chất đối với sự ức chế tái hấp thụ xươngcủa tế bào hủy xương

Axit zoledronic có tiềm năng và tính chất dược lý vượt trội so với cácbisphotphonat khác Các thử nghiệm lâm sàng đã cho thấy rõ ràng tính ưu việtcủa nó Axit zoledronic đã được chứng minh là có hiệu quả cao trong điều trịcác di căn xương, tổn thương xương ở những bệnh nhân có các khối u ác tính.Theo kết quả thống kê được từ công trình nghiên cứu lâm sàng “Hiệu quả y tế

và giảm nguy cơ gãy xương qua thử nghiệm axit zoledronic” trên 7.765 phụ

nữ sau mãn kinh ở nhiều quốc gia khác nhau, một liều truyền axit zoledronic5mg trong một năm làm giảm nguy cơ gãy xương hông 41%, nguy cơ gãyxương đốt sống 70% và nguy cơ tử vong sau gãy xương đến 28% [11],[21].Trong khi đó, các loại thuốc viên chống loãng xương hiện nay chỉ giúp giảmnguy cơ gãy xương sống ở tỉ lệ từ 40 - 50% mà thôi

Axit zoledronic còn là thuốc có hiệu quả tốt nhất trong điều trị tăngcanxi máu trong ung thư di căn xương Hầu hết các ung thư có khả năng dicăn xương Tỷ lệ di căn xương của ung thư vú, tiền liệt tuyến lên tới 65-70%;ung thư phổi, dạ dày, đại tràng khoảng 15-40% Di căn xương gây đau, hạnchế vận động, gãy xương, chèn ép tủy 90% di căn xương gặp ở các vị trí cột

sống, xương chậu, đầu trên xương đùi, các xương sườn, đầu trên xương cánhtay, khi chẩn đoán thường đã đa ổ Một trong những biến chứng nghiêm trọngnhất của di căn xương do ung thư là tăng canxi máu, tỷ lệ sống trung bình củacác bệnh nhân bị tăng canxi máu do ung thư khoảng 1-3 tháng Axitzoledronic tiêm tĩnh mạch đã được Cục Quản lý thuốc và thực phẩm Hoa kỳ(FDA - Food and Drug Administration) phê chuẩn trong điều trị tăng cancimáu trong các bệnh đa u tủy xương Kahler, di căn của ung thư xương Thuốc

có tác dụng hạ canxi máu mạnh hơn từ 5 - 25 lần so với các thuốcbisphotphonat khác như risedronat, ibandronat, có hiệu quả cả với các trườnghợp thất bại với pamidronat [9]

Như vậy, axit zoledronic - một dẫn xuất imidazol có chứa hai nguyên tửnitơ trong cấu trúc vòng - là bisphotphonat dạng tiêm tĩnh mạch mạnh nhấtđược biết cho đến nay

1.3.2 Các phương pháp tổng hợp axit zoledronic

Việc tổng hợp toàn phần axit zoledronic đã thu hút sự quan tâm củanhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới Nhiều phương pháp tổng hợp axitzoledronic đã được công bố trên các tạp chí chuyên ngành, trong đó có 4hướng điển hình đã được công bố gần đây Các phương pháp đều sử dụng hợp

chất đầu là imidazol, trải qua 2 giai đoạn để điều chế hợp chất 3 rồi chuyển

hóa thu được hoạt chất axit zoledronic đạt độ tinh khiết cao Do hợp chất

“chìa khóa” 3 có đặc tính tan tốt trong nước, kém tan trong các dung môi hữu

cơ nên việc nghiên cứu các phương pháp tổng hợp axit zoledronic cần phải

giải quyết được 2 vấn đề: nâng cao hiệu suất của hợp chất 3; đồng thời phải

sử dụng các tác nhân và phản ứng sao cho tạo thuận lợi cho việc xử lý và tinh

chế hợp chất 3.

Phương pháp tổng hợp axit zoledronic đầu tiên là phương pháp củaZaderenko và cộng sự công bố vào năm 1994 [28] Trong nghiên cứu này, các

tác giả đã sử dụng ter-butyl cloaxetat làm tác nhân ankyl hóa imidazol (1) để thu được hợp chất 2, sau đó thủy phân hợp chất 2 ở 100oC thu được hợp chất

chìa khóa 3 Tuy nhiên việc dùng nước để loại bỏ nhóm ter-butyl sẽ dẫn tới

phải cô cất một lượng lớn nước khi triển khai trên quy mô lớn do vậy gây khókhăn trong công đoạn xử lý phản ứng Ngoài ra phương pháp này còn phảidùng tác nhân đắt tiền làm xúc tác là bis-[2-(N-benzyl-N,N-dietylamoni)etediclorua (BBDE Cl)

OH P

P

HO O

OH

OH O HO

NH

ClCH2COOMe,

K2CO3,KI DMF, Toluen

N

O

H2O,100oC (81%)

N

O

N N

OH P P

HO O OH OH O HO

4

Axit zoledronic

Sơ đồ 1.2 Phương pháp tổng hợp axit zoledronic

của Pulla Reddy và cộng sự

Để tránh việc phải cô cất nước khi loại bỏ nhóm ankyl este trong cácphương pháp trên, Patel và cộng sự đã sử dụng hỗn hợp tác nhân benzyl ancol

và cloaxetyl clorua, sau đó loại bỏ nhóm benzyl của hợp chất 6 bằng hidro hóa với xúc tác paladi trên than hoạt tính để thu hợp chất 3 [26] Tuy nhiên

phương pháp này cho hiệu suất không cao

N

NH

PhCH2OH, ClCH2COCl

CH3CN,55-60oC (23%)

N

O

Pd/C,H2, i-PrOH (70%)

4

Axit zoledronic

Sơ đồ 1.3 Phương pháp tổng hợp axit zoledronic của Patel và cộng sự

Gần đây, năm 2008, Santosh Kumar Singh và cộng sự đã trình bày một

phương pháp mới, trong đó hợp chất 2 được điều chế từ imidazol và ter-butyl

cloaxetat, sau đó nhóm ter butyl được loại bỏ bằng việc sử dụng TiCl4 [25].Phương pháp này cho hiệu suất cao, tuy nhiên việc sử dụng TiCl4 cần thao táctrong điều kiện khan Do vậy, khi thực hiện trong điều kiện có độ ẩm cao sẽgây khó khăn trong quá trình thao tác cũng như làm giảm hiệu suất phản ứng

N

NH

ClCH 2 COO-ter-Bu,

K2CO3EtOAc, 80oC

N

O

N N

OH P P

HO O OH OH O HO

và có mặt hợp chất kiềm Do vậy, các phản ứng ở bước 1 cho hiệu suất khôngcao và hiệu suất sản phẩm sẽ rất kém ổn định khi các yếu tố môi trường bênngoài thay đổi

Năm 2009, trong khuôn khổ đề tài cấp cơ sở Viện hóa học, Phạm VănCường và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tổng hợp hoạt chất axit

zoledronic theo phương pháp của Pulla Reddy và cộng sự tuy nhiên hiệu suất

chất 5 thu được từ imidazol (1) không cao.

CHƯƠNG 2 NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.1 Nội dung nghiên cứu

Trên cơ sở lý thuyết và nghiên cứu các phương pháp tổng hợp trong cáctài liệu, chúng tôi quyết định nghiên cứu phương pháp mới cho việc tổng hợphoạt chất axit zoledronic với việc sử dụng hợp chất xianometyl-4-metylbenzensulfonat (còn gọi là (tosyloxy)axetonitril) theo sơ đồ như sau:

HCl, H2O N

N OHO

N N

OH P P

HO O OH OH O HO

Sơ đồ 2.1 Quy trình tổng hợp axit zoledronic

Việc sử dụng hợp chất này làm tác nhân ankyl hóa imidazol sẽ tạo ra hợp

chất trung gian nitril 7 tránh được sự thủy phân trong môi trường có mặt

K2CO3 Hợp chất 7 sau đó được thủy phân trong môi trường axit để tạo thành hợp chất 3.

Phản ứng điều chế hợp chất 7 từ imidazol (1) được khảo sát trong các

dung môi khác nhau là etyl axetat, etanol và axetonitril Mặt khác, nhiệt độphản ứng cũng được khảo sát nhằm tối ưu hóa hiệu suất phản ứng tạo hợp

chất 7.

Hợp chất cacboxylic 3 sau đó được phản ứng với hỗn hợp tác nhân

H3PO4/PCl3, sau đó thủy phân tạo hợp chất bisphotphonat axit zoledronic (4).

Trong bước này, các điều kiện ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng cũng đượcxem xét nghiên cứu

- Đimetyl sunfoxit (DMSO): (CH3)2SO

- Các chất vô cơ: KCN, K2CO3, KI, Na2CO3, Na2SO4, PCl3

- H3PO3 khan, H3PO4 khan

- Các dung dịch: H2SO4 6,5N, HCl 3N, HCl 9N

- Silica gel Merck 60 (ϕ = 0,063 – 0,2 mm)

- TLC silicagel 60 F254 (Merck)

2.2.2 Dung môi

Các dung môi sử dụng trong tổng hợp hữu cơ chủ yếu được mua từTrung Quốc gồm có metanol, etanol, điclometan, etylaxetat, n-hexan, axeton.Các dung môi đều được cất lại trước khi sử dụng

- Phổ khối ESI – MS được đo trên máy Agilent 6310 ion trap

OH

baz¬, CH2Cl2

H3C SO2OCH2CN O

đó, dung dịch H2SO4 được nhỏ giọt từ từ vào đến khi pH khoảng bằng 2

(khoảng 40 ml), đồng thời nhiệt độ thấp vẫn được duy trì Thêm Na2CO3 vàocho đến khi pH khoảng bằng 5 thì dừng lại (khoảng 3 g)

Hỗn hợp phản ứng được lọc hút chân không bằng phễu Buchner để loại

bỏ phần chất rắn, rửa với etylaxetat Dịch nước sau đó được chiết vớietylaxetat 5 lần, mỗi lần 70 ml Gộp các dịch etylaxetat lại, làm khan bằng

natrisunfat rồi cô cạn dung môi thu được 51,3 g sản phẩm 1a là chất lỏng sánh

trong suốt Hiệu suất phản ứng đạt được là 90%

b Tổng hợp xianometyl-4-metylbenzensulfonat (1c) với việc sử dụng bazơ là trietyl amin

Trong bình cầu 2 cổ dung tích 25 ml có chứa chất 1a (0,34 g; 6 mmol),

trietyl amin Et3N (1 ml) được thêm vào Dịch phản ứng được làm lạnh đến

0oC bằng hỗn hợp đá muối Dung dịch của para-tosyl clorua 1b (1,06 g; 5

mmol) hòa tan trong CH2Cl2 (3 ml) được thêm vào từ từ Sau đó hỗn hợpđược đưa về nhiệt độ phòng và khuấy qua đêm

Hỗn hợp phản ứng có màu vàng nhạt được cô cạn dưới áp suất giảm thuđược chất lỏng sánh Sản phẩm được tinh chế bằng sắc ký cột với hệ dungmôi n-hexan : axeton = 3 : 1 sau đó kết tinh trong hệ n-hexan : axeton = 7 : 1

thu được 0,74 g sản phẩm 1c dưới dạng tinh thể trong suốt Hiệu suất phản

ứng đạt được là 70,14%

c, Tổng hợp xianometyl-4-metylbenzensulfonat (1c) với việc sử dụng bazơ là kali cacbonat

Trong bình cầu 2 cổ dung tích 25 ml, K2CO3 (0,34 g; 2,5 mmol) được

thêm vào dịch lỏng chất 1a (0,34 g; 6 mmol, hỗn hợp được làm lạnh đến 0oC

bằng đá muối Dung dịch của para-tosyl clorua 1b (1,06 g; 5 mmol) hòa tan

trong CH2Cl2 (3 ml) được thêm vào từ từ Sau đó hỗn hợp được đưa về nhiệt

độ phòng và khuấy qua đêm

Hỗn hợp sau phản ứng được lọc hút chân không bằng phễu Buchner, rửavới axeton Phần dịch lọc thu được có màu vàng nhạt, được cô cạn loại dungmôi dưới áp suất giảm thu được chất lỏng sánh màu vàng cam Sản phẩmđược tách bằng sắc ký cột với hệ dung môi n-hexan : axeton = 3 : 1 cho sản

phẩm sạch 1c ở dạng chất dầu trong suốt Kết tinh trong hệ n-hexan : axeton =

7 : 1 thu được 0,91 g tinh thể trong suốt sản phẩm 1c Hiệu suất phản ứng đạt

được là 86,26%

d, Quy trình được lựa chọn

K2CO3 (41,4 g; 0,3 mol) được thêm vào bình cầu có chứa chất 1a (51,3

g; 0,9 mol) Sau đó dịch phản ứng được làm lạnh bằng hỗn hợp đá muối

Dung dịch của para-tosyl clorua 1b (114,3 g; 0,6 mol) hòa tan trong CH2Cl2

(200 ml) được thêm vào từ từ Sau đó hỗn hợp được đưa về nhiệt độ phòng vàkhuấy qua đêm

Hỗn hợp sau phản ứng được lọc hút chân không bằng phễu Buchner, rửavới axeton Phần dịch lọc thu được có màu vàng nhạt, được cô cạn loại dungmôi dưới áp suất giảm thu được chất lỏng sánh màu vàng cam Sản phẩmđược kết tinh nhiều lần trong hệ n-hexan : axeton = 7 : 1, rửa bằng metanol

lạnh thu được 96,22 g tinh thể trong suốt sản phẩm 1c Hiệu suất phản ứng đạt

được là 76,00%

 Dữ liệu phổ của hợp chất 1c:

- 1H-NMR (CDCl3): δ (ppm): 7,83 (d, 2H); 7,41 (d, 2H); 4,74 (s, 2H);2,48 (s, 3H)

- 13C-NMR (CDCl3): δ (ppm): 146,430; 131,339; 130,293; 128,230;112,662 (CN); 52,480 (CH2); 21,738 (CH3)

- ESI – MS: m/z = 211 [M+H]+

2.3.2 Tổng hợp 1H-imidazol-1-axetonitril (hợp chất 7)

 Phản ứng tổng quát:

1c

N N

Na2CO3 + KI dung m«i, to

7

CH 2 - CN

1

 Cơ sở lý thuyết: Phản ứng thế nucleophin lưỡng phân tử SN2

a, Tổng hợp 1H-imidazol-1-axetonitril trong dung môi etyl axetat

Xianometyl-4-metylbenzensulfonat (1c) (0,422 g; 2 mmol) và Na2CO3

(0,318g; 3 mmol) được đưa vào bình cầu hai cổ dung tích 100 ml Nhỏ từ từ

imidazol (1) (0,136g ; 2 mmol) được hòa tan trong 40 ml etyl axetat vào bình

cầu phản ứng Sau đó nâng dần nhiệt độ lên đến 80oC Hỗn hợp phản ứngđược tiếp tục khuấy trong 5 giờ ở 80oC

Sau 5 giờ, thử phản ứng bằng sắc ký bản mỏng thấy không có phản ứngxảy ra Thêm KI (0,498 g; 3 mmol) vào bình phản ứng Tiếp tục đun ở nhiệt

độ 80oC trong 2 giờ rồi thử bằng sắc ký bản mỏng vẫn không thấy phản ứngxảy ra

b, Tổng hợp 1H-imidazol-1-axetonitril trong dung môi etanol

Xianometyl-4-metylbenzensulfonat (1c) (0,422 g; 2 mmol), Na2CO3

(0,318g; 3 mmol) và KI (0,498 g; 3 mmol) được đưa vào bình cầu hai cổ dung

tích 100 ml Nhỏ từ từ imidazol (1) (0,136g ; 2 mmol) được hòa tan trong 40

ml etanol vào bình cầu phản ứng Sau đó nâng dần nhiệt độ lên đến 60oC Hỗnhợp phản ứng được tiếp tục khuấy trong 6 giờ ở 60oC Sau 6 giờ, thử phảnứng bằng sắc ký bản mỏng thấy đã hết chất đầu nên dừng phản ứng

Dịch phản ứng được lọc hút chân không trên phễu Buchner, rửa vớiđiclometan Dịch điclometan được cô bớt dung môi rồi chiết với 30 ml nướccất Dịch nước được rửa lại 3 lần với điclometan, mỗi lần 25ml Gộp các dịchđiclometan lại, cô cất loại dung môi thu được keo màu vàng nâu Cặn nàyđược tinh chế bằng sắc ký cột với hệ dung môi n-hexan : axeton = 5 : 1 Lấy

chất sạch thu được đi đo phổ 1H-NMR chứng minh không phải sản phẩmmong muốn.

c, Tổng hợp 1H-imidazol-1-axetonitril trong dung môi DMSO

Xianometyl-4-metylbenzensulfonat (1c) (0,422 g; 2 mmol), Na2CO3

(0,318g; 3 mmol) và KI (0,498 g; 3 mmol) được đưa vào bình cầu hai cổ dung

tích 50 ml Nhỏ từ từ imidazol (1) (0,136g ; 2 mmol) được hòa tan trong 40

ml DMSO vào bình cầu phản ứng Sau đó nâng dần nhiệt độ lên đến 60oC.Hỗn hợp phản ứng được tiếp tục khuấy trong 6 giờ ở 60oC Sau 6 giờ, thửphản ứng bằng sắc ký bản mỏng thấy chất đầu còn lại ít nên dừng phản ứng.Dịch phản ứng được hòa tan với nước sau đó chiết với đietyl ete (ba lần)

Cô cất loại dung môi dịch ete thu được chất dạng dầu không màu Hòa tanchất thu được trong CDCl3 rồi đo phổ 1H-NMR chứng minh không phải sảnphẩm mong muốn

d, Tổng hợp 1H-imidazol-1-axetonitril trong dung môi axetonitril

Xianometyl-4-metylbenzensulfonat (1c) (0,422 g; 2 mmol), Na2CO3

(0,318g; 3 mmol) và KI (0,498 g; 3 mmol) được đưa vào bình cầu hai cổ dung

tích 50 ml Nhỏ từ từ imidazol (1) (0,136g ; 2 mmol) được hòa tan trong 40

ml axetonitril vào bình cầu phản ứng Sau đó nâng dần nhiệt độ lên đến 50 –

100oC (khảo sát nhiều lần ở các nhiệt độ khác nhau) Hỗn hợp phản ứng đượctiếp tục khuấy trong 5 giờ

Dịch phản ứng được lọc hút chân không trên phễu Buchner, rửa vớietylaxetat Dịch etylaxetat được cô bớt dung môi rồi chiết với 200 ml dungdịch Na2CO3 5% Dịch nước được rửa lại 3 lần với etylaxetat, mỗi lần 25ml.Gộp các dịch etylaxetat lại, làm khan bằng natrisunfat rồi cô cất loại dung môithu được keo màu vàng nâu Cặn này được tinh chế bằng sắc ký cột với hệ

dung môi n-hexan : axeton = 7 : 3 cho sản phẩm sạch 7 là chất lỏng màu vàng

nâu nhạt

e, Quy trình được lựa chọn

Xianometyl-4-metylbenzensulfonat (1c) (65,41 g; 0,31 mol), Na2CO3

(32,86 g; 0,31 mol) và KI (51,46 g; 0,31 mol) được đưa vào bình cầu dung

tích 1 lít Nhỏ từ từ imidazol (1) (25,16 g ; 0,37 mol) được hòa tan trong 500

ml axetonitril vào bình cầu phản ứng Sau đó nâng dần nhiệt độ lên đến 60oC.Hỗn hợp phản ứng được tiếp tục khuấy trong 6 giờ ở 60oC

Dịch phản ứng được lọc hút chân không trên phễu Buchner, rửa vớietylaxetat Dịch etylaxetat được cô bớt dung môi rồi chiết với 200 ml dungdịch Na2CO3 5% Dịch nước được rửa lại 3 lần với etylaxetat, mỗi lần 150 ml.Gộp các dịch etylaxetat lại, làm khan bằng natrisunfat rồi cô cất loại dung môithu được 34,5 g keo màu vàng nâu Cặn này được tinh chế bằng sắc ký cột với

hệ dung môi n-hexan : axeton = 7 : 3 cho 28,2 g sản phẩm 7 sạch là chất lỏng

màu vàng nâu nhạt Hiệu suất phản ứng đạt được là 85,02%

 Dữ liệu phổ của hợp chất 7:

- 1H-NMR (CDCl3): δ (ppm): 7,567 (s, 1H); 7,135 (s, 1H); 7,040 (s, 1H);4,911 (s, 2H)

- 13C-NMR (CDCl3): δ (ppm): 136,994; 131,034; 118,886; 113,507(CN); 34,363

 Cơ sở lý thuyết: Phản ứng thủy phân

a, Tổng hợp axit 2-(1H-imidazol-1-yl)axetic ở các nhiệt độ khác nhau

Trong bình 2 cổ dung tích 25 ml, được trang bị máy khuấy và nhiệt kế,

hợp chất 7 (0,214 g; 2 mmol) được hòa tan trong dung dịch HCl 3N (10 ml).

Nhiệt độ phản ứng được nâng dần đến 80 – 110oC (khảo sát nhiều lần ở cácnhiệt độ khác nhau) Hỗn hợp phản ứng được khuấy trong 5 giờ

Hỗn hợp sau phản ứng có dạng lỏng, không có kết tủa, đem cô cạn thuđược chất rắn màu vàng nhạt Rửa nhiều lần bằng axeton được chất rắn màu

trắng là sản phẩm sạch 3

b, Quy trình được lựa chọn

Trong bình cầu dung tích 500 ml, được trang bị máy khuấy và nhiệt kế,

hợp chất 7 (26,75g; 0,25 mol) được hòa tan trong dung dịch HCl 3N (300 ml).

Nhiệt độ phản ứng được nâng dần đến 110oC Hỗn hợp phản ứng được khuấytrong 6 giờ

Hỗn hợp phản ứng sau đó được cô cạn thu được chất rắn màu vàng nhạt.Rửa nhiều lần bằng axeton được chất rắn màu trắng, phần nước rửa axetonđem cô cạn, thêm từ từ axeton thu được thêm chất rắn trắng Gộp các phần

chất rắn sấy khô thu được sản phẩm 3 (38,28 g) dưới dạng chất rắn màu trắng.

Hiệu suất phản ứng đạt được là 85,30%

 Dữ liệu phổ của hợp chất 3:

- 1H-NMR (CDCl3): δ (ppm): 8,780 (s, 1H); 7,500 (d, J = 7,5 Hz, 2H);5,125 (s, 2H)

- 13C-NMR (CDCl3): δ (ppm): 170,120 (COOH); 135,988; 123,136;119,621; 49,891 (CH2)

- EI – MS: m/z = 126 [M]+

2.3.4 Tổng hợp axit zoledronic (hợp chất 4)

 Phản ứng tổng quát:

OH P

P

OH

OH O HO

4

Cl

a, Tổng hợp axit zoledronic với tác nhân H 3 PO 3 /PCl 3

Hỗn hợp chất 3 (0,359 g; 2 mmol) và H3PO3 khan (0,656 g; 8 mmol)được đun nóng đến 60 – 80oC, sau đó thêm từ từ PCl3 (0,7 ml; 8 mmol) vào.Hỗn hợp phản ứng được khuấy tiếp trong 6 giờ ở 75oC Dung dịch phản ứngsau đó được đưa về nhiệt độ phòng rồi thêm từ từ dung dịch HCl 9N (1,5 ml)vào Hỗn hợp thu được, được khuấy tiếp ở 80oC trong 12 giờ

Làm nguội dung dịch phản ứng về nhiệt độ phòng, sau đó thêm than hoạttính (0,1 g) Lọc bỏ than hoạt tính thu được dung dịch trong suốt Cô cạn bớtnước, thêm axeton (3 ml) vào dung dịch rồi để vào tủ mát qua đêm thấy xuấthiện kết tủa trắng Lọc kết tủa, rửa bằng axeton rồi sấy khô thu được 0,358 g

axit zoledronic (4) sạch Hiệu suất phản ứng đạt được là 65,81%.

b, Tổng hợp axit zoledronic với tác nhân H 3 PO 4 /PCl 3

Hỗn hợp chất 3 (0,359 g; 2 mmol) và H3PO4 khan (0,784 g; 8 mmol)được đun nóng đến 60 – 80oC, sau đó thêm từ từ PCl3 (0,7 ml; 8 mmol) vào.Hỗn hợp phản ứng được khuấy tiếp trong 6 giờ ở 75oC Dung dịch phản ứngsau đó được đưa về nhiệt độ phòng rồi thêm từ từ dung dịch HCl 9N (1,5 ml)vào Hỗn hợp thu được, được khuấy tiếp ở 80oC trong 12 giờ

Làm nguội dung dịch phản ứng về nhiệt độ phòng, sau đó thêm than hoạttính (0,1 g) Lọc bỏ than hoạt tính thu được dung dịch trong suốt Cô cạn bớtnước, thêm axeton (3 ml) vào dung dịch rồi để vào tủ mát qua đêm thấy xuất